Potenciálny terapeutický prínos nízkej dávky Cistanche pri chronickom únavovom syndróme

Chronický únavový syndróm(ME/CFS) je oslabujúci multisystémový systémchronický stav neznámej etiológie classifified ako imunitná dysfunkciasyndróm a neurologické poruchy. Objav široko vyjadreného prechodného javuPotenciál receptora Melastatín 3 (TRPM3) ako v podstate cielený nociceptorový kanálurčitými opioidnými receptormi a ich vplyv na vápnik (Ca2 plus)-závislý Natural KillerImunitné funkcie (NK) buniek zvýšili možnosť, že by to mohol byť TRPM3farmakologicky zamerané na liečbu charakteristických symptómov ME/CFS. naltrexónhydrochlorid (NTX) pôsobí ako antagonista mu (m)-opioidný receptor teda negujejeho inhibičná funkcia na TRPM3. Na základe výhodhlásené pacientmi na ichpríznaky, nízka dávka NTX (LDN, 3.0–Zdá sa, že liečba 5.0 mg/deň) ponúka určitý potenciálny prínosčo naznačuje, že jeho účinok môže byť zameraný na patomechanizmus ME/CFS. Keďže neexistuje žiadna literatúra, ktorá by to potvrdilaúčinnosťLDN pre pacientov s ME/CFSin vitro, táto štúdia skúma potenciálny terapeutický účinok LDN u pacientov s ME/CFS. TRPM3Aktivita iónového kanála sa merala po modulácii s pregnenolón sulfátom (PregS) a žiadna inNK bunky na 9 pacientoch ME/CFS užívajúcich LDN a 9 vekovo a pohlavne zodpovedajúcichzdravé kontroly pomocou techniky celobunkovej náplasti. Uvádzame, že pacienti s ME/CFSužívanie LDN obnovilo TRPM3-ako iónové prúdy v NK bunkách. Malé iónové prúdy s atypické TRPM3-ako vonkajšia nápravaboli namerané po aplikácii PregS, aTRPM3-agonista v NK bunkách od pacientov užívajúcich LDN. Navyše, PregS-evokovaný iónovýprúdy cez TRPM3 boli výraznemodulovaný žiadnym inom, antagonistom TRPM3-,v NK bunkách od pacientov s ME/CFS užívajúcich LDN. Tieto údaje podporujú hypotézu, žeLDN môže mať potenciál ako liečba ME/CFS charakterizovaním podkladu regulačné mechanizmy liečby LDN zahŕňajúce TRPM3 a opioidné receptory v NKbunky. Napokon, táto štúdia môže slúžiť na opätovné využitie predávaných liekov, ako aj na podporuschválenie prospektívnych randomizovaných klinických štúdií o úlohe a dávke NTX vliečbu pacientov s ME/CFS.

Kľúčové slová:cistanche s nízkou dávkou, prechodný receptorový potenciál melastatín 3, vápnik, opioidný receptor, myalgencefalomyelitída/chronický únavový syndróm, prirodzené zabíjačské bunky, celobunková náplasťová elektrofyziológia

