Predkondicionovaním aktivovaná AKT kontroluje neuronálnu toleranciu voči ischémii prostredníctvom dráhy MDM2–p53Ⅰ

Abstraktné

Jedným z najdôležitejších mechanizmov neuroprotekcie sprostredkovanej predkondicionovaním je zoslabenie bunkovej apoptózy, navodenie tolerancie mozgu po následnej škodlivej ischémii. V tomto kontexte hrá antiapoptotická PI3K/AKT signálna dráha kľúčovú úlohu pri regulácii bunkovej diferenciácie a prežitia.

Kliknite pre cistanche tubulosa prášok preneuroprotekcia

Je známe, že aktívna AKT zvyšuje expresiu myšacej dvojminútovej{0}} (MDM2), E3-ubikvitín ligázy, ktorá destabilizuje p53, čím podporuje prežitie rakovinových buniek. V neurónoch sme nedávno ukázali, že interakcia MDM2 – p53 je zosilnená farmakologickým predkondicionovaním na základe subtoxickej stimulácie NMDA glutamátového receptora, ktorá zabraňuje apoptóze neurónov vyvolanej ischémiou.

Či však tento mechanizmus prispieva k neuronálnej tolerancii počas ischemickej prekondicionácie (IPC), nie je známe. Tu ukazujeme, že IPC indukovala PI3K-sprostredkovanú fosforyláciu AKT na Ser473, ktorá zase fosforylovala MDM2 na Ser166. Táto fosforylácia spustila jadrovú stabilizáciu MDM2, čo viedlo k destabilizácii p53, čím sa zabránilo apoptóze neurónov po ischemickom poškodení. Inhibícia dráhy PI3K/AKT wortmannínom alebo umlčaním AKT vyvolala akumuláciu cytosolického MDM2, čím sa zrušila neuroprotekcia indukovaná IPC.

IPC teda zvyšuje aktiváciu signálnej dráhy PI3K / AKT a podporuje neurónovú toleranciu riadením interakcie MDM2 – p53. Naše zistenia poskytujú novú mechanickú dráhu zapojenú do neuroprotekcie indukovanej IPC prostredníctvom modulácie signalizácie AKT, čo naznačuje, že AKT je potenciálnym terapeutickým cieľom proti ischemickému poškodeniu. Kľúčové slová: AKT; MDM2; p53; PI3K; ischemická tolerancia; predkondicionovanie

1. Úvod

U ľudí bola zistená existencia prechodného ischemického ataku (TIA) ako endogénny predkondicionovaný stav s výhodami funkčných výsledkov u pacientov s cievnou mozgovou príhodou [1–3]. Endogénna neuroprotekcia indukovaná krátkym, subtoxickým ischemickým stimulom, známym ako ischemické prekondicionovanie (IPC), sa považuje za stratégiu vo vznikajúcej oblasti neuroprotekcie proti ischemickému poškodeniu [4–6].

Dôkazy ukazujú, že neuroprotekcia podporovaná IPC závisí od transkripcie, translácie a posttranslačných mechanizmov, ktoré menia funkciu kľúčových proteínov po ischémii [6–11]. Mechanizmus zapojený do IPC-indukovanej ischemickej tolerancie (IT) však nebol v ľudskom mozgu úplne objasnený [12,13].

Vývoj nových experimentálnych prístupov k pochopeniu neuroprotekcie sprostredkovanej IPC predstavuje silný nástroj na dešifrovanie endogénnych mechanizmov, ktoré sú základom mozgovej IT [6], ktoré majú potenciál odhaliť nové terapeutické ciele zamerané na minimalizáciu poškodenia mozgu u pacientov s mozgovou príhodou. V posledných dvoch desaťročiach sa apoptotická bunková smrť neurónov stala základným mechanizmom zapojeným do cerebrálneho ischemického poškodenia [14–16]. V tomto zmysle sa proteínkináza B alebo AKT, serín/treonínkináza, ktorá vyžaduje aktiváciu funkčnej fosfoinozitidkinázy (PI3K), považovala za základný cieľ neuroprotektívnych terapií po ischémii [17,18].

Nedávno sme preukázali, že inhibícia signálnej dráhy PI3K/AKT zvyšuje citlivosť neurónov na excitotoxicitu [19]. AKT sa podieľa na komplexnej antiapoptickej signalizačnej sieti [20], ktorej zložky môžu byť prítomné na rôznych subcelulárnych miestach v závislosti od typu tkaniva [21,22]. V srdci sa AKT podieľa na kardioprotekcii podporovanej predkondicionovaním [23].

Dôkazy tiež ukazujú, že fosforylovaný AKT podporuje prežitie neurónov na začiatku cerebrálnej ischémie [24]. Hoci aktivácia AKT môže prispievať k indukcii IT v mozgu [25], presný mechanizmus zahŕňajúci jej IPC-sprostredkovanú aktiváciu zostáva nepolapiteľný. V nádorových bunkách vedie aktivácia signálnej dráhy PI3K/AKT k fosforylácii MDM2 na Ser166/186, čo podporuje jadrovú translokáciu MDM2 [26,27] a zvyšuje jeho ubikvitinačnú aktivitu [28].

V jadre sa MDM2 viaže na p53 a podporuje jeho ubikvitináciu a následnú proteazomálnu degradáciu, ktorá inhibuje funkciu p53 [29]. V stresových podmienkach by p53 mohol tiež spustiť nadmernú expresiu MDM2, ktorá naopak potláča aktiváciu p53 v negatívnej spätnej väzbe [30]. Inhibícia PI3K zabraňuje aktivácii AKT [31] a fosforylácii MDM2 v predkondicionovanom srdci [32].

V tejto súvislosti sme predtým zistili, že predkondicionovanie mozgu in vivo znížilo objem infarktu po prechodnej oklúzii strednej cerebrálnej artérie (tMCAO) zvýšením expresie proteínu MDM2. V dôsledku toho komplex MDM2–p53 zoslabil ischémiou indukovanú aktiváciu signálnej dráhy p53/PUMA/kaspáza-3 v primárnych kortikálnych neurónoch [33].

Tu sa zaoberáme úlohou signálnej dráhy PI3K / AKT v neuronálnej tolerancii sprostredkovanej IPC proti následnému ischemickému poškodeniu, ako aj základným mechanizmom, a zameriavame sa hlavne na potenciálne spojenie medzi aktiváciou AKT a komplexom MDM2 – p53. .

2. Výsledky

2.1. Neuroprotekcia podporovaná IPC

je sprostredkovaná fosforyláciou AKT na Ser473, fosforyláciou MDM2 na Ser166 a destabilizáciou p53 Už sme opísali vplyv interakcie MDM2 – p53 na neuronálnu náchylnosť k ischémii [34] a IT [33]. Tu sme skúmali potenciálnu úlohu AKT na neuroprotekciu sprostredkovanú IPC ako kandidáta na zapojenie do dráhy MDM2 – p53.

Najprv sme potvrdili, že ischémia podporovala aktiváciu AKT v neurónoch, čo dokazuje fosforylácia AKT na Ser473. Ako je znázornené na obrázku 1A, krátky (20 minút) OGD významne indukoval expresiu p(Ser473)AKT a MDM2, zatiaľ čo hladiny proteínu AKT zostali nezmenené (obrázok S1A). Fosforylácia AKT sa však nepozorovala, keď boli neuróny vystavené predĺženému OGD (90 minút). Okrem toho boli hladiny proteínu MDM2 nižšie, čo je v súlade s vyššou expresiou proteínu p53, ako je znázornené na obrázku 1A.

Časovo závislá upregulácia expresie Mdm2 po OGD (obrázok 1B) potvrdzuje, že subakútna ischémia môže byť dôležitá na vyvolanie mechanizmov, ktoré zabraňujú stabilizácii p53 po OGD, ako už bolo opísané [33]. Ako model IPC sme použili krátky OGD (20 minút), po ktorom nasledovali 2 hodiny reoxygenácie (obrázok S1B) [33]; preto sme analyzovali neurónové extrakty zozbierané po 4 hodinách reoxygenácie po OGD (OGD / R) alebo po OGD, ktorému predchádzal protokol IPC (IPC plus OGD / R). Paralelne sa neuróny inkubovali v normoxii (Nx) alebo predkondicionovaní (IPC) (obrázok S1B).

Ako je znázornené na obrázku 1C a obrázku S1C, IPC indukoval skorú aktiváciu AKT, ako sa ukázalo fosforyláciou na Ser473 [35], po ktorej nasledovala stabilizácia proteínu MDM2 a fosforylácia na Ser166. IPC tiež zabránila stabilizácii p53 indukovanej OGD/R (obrázok 1C). Je zaujímavé, že imunofluorescenčné obrázky zobrazené na obrázku 1D odhalili, že IPC podporoval AKT fosforyláciu na Ser473 v neurónoch, ktoré sa prevažne akumulovali v jadre, a znížil stabilizáciu p53 po OGD/R (IPC plus OGD/R) v porovnaní s neurónmi bez predkondicionovania (OGD /R).

V dôsledku toho IPC zabránil neuronálnej apoptóze a aktivácii kaspázy{0}} spôsobenej OGD/R, ako sa meralo prietokovou cytometriou (obrázok S1D) a fluorimetrickými testami (obrázok S1E). Na potvrdenie úlohy p53 v neuroprotekcii sprostredkovanej IPC sme použili neuróny exprimujúce (divoký typ; wt) alebo nie (knockout; ko) proteín p53. Naše výsledky ukazujú, že neuróny bez p53 (obrázok S1F) boli odolnejšie voči apoptóze indukovanej OGD ako neuróny p53 wt.

Okrem toho hladiny apoptózy v neurónoch p53KO boli podobné hladinám pozorovaným v predkondicionovaných (IPC plus OGD/R) wt neurónoch (obrázok S1G), čím sa potvrdila kľúčová úloha destabilizácie p53 v neuroprotekcii sprostredkovanej IPC [33]. Naše výsledky ukazujú, že IPC indukovala neuroprotekciu proti ischemickému poškodeniu prostredníctvom mechanizmu, ktorý zahŕňa fosforyláciu AKT na Ser473, stabilizáciu MDM2 a fosforyláciu na Ser166 a destabilizáciu p53.

2.2. IPC spúšťa fosforyláciu MDM2 na Ser166 prostredníctvom dráhy PI3K/AKT

Signálna dráha PI3K/AKT sa podieľa na neurónovej IT in vitro [36] aj in vivo [37]. Úloha IPC sprostredkovanej aktivácie PI3K / AKT dráhy pri regulácii komplexu MDM2 – p53 však zostáva nepreskúmaná. Aby sa to objasnilo, neuróny boli inkubované s ireverzibilným a špecifickým inhibítorom dráhy PI3K/AKT, wortmannínom [19].

Ako je znázornené na obrázku 2A, wortmannín zrušil fosforyláciu (Ser473)AKT zosilnenú IPC a destabilizáciu p53, ako je znázornené na obrázku 1D. Tieto výsledky naznačujú priamu súvislosť medzi aktiváciou AKT a inhibíciou neuronálnej apoptózy sprostredkovanej p53- (obrázok S1D) a aktiváciou kaspázy -3 (obrázok S1E) indukovanej po OGD/R. Hlavný regulátor stabilizácie p53, MDM2, je cieľom AKT [26], ktorý fosforyluje MDM2 na Ser166 a Ser186 [26]. Inhibícia PI3K wortmanínom zabránila fosforylácii (Ser473)AKT aj (Ser166)MDM2 indukovanej IPC (obrázok 2B).

Špecifická Akt-sprostredkovaná fosforylácia MDM2 na Ser166 indukovaná IPC bola potvrdená použitím malej interferujúcej RNA (siRNA) špecificky navrhnutej proti proteínu AKT1 (siAkt), vysoko exprimovanej v kortikálnych neurónoch a ktorej aktivita je nevyhnutná pre prežitie neurónov po ischémii [ 38]. Ako je znázornené na obrázku 3, siAkt znížil celkové hladiny AKT a p(Ser473)AKT proteínu na 3. deň po transfekcii, a to ako v HEK-293T bunkách (obrázok 3A), tak v kortikálnych neurónoch (obrázok 3B).

Okrem toho knockdown AKT (siAkt) zabránil fosforylácii (Ser166) MDM2 (obrázok 3B). Tieto výsledky ukazujú, že signálna dráha PI3K/AKT aktivovaná IPC podporuje fosforyláciu MDM2 na Ser166, ktorá môže byť zodpovedná za stabilizáciu MDM2 a následnú destabilizáciu p53 po ischemickom poškodení.

2.3. IPC-aktivovaný AKT spúšťa jadrovú stabilizáciu proteínu MDM2 po ischémii

Aktivácia AKT sa podieľa na jadrovej translokácii MDM2 v nádorových bunkách [26]. Vzhľadom na význam jadrovej stabilizácie MDM2 pre prežitie neurónov po ischémii [34] a konkrétnejšie jeho neuroprotektívnu úlohu v IPC [33] sme sa rozhodli ďalej skúmať význam signálnej dráhy PI3K/AKT v regulácii subcelulárnej lokalizácie MDM2 proteín.

Neuróny alebo HEK-293T bunky boli teda transfekované ľudským MDM2-značeným proteínom (MDM2-GFP). Reprezentatívne bloty transfekovaných HEK-293T buniek a obrázky z neurónov ektopicky exprimujúcich ľudský proteín MDM2 po štyroch rôznych experimentálnych podmienkach (Nx, IPC, OGD/R a IPC plus OGD/R) sú znázornené na obrázku 4A a obrázku S1H , resp.

Ektopická expresia MDM2- GFP potvrdila, že IPC podporuje jadrovú akumuláciu MDM2 v porovnaní s nepredkondicionovanými ischemickými (OGD/R) alebo normoxickými (Nx) neurónmi (obrázok 4A, B), ako sa ukázalo pri kvantifikácii pomeru jadrovej/cytosolickej fluorescencie (obrázok S2B) a intenzita jadrovej fluorescencie MDM2-GFP (obrázok S2C).

2.4. IPC podporuje interakciu p(Ser473)AKT a MDM2, čo zvyšuje stabilizáciu MDM2 v jadre a znižuje indukovanú neuronálnu apoptózu pri ischémii

Po demonštrácii úlohy IPC zosilnenej aktivácie PI3K/AKT dráhy pri jadrovej stabilizácii MDM2 sme ďalej skúmali, či p(Ser473)AKT a MDM2 interagovali v jadre (obrázok 6A). Imunoprecipitácia MDM2 z extraktov jadrového proteínu, po ktorej nasledovalo imunoblotovanie proti MDM2 a p(Ser473)AKT, odhalilo, že IPC podporovalo interakciu medzi p(Ser473)AKT a MDM2 po OGD/R, čím sa zabránilo stabilizácii jadrového p53 indukovanej OGD/R, ako je znázornené na vstupe jadra (obrázok 6A).

Nakoniec sme študovali škodlivý účinok narušenia dráhy PI3K / AKT na apoptózu neurónov (obrázok 6B). Inhibícia AKT pôsobila proti ochrannému účinku IPC pred OGD, čo potvrdzuje neuroprotektívnu úlohu AKT–MDM2 v kontexte IT. Naše výsledky teda ukazujú, že IPC indukuje fosforyláciu a aktiváciu AKT, ktorá podporuje fosforyláciu MDM2 na Ser166 a jadrovú translokáciu, kde interaguje s p (Ser473) AKT. Tento mechanizmus môže prispieť k zvýšenej jadrovej stabilizácii MDM2, ktorá hrá zásadnú úlohu v IPC-indukovanej ischemickej tolerancii.

Ako Cistanche chráni neuróny?

Existujú určité dôkazy, ktoré naznačujú, že Cistanche môže chrániť neuróny znížením apoptózy (programovaná bunková smrť) a podporou prežitia neurónov. Apoptóza je prirodzený proces, ktorý sa vyskytuje v tele na odstránenie poškodených alebo nežiaducich buniek, ale môže byť škodlivý, ak k nemu dochádza nadmerne alebo neprimerane. V laboratórnych štúdiách sa zistilo, že Cistanche inhibuje apoptózu a tento účinok môže pomôcť chrániť neuróny pred poškodením.

Okrem toho obsahuje Cistanche množstvo bioaktívnych zlúčenín, u ktorých sa preukázalo, že majú neuroprotektívne účinky. Obsahuje napríklad echinakozid, ktorý preukázateľne chráni neuróny pred oxidačným stresom a zápalom. Obsahuje tiež akteozid, o ktorom sa zistilo, že má protizápalové a antioxidačné vlastnosti.

Pokračovanie nabudúce...

Emilia Barrio 1,†, Rebeca Vecino 1,2,†, Irene Sánchez-Morán 1 , Cristina Rodríguez 1,2,3, Alberto Suárez-Pindado 1, Juan P. Bolaños 1,2,3,4, Angeles Almeida 1, 2,3 a Maria Delgado-Esteban 1,2,3,*

1 Inštitút funkčnej biológie a genomiky, Univerzita v Salamance, CSIC, 37007 Salamanca, Španielsko; emibg7@gmail.com (EB); rebecavecino@usal.es (RV); irene_sm@usal.es (IS-M.); c.rodriguez@usal.es (CR); Alsuap77@gmail.com (AS-P.); jbolanos@usal.es (JPB); aaparra@usal.es (AA)

2 Inštitút biomedicínskeho výskumu v Salamance, Univerzitná nemocnica v Salamance, Univerzita v Salamance, CSIC, 37007 Salamanca, Španielsko

3 Katedra biochémie a molekulárnej biológie, Univerzita v Salamance, 37007 Salamanca, Španielsko 4 Centro de Investigación Biomédica en Red de Fragilidad y Envejecimiento Saludable (CIBERFES), Instituto de Salud Carlos III, 28029 Madrid, Španielsko * Korešpondencia: mdesteban@usal.es ; Tel.: plus 34-923-29-4908