Predkondicionovaním aktivovaná AKT kontroluje neuronálnu toleranciu voči ischémii prostredníctvom dráhy MDM2–p53Ⅱ

3. Diskusia

Naše výsledky ukazujú, že aktivácia signálnej dráhy PI3K / AKT sprostredkovaná IPC spúšťa neurónovú IT kontrolou komplexu MDM2 – p53 v primárnych kortikálnych neurónoch. Najprv sme potvrdili účinnosť predkondicionovania z hľadiska neuroprotekcie [33,39–41] pomocou validovaného experimentálneho modelu IPC.

Kliknutím zobrazíte vedľajšie účinky cistanche tubulosa pre Neuron

Zistili sme, že experimentálne IPC vyvolané krátkou (20 minútovou) depriváciou kyslíka a glukózy (OGD), po ktorej nasledovala 2 hodinová reoxygenácia, viedlo k neuroprotekcii, čo dokazuje prevencia neuronálnej apoptózy a aktivácie kaspázy-3 vyvolanej predĺženým OGD (90 minút) a potom 4 hodiny reoxygenácie (OGD/R). Ukazujeme, že IPC znižuje aktiváciu kaspázy-3 v kortikálnych neurónoch, čo koreluje s menšou apoptózou po následnom a závažnejšom ischemickom poškodení.

Rovnováha medzi pro- a antiapoptotickými signálmi je základom pre zabezpečenie prežitia neurónov po ischémii [3,33,38,42–44]. Hoci sa relevantnosť takýchto udalostí preukázala v modeloch hemoragickej aj ischemickej cievnej mozgovej príhody in vivo [43,45], mechanizmy, ktoré regulujú tieto signálne dráhy, nie sú v kontexte ischemickej tolerancie ešte úplne pochopené. Úloha antiapoptotického AKT a jeho príbuzných dráh bola rozsiahle študovaná v rakovinových bunkách [46,47] a mozgovom tkanive [38,48]; zatiaľ však zostáva úloha signálnej dráhy AKT/MDM2 – p53 v neurónovej tolerancii voči ischemickému poškodeniu sprostredkovaná IPC nepolapiteľná.

Tu sme zistili, že aktivácia signálnej dráhy PI3K/AKT spôsobená IPC podporuje fosforyláciu MDM2 na Ser166, čo spúšťa jeho jadrovú translokáciu a stabilizáciu proteínu, čím bráni p53-indukovanej apoptóze prostredníctvom aktivácie kaspázy-3 po ischémii. Aktivácia AKT prostredníctvom fosforylácie podporuje prežitie neurónov [24,49] a môže prispieť k indukcii IT [25,50]. Naše výsledky ukazujú, že relatívna hojnosť proteínu AKT sa pri ischemických alebo predkondicionačných stimuloch nemení. Je zaujímavé, že sme zistili, že skorá PI3K-sprostredkovaná fosforylácia AKT na Ser473 zabraňuje ischémiou indukovanej stabilizácii p53 v predkondicionovaných neurónoch.

Účinok nebol spôsobený modifikáciami hladín p53 mRNA [33,34,44], ale zníženými hladinami proteínu p53 v dôsledku IPC pred OGD/R. Keďže MDM2 je hlavným regulátorom stabilizácie p53 a je tiež priamym cieľom AKT, naše výsledky poukazujú na úlohu signálnej dráhy AKT/MDM2–p53 v neuronálnej tolerancii voči ischémii. MDM2 mRNA sa po OGD rýchlo zvyšuje [34], ale aktivita MDM2 je kontrolovaná hlavne posttranslačnými modifikáciami, najmä fosforyláciou [51]. V dobrej zhode s tým sme zistili, že po aktivácii fosforyláciou po IPC AKT zase fosforyluje MDM2 na zvyšku Ser166, ktorý sa nachádza v blízkosti jadrového lokalizačného signálu [52], a tento účinok sa zachováva aj po poškodení OGD/R.

Naše výsledky ukazujú, že fosforylácia MDM2 na Ser166 je dostatočná na uplatnenie neuroprotektívneho účinku sprostredkovaného IPC prostredníctvom destabilizácie p53. Tu sme teda identifikovali časovo závislú aktiváciu dráhy AKT / MDM2 – p53 po ischemickom poškodení a skutočne sme preukázali, že AKT aktivovaný IPC spustil jadrovú translokáciu ektopického MDM2, ako aj stabilizáciu endogénneho proteínu.

Okrem toho AKT zostáva aktívny v jadre, kde PI3K môže tiež migrovať v reakcii na oxidačný stres a potom zodpovedať za fosforyláciu AKT [53]. Inhibícia fosforylácie AKT alebo knockdown AKT sprostredkovaná PI3K podporuje zadržiavanie proteínu MDM2 v cytoplazme a zabraňuje fosforylácii Ser166 MDM2, ako aj neuroprotekcii sprostredkovanej IPC proti apoptóze neurónov vyvolanej ischémiou. Naopak, ukázali sme, že aktívny AKT sa viaže na jadrový proteín MDM2.

V dôsledku toho aktívna AKT podporuje fosforylácie MDM2 a jeho jadrovú stabilizáciu, čo prispieva k neuroprotekcii sprostredkovanej IPC. Naše výsledky ukazujú, že neuroprotekcia podporovaná IPC bola závislá od aktivácie AKT sprostredkovanej PI3K, ktorá fosforylovala MDM2 na Ser166, čím podporovala akumuláciu jadra MDM2 po ischemickom urážke.

V súlade s tým inhibícia PI3K/AKT wortmannínom alebo deplécia AKT pomocou siRNA zrušila neuroprotekciu podporovanú IPC, čo viedlo k stabilizácii p53 a následnej apoptóze neurónov po ischémii. Naše výsledky teda pomáhajú objasniť zásadnú úlohu IPC-dependentnej aktivácie dráhy AKT-MDM2 pri prežití neurónov proti ischemickému poškodeniu.

Proteín p53 sa podieľa na kontrole neuronálnej smrti/prežitia určujúcej prognózu u pacientov s cievnou mozgovou príhodou [34,42,54], ako aj u pacientov s TIA [3]. Stabilizácia P53 ohrozuje neuroprotekciu sprostredkovanú predkondicionovaním pred ischemickým/reperfúznym poškodením [33]. Interakcia MDM2 – p53 bude preto v tomto kontexte kritická pre prežitie neurónov [34] a pre toleranciu voči ischemickému poškodeniu sprostredkovanú IPC [33].

Thus, the control of such interaction will also have an impact on stroke outcomes. In this context, we recently found that a single-nucleotide polymorphism (SNP) 309T>G v promótore MDM2 určuje expresiu MDM2 a následne moduluje zotavenie pacientov trpiacich mozgovou príhodou [34].

Okrem toho sme pozorovali, že gén SNP Tp53 (rs1042522) moduluje mitochondriálnu stabilizáciu p53 a neuronálnu toleranciu voči ischémii, pričom predpovedá funkčné zotavenie pacientov, ktorí trpia TIA pred mozgovou príhodou [3]. Preto bude kontrola apoptotických dráh p53 nevyhnutná na zabezpečenie neuroprotektívneho účinku IPC.

Tieto výsledky poskytujú translačný prístup k štúdii, ktorý by sa mohol v budúcnosti implementovať v prospech pacientov, a predstavujú signálnu dráhu PI3K/AKT–MDM2–p53 ako zásadný cieľ pre IT stratégie podporované predkondicionovaním pri ischemickej cievnej mozgovej príhode. V súhrne demonštrujeme, že signálna dráha PI3K / AKT zosilnená IPC podporuje fosforyláciu MDM2 na Ser166, čo vedie k jadrovej translokácii MDM2 a jej stabilizácii, čo spúšťa neurónovú IT podporou destabilizácie p53 a následnou inaktiváciou apoptotickej smrti indukovanej po ischemickom urážke.

Naše výsledky zdôrazňujú potenciálne výhody včasnej aktivácie AKT v neuronálnej tolerancii sprostredkovanej IPC, ktorá reguluje apoptotickú dráhu MDM2 – p53 pri ischemickom poškodení. Tieto zistenia poukazujú na príležitosť pochopiť mechanizmy, ktoré regulujú neurónovú signálnu dráhu AKT–MDM2–p53, aby sa vyvinuli nové neuroprotektívne stratégie pre poruchy súvisiace s IT.

4. Materiály a metódy

4.1. Primárne kultúry kortikálnych neurónov

Neurónové kultúry boli pripravené z C57Bl/6J alebo p53-null (Tp53-/-, B6.129S2, The Jackson Laboratory) myšacích embryí (14,5E) kortexov. Neuróny boli naočkované pri 1,8 × 105 buniek/cm2 v Neurobazálnom médiu doplnenom 2 percentami B27 a 2 mM glutamínom (Invitrogen, Madrid, Španielsko) a inkubované pri 37 °C vo zvlhčenej atmosfére obsahujúcej 5 percent CO{18} [ 55].

4.2. Modely nedostatku kyslíka a predkondicionovania glukózy

Po 9–1{{10}} dňoch in vitro (DIV) boli neuróny vystavené nedostatku kyslíka a glukózy (OGD) inkubáciou buniek pri teplote 37 ◦C počas 90 minút v inkubátore vybavené vzduchovou komorou a nepretržite doplnené plynom 95 percent N2/5 percent CO2. Inkubačné médium (tlmený Hanksov roztok bez glukózy: 5,26 mM KCl, 0,43 mM KH2P04, 132,4 mM NaCI, 4,09 mM NaHC03, 0,33 mM Na2HP04, 2 mM CaCl2 a NEPES7, pH 20,5 % predtým bolo pH 20 mM percent). /5 percent CO2 počas 30 min. Za týchto podmienok boli koncentrácie kyslíka v inkubačnom médiu 6,7 ± 0,5 µM, merané pomocou kyslíkovej elektródy Clarkovho typu [56,57].

Keď je to indikované, neuróny boli vystavené ischemickej prekondicionácii (IPC; krátky OGD počas 20 minút, po ktorých nasledovali 2 hodiny reoxygenácie) pred následnou predĺženou ischémiou (OGD, 90 minút) a 4 hodinami reoxygenácie (IPC plus OGD/R) (obrázok S1B ). Paralelne boli neuróny inkubované v normoxii (Nx) pri 37 ◦C vo zvlhčenej atmosfére 95 percent vzduchu/5 percent CO2 alebo ischemickej predkondicionácii (IPC). Ak je to indikované, neuróny sa inkubovali 30 minút pred IPC v pufrovanom Hanksovom roztoku (pH 7,4), v neprítomnosti alebo prítomnosti wortmannínu (100 nmol/l), ako bolo opísané vyššie [19].

4.3. Bunkové transfekcie

Neuróny (8 DIV) alebo HEK-293T bunky boli transfekované plazmidovým vektorom exprimujúcim YFP-značený Mdm2 z MDM2 ľudského promótora. MDM2p/Mdm2-YFP bol dar od Uriho Alona a Galita Lahava (Addgene plazmid # 53962, Watertown, MA, USA) [58]. V prípade potreby sa ako kontrola za rovnakých podmienok použil prázdny vektor (pYFP). Transfekcia plazmidu sa uskutočnila s použitím Lipofectamine® LTX (Invitrogen, Carlsbad, MA, USA) podľa pokynov výrobcu. Bunky boli transfekované 1,5 ug/ul plazmidových vektorov a použité po 24 hodinách.

Knockdown AKT v 6 neurónoch DIV sa dosiahol transfekciou s malými interferujúcimi dvojvláknovými ribonukleotidmi (siRNA). Cielené sekvencie boli nasledovné: 50–CUCAAGUACUCAUUCCAGAtt–30, antisense: 5 0–UCUGGAAUGAGUACUUGAGgg–30 (myš, s62216, zodpovedajúce nukleotidom 1006–1025, prírastkové číslo GenBank NM_009652) [59]. Ako negatívnu kontrolu sme použili Silencer™ Select Negative Control No. 1 siRNA (siControl). Všetky siRNA boli zakúpené od Ambion®, Invitrogen® a Thermo Fischer Scientific (Offenbach, Nemecko). Podľa stupňa knockdown proteínu sa účinnosť transfekcie siRNA odhadla na 70–80 percent 3 dni po transfekcii. Pre experimenty s umlčaním boli neuróny transfekované siRNA (10 nM) s použitím Lipofectamine® RNAiMAX (Invitrogen), podľa pokynov výrobcu. Neuróny sa ďalej inkubovali v Neurobazálnom médiu počas 72 hodín pred ich použitím.

4.4. Prietoková cytometrická detekcia apoptotickej bunkovej smrti

Neuróny boli opatrne oddelené od platní s použitím 1 mM tetrasodnej soli EDTA v PBS (pH 7,4) a boli zafarbené anexínom V/APC a 7-AAD, uskutočnené presne tak, ako bolo opísané vyššie [55].

4.5. Test aktivity Caspase{2}}

Aktivita kaspázy{0}} sa hodnotila v bunkových lyzátoch [33] a podľa pokynov výrobcu s použitím súpravy Fluorimetric Assay kit CASP3F od SIGMA a odčítala sa pri emisii pri vlnovej dĺžke 405 nm. Metóda je založená na uvoľňovaní fluorescenčnej skupiny 7-amino4-metylkumarínu (AMC). Koncentrácia AMC sa vypočíta pomocou štandardu AMC.

4.6. Imunobloty a ko-imunoprecipitačný test

Neuróny boli lyzované v pufri obsahujúcom 1 percento SDS, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 12,5 mM Na2HP04 a 1 percento Triton X-100 (NP40: 1 percento NP40, EDTA diK plus 5 mM, Tris pH{{13 }} mM, NaCl 135 mM a 10 percent glycerolu) doplnený o inhibítory fosfatázy (1 mM Na3V04 a 50 mM NaF) a inhibítory proteázy (100 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 50 ug/ml antipapain, 50 ug pestatg/50 ug/pstatín ug/ml amastatínu, 50 ug/ml leupeptínu, 50 ug/ml bestatinu a 50 ug/ml sójového inhibítora trypsínu), uskladnené na ľade počas 30 minút a varené počas 5 minút. Alikvóty lyzovaných extraktov boli podrobené SDS polyakrylamidovému gélu (MiniProtean®, Bio-Rad) a blotované protilátkami cez noc pri 4 °C. Použité protilátky boli anti-AKT (9272), anti-p(Ser473)AKT (9271), anti-štiepená kaspáza-3 (Asp175, 9661) (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), anti-p53 ( 554157, BD Biosciences), anti-MDM2 (2A10, ab-16895), anti (Ser166)MDM2 (ab131355), anti-GFP (ab290; deteguje aj YFP) (Abcam, Cambridge, UK), anti-LAMIN B (sc{55}}, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Nemecko) a antiGAPDH (Ambion, Cambridge, Spojené kráľovstvo) cez noc pri 4 ◦C. Po inkubácii s kozím anti-králičím IgG konjugovaným s chrenovou peroxidázou (Pierce, Thermo Scientific) alebo kozím anti-myším IgG (Bio-Rad) sa membrány ihneď inkubovali so zvýšenou chemiluminiscenciou SuperSignal West Dura (Pierce) počas 5 minút pred vystavením Kodak XAR-5 film na 1 až 5 minút a autorádiogramy sa naskenovali. Intenzity pásov boli kvantifikované pomocou softvéru ImageJ 1,48v, ako bolo opísané vyššie [60].

Pre koimunoprecipitačný test sa neuróny lýzovali v ľadovo studenom pufri obsahujúcom 50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCI, 2 mM EDTA, 1 percento NP -40) ​​doplnenom o inhibítory fosfatázy opísané vyššie. Po odstránení zvyškov centrifugáciou sa neurónové lyzáty (100 mg) inkubovali s 1 mg protilátky počas 24 hodín pri 4 °C, po čom nasledovalo pridanie 10 ml proteín A-agarózy (GE Healthcare Life Sciences) počas 2 hodín pri 4 °C. ◦C. Imunoprecipitáty sa dôkladne premyli lyzačným pufrom a rozdelili pomocou SDS-PAGE a imunoblotovali s uvedenými protilátkami [61]. Relatívne zastúpenie proteínov je znázornené na obrázku S1. Úplné bloty a gélové skeny sú zahrnuté na obrázku S3.

4.7. Imunocytochémia a analýza obrazu

Neuróny boli pestované na sklenených krycích sklíčkach a fixované 4 percentami (w/v, v PBS) paraformaldehydom počas 30 minút a imunofarbené králičou anti-fosfoAKT (Ser473; 9271; Cell Signaling, MA, USA), myšou anti-MDM2 (2A10, ab-16895), myšacia anti-MAP2 (1:500; M#1406, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) [55], myšacia anti-p53 (1:200; 554157, BD Pharmingen , San Diego, CA, USA) a anti-GFP (1:1000; ab290; tiež validované na detekciu YFP). Imunoznačenie sa detegovalo pomocou sekundárnych protilátok proti králičím IgG–Cy3 alebo anti-myším IgG–Cy2 (1:500; Jackson ImmunoResearch. Cambridge, UK).

Jadrá boli zafarbené 40,6-diamidino-2fenylindolom (DAPI; D9542, Sigma-Aldrich). Krycie sklíčka sa umyli, umiestnili do činidla proti vyblednutiu svetla SlowFade (Invitrogen) na podložné sklíčka a skúmali pomocou mikroskopu (obrátený mikroskop Nikon Eclipse Ti-E, (NY, USA) vybaveného 40× objektívom, vopred vycentrovaným iluminátorom z vlákien Nikon Intensilight C-HGFI a čiernobiely digitálny fotoaparát Hamamatsu ORCAER alebo skenovací laserový konfokálny mikroskop ("Spinning Disk" Roper Scientific Olympus IX81, Tokio, Japonsko) s tromi lasermi 405, 491 a 561 nm, vybavená 40×, 63× a 100× PL Apo olejovým imerzným objektívom pre zobrazovanie s vysokým rozlíšením a prístrojovým digitálnym fotoaparátom Evolve Photometrics.

Všetky nastavenia mikroskopu boli nastavené tak, aby zbierali fluorescenčné obrázky pod saturáciou a udržiavali sa konštantné pre všetky obrázky urobené v experimente. Obrázky sa analyzovali pomocou softvéru ImageJ 1.48v (National Institutes of Health). Percento neurónov p(Ser473)AKT plus a p53 plus a kvantifikácia maximálnej intenzity proteínovej fluorescencie p(Ser473)AKT a p53 sú znázornené na obrázku S2A. V neurónoch transfekovaných MDM2-GFP sa nukleocytoplazmatická distribúcia MDM2-GFP vypočítala ako pomer priemernej jadrovej fluorescencie k strednej cytoplazmatickej fluorescencii endogénneho MDM2, merané v 24 neurónoch (šesť neurónov na stav v štyroch rôznych neurónových kultúrach) (obrázok S2B) [62].

Na kvantifikáciu maximálnej intenzity jadrovej fluorescencie endogénneho farbenia MDM2 a pSer473AKT sa zmeralo 40 neurónov (10 neurónov na stav v štyroch rôznych kultúrach) (obrázok S2C), ako už bolo opísané [44]. V reprezentatívnych profiloch prierezovej intenzity znázornených na obrázku 5B sa percento p(Ser473)AKT a MDM2 uvedené pod každou podmienkou kvantifikovalo ako priemerná jadrová fluorescencia. Vo všetkých prípadoch boli jadrá identifikované farbením DAPI. Maximálna intenzita jadrovej MDM2 fluorescencie v neurónoch ošetrených wortmannínom alebo siAkt je znázornená na obrázku S2D.

4.8. Štatistická analýza

Experimentálne výsledky boli vyhodnotené jednosmernou analýzou rozptylu, po ktorej nasledoval Bonferroniho post hoc test, ktorý sa použil na porovnanie hodnôt medzi viacerými skupinami. Výsledky sú vyjadrené ako priemer ± SEM. Na porovnanie dvoch skupín hodnôt bol použitý Studentov t-test. Vo všetkých prípadoch sa p < 0.05 považovalo za významné (* p < 0,05 oproti Nx; # p<0.05 versus OGD). Statistical analyses were performed using SPSS Statistics 24.0 for Macintosh (IBM).

Ako Cistanche chráni neuróny?

Existujú určité dôkazy, ktoré naznačujú, že Cistanche môže chrániť neuróny znížením apoptózy (programovaná bunková smrť) a podporou prežitia neurónov. Apoptóza je prirodzený proces, ktorý sa vyskytuje v tele na odstránenie poškodených alebo nežiaducich buniek, ale môže byť škodlivý, ak k nemu dochádza nadmerne alebo neprimerane. V laboratórnych štúdiách sa zistilo, že Cistanche inhibuje apoptózu a tento účinok môže pomôcť chrániť neuróny pred poškodením.

Okrem toho Cistanche obsahuje niekoľko bioaktívnych zlúčenín, u ktorých sa preukázalo, že majú neuroprotektívne účinky. Obsahuje napríklad echinakozid, ktorý preukázateľne chráni neuróny pred oxidačným stresom a zápalom. Obsahuje tiež akteozid, o ktorom sa zistilo, že má protizápalové a antioxidačné vlastnosti.

Referencie

1. Emberson, J.; Lees, KR; Lyden, P.; Blackwell, L.; Albers, G.; Bluhmki, E.; Brott, T.; Cohen, G.; Davis, S.; Donnan, G.; a kol. Účinok oneskorenia liečby, veku a závažnosti cievnej mozgovej príhody na účinky intravenóznej trombolýzy s alteplázou pri akútnej ischemickej cievnej mozgovej príhode: Metaanalýza údajov o jednotlivých pacientoch z randomizovaných štúdií. Lancet 2014, 384, 1929–1935. [CrossRef]

2. Wang, W.-W.; Chen, D.-Z.; Zhao, M.; Yang, X.-F.; Gong, D.-R. Predchádzajúce prechodné ischemické ataky môžu mať neuroprotektívny účinok u pacientov s ischemickou mozgovou príhodou. Arch. Med. Sci. 2017, 5, 1057–1061. [CrossRef] [PubMed]

3. Ramos-Araque, ME; Rodriguez, C.; Vecino, R.; Garcia, EC; Alfonso, MDL; Barba, MS; Colàs-Campàs, L.; Purroy, F.; Arenillas, JF; Almeida, A.; a kol. Neuronálna ischemická tolerancia je podmienená polymorfizmom Tp53 Arg72Pro. Prekl. Stroke Res. 2019, 10, 204–215. [CrossRef] [PubMed]

4. Iadecola, C.; Anrather, J. Výskum mozgovej príhody na križovatke: Pýtanie sa mozgu na smer. Nat. Neurosci. 2011, 14, 1363–1368. [CrossRef] [PubMed]

5. Zhao, C.; Jiang, M.; Zhang, L.; Hu, Y.; Hu, Z.; Zhang, M.; Qi, J.; Su, A.; Lou, N.; Xian, X.; a kol. Receptor gama aktivovaný peroxizómovým proliferátorom sa podieľa na získaní ischemickej tolerancie mozgu indukovanej ischemickým predkondicionovaním prostredníctvom gliálneho glutamátového transportéra 1 in vivo a in vitro. J. Neurochem. 2019, 151, 608–625. [CrossRef]

6. Rodriguez, C.; Agulla, J.; Delgado-Esteban, M. Refocusing the Brain: New Approaches in Neuroprotection against Ischemic Injury. Neurochem. Res. 2021, 46, 51–63. [CrossRef] [PubMed] 7. Stenzel-Poore, MP; Stevens, SL; Xiong, Z.; Lessov, NS; Harrington, AC; Mori, M.; Meller, R.; Rosenzweig, HL; Tobar, E.; Shaw, ET; a kol. Účinok ischemického predkondicionovania na genómovú odpoveď na cerebrálnu ischémiu: Podobnosť s neuroprotektívnymi stratégiami v hibernácii a stavoch tolerantných voči hypoxii. Lancet 2003, 362, 1028–1037. [CrossRef]

8. Gidday, JM Predkondicionovanie mozgu a ischemická tolerancia. Nat. Neurosci. 2006, 7, 437-448. [CrossRef] [PubMed]

9. Stetler, RA; Leak, R.; Gan, Y.; Li, P.; Zhang, F.; Hu, X.; Jing, Z.; Chen, J.; Zigmond, MJ; Gao, Y. Preconditioning poskytuje neuroprotekciu v modeloch ochorenia CNS: Paradigmy a klinický význam. Prog. Neurobiol. 2014, 114, 58–83. [CrossRef] [PubMed]

10. Koch, S.; Della Morte, D.; Dave, KR; Sacco, RL; Perez-Pinzon, AM Biomarkery pre ischemickú predkondicionáciu: Hľadanie respondentov. Br. J. Pharmacol. 2014, 34, 933–941. [CrossRef]

11. La Russa, D.; Frisina, M.; Secondo, A.; Bagetta, G.; Amantea, D. Modulácia regulačného faktora vstupu vápnika do mozgu (SARAF) a periférneho orai1 po fokálnej cerebrálnej ischémii a predkondicionovaní u myší. Neuroveda 2020, 441, 8–21. [CrossRef]

12. Sisalli, MJ; Annunziato, L.; Scorziello, A. Nové bunkové mechanizmy pre neuroprotekciu v ischemickej prekondicionácii: Pohľad z vnútra organel. Predné. Neurol. 2015, 6, 115. [CrossRef]

13. Durukan, A.; Tatlisumak, T. Ischemická tolerancia vyvolaná predkondicionovaním: Okno do endogénneho prevodu na cerebroprotekciu. Exp. Prekl. Stroke Med. 2010, 2, 2. [CrossRef]

14. Broughton, BR; Reutens, D.; Sobey, CG; Sims, K.; Politei, J.; Banikazemi, M.; Lee, P. Apoptotické mechanizmy po cerebrálnej ischémii. Mŕtvica 2009, 40, 788–794. [CrossRef]

15. Zhao, H.; Sapolsky, RM; Steinberg, GK Fosfoinozitid-3-Signálové dráhy prežitia kinázy/Akt sa podieľajú na prežití neurónov po mŕtvici. Mol. Neurobiol. 2006, 34, 249–270. [CrossRef]

16. Udensky, AB Regulácia apoptózy v penumbre po ischemickej cievnej mozgovej príhode: Expresia pro- a antiapoptotických proteínov. Apoptóza 2019, 24, 687–702. [CrossRef] [PubMed]

17. Fukunaga, K.; Kawano, T. Akt je molekulárny cieľ pre terapiu prenosom signálu pri ischemickom poranení mozgu. J. Pharmacol. Sci. 2003, 92, 317-327. [CrossRef] [PubMed]

18. Zhao, EY; Efendizade, A.; Cai, L.; Ding, Y. Úloha Akt (proteínkináza B) a proteínkináza C pri ischemicko-reperfúznom poškodení. Neurol. Res. 2016, 38, 301–308. [CrossRef] [PubMed]

19. Delgado-Esteban, M.; Martín-Zanca, D.; Andres-Martin, L.; Almeida, A.; Bolanos, JP Inhibícia PTEN peroxynitritom aktivuje fosfoinozitid-3-kinázovú/Akt neuroprotektívnu signálnu dráhu. J. Neurochem. 2007, 102, 194–205. [CrossRef]

20. Manning, BD; Toker, A. Signalizácia AKT/PKB: Navigácia v sieti. Cela 2017, 169, 381–405. [CrossRef] [PubMed]

21. Diez, H.; Garrido, JJ; Wandosell, F. Špecifické úlohy Akt iso foriem v apoptóze a regulácii rastu axónov v neurónoch. PLoS ONE 2012, 7, e32715. [CrossRef]

22. Santi, SA; Lee, H. Izoformy Akt sú prítomné na odlišných subcelulárnych miestach. Am. J. Physiol. Physiol. 2010, 298, C580 – C591. [CrossRef]

23. Yang, C.; Talukder, MH; Varadharaj, S.; Velayutham, M.; Zweier, JL Skoré ischemické predkondicionovanie vyžaduje aktiváciu eNOS sprostredkovanú Akt a PKA prostredníctvom fosforylácie serínu1176. Cardiovasc. Res. 2012, 97, 33–43. [CrossRef] [PubMed]

24. Ouyang, Y.-B.; Tan, Y.; Comb, M.; Liu, C.-L.; Martone, ME; Siesjö, BK; Hu, B.-R. Udalosti podporujúce prežitie a smrť po prechodnej cerebrálnej ischémii: Fosforylácia Akt, uvoľňovanie cytochrómu C a aktivácia kaspázových proteáz. Br. J. Pharmacol. 1999, 19, 1126–1135. [CrossRef] [PubMed]

25. Li, S.; Hafeez, A.; Noorulla, F.; Geng, X.; Shao, G.; Ren, C.; Lu, G.; Zhao, H.; Ding, Y.; Ji, X. Preconditioning v neuroprotekcii: Od hypoxie k ischémii. Prog. Neurobiol. 2017, 157, 79–91. [CrossRef] [PubMed]

26. Mayo, LD; Donner, DB Dráha fosfatidylinozitol 3-kinázy/Akt podporuje translokáciu Mdm2 z cytoplazmy do jadra. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 2001, 98, 11598–11603. [CrossRef]

27. Ashcroft, M.; Ludwig, RL; Woods, DB; Copeland, TD; Weber, HO; Macrae, EJ; Vousden, KH Fosforylácia HDM2 pomocou Akt. Oncogene 2002, 21, 1955–1962. [CrossRef]

28. Zhou, BP; Liao, J.; Xia, W. HER-2/neu indukuje ubikvitináciu p53 prostredníctvom fosforylácie MDM2 sprostredkovanej Akt. Nat. Cell Biol. 2001, 3, 973-982. [CrossRef]

29. Grossman, SR; Perez, M.; Kung, AL; Jozef, M.; Mansur, C.; Xiao, Z.-X.; Kumar, S.; Howley, P.; Livingston, DM p300/MDM2 komplexy Zúčastňujú sa MDM2-sprostredkovanej degradácie p53. Mol. Cell 1998, 2, 405-415. [CrossRef]

30. Tóth, A.; Nickson, P.; Qin, LL; Erhardt, P. Diferenciálna regulácia prežitia a hypertrofie kardiomyocytov pomocou MDM2, E3 ubikvitín ligázy. J. Biol. Chem. 2006, 281, 3679–3689. [CrossRef]

31. Hausenloy, DJ; Tsang, A.; Mocanu, MM; Yellon, DM Ischemické predkondicionovanie chráni aktiváciou prosurvival kináz pri reperfúzii. Am. J. Physiol. Circ. Physiol. 2005, 288, H971-H976. [CrossRef] [PubMed]

32. Mocanu, MM; Yellon, DM p53 down-regulácia: Nový molekulárny mechanizmus zapojený do ischemického predkondicionovania. FEBS Lett. 2003, 555, 302-306. [CrossRef]

33. Vecino, R.; Burguete, MC; Jover-Mengual, T.; Agulla, J.; Bobo-Jiménez, V.; Salom, JB; Almeida, A.; Delgado-Esteban, M. Dráha MDM2-p53 sa podieľa na neurónovej tolerancii voči ischémii vyvolanej predkondicionovaním. Sci. Rep. 2018, 8, 1610. [CrossRef] [PubMed]

34. Rodriguez, C.; Ramos-Araque, M.E.; Domínguez-Martínez, M.; Sobrino, T.; Sánchez-Morán, I.; Agulla, J.; Delgado-Esteban, M.; Gómez-Sánchez, J.C.; Bolaños, J.P.; Castillo, J.; et al. Single-Nucleotide Polymorphism 309T>G v promóte MDM2 určuje funkčný výsledok po mŕtvici. Mŕtvica 2018, 49, 2437–2444. [CrossRef]

35. Feng, J.; Park, J.; Cron, P.; Hess, D.; Hemmings, BA Identifikácia PKB/Akt hydrofóbneho motívu Ser-473 kinázy ako DNA-dependentnej proteínkinázy. J. Biol. Chem. 2004, 279, 41189-41196. [CrossRef]

36. Lai, TW; Zhang, S.; Wang, YT Excitotoxicita a mŕtvica: Identifikácia nových cieľov neuroprotekcie. Prog. Neurobiol. 2014, 115, 157–188. [CrossRef] [PubMed]

37. Constantino, LC; Binder, LB; Vandresen-Filho, S.; Viola, GG; Ľudka, FK; Lopes, MW; Leal, RB; Tasca, CI Úloha fosfatidylinozitol{2}} kinázovej dráhy v predkondicionovaní NMDA: Rôzne mechanizmy pre záchvaty a neuronálnu degeneráciu hipokampu indukovanú kyselinou chinolínovou. Neurotox. Res. 2018, 34, 452–462. [CrossRef]

38. Xie, R.; Cheng, M.; Li, M.; Xiong, X.; Daadi, M.; Sapolsky, RM; Zhao, H. Akt Izoformy rozdielne chránia pred mŕtvicou indukovaným neuronálnym poranením reguláciou aktivít mTOR. Br. J. Pharmacol. 2013, 33, 1875–1885. [CrossRef]

39. Soriano, FX; Papadia, S.; Hofmann, F.; Hardingham, NR; Bading, H.; Hardingham, GE Predprípravné dávky NMDA podporujú neuroprotekciu zvýšením dráždivosti neurónov. J. Neurosci. 2006, 26, 4509-4518. [CrossRef]

40. Grabb, MC; Choi, DW Ischemická tolerancia v myšacej kortikálnej bunkovej kultúre: kritická úloha pre NMDA receptory. J. Neurosci. 1999, 19, 1657–1662. [CrossRef]

41. Chen, M.; Lu, T.-J.; Chen, X.-J.; Zhou, Y.; Chen, Q.; Feng, X.-Y.; Xu, L.; Duan, W.-H.; Xiong, Z.-Q. Diferenciálne úlohy podtypov NMDA receptorov pri smrti ischemickej neurónovej bunky a ischemickej tolerancii. Mŕtvica 2008, 39, 3042–3048. [CrossRef]

42. Gomez-Sanchez, JC; Esteban, MD; Rodriguez-Hernandez, I.; Sobrino, T.; De La Ossa, NP; Reverte, S.; Bolaños, JP; GonzalezSarmiento, R.; Castillo, J.; Almeida, A. Ľudský polymorfizmus Tp53 Arg72Pro vysvetľuje rôzne funkčné prognózy pri mŕtvici. J. Exp. Med. 2011, 208, 429–437. [CrossRef]

43. Xu, W.; Gao, L.; Li, T.; Zheng, J.; Shao, A.; Zhang, J. Neurotrofický faktor odvodený od mesencefalických astrocytov (MANF) chráni pred neuronálnou apoptózou prostredníctvom aktivácie Akt/MDM2/p53 signálnej dráhy v potkanom modeli intracerebrálneho krvácania. Predné. Mol. Neurosci. 2018, 11, 176. [CrossRef] [PubMed]

44. Sánchez-Morán, I.; Rodríguez, C.; Lapresa, R.; Agulla, J.; Sobrino, T.; Castillo, J.; Bolaños, JP; Almeida, A. Nuclear WRAP53 podporuje prežitie neurónov a funkčné zotavenie po mŕtvici. Sci. Adv. 2020, 6, eabc5702. [CrossRef]

45. Burmistrová, O.; Olias-Arjona, A.; Lapresa, R.; Jimenez-Blasco, D.; Eremeeva, T.; Shishov, D.; Romanov, S.; Zakurdaeva, K.; Almeida, A.; Fedichev, PO; a kol. Zacielenie na PFKFB3 zmierňuje cerebrálne ischemicko-reperfúzne poškodenie u myší. Sci. Rep. 2019, 9, 1–13. [CrossRef]

46. ​​Tu, Y.; Kim, E.; Gao, Y.; Rankin, GO; Li, B.; Chen, YC Theaflavin-3, 30 -galát indukuje apoptózu a zastavenie bunkového cyklu G2 prostredníctvom dráhy Akt/MDM2/p53 v bunkách rakoviny vaječníkov A2780/CP70 rezistentných na cisplatinu. Int. J. Oncol. 2016, 48, 2657–2665. [CrossRef] [PubMed]

47. Wan, W.; Hou, Y.; Wang, K.; Cheng, Y.; Pu, X.; Áno, X. Dlhá nekódujúca RNA LINC01125 indukovaná LXR-623- potláča proliferáciu buniek rakoviny prsníka prostredníctvom signálnej dráhy PTEN/AKT/p53. Cell Death Dis. 2019, 10, 248. [CrossRef] [PubMed]

48. Tao, J.; Cui, Y.; Duan, Y.; Zhang, N.; Wang, C.; Zhang, F. Puerarin zmierňuje lokomotorické a kognitívne deficity, ako aj poškodenie hipokampálnych neurónov prostredníctvom signálnej dráhy PI3K/Akt1/GSK-3 v in vivo modeli cerebrálnej ischémie. Oncotarget 2017, 8, 106283–106295. [CrossRef] [PubMed]

49. Janelidze, S.; Hu, B.-R.; Siesjö, P.; Siesjö, BK Zmeny Akt1 (PKB) a p70S6K pri prechodnej fokálnej ischémii. Neurobiol. Dis. 2001, 8, 147-154. [CrossRef] [PubMed]

50. Pignataro, G.; Boscia, F.; Esposito, E.; Sirabella, R.; Cuomo, O.; Vinciguerra, A.; Di Renzo, G.; Annunziato, L. NCX1 a NCX3: Dva nové efektory oneskoreného predkondicionovania pri ischémii mozgu. Neurobiol. Dis. 2012, 45, 616–623. [CrossRef]

51. Li, J.; Kurokawa, M. Regulácia stability MDM2 po poškodení DNA. J. Cell. Physiol. 2015, 230, 2318–2327. [CrossRef]

52. Olson, DC; Marechal, V.; Momand, J.; Chen, J.; Romocki, C.; Levine, AJ Identifikácia a charakterizácia viacerých proteínov mdm-2 a proteínových komplexov mdm-2-p53. Oncogene 1993, 8, 2353-2360. [PubMed]

53. Uranga, RM; Katz, S.; Salvador, GA Zosilnená fosfatidylinozitol 3-kináza (PI3K)/Akt signalizácia má pleiotropné ciele v hipokampálnych neurónoch vystavených oxidačnému stresu vyvolanému železom. J. Biol. Chem. 2013, 288, 19773–19784. [CrossRef] [PubMed]

54. Almeida, A.; Sánchez-Morán, I.; Rodríguez, C. Mitochondriálne-nukleárne obchodovanie s p53 riadi neuronálnu náchylnosť pri mŕtvici. IUBMB Life 2021, 73, 582–591. [CrossRef] [PubMed]

55. Delgado-Esteban, M.; Garcia-Higuera, I.; Maestre, C.; Moreno, S.; Almeida, A. APC/C-Cdh1 koordinuje neurogenézu a kortikálnu veľkosť počas vývoja. Nat. komun. 2013, 4, 2879. [CrossRef] [PubMed]

56. Constantino, LC Úloha NMDA receptorov pri rozvoji mozgovej rezistencie prostredníctvom pre- a postkondicionovania. Aging Dis. 2014, 5, 430–441. [CrossRef]

57. Almeida, A.; Esteban, MD; Bolaños, JP; Medina, JM Deprivácia kyslíka a glukózy indukuje mitochondriálnu dysfunkciu a oxidačný stres v neurónoch, ale nie v astrocytoch v primárnej kultúre. J. Neurochem. 2002, 81, 207-217. [CrossRef]

58. Lahav, G.; Rosenfeld, N.; Sigal, A.; Geva-Zatorsky, N.; Levine, AJ; Elowitz, MB; Alon, U. Dynamika spätnoväzbovej slučky p53-Mdm2 v jednotlivých bunkách. Nat. Genet. 2004, 36, 147–150. [CrossRef]

59. Li, J.; Karaplis, AC; Huang, DC; Siegel, PM; Camirand, A.; Yang, XF; Muller, WJ; Kremer, R. PTHrP riadi iniciáciu, progresiu a metastázy nádoru prsníka u myší a je potenciálnym terapeutickým cieľom. J. Clin. Vyšetrovať. 2011, 121, 4655–4669. [CrossRef]

60. Maestre, C.; Esteban, MD; Gomez-Sanchez, JC; Bolaños, JP; Almeida, A. Cdk5 fosforyluje Cdh1 a moduluje stabilitu cyklínu B1 v excitotoxicite. EMBO J. 2008, 27, 2736–2745. [CrossRef]

61. De Tudela, MV-P.; Esteban, MD; Maestre, C.; Bobo-Jiménez, V.; Jiménez-Blasco, D.; Vecino, R.; Bolaños, JP; Almeida, A. Regulácia interakcie Bcl-xL-ATP syntázy mitochondriálnou cyklínou B1-kinázou závislou od cyklínu-1 určuje prežitie neurónov. J. Neurosci. 2015, 35, 9287–9301. [CrossRef] [PubMed]

62. Bobo-Jiménez, V.; Esteban, MD; Angibaud, J.; Sánchez-Morán, I.; de la Fuente, A.; Yajeya, J.; Nägerl, UV; Castillo, J.; Bolaños, JP; Almeida, A. APC/CCdh1-Cesta Rock2 riadi dendritickú integritu a pamäť. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 2017, 114, 4513–4518. [CrossRef] [PubMed]