ÚVOD

myalgická encefalomyelitída/Chronický únavový syndróm(ME/CFS) je závažný multisystémový stav charakterizovanýpretrvávajúca vyčerpávajúca únava sprevádzaná celým radominvalidizujúce symptómy zahŕňajúce nevoľnosť po námahe, spánokdysfunkcia, rozšírená bolesť, ako aj neurokognitívne,autonómne, kardiovaskulárne, neuroendokrinné a imunitnéprejavy (1, 2). Existuje rôzna závažnosť ME/CFS(mierne až veľmi ťažké) (3), ak je to významnéa konzistentnéimunitná dysfunkcia a abnormality prirodzeného zabijaka (NK)bunkové funkcie boli hlásené na základe závažnosti (4). Bezklinicky stanovený diagnostický test, diagnostika je zložitá anepresné. Diagnóza sa v súčasnosti opiera o rôzne symptómydefinície prípadov, známe ako kanadské kritériá konsenzu(CCC, 2003) a International Case Criteria (2011), ktorériešiť klinické charakteristiky ME/CFS (2, 5, 6). Theetiológie a špecificképatofyziológia stavu, ktorýpostihuje 17 až 24 miliónov ľudí na celom svete (7), zostávajú neznáme.ME/CFS sa potenciálne vyvíja v dôsledku poškodenia vNeselektívny katión prechodného receptorového potenciálu (TRP).kanály spôsobené buď genetickými alebo získanými faktormi (8–13). Predchádzajúce štúdie naznačili dôležitosť TRP melastatínu 3(TRPM3), široko exprimovaný vápnik (Ca2 plus)-priepustnéneselektívny katiónový kanál v patofyziológii ME/CFS(8–10). Nedávno nezávislé elektrofyziologické výskumypreukázali stratu funkcie iónového kanála TRPM3 postimulácia dvoma silnými TRPM3-agonistami, pregnenolónomsulfátom (PregS) a nifedipínom a inhibíciou selektívnoua silný blokátor, deoxybezoín ononetín, v NK bunkách ztri rôzne kohorty pacientov s ME/CFS (11–13). TRPM3 bol už predtým identifikovanýako chemo- atermosenzitívny nociceptorový kanál v somatosenzorickomsystému a podieľa sa na detekcii škodlivého tepla a zápalutepelnej hyperalgézie, ako aj pri prenose bolesti(14). Nedávna literatúra naznačuje, že signálne dráhyspojené s aktiváciou určitého spojeného G-proteínureceptory (GPCR), nazývané opioidné receptory, môžu inhibovať TRPM3aktivita iónového kanála priamou väzbou Gbgpodjednotkatrimérne G-proteíny do iónového kanála (15–18). Fyziologicky,opioidné receptory sú aktivované endogénnymi opioidnými peptidmi namodulovať mechanizmy bolesti a zápalucesty (19). Opioidné lieky alebo opiáty spôsobujú analgéziu ajnežiaduce vedľajšie účinky napojením na rovnaké GPCR (19). Dôkazy naznačujú, že opioidné receptory nie sú len exprimovanécentrálnym nervovým systémom (CNS), ale sú široko distribuovanéna tkanivách a orgánových systémoch mimo CNS, ako naprimunitné bunky (20). Aktivácia leukocytových opioidných receptorovvedie k sekrécii endogénnych opioidných peptidov, ktorénásledne aktivujú neuronálne opioidné receptory a zmierňujúbolesť (21). Ukázalo sa tiež, že opioidy majú imunosupresívne účinkyúčinky na vrodený a adaptačný imunitný systém (22). JA/Patológiu CFS možno považovať za poruchu iónového kanála respkanálopatia (8–13), ako aj porucha imunitysyndróm a neurologické poruchy (23, 24). Preto je životne dôležitépreskúmať regulačné mechanizmy, ktoré sú základomInterakcia TRPM3-opioidného receptora v NK bunkách z ME/CFSpacientov, aby lepšie porozumeli patogenéze.Objav TRPM3 ako nociceptorového kanálav podstate cielené určitými opioidnými receptormi, ako aj jehoimplikácia v Ca2 plus- závislé imunitné funkcie NK bunieknaznačuje, že iónový kanál TRPM3 môže byť farmakologickyzamerané na liečbu ME/CFS. Naltrexón hydrochlorid (NTX) je ašpecificky dlhotrvajúceho opioidného antagonistuzameraný na mu-opioidreceptor (MOR) a v menšej miere delta-opioidreceptory (dALEBO) (25, 26). Väzba NTX zapnutámOR negujeinhibičná funkcia týchto opioidných receptorov na TRPM3 (15, 17, 18, 26). Už sme o tom informovaliin vitroliečbeNK buniek od pacientov s ME/CFS s NTX počas 24 hodín sa obnovíaktivita iónového kanála TRPM3 (13). Obnova iónu TRPM3aktivita kanála zase obnovila príslušný Ca2 plussignalizácia aako takéNK bunky' aktivačné a efektorové funkcie(13). NTX sa bežne používa pri liečbe opioidov azávislosť od alkoholu v dávke 50-100 mg/deň (25). Pri vysokejdávkovanie, predpokladá sa, že NTX blokuje euforické pocity beta-endorfínovktoré sú zapojené do prirodzených okruhov odmeňovania apreto môže udržať závislosť (27). Nízka dávka (3.0–5.0 mg/deň,zdá sa, že nízka dávka NTX, LDN) má opačný účinok,zvýšenie účinku endorfínov na zníženie bolesti a posilneniepotešenie (28). Tomu sa verímajú význam pri chorobáchako ME/CFS, kde je to nedostatočnésekrécia endogénnychopioidné peptidy ovplyvňujú imunitnú odpoveď alebo kontrolu bolesti (29, 30), alebo uvoľnenie prozápalovýchcytokíny (25, 31). Nedávnaštúdia uviedla, že LDN je bezpečná a účinná na zmiernenie ME/CFSsymptómov retrospektívnym vyšetrením klinického pacientazáznamy 218 pacientov s ME/CFS, ktorým bola podaná LDN (27). Aj keďnové dôkazy naznačujú, že LDN môže zlepšiť každodenné funkcie akvalitu života u pacientov s ME/CFS, ďalejin vitrovyšetrovanie jepotrebné na pochopenie základných regulačných mechanizmovzapojenie TRPM3 a opioidných receptorov v NK bunkách na pomocpochopiť patomechanizmus ME/CFS a identifikovaťterapeutické ciele.Táto štúdia skúmala potenciálny terapeutický účinokLDN u pacientov s ME/CFS obnovením iónového kanála TRPM3fungujú v NK bunkách pomocou celobunkových patch-clamp techník.Naše výsledky naznačujú, že pacienti s ME/CFS užívajúci LDN majúobnovili TRPM3-ako iónové prúdy v NK bunkách. ObnovaFunkcia TRPM3 je potrebná na podporu Ca2 plusprestavba signáluv NK bunkách aako takéAktivácia NK buniek a efektorové funkcie.Toto je prvéštúdiu na uvedenie účinnostiLDN pre ME/CFSpacientovin vitro, teda potvrdzujejeho potenciál využitia ako aliečbu choroby.

Kliknite sem a dozviete sa viac o funkcii proti únave cistanche

MATERIÁLY A METÓDYNábor účastníkov

Deväť pacientov s ME/CFS a deväť zdravých s vekom a pohlavímkontroly (HC) boli prijaté pomocou Národného centra prePacient s neuroimunológiou a vznikajúcimi chorobami (NCNED).databázy medzi septembrom 2019 a februárom 2021.Účastníci boli vo veku od 18 do 60 rokov. Všetky ME/CFSpacienti predtým dostali potvrdenélekárska diagnózaa boli preverené pomocou komplexného online dotazníkav súlade s Centrami pre kontrolu chorôb aPrevencia (CDC), definície prípadov CCC a ICC. Všetci deviati JA/Pacienti s CFS boli definovanízo strany CCC. Všetkých deväť pacientov s ME/CFSboli prijatí do NCNED, keďže predtým začali LDNošetrenie (3.0–5.0 mg/deň) aspoň 4 týždne ako súčasť ichplán manažmentu po predpísaní ich všeobecným lekárom.HC nehlásil žiadny výskyt únavy a bol v dobrom zdravotnom stavebez dôkazu choroby. Účastníci boli z toho vylúčeníštúdia, či boli tehotné alebo dojčiace, alebo hlásili apredchádzajúca anamnéza fajčenia, nadmerného požívania alkoholu alebo chronického ochorenia(napríklad autoimunitné ochorenia, kardiovaskulárne ochorenia,cukrovka, metabolický syndróm, ochorenie štítnej žľazy, zhubné nádory,nespavosť, chronická únava a primárne psychické poruchy)alebo boli obézni (BMIVäčšie alebo rovné30). Žiadni účastníci neuviedli užívanie opioidovalebo akékoľvek iné lieky proti bolesti v predchádzajúcich 3 mesiacoch, ako ajfarmakologické látky, ktoré priamo alebo nepriamo ovplyvňujú TRPM3 alebo Ca2 plussignalizácia. Účastníkom bolo poskytnutémožnosť ukončiť akýkoľvek konfliktlieky minimálne 14dní pred darovaním krvi so súhlasom svojho lekára.Všetci účastníci vyplnili online dotazník, ktorý poskytlisociodemografické pozadie, anamnéza, lieky aanamnéza symptómov u pacientov s ME/CFS (stôl 1). Položka 36-krátky prieskum zdravia (SF-36) a Svetová zdravotnícka organizácia(WHO) Disability Assessment Schedule (DAS) bol zvyknutýurčiť úroveň postihnutia a kvalitu života (Tabuľka 2) (32, 33). Nakoniec boli pacienti ME / CFS požiadaní, aby sami nahlásili závažnosťpríznaky pred a po užití LDN ​​(Tabuľka 3). Totovyšetrovanie schválil GriffithUniverzitný človekEtická komisia pre výskum (GU2019/1005) a Gold CoastEtická komisia pre ľudský výskum Univerzitnej nemocnice(HREC/2019/QGC/56469).

Mononukleárna bunka periférnej krviIzolácia a izolácia prirodzených zabíjačských buniek

Celkovo sa odobralo 85 ml plnej krviskúmavky s kyselinou etyléndiamíntetraoctovou (EDTA).cezvenepunkciakvalifikovanýmflebotoma od každého účastníka medzi 8:30 hoda 10:30 na zberných miestach vrátane Griffithauniverzita,Royal Brisbane a ženy's Nemocnica, Nemocnica Robina, SunshineCoast University Hospital, Calvary John James Hospital,

Royal Melbourne Hospital, Austrália. Rutinná úplná analýza krvibola vykonaná do štyroch hodín od odberu červených krviniekpočet, počet bielych krviniek a počet granulocytov pre každý z nichúčastník v Gold Cost University Hospital alebo Royal MelbourneNemocnica, Austrália.Vzorky boli poskytnuté do laboratória a deidentifikovanépomocou ajedinečný kód nezávislým zberateľom krvi. Periférna krvmononukleárne bunky (PBMC) boli izolované z 80 ml celkrvi centrifugáciou na médiu s hustotným gradientom (FicollPaque Premium; GE Healthcare, Uppsala, Švédsko) ako predtýmpopísané (34, 35). PBMC boli zafarbené trypánovou modrou(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) na stanovenie počtu buniek aživotaschopnosť buniek. PBMC boli upravené na afifikonečnej koncentrácie5x107 buniek/ml na izoláciu NK buniek.NK bunky boli izolované imunomagnetickou selekciou s použitím anEasySep Negative Human NK Cell Isolation Kit (Stem CellTechnologies, Vancouver, BC, Kanada). Purifikácia NK buniek bola stanovená pomocouflflcytometria. NK bunky boli inkubované20 minút pri teplote miestnosti v prítomnosti CD56FITC ({{0}},25µg/5µl) a CD3 PE Cy7 (0,25µg/20µl) monoklonálneprotilátky (BD Bioscience, San Jose, CA, USA) ako predtýmpopísané (10). 7-amino-aktinomycín (7-AAD) (2,5 µl/test) (BDBioscience, San Jose, CA, USA) sa použil na stanovenie buniekživotaschopnosť. Bunky sa premyli a resuspendovali v 200 ulml zfarbiaci pufor (BD Bioscience, New Jersey, USA) a získanýo 10,000 udalostiach pomocou LSRFortessa X-20 (BD Biosciences,San Diego, CA, USA). Pomocou predného a bočného rozptylu sapopulácia lymfocytov bola hradená pri získavaní vzorky.Potom sa identifikovala populácia NK buniekako CD3− CD56plusbunky.

Záznam elektrofyziológie celých buniek

Elektrofyziologické záznamy boli uskutočnené s borosilikátomsklenené kapilárne elektródy s vonkajším priemerom 1,5 mm a anvnútorný priemer 0.86 mm (Harvard Apparatus, Holliston, MA,USA). Odolnosť pipety pri naplnenís pipetovým roztokom bol 8-12 MW. Pipety boli namontované na CV203BU head-stage(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) pripojené k 3-cestehrubý manipulátor a mikromanipulátor (Narishige, Tokio,Japonsko). Elektrické signály boli zosilnenéa zaznamenané pomocou anZosilňovač Axopatch 200Ba softvér PClamp 10.7 (MolecularDevices, Sunnyvale, CA, USA). Údaje boli filtrovanépri 5 kHz avzorkované digitálne pri 10 kHzcezanalógu Digidata 1440Adigitálny prevodník (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Theprotokol napäťovej rampy bol krokom od udržiavacieho potenciálu plus 10mV až−90 mV, po ktorom nasleduje 0,1 s nárast na plus 110 mV, prednávrat k plus 10 mV (opakuje sa každých 10 s). Spojenie kvapalinypotenciál medzi pipetou a roztokmi kúpeľa (−10 mV).opravené. Zložka unikajúceho prúdu nebola odpočítanázaznamenané prúdy. Elektróda bola naplnenás intracelulárnympipetový roztok obsahujúci 30 mM CsCl, 2 mM MgCl2110 mMKyselina L-asparágová, 1 mM EGTA, 10 mM HEPES, 4 mM ATP,0,1 mM GTP, pH upravené na 7,2 pomocou CsOH a osmolalita

290 mOsm/l s D-manitolom. Pipetový roztok sa prefiltroval pomocou 0.22mm membránový filter(Sigma-Aldrich, St. Louise, MO,USA), rozdelené na alikvóty a uložené pri−20 stupňov. Roztok do kúpeľaobsahuje: 130 mM NaCl, 10 mM CsCl, 1 mM MgCl21,5 mMCaCl22H2O, 10 mM HEPES, upravené pH na 7,4 pomocou NaOH aosmolalita 300 mOsm/l s D-glukózou. Všetky činidlá bolizakúpené od Sigma-Aldrich, okrem ATP a GTP, ktoréboli zakúpené od Sapphire Bioscience. TRPM3 iónovýprúdy na NK bunkách boli stimulované pridaním 100mM PregS(Tocris Bioscience, Bristol, UK) do kúpeľového roztoku, zatiaľ čoPregS-indukované TRPM3 prúdy boli blokované pridaním 10mM ononetín (Tocris Bioscience, Bristol, UK). Pre každého účastníka,Bolo urobených 10 rôznych nahrávok. Preto N znamená početúčastníci v každej skupine (pacienti ME/CFS alebo HC) a n, kpočet odčítaní alebo veľkosť vzorky. Všetky merania boliuskutočňované pri izbovej teplote. Autori odstránilimožnosť zapojenia chloridového prúdu do TRPM3hodnotenie pomocou kyseliny L-asparágovej v intracelulárnej pipeteRiešenie. Bunky, ktoré majú nestabilné prúdy, boli tiež vylúčenéz analýzy.Štatistická analýzaBoli identifikované populácie lymfocytovod kolegupomocou cytometriedopredný a bočný rozptyl bodových grafov. Čistota CD3- CD56pluslymfocytov. Cytometrické údaje boli exportované zFacsDiva v8.1 a analyzované pomocou SPSS v24 (IBM Corp, Version24, Armonk, NY, USA) a GraphPad Prism v7 (GraphPadSoftware Inc., verzia 7, La Jolla, CA, USA). Elektrofyziologickéúdaje sa analyzovali pomocou softvéru pCLAMP 10.7 (MolecularDevices, Sunnyvale, CA, USA). Pôvod 2018 (OriginLabCorporation, Northampton, MA, USA) a GraphPad Prismv7 (GraphPad Software Inc., verzia 7, La Jolla, CA, USA).používa sa na štatistickú analýzu a prezentáciu údajov. Vizuálne ana určenie normality boli použité výpočtové metódynezávislé údaje.

Konkrétne grafy histogramu aPoužil sa Shapiro-Wilkov test normality, šikmosť a špičatosťurčiť rozdelenie údajov a normalitu. V závislostina normalitu sa uskutočnilo štatistické porovnanie pomocounezávislý neparametrický Mann-Whitney U test, prípnezávislý parametrický t-test. Použil sa Fishersov presný testurčiť citlivosť NK buniek na ononetín. Význambol nastavenýu p<0.05 and="" the="" data="" are="" presented="" as="" mean="" ±="" sem="" unless="">inak uvedené.VÝSLEDKYCharakteristika účastníka aKrvné parametreZaradených bolo osemnásť účastníkov zhodných veku a pohlaviatoto vyšetrovanie. Demografické údaje pre pacientov súzhrnuté vstôl 1. Nebolo tam žiadne významnérozdiel vvek alebo pohlavie medzi pacientmi s ME/CFS a HC. SF-36 aNa zistenie zdravia účastníkov boli použité prieskumy WHODASsúvisiaca kvalita života (Tabuľka 2) (36, 37). 

Ako sa dalo očakávať, došlo k významnémurozdiel medzi skóre SF-36 a WHODASME/CFS pacienti a HC. Navyše úplný krvný obrazparametre boli merané pre každého zdravého účastníka aME/CFS pacienti (Tabuľka 2). Zatiaľ čo sme informovali o významnom rozdiel eozinofilov medzi zdravými účastníkmi a ME/U pacientov s CFS boli všetky výsledky v rámci špecifikovaných hodnôtodkazrozsahy poskytované Univerzitnou nemocnicou v Gold CoastPatologická jednotka, laboratórium akreditované NATA. Žiadne významné rozdiely boli zaznamenané v iných parametroch. Nakoniec ME/CFSpacienti hlásili zlepšenie poruchy myslenia,koncentrácie a kognitívne preťaženie ako aj iné imunitnépríznaky porúch (bolesť hrdla, zväčšená alebo citlivá lymfa).uzliny a náchylnosť na prechladnutie/chrípku) po liečbe sLDN (Tabuľka 3), ako je opísané vyššie (27, 38). 

Natural Killer Cell Purity

NK bunkačistota (CD3- /CD56plus) bola 92,42 percent ± 1,849 pre HC a82,20 percent ± 9,409 pre pacientov s ME/CFS užívajúcich LDN, ako bolo stanovenépodľaflflovu cytometriu (Obrázok 1A). Nebolo tam žiadne významné rozdiel v čistote NK buniek u pacientov s ME/CFS užívajúcich LDNv porovnaní s HC (Obrázok 1B).

Aktivita iónového kanála TRPM3 poStimulácia pregnenolónu v NK bunkáchOd pacientov ME/CFS užívajúcich LDNV porovnaní s NK bunkami z HC

Aktivita iónového kanála TRPM3 bola zaznamenaná v izolovanom ľudskom NKbunky od pacientov s ME/CFS užívajúcich LDN (3.0–5.0 mg/deň) av porovnaní s izolovanými ľudskými NK bunkami zhodných s vekom a pohlavímHC pomocou techniky celobunkovej náplasti.Funkcia endogénneho iónového kanála TRPM3 bola rýchla areverzibilne aktivovaný aplikáciou 100mSpoločnosť M PregS, aneurónový steroid. Stimulácia s meraním povoleným PregSmalého, smerom von usmerňujúceho prúdu pod napäťovou svorkoupodmienky a pozorovanie typického tvaru prúdového napätia TRPM3vzťah (I–V) (Obrázok 2). My tedanamerali malý iónový prúd s typickým3-TRPMvonkajšia nápravav NK bunkách izolovaných z HC popridanie PregS (Obrázky 2A, B). Zaujímavé je, že PregSaplikácia v NK bunkách od pacientov s ME/CFS užívajúcich LDNnapodobňovalo PregS-indukované zvýšenie NK buniek z HC(Obrázky 2C, D). Stimulácia PregS teda vyvolala zvýšenienavonok opravenýchprúdové amplitúdy v NK bunkách zME/CFS pacienti užívajúci LDN na rovnakej úrovni ako NK bunky zHC (Obrázok 2E). Okrem toho, PregS-evokované prúdy predstavujú atypickýI–V z TRPM3 (Obrázok 2D). Údaje naznačujú, že ME/Pacienti s CFS užívajúci LDN už nie sú postihnutíAktivita kanála TRPM3, ako bolo nahlásené predtým (11–13), apreto môže mať LDN potenciálny terapeutický prínosprepatológiu.

Modulácia PregS-evokovaných prúdovS ononetínom v NK bunkách z ME/CFSPacienti užívajúci LDN v porovnaní s NKBunky z HC

PregS-indukovaný Ca2 plus-príliva iónové prúdy cez TRPM3iónové kanály môžu byť účinne inhibované prírodnou zlúčeninou,deoxybezoín ononetín (39). Preto na potvrdenieže TRPM3aktivita sa podieľa na PregS-evokovaných iónových prúdoch v NK bunkách, weďalšie použité 10mMononetín na moduláciu iónového kanála TRPM3aktivita (Obrázok 3). Ako bolo uvedené vyššie (11–13), iónovýprúdy vyvolané aplikáciou PregS boli efektívneinhibovaná súčasnou aplikáciou žiadnej v izolovanejNK bunky z HC (Obrázky 3A–C). Navyše,I–V zprúdy citlivé na ononetín boli navonok usmernenéa typicképre TRPM3 (Obrázok 3B). Zaujímavé je, že vyvolali iónové prúdyaplikáciou PregS boli tiež účinne inhibovanésúčasná aplikácia 10mM ononetín v izolovanej NKbunky od pacientov s ME/CFS užívajúcich LDN (Obrázky 3D–G). Skutočne, iónový prúd3-závislý od TRPM bol už predtýmhlásené, že sú rezistentné na ononetín v izolovaných NK bunkách zME/CFS pacienti (11–13). Avšak NK bunky z ME/CFSpacienti užívajúci LDN sú citliví na ononetín v rovnakom rozsahuako NK bunky z HC (Obrázok 3G). Navyše,I–V ononetínucitlivé prúdy boli navonok usmernenéa typické pre TRPM3

(Obrázok 3E). nakoniecObrázok 3Hhlási aktuálne TRPM3amplitúdy po stimulácii PregS a modulácii ononetínuv rámci skupín HC a ME/CFS užívajúcich LDN a ibaboli zahrnuté záznamy citlivé na ononetín. Významný pokles amplitúdy prúdu TRPM3 bol hlásený pomoduláciu ononetínom u oboch pacientov užívajúcich ME/CFSskupiny LDN (p=0.0336) a HC (p=0.0205). Tento graf potvrdzujeIónový kanál TRPM3 funguje podobne v ME/CFSpacientov užívajúcich LDN v porovnaní s HC ako rovnaký prúdsú uvedené rozsahy amplitúd (Obrázok 3H). Spoločne tietovýsledky potvrdzujúže ME/CFS pacienti užívajúci LDN nemajú anzhoršená aktivita iónového kanála TRPM3, o ktorej sa uvádza, že jecharakteristika choroby (11–13). Na záver liečbas LDN umožňuje obnoviť funkciu iónového kanála TRPM3 v ME/pacientov s CFS a má preto potenciálny terapeutický účinok.

DISKUSIA

V tejto štúdii sme použili celobunkovú náplasťovú svorkutechnika na meranie endogénneho iónového kanála TRPM3funkcie v NK bunkách od pacientov s ME/CFS užívajúcich LDN. myhlásiť za prvýčas, ktorý majú pacienti s ME/CFS užívajúci LDNobnovili TRPM3-ako iónové prúdy v NK bunkách. Skutočne,aplikácia PregS umožnila meranie malých iónprúdy s typickým TRPM3-ako vonkajšia nápravav NKbuniek od pacientov užívajúcich LDN. Navyše PregS-evokovaný iónovýprúdy cez TRPM3 boli výraznemodulovanýononetín v NK bunkách od pacientov s ME/CFS užívajúcich LDN akopodobne opísané v HC. Tieto výsledky odzrkadľujúnaše predchádzajúce zisteniahlásenie obnovenia funkcie iónového kanála TRPM3v NK bunkách od pacientov s ME/CFS poin vitroliečba sNTX (13). Tieto výsledky sú tiež v súlade s našimi predchádzajúcimivyšetrovania naznačujúce ME/CFS možno považovať za akanálopatia vyvolaná stratou funkcie TRPM3 acharakterizované znížením PregS-indukovaných iónových prúdovako aj rezistenciu na ononetín v NK bunkách z ME/CFSpacienti (8–13). Môže za to strata funkcie TRPM3pre zhoršené Ca2 plussignalizácia a Ca2 plus- sprostredkované bunkové funkcie,vrátane imunitných funkcií NK buniek (11–13). Naša súčasná nová štúdia je prvou in vitroštúdia potvrdzujúca účinnosťa terapeutickým prínosomLDN pre pacientov s ME/CFScharakterizáciou základných regulačných mechanizmov LDNliečba zahŕňajúca TRPM3 a interakciu s opioidným receptoromv NK bunkách. LDN bolo predtým hlásené ako prospešnépreliečba rôznych chorôb, ako je skleróza multiplex,Crohn's chorobou, fibromyalgiou, rakovina, zápalčrevachoroba a ME/CFS (40–44). Konkrétnejšie, vpredbežná štúdia vykonaná Poloom a kol. o bezpečnosti aúčinnosť liečby LDN, 73,9 percenta pacientov s ME/CFShlásili pozitívnu odpoveď na liečbu (27). Väčšina pacientovzažili zlepšenú bdelosť/bdelosť a zlepšenú fyzickú kondíciua kognitívny výkon. Niektorí pacienti hlásili aj menšiu bolesťa horúčka, čo dokazuje, že LDN môže vykazovať určitý potenciálzmierniť široké spektrum symptómov ME/CFS (27). podobne,Bolton a spol. opísali tri kazuistiky zostavené ME/CFSpacienti užívajúci LDN a hlásili rozsah odpovedí,od zmeny života po zmiernenie len niektorých symptómov (38).

Na základe výhodhlásené pacientmi o ich príznakoch,Liečba LDN sa môže použiť ako potenciálna liečba a môžezamerať sa na patomechanizmus ME/CFS.Patogenéza ME/CFS je neznáma, ale abnormálny iónkanály a konkrétnejšiemajú narušenú funkciu TRPM3nedávno sa objavil ako charakteristický znak choroby (8–13). Predtým sme hlásili stratu funkcie TRPM3 pomodulácia pomocou silných TRPM3-agonistov a antagonistov v NKbunky z troch rôznych kohort pacientov s ME/CFS (11–13). TRPM3 bol opísaný ako centrálny aktér Ca2 plus- závislých signálnych dráh, v excitabilných aj neexcitabilnýchbunky, kde Ca2 plussignály riadia rôzne bunkyprocesy (45). Papanikolaou a kol., identifikovanéTRPM3 ako andôležitou súčasťou'Ca2 plusnástrojov' ktorý podporuje prevádzku obchoduCa2 plusvstup a udržateľnosť Ca2 plussignalizácia vGlia bielej hmoty CNS (46). Podobne sa ukázalo, že TRPM3 vediek zvýšeniu Ca2 plus prílivv beta bunkách pankreasu, čo má za následoknásledné uvoľnenie inzulínu (47). Každý typ bunky predstavuje unikátsignalizačný fenotyp schopný dodávať prísne regulovanéčasopriestorový Ca2 plussignály na moduláciu jeho konkrétnej funkcie(48). V dôsledku toho akékoľvek jemné dysregulácie Ca2 plussignály môžumá veľký vplyv na bunkové funkcie a vedie k chorobám (48, 49). NK bunky tiež vyžadujú Ca2 plusza efektívnestimulácia afunkcie vrátane cytotoxicity NK buniek (50–53). KompromitovanýCytotoxická funkcia NK buniek je dobre zdokumentovaná a konzistentnávlastnosť ME/CFS (54). Preto môže dôjsť k strate funkcie TRPM3prispievajú k symptomatológii ME/CFS ovplyvňovanímCa2 plussignalizácia a Ca2 plus-sprostredkované funkcie buniek, vrátane NKimunitné funkcie buniek.V literatúre je dobre charakterizovaná funkcia TRPM3úlohu pri detekcii škodlivého tepla (akútna bolesť), ako aj zápaluhyperalgézia (akútna a chronická bolesť)14). Syntetizujú sa endogénne opioidyin vivomodulovaťfyziologické analgetické reakcie pri zápalochaneuropatickej bolesti. Endogénne a exogénne opioidy sa viažu naOR, nachádzajúce sa na periférii, na presynaptických a postsynaptických miestachmiesta v dorzálnom rohu miechy a v mozgovom kmeni,talamus a kôra, čo predstavuje vzostupnú bolesťprenosový systém (55). Nedávne štúdie o tom informovaliopioidné receptory sú tiež exprimované imunitnými bunkamiopioidná analgézia sprostredkovaná imunitnými bunkami produkciou endogénnychopioidné peptidy, ktoré zahŕňajú Gai/o–Gbg–fosfolipáza C(PLC)–inozitol 1,4,5-trifosfátový receptor (IP3R)– intracelulárneCa2 pluschodník. Uvoľnené opioidné peptidy sa následne aktivujúperiférne neurónové opioidné receptory a zmierňujú bolesť (21). Ukázalo sa tiež, že opioidy priamo modulujú funkcielymfocyty a iné bunky zapojené do obrany hostiteľa aimunita s imunosupresívnymi účinkami (56, 57). Konkrétnejšieaktivácia OR opioidnými alkaloidmi apeptidy, ako je morfín a endogénne peptidy,vrátane beta-endorfínu a dynorfínových peptidov, čo vedie k aznížený počet makrofágov, znížený počet leukocytovproliferáciu a migráciu na zápalovélokalít, znížilfagocytotická aktivita makrofágov, znížená chemotaxia atvorba superoxidu neutrofilmi a makrofágmi,zrýchlená apoptóza makrofágov, oslabená mikrobiologickáochrana a znížená adhézia leukocytov a endotelubunky (58). Ďalšie negatívne vplyvy boli popísané aj vvzťah k mastocytom, dendritickým bunkám a NK bunkám s aznížená cytotoxicita NK buniek a produkcia cytokínov (22, 56, 59, 60). Imunitné bunky, glia a neuróny preto tvoria aintegrovaná sieť, ktorá koordinuje imunitné reakcie amoduluje excitabilitu dráh bolesti (61). Zameranie naopioidné receptory na imunitných bunkách môžu viesť k zmenám vimunitné odpovede na podporu rozlíšenia inflflstrelivo akoako aj modulácia bolesti u pacientov s ME/CFS.Zaujímavé je, že molekuly, ktoré sa viažu na opioid a aktivujú horeceptory výrazneznížiť bolesť závislú od TRPM3-. Inodpoveď na akútnu aktiváciu agonistami, opioidnými receptormipár do Gi/o proteíny, ktoré disociujú na Gai/o a Gbgpodjednotky interagujú s intracelulárnymi efektormi (62). TRPM3aktivita je silne inhibovaná aktiváciou uOR cezpriama interakcia s Gbgako TRPM3-závislý Ca2 plusvstupy sú silne a reverzibilne inhibované, keď bunkamembrána jeflflpremyté očisteným Gbg(15–18). NTX je dlhotrvajúcišpecificky opioidného antagonistubrzdiacimOR, tedanegujúc inhibičnú funkciu tohto opioidného receptoraTRPM3 (22, 26). V našej predchádzajúcej štúdii sme o tom informovaliin vitroliečba NTX obnovuje iónový kanál TRPM3aktivita v NK bunkách izolovaných z ME/CFS (13). Podobne aj vv súčasnej štúdii to urobili NK bunky izolované od pacientov užívajúcich LDNnevykazujú žiadnu zhoršenú aktivitu iónového kanála TRPM3. LDNZdá sa, že liečba u pacientov s ME/CFS obnovuje ión TRPM3funkcia kanála v NK bunkách, čo vedie k Ca2 plussignályprestavba, aby prispela k obnove integritya stabilitu špecifickej pre NK bunkysignalizačné systémy (10–13). Je zaujímavé, že sa uvádza, že antagonistický účinokNTX je zapnutýmOR tiež narúša reguláciu negatívnej spätnej väzby nadALEBO, čím sa zvýšidFunkcia ALEBO.

VylepšeniedALEBOaktivita podporuje cytotoxicitu NK buniek v reakcii na beta-endorfíny in vitrona splenocytoch potkanov, čo naznačuje potenciálpoužitie NTX pri liečbe imunitnej nedostatočnosti (63). Mechanizmus, ktorý je základom LDN's účinnosťouna únavu,Crohn's chorobou, fibromyalgioua teda skleróza multiplex,zahŕňa intermitentnú blokádu opioidných receptorov, po ktorej nasledujeCa2 plus závislá produkciaa upregulácia endogénnychopiáty. Ludwig a kol. oznámili, že sérum [Met5 ]-enkefalínhladiny boli nižšie u ľudí so sklerózou multiplex v porovnaní spacienti bez roztrúsenej sklerózy a LDN obnovili ich hladiny.Podobne u experimentálnych myší s autoimunitnou encefalomyelitídou,[Splnené5 Hladiny ]-enkefalínu boli pred objavením saklinického ochorenia a boli obnovené liečbou LDN(28). Preto sa zdá, že výsledkom liečby LDN je tzvzosilnenie analgetických účinkov a môže byť relevantné priME/CFS, kde je nedostatočnéovplyvňuje sekréciu opioidných peptidovimunitná odpoveď alebo kontrola bolesti (29, 30), alebo uvoľnenie prozápalovýchcytokíny (25, 31). Skutočne, znížené beta-endorfínykoncentrácia bola hlásená v ME/CFSpacientov trpiacich dysreguláciou termoreguláciereakcie a generalizovaná ťažká alebo dlhotrvajúca bolesť (64). Na záver, táto štúdia po prvéčas vyhodnotený a identifikovanývplyv LDN na funkciu iónového kanála TRPM3 vNK bunky u pacientov s ME/CFS. Táto nová štúdia uvádzazákladná obnova TRPM3-kanálu opioidného receptorainterakcie v NK bunkách od pacientov s ME/CFS užívajúcich LDN.Okrem toho široká distribúcia iónových kanálov TRPM3 vtelo naznačuje, že ich narušená funkcia môže prispieť kpríznaky a symptómy ME/CFS, a teda liečba sLDN môže mať terapeutickú úlohu. Nakoniec táto štúdia slúžipodporovať plánovanie a schvaľovanie potenciálnych randomizovanýchklinické štúdie o úlohe a dávke NTX pri liečbe ME/pacientov s CFS.