Micelárna formulácia kvercetínu zabraňuje nefrotoxicite cisplatiny

pre viac informácií:{0}}

Alfredo G. Casanova, Marta Prieto, Clara I. Colino a kol.

Antioxidačný flavonoidkvercetínukázalo sa, že zabraňujenefrotoxicitana zvieracích modeloch a v klinickej štúdii a je teda veľmi sľubným profylaktickým kandidátom vo vývoji.kvercetínrozpustnosť je veľmi nízka, čo znemožňuje klinickú aplikáciu. Cieľom tejto práce bolo študovať na potkanoch biologickú dostupnosť a nefroprotektívnu účinnosť micelárnej formulácie Pluronic F127-zapuzdrenejkvercetín(P-kvercetín), so zlepšenou rozpustnosťou vo vode. Intraperitoneálne podanie P-kvercetínvedie k zvýšeniu plazmatickej koncentrácie a biologickej dostupnostikvercetínv porovnaní s ekvimolárnym podávaním naturkvercetín. Navyše, P-kvercetínzachováva celkové nefroprotektívne vlastnosti a dokonca mierne zlepšuje niektoré parametre funkcie obličiek v porovnaní s prirodzenýmkvercetín. Konkrétne P-kvercetínznížil prírastok plazmatického kreatinínu (z 3,4±{2}},5 na 1,2±0,3 mg/dl) a močoviny (z490,9±43,8 na 184,1±) 50,1 mg/dl)a pokles klírensu kreatinínu (z {{20}},08±0,02 na 0,58±0,19 ml/min) vyvolaný nefrotoxickým chemoterapeutikom cisplatinou, a zlepšilo to histologické dôkazy tubulárneho poškodenia. Táto nová formulácia so zlepšenými kinetickými a biofarmaceutickými vlastnosťami umožní ďalšie skúmaniekvercetínako kandidátne nefroprotektívum v nižších dávkach a spôsobmi podávania orientovanými na jeho klinické použitie.

Kľúčové slová:cisplatina;nefrotoxicita; flavonoid;kvercetín; nefroprotekcia; biologická dostupnosť;obličkymicely; rozpustnosť; formulácia

Prevencianefrotoxicita

Kliknite na Cistanche para que sirve pre ochorenie obličiek

1. Úvod

Drugnefrotoxicitaje vážnym medicínskym a ekonomickým problémom [1,2], pričom 25 percent zo 100 najpoužívanejších liekov na jednotkách intenzívnej starostlivosti je nefrotoxických [3] anefrotoxicitaje tiež dôležitou príčinou poklesu kandidátov počas procesu objavovania lieku 4]. Cisplatina je protinádorová látka na báze platiny, ktorá sa často používa pri liečbe rôznych solídnych malígnych novotvarov [5,6]. Takmer 30 percent pacientov vykazuje dôkazynefrotoxicitapočas prvých desiatich dní po podaní cisplatiny, čo predstavuje dôležité obmedzenie jej dávkovania a terapeutickej účinnosti [5-8]. Akútna cisplatinanefrotoxicitaspôsobuje tubulopatiu odvodenú od 5-násobnej akumulácie v epitelových bunkách proximálneho tubulu, vzhľadom na jeho plazmatickú koncentráciu [9-1l], a v menšej miere v distálnom tubule [12,13 ].

Cisplatinová tubulopatia má elektrolytické poruchy (hlavne hypomagneziémiu a hypokaliémiu) aakútnaobličkyzranenie(AKI). AKI je bežný syndróm charakterizovaný náhlym poklesom rýchlosti glomerulárnej filtrácie (GFR), ťažkou azotémiou a často oligúriou alebo anúriou [7,14]. Okrem toho endoteliálna dysfunkcia, ktorá zvyšuje renálnu vaskulárnu rezistenciu a zhoršuje autoreguláciu, tiež prispieva k AKI indukovanej cisplatinou [9]. AKI je zvyčajne reverzibilný stav, ktorý má napriek tomu relevantný vplyv na výsledky pacientov, vrátane zvýšenej nemocničnej úmrtnosti (viac ako 50 percent prípadov medzi vážne chorými), predĺženej hospitalizácie, dodatočných nákladov na zdravotnú starostlivosť a stredne veľkých a dlhodobé scenáre, zvýšené riziko rozvojachronické ochorenie obličieka všeobecnej a kardiovaskulárnej morbimortality [7,14]. Na subcelulárnej a molekulárnej úrovni je tubulárna cytotoxicita cisplatiny poháňaná mitochondriálnym poškodením, ktoré obmedzuje dýchanie, produkuje oxidačný stres a indukuje apoptotickú a nekrotickú bunkovú smrť a škodlivú zápalovú odpoveď [13,15,16]. Oxidačný stres je uznávaný ako centrálny mechanizmus cytotoxicity cisplatiny anefrotoxicita[12,13,15-17], vznikajúce zvýšenou produkciou reaktívnych foriem kyslíka a oslabenou endogénnou antioxidačnou enzýmovou bariérou [5,7,18].

Účinné profylaktické opatrenia pre cisplatinunefrotoxicitapredstavujú nesplnenú klinickú potrebu zlepšiť svoj farmakotoxikologický profil a maximalizovať jeho užitočnosť. Existujúce preventívne stratégie vrátane intenzívnej hydratácie preukázali len obmedzenú ochranu [6,19]. Vyvíjajú sa nové stratégie založené na súbežnom podávaní nefroprotektív. Kandidátske nefroprotektíva zahŕňajú horčíkové formulácie |6,9 a predovšetkým rôzne antioxidanty [6,20,21]. Flavonoidy sú skupinou nefroprotektívnych polyfenolových produktov získaných zo zeleniny, ovocia, orechov a vína so silnými antioxidačnými vlastnosťami [22].kvercetínje charakteristický flavonoid, ktorý má mnoho priaznivých účinkov [23,24], vrátane zachytávania reaktívnych foriem kyslíka, potlačenia aktivácie krvných doštičiek, endoteliálnej ochrany, modulácie zápalu, inhibície apoptózy, supresie nádoru a nefroprotekcie. Spoločné podávaniekvercetínspolu s terapiou cisplatinou na zvieracom modeli nádoru poskytuje nefroprotekciu bez interferencie s protinádorovým účinkom |25,26]. V skutočnosti bola identifikovaná aktualizovaná metaanalýzakvercetínako veľmi perspektívneho kandidáta ako neuroprotektora pre ďalší klinický vývoj [21]. Nedávna klinická štúdia konzistentne uvádza ochranný účinokkvercetínna kontrastom indukovanú nefropatiu (CIN) [27].

Silné obmedzenie potenciálnej aplikáciekvercetín(spoločný pre flavonoidy vo všeobecnosti) je jeho nízka rozpustnosť vo vode vyplývajúca z jeho chemickej štruktúry a častí, ktoré znižujú jeho absorpciu v tenkom čreve, a tým aj jeho biologickú dostupnosť a účinnosť [23,24, 28]. Zaujímavé je, že lipofóbna glukózakvercetínkonjugáty (glukozidy) sú podstatne biologicky dostupnejšie ako lipofilné aglykóny, pretože lipofilné aglykóny sú menej rozpustné v lúmene čreva [24]. V skutočnosti,kvercetínglukozidy z cibule vykazujú najvyššiu mieru absorpcie a zvyšujú obsah tuku v stravekvercetínabsorpcia aglykónu v tenkom čreve [29]. Veľmi nízka rozpustnosť vo vodekvercetínnielenže bráni jeho klinickému použitiu pri praktickom podávaní (tj orálne, intravaskulárne), ale tiež obmedzuje predklinický výskum. Napriek tomu na zvieracích modeloch možno na účely preukázania koncepcie použiť alternatívne cesty (tj intraperitoneálne) s liekovými suspenziami [25,26].

kvercetínboli vyvinuté formulácie s novými nosnými materiálmi so zlepšenou rozpustnosťou vo vode, ktorých biomedicínske vlastnosti je potrebné otestovať. Poloxaméry Pluronic sú triedou nosných materiálov, ktoré sú hostiteľmi a zvyšujú absorpciu vo vode nerozpustných zlúčenín vďaka ich schopnosti vytvárať micely vo vodnom prostredí [30]. Tu sme predpokladali, že micelárna formuláciakvercetínzapuzdrené s Pluronic F127 opísaným vyššie [31, by si zachovali nefroprotektívne vlastnosti prirodzenéhokvercetínpričom ponúka zlepšené biofarmaceutické vlastnosti na manipuláciu, formuláciu a podávanie.

Zabrániťnefrotoxicita:kvercetín

2. Výsledky

Uskutočnila sa štúdia biologickej dostupnosti a nefroprotekcie s novým micelárnym prípravkomkvercetínzapuzdrený s Pluronic F127[31 a našou tradičnou prírodnou formulácioukvercetín|25,26|(pozri nižšie Materiály a metódy). Zatiaľ čo táto bola suspenzia obsahujúca tenzoaktívnu látku, prvá bola fyziologickým roztokom bez ďalších prísad. Naše tradičné prírodné zloženiekvercetínbol vhodný len na experimentálne účely, vyzrážal sa, keď zostal nehybný, a ťažšie sa s ním manipulovalo a vstrekovalo sa. Na rozdiel od toho sa micelárna formulácia správala ako roztok a nevykazovala žiadne ťažkosti pri používaní.

2.1.Štúdia biologickej dostupnosti

Ako metóda na porovnávaciu biologickú dostupnosť, vývojkvercetín(Q) plazmatická koncentrácia bola študovaná po jednom intraperitoneálnom boluse prirodzeného a P-kvercetín(PQ). Obrázok 1 ukazuje priemerkvercetínkrivky plazmatickej hladiny získané po podaní dávkykvercetínalebo P-kvercetín. Maximálne koncentrácie liečiva (Cmax) pozorované v skupinách Q a PQ boli 1,14 ± 1,28 ug/ml a 8,90 ± 4,62 ug/ml, v tomto poradí, tj 7.8-násobný prírastok pre P-kvercetínčo naznačuje, že micelárna formulácia zvýšila absorpciu liečiva.

Obrázok 1. Vývoj plazmatickej koncentrácie kvercetínu po intraperitoneálnom podaní jedného bolusu ekvimolárneho P-kvercetínu a prirodzeného kvercetínu.

Hodnoty sú vyjadrené ako priemer ± štandardná chyba priemeru (SEM) (n=5 na skupinu). *p<0.05;><0.01;><0.001 vs.qgroup.="">kvercetín(50mg/kg,ip.);PQ:100mg/kgi.pP-kvercetín(obsahuje 50 mg/kgkvercetín).

Tabuľka 1. Farmakokinetické parametre po intraperitoneálnom podaní P-kvercetínu a prirodzeného kvercetínu (n=5 na skupinu).

Otázka: kvercetín(50 mg/kg, ip; PQ: P-kvercetín(100 mg/kg,ip).AUCo24: plocha pod parciálnou krivkou; AUCo: plocha pod celkovou krivkou; MRT: stredný čas zotrvania; t1/2: polčas eliminácie; X: sklon koncovej fázy.

Tabuľka 1 ukazuje farmakokinetické parametre nezávislé od modelukvercetínu potkanov po podaní jednej bolusovej dávky naturalkvercetínalebo P-kvercetín. Čas do Cmax sa zvýšil z 15 minút (pre prirodzenékvercetín) až 1 h (pre P kvercetín). Toto oneskorenie možno pripísať postupnému uvoľňovaniukvercetínz micelárnej formulácie. Celková expozícia potkanov flavonoidom bola významne vyššia pre P-kvercetínčo dokazuje väčšia plocha pod krivkou (AUC), ktorá sa premietne do o 302,5 percent vyššej biologickej dostupnosti. Tieto výsledky naznačujú, že vyššia rozpustnosť micelárnej formulácie zvyšuje jej absorpciu.

2.2. Štúdia účinnosti nefroprotekcií 2.2.1. Fyziologický stav

Ako dokazuje vývoj telesnej hmotnosti (obrázok 2a), celkový zdravotný stav sa po liečbe cisplatinou v porovnaní s kontrolnými zvieratami zhoršil. Ani prirodzenékvercetínani P-kvercetínvýznamne modifikovali účinok cisplatiny. Avšak, obojekvercetínliečby takmer úplne zabránili zvýšeniuobličky/pomer telesnej hmotnosti vyvolaný cisplatinou (obrázok 2b), parameter, o ktorom je známe, že koreluje s veľkosťou opotrebovanianefrotoxicita[32].

Obrázok 2. Vývoj celkového zdravotného stavu. (a) Percentuálna zmena telesnej hmotnosti počas experimentu; (b) Pomer obličky/telesná hmotnosť na 9. deň.

Hodnoty sú vyjadrené ako priemer ± SEM (n=3-5 na skupinu). *p<><0.01;><0.001vs.controlgroup.><0.05;><0.01 vs.="" cp="" group.cp:cisplatin(6.5="" mg/kg,="" i.p.)on="" day="">

CP plus Q:kvercetín(50 mg/kg, ip) počas 9 dní a cisplatina (6,5 mg/kg, ip) v deň 3; CP plus PQ:P-kvercetín(100 mg/kg, ip) počas 9 dní a cisplatina (6,5 mg/kg, ip) v deň 3.

2.2.2. Hodnotenie funkcie obličiek a tkaniva obličiek

Podľa medzinárodných kritérií je AKI definovaná a diagnostikovaná podľa zvýšenia koncentrácie kreatinínu v plazme (Crp)[33-35], náhradného markera rýchlosti glomerulárnej filtrácie (GFR). Ďalšie parametre, ako je koncentrácia močoviny v plazme, sa tiež často hodnotia ako indikátory azotémie [36-38]. Zvýšenie Crp a plazmatickej urey je znakom zníženej GFR a AKI. V našej štúdii bola funkcia obličiek vážne postihnutá cisplatinou a tento účinok bol čiastočne zlepšenýkvercetín. P-kvercetínvykázala o niečo smelšiu aktivitu ako prirodzenúkvercetín, čo naznačuje miernejšie poškodenie a zlepšený profil zotavenia (obrázok 3). Potkany v skupine s cisplatinou (CP) podstúpili zjavnú AKI, pretože u nich došlo k progresívnemu a významnému zvýšeniu plazmatických hladín kreatinínu a močoviny v porovnaní s hladinami kontrolnej skupiny (obrázok 3a, b). Tieto parametre sa tiež zvýšili v skupinách CP plus Q a CP plus PQ, ale vo výrazne nižšej miere. Rozdiely medzi skupinami CP plus Q a CP plus PQ neboli štatisticky významné, avšak potkany liečené P-kvercetínvykazovali o niečo nižšie hladiny kreatinínu a močoviny ako tie, ktoré boli liečené prírodnýmikvercetín. Klírens kreatinínu (ClCr) je štandardná metóda na meranie GFR ]39,40]. V súlade s údajmi Cr cisplatina vyvolala hlboký pokles, ktorý bol čiastočne zmiernenýkvercetín(Obrázok 3c). V tomto prípade bol však badateľný rozdiel medzi P-kvercetínom a prírodným kvercetínom, pričom prvý z nich bol výrazne účinnejší pri zlepšovaní a urýchľovaní regenerácie. Je potrebné poznamenať, že Clcr a Crpl sa správajú nepriamo úmerným spôsobom, čo je zrejmé iba v ustálenom stave. Počas AKI sa však funkcia obličiek neustále a rýchlo mení, čo vedie k miernemu rozpojeniu tohto vzťahu.

Obrázok 3. Vývoj renálnych parametrov.

(a) Plazmatická koncentrácia kreatinínu; (b) Plazmatická koncentrácia močoviny; (c) klírens kreatinínu; (d) Proteinúria; a (e)KIM-1 vylučovanie močom.

Hodnoty sú vyjadrené ako priemer ± SEM (n{0}} na skupinu). *p<><><0.001 vs=""><0.05;><0.01vs.cp group.cp:cisplatin(6.5="" mg/kg,i.p.)on="" day="">

CP plus Q:kvercetín(50 mg/kg, ip) počas 9 dní a cisplatina (6,5 mg/kg, ip) v deň 3; CP plus PQ: P-kvercetín(100 mg/kg, ip.) počas 9 dní a cisplatina (6,5 mg/kg, ip) v deň 3. KIM-1:obličkyzraneniemolekula1.

Proteinúria sa tiež často meria v kontexte renálnej patológie. V závislosti od základného modelu poškodenia môže mať proteinúria glomerulárny pôvod (tj zvýšená permeabilita glomerulárnej filtračnej bariéry) alebo ako v prípade cisplatinynefrotoxicita[13], môže vzniknúť z defektnej tubulárnej reabsorpcie v dôsledku tubulárneho poranenia. Nevýznamné zvýšenie proteinúrie sa zistilo v skupinách CP a CP-Q (hoci menej výrazné v skupine CP-Q) na 7. deň, ktoré sa vrátilo do normálu na 9. deň. Podobne aj vylučovanie biomarkera tubulárneho poškodenia močom (tj.obličkyzraneniemolekula 1; KIM-1)[41,42]bolo výrazne zvýšené cisplatinou a toto zvýšenie bolo oslabené oboma formamikvercetín, aj keď P-kvercetínbola opäť o niečo efektívnejšia.

Histologická štúdia obličkového tkaniva bola v súlade s biochemickými nálezmi. Vzorky z potkanov liečených cisplatinou odhalili masívnu tubulárnu nekrózu v hornom pruhu vonkajšej drene, sprevádzanú určitým kortikálnym postihnutím akvercetínznížené poškodenie kôry (obrázky 4 a 5). U potkanov, ktoré dostali len nefrotoxické činidlo, sa vyvinula tubulárna dilatácia a obštrukcia (považovaná za nahromadený hyalínový materiál) a tubulárna nekróza s deepitelizáciou a odlupovaním buniek. Obajakvercetínliečby podobne znížili kortikálne poškodenie vyvolané cisplatinou, ale nemali žiadny účinok na poškodenie drene (obrázky 4 a 5).

Obrázok 4. Reprezentatívne snímky renálnych vzoriek zafarbených hematoxylínom a eozínom.

Čierne šípky: tubulárna nekróza a odlupovanie buniek; modré šípky: tubulárne dilatácie; zelené šípky: intratubulárne usadeniny hyalínového materiálu. CP: cisplatina (6,5 mg/kg, ip) v deň 3;

CP plus Q:kvercetín(50 mg/kg, ip) počas 9 dní a cisplatina (6,5 mg/kg, ip) v deň 3; CP plus PQ: P-kvercetín(100 mg/kg, ip) počas 9 dní a cisplatina (6,5 mg/kg, ip) v deň 3.

Obrázok 5. Kvantifikácia poškodenia obličiek.

Hodnoty sú vyjadrené ako priemer ± SEM (n =5 obrázkov x 3 potkany na skupinu). * str<><0.001 vs.=""><0.05 vs.cp="">

CP: cisplatina (6,5 mg/kg, ip.) v deň 3; CP plus Q:kvercetín(50 mg/kg, ip počas 9 dní a cisplatina (6,5 mg/kg, ip) v deň 3; CP plus PQ: P-kvercetín(100 mg/kg, ip) počas 9 dní a cisplatina (6,5 mg/kg, ip) v deň 3.AU: ľubovoľné jednotky.

3. Diskusia

Naše výsledky ukazujú, že micelárna formuláciakvercetíns Pluronic F127 (P-kvercetín), nesúci vylepšené biofarmaceutické vlastnosti, zvýšil biologickú dostupnosť tohto antioxidačného flavonoidu a zachoval (alebo dokonca mierne zlepšil) jeho celkové nefroprotektívne vlastnosti v porovnaní s prírodnýmikvercetín.

kvercetínsa predpokladá ako sľubný kandidát na ochranu pred poškodením obličiek spôsobeným množstvom liekov a toxínov, vrátane cisplatiny [25,26], metotrexátu [43,44], ciprofloxacínu [45], NaF [46], HgCl [47l a kadmia [48]. Hoci tieto štúdie preukázali predklinickú účinnosť,kvercetínnebol testovaný v podobných klinických scenároch kvôli prekážkam vo formulácii a nízkej biologickej dostupnosti, s výnimkou klinickej štúdie, v ktorejkvercetínposkytli určitú ochranu pred CIN [27]. Obe obmedzenia sú dôsledkom veľmi nízkej rozpustnosti vo vode (iba 0,01 mg/ml, pri 25 stupňoch [49])kvercetína jeho nízkej stability (ktorá je ovplyvnená teplotou, pH, hydroxyláciou, enzymatickou aktivitou a kovovými iónmi) [28,29,50]. Orálne podávanékvercetínčelí rozsiahlej degradácii počas prechodu žalúdkom v dôsledku veľmi nízkeho pH žalúdka (tj 1,5)[50]. V tenkom čreve, chemicky chránené vyšším pH(7,5), zostávajúcekvercetínsa len minimálne vstrebáva. Preto, aby sa zvýšila jeho biologická dostupnosť a biologická účinnosť, boli vyvinuté nové formulácie kvercetínu s cieľom zlepšiť jeho hydrorozpustnosť, ako aj chrániť jeho aktívne časti pred degradáciou, vrátane lipozómov, nanočastíc, nanoemulzií a miciel [28].

Naša micelárna formulácia s Pluronic F127 sa zvyšujekvercetínrozpustnosť desaťnásobne a v štúdiách in vitro preukázala lepšie správanie pri rozpúšťaní v simulovaných žalúdočných a črevných tekutinách, pretože dosahuje významné zníženie veľkosti častíc a homogénnejšiu disperziukvercetínv polymérnej matrici I3l. Táto formulácia poskytuje výrazne zvýšené množstvokvercetíndo krvného obehu, čo vedie k 3-násobnej biologickej dostupnosti, ktorá sa, napodiv, premieta len do mierne vyššieho nefroprotektívneho účinku. Zhodne sme nepozorovali dodatočný nefroprotektívny účinok, keď sme použili vyššiu dávku (tj 100 mg/kg) prírodnéhokvercetínv predchádzajúcich experimentoch (naše nepublikované pozorovania)[25,26]. V týchto štúdiách naša interpretácia bola, že pravdepodobne vyššie dávky ipkvercetín(i.e., >50 mg/kg) sa nepremietlo do zvýšenej biologickej dostupnosti v dôsledku zníženej rozpustnosti, čo neviedlo k žiadnemu významnému zvýšeniu čistej absorpcie. Toto sa zhodovalo so žltými nánosmi nevstrebanéhokvercetínnájdený v peritoneálnej dutine pri obetovaní. Okrem toho naše súčasné výsledky ukazujú, že ešte vyššie plazmatické koncentrácie kvercetínu (ako sú tie, ktoré sa získali s P-kvercetínom) sa premietajú do len mierne vyššieho účinku. Pretožekvercetíndistribúcia bola vysvetlená v zjednodušenej forme pomocou dvojkompartmentového modelu prvého rádu [51], zdá sa, že prístup k cieľovým bunkám z hlavného kompartmentu (tj z krvného obehu) nie je obmedzením. Dôvod, prečo sa maximálny nefroprotektívny účinok takmer dosiahne pri nižších plazmatických koncentráciách, ktoré poskytuje prírodný kvercetín, zostáva nejasný.

To má praktické dôsledky pre ďalší rozvojkvercetínako profylaktický nefroprotektor. Po prvé, tieto výsledky otvárajú možnosť skúmať, či režimy s nižším dávkovaním budú podobne účinné, ako veľký nadbytok biologickej dostupnosti P-kvercetínmožno obetovať bez straty akéhokoľvek terapeutického účinku, ale maximalizuje bezpečnostný profil. Po druhé, teraz je otvorená príležitosť na orálne podávanie, ktoré je však potrebné otestovať pre novú formuláciu. Absorpcia z peritoneálnej dutiny zabraňuje prekážkam, s ktorými sa stretávame cez orálnu cestu. Predpokladá sa, že vyššia rozpustnosť v intestinálnom lúmene môže viesť k zvýšeniu a stuhnutiukvercetínbiologická dostupnosť v rámci terapeutického okna. Po tretie, intravenózna cesta môže byť teraz realistickou alternatívou s minimalizovanou toxicitou, ktorá by zabránila absorpčným bariéram. Doteraz boli experimentálne injekčné formuláciekvercetínpoužil ako rozpúšťadlo dimetylsulfoxid (DMSO) [51].

Je známe, že cisplatina sa akumuluje v proximálnych a distálnych tubuloch a poškodzuje ich a vyvoláva apoptózu a nekrózu epitelových buniek tubulov v závislosti od koncentrácie [16]. Najviac je postihnutý proximálny segment S3, aj keď vyššími dávkami sú čoraz viac poškodzované aj segmenty S1 a S2. V súlade s jeho známymi antiapoptickými vlastnosťami na tubulárne bunky [52,53],kvercetínznížená kortikálna tubulárna deepitelizácia. Rovnaký účinok pozorovaný pri oboch formuláciách posilňuje myšlienku, žekvercetíndistribučná kinetika kobličkysú v našej štúdii nasýtené. Okrem toho v rámciobličky, kvercetínvykazuje odlišné správanie pozdĺž nefrónu. V skutočnosti,kvercetínnemal žiadny vplyv na vonkajšiu dreň, kde sa nachádza segment S3 proximálnych tubulov.kvercetínZdá sa, že sa hromadí v S1, S2 alebo distálnych tubuloch, ktoré sa nachádzajú blízko kôry. Pretože nie je známe ako (tj ktoré transportéry alebo difúzne cesty) a odkiaľ (tj luminálna alebo bazolaterálna strana)kvercetínpristupuje k tubulárnym bunkám, je potrebný ďalší výskum na vysvetlenie týchto rozdielnych účinkov.

Mierna konzervácia kortikálneho tkaniva môže len čiastočne vysvetliť účinokkvercetínna renálnu funkciu (tj GFR). Dodatočná ochrana môže vzniknúť z vaskulárnych účinkovkvercetín. Endoteliálna funkcia sa podieľa na regulácii prietoku krvi obličkami (RBF) a GFR moduláciou aferentného a eferentného arteriolového kontraktilného tonusu [54-57]. Cisplatina indukuje endoteliálnu dysfunkciu a predpokladá sa, že to podstatne prispieva k poklesu GFR spolu s renálnou aferentnou vazokonstrikciou indukovanou tubuloglomerulárnymi spätnoväzbovými mechanizmami (aktivovanými tubulárnym poškodením) a zápalovými cytokínmi [13,58]. V skutočnosti je zvrátenie endoteliálnej dysfunkcie široko uznávaným účinkomkvercetín(a flavonoidov vo všeobecnosti)[59-61l, čo môže vysvetľovať prečokvercetínzlepšuje RBF (a tým aj GFR), ako už bolo uvedené [25]. Okrem toho tieto endotelovo-vaskulárne účinky môžu tiež pomôcť vysvetliť mierne vyššiu účinnosť P-kvercetínna zlepšenie funkcie obličiek a obnovenie funkcie obličiek. Pravdepodobne nie je nerozumné špekulovať, že vyššia biologická dostupnosť by mohla mať výraznejší účinok na endoteliálny lavor v priamom kontakte s krvou.

Niektoré z účinkov pozorovaných po podaníkvercetínmôžu pôsobiť jeho metabolity.kvercetínsa metabolizuje v črevnej sliznici a pečeni glukuronidačnými, sulfatačnými a metylačnými reakciami [62], pričom najpočetnejšími metabolitmi sú glukuronidové metabolity v krvnom obehu [63]. konkrétnekvercetínUkázalo sa, že -3-bO-glukuronid (Q3GA), hlavný plazmatický metabolit, má protizápalové a vaskulárne účinky, a to priamo aj po metabolizácii späť na formu aglykónu [64]. Je potrebný ďalší výskum na pochopenie špecifických metabolitov zodpovedných za neuroprotekciu a ich rozdielnu produkciu a transformáciu z rôznych miest podania na ich konečné ciele.

Na záver, táto počiatočná štúdia ukazuje terapeutický potenciál P-kvercetínako vylepšená formulácia so zlepšenými biofarmaceutickými a farmakokinetickými vlastnosťami, užitočná pre ďalší vývoj a perspektívne klinické použitie v profylaxiinefrotoxicita.

Výhody kvercetínu na nefrotoxicitu

4. Materiály a metódy

Všetky chemikálie a činidlá boli zakúpené od spoločnosti Merck (Darmstadt, Nemecko), pokiaľ nie je uvedené inak.

4.1. Príprava micelárnej formulácie (P-kvercetín) a PrírodnékvercetínFormulácia

kvercetínhydrát (minimálna čistota 95 percent) bol získaný od Acros Organics (Madrid, Španielsko) a blokový kopolymér etylénoxid-propylénoxid Pluronic F127 (priemerná molekulová hmotnosť 12,6 kDa, hydrofilno-lipofilná rovnováha 22) poskytol BASF (Ludwigshafen am Rhein, Nemecko). Na výrobu micelárnej formulácie sa použila technika zrážania superkritického antirozpúšťadlakvercetín/častice Pluronic F127 (P-kvercetín), ako už bolo opísané [31]. Výsledný Pluronic-kvercetínformulácia mala relatívne zloženie 50 percent /50 percent w/w Pluronic F127/kvercetín. Pre prirodzenékvercetínformulácia,kvercetínbol suspendovaný v 0.16 percent Tween 20 vo fyziologickom roztoku, ako už bolo opísané [25,26].

4.2. Zvieratá a bioetika

Všetky postupy boli schválené Bioetickým výborom Univerzity v Sala-manca a regionálnou vládou Kastílie a Leónu, Ministerstvom poľnohospodárstva a chovu dobytka (kód: 0000037, 27. júla 2015). So zvieratami sa zaobchádzalo v súlade s usmerneniami smernice Rady Európskeho spoločenstva 2010/63/UE a podľa aktuálnej španielskej legislatívy pre experimentálne zvieratá a starostlivosť o ne (RD53/2013, 1. februára 2013). Samce potkanov Wis-tar (200-250 g) boli chované v kontrolovaných podmienkach prostredia v zariadení Animal House University of Salamanca s voľným prístupom k vode a štandardnej potrave.

4.3. Štúdia biologickej dostupnosti

Potkany boli rozdelené do dvoch experimentálnych skupín: O (n{0}}), v ktorých zvieratá dostali jednu dávkukvercetín(50 mg/kg); a PQ(n{1}}), v ktorých zvieratá dostali jednu ip ekvimolárnu dávku P-kvercetín(100 mg/kg (tj s obsahom 50 mg/kgkvercetín). Následne sa odobrali vzorky krvi do skúmaviek potiahnutých kyselinou etyléndiamíntetraoctovou (EDTA) z malého rezu na špičke chvosta v nasledujúcich časoch:0.25,0.5,1,2,8, 12 a 24 hodín. Plazma sa získala centrifugáciou a 10 μl 10 mM kyseliny askorbovej (aby sa zabránilokvercetíndegradácia） bola pridaná do 100 μl plazmy a zmrazená na -80 stupeň až do jej analýzy.kvercetínkoncentrácie boli stanovené metódou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC) s reverznou fázou s UV detekciou. Použila sa kolóna Prosper 3 um s veľkosťou častíc C18 s mobilnou fázou zloženou z 28 percent acetonitrilu a 72 percent vodného roztoku 0,2 percenta kyseliny ortofosforečnej pri prietoku 1 ml/min. Detekčná vlnová dĺžka bola 371 nm. Pred vstreknutím do chromatografického zariadenia sa vzorky podrobili procesu glukuronidácie na kvantifikáciu celkového množstvakvercetín. Na tento účel sa 100}0 jednotiek -glukuronidázy z Helix pomatia v 0,1 M acetátovom pufri (pH 5) pridalo do 100 μl plazmy a táto zmes sa inkubovala pri 37 stupňoch počas 1 hodiny. . Potom sa uskutočnil extrakčný proces so 100 ul zmesi 0,5 M 80~20 acetonitril/octová kyselina (trikrát). Keď sa supernatant odparil v prúde dusíka, suchý zvyšok sa znova rozpustil v 40 ul mobilnej fázy a 20 ul sa vstreklo do systému HPLC.

4.4. Štúdia o nefroprotekcii

Potkany boli rozdelené do nasledujúcich experimentálnych skupín (obrázok 6): Kontrolné (n{1}}) zvieratá dostávali vehikulum (NaCl0,9 percent) intraperitoneálne (ip) počas 9 dní; CP(n{5}}) zvieratá dostali jednu nefrotoxickú dávku cisplatiny (6,5 mg/kg,ip) v deň 3 experimentu; CP plus Q(n{9}}) zvieratá dostali dennú dávkukvercetín(50 mg/kg,ip) počas 9 dní a jedna dávka cisplatiny (6,5 mg/kg,ip) v deň 3; a CP plus PQ (n=5) zvieratá dostávali dennú dávku P-kvercetín(100 mg/kg, ip (tj s obsahom 50 mg/kgkvercetín)) počas 9 dní a dávka cisplatiny (6,5 mg/kg, ip) v deň 3.

Obrázok 6. Schéma modelu nefrotoxicity.

CP: cisplatina (6,5 mg/kg, ip) v deň 3; CP plus Q:kvercetín(50 mg/kg, ip) počas 9 dní a cisplatina (6,5 mg/kg, ip) v deň 3; CP plus PQ:P-kvercetín(100 mg/kg, ip.) počas 9 dní a cisplatina (6,5 mg/kg, ip) v deň 3.

Vzorky krvi （150 μl） sa odobrali v dňoch 0, 3, 5, 7 a 9 v heparinizovaných kapilárach z malého rezu na špičke chvosta. Plazma sa oddelila centrifugáciou (11.000 otáčok za minútu počas 3 minút) a udržiavala sa pri -80C. V dňoch 7 a 9 sa 24-hodinový moč zhromaždil v metabolických klietkach, vyčistil sa centrifugáciou (2000 x g počas 9 minút) a skladoval sa pri -80 stupni. Na konci experimentu (deň 9) boli potkany anestetizované a ichobličkyboli vypreparované, odvážené a fixované v 3,7 percentnom paraformaldehyde na histologické štúdie.

Kreatinín v plazme a moči sa meral pomocou komerčnej súpravy založenej na Jaffeovej metóde [65] (QuantiChrom Creatinine Assay Kit, BioAssay Systems, Hayward, CA, USA). Plazmatická močovina bola stanovená pomocou komerčnej súpravy založenej na Jungovej metóde [66] (Quan-tiChrom Urea Assay Kit, BioAssay Systems, Hayward, CA, USA). Klírens kreatinínu (Clcr) sa vypočítal pomocou vzorca: Clcr=Crur × UF/ Crp); kde Crur zodpovedá koncentrácii kreatinínu v moči, UF je prietok moču a Crp je plazmatická koncentrácia kreatinínu. Proteinúria sa merala Bradfordovým testom [67]. KIM-1 bol kvantifikovaný pomocou potkanaObličkyzraneniemolekula 1 (KIM-1) ELISA Kit (Cusabio, Houston. TX, USA). podľa pokynov výrobcu.

Na histologické štúdie sa vzorky obličiek zaliali do parafínu a 5 um tkanivové rezy sa zafarbili hematoxylínom a eozínom. Fotografie boli urobené pod mikroskopom Olympus BX51 pripojeným k farebnému digitálnemu fotoaparátu Olympus DP70 (Olympus, Madrid, Španielsko). Kvantifikácia poškodenia sa uskutočnila slepým spôsobom, ako už bolo opísané [68]. Stručne povedané, bolo urobených päť náhodných fotografií kortikálnej oblasti a päť fotografií vonkajšej medulárnej oblasti (tj oblastí poškodených cisplatinou), ktoré tieto oblasti rovnomerne zmapovali. Každý obrázok bol rozdelený na 10 identických sekcií (pomocou softvéru Microsoft Office PowerPoint 2016), pričom každej z nich bolo priradené skóre 0 (žiadne poškodenie), 1 (prítomnosť poškodenia na menej ako 1/3 plochy), 2 (prítomnosť poškodenia medzi 1/3-2/3 plochy) alebo 3 (prítomnosť poškodenia na viac ako 2/3 plochy). Poškodenie bolo hodnotené s prihliadnutím na prítomnosť tubulárnej nekrózy a odlupovania buniek, tubulárnej dilatácie, vakuolizácie, prítomnosti hyalínových usadenín a straty kefového lemu.

4.5. Štatistická analýza

Údaje sú prezentované ako priemer ± štandardná chyba priemeru (SEM). Odľahlé hodnoty boli identifikované pomocou Grubbsovho testu|69]. Normálna distribúcia údajov bola hodnotená pomocou Shapiro-Wilkovho testu. V štúdii biologickej dostupnosti sa porovnanie medzi týmito dvoma skupinami uskutočnilo pomocou Studentovho t-testu alebo Mann-Whitneyho U testu. Farmakokinetická štúdia sa uskutočnila pomocou modelovo nezávislej analýzy priemerných plazmatických hladínkvercetín. Odhadované parametre na vyhodnotenie relatívnej biologickej dostupnostikvercetínboli plocha pod čiastočnou krivkou plazmatických hladín (AUC)24, plocha pod celkovou krivkou plazmatických hladín (AUC)0~, sklon terminálnej fázy, polčas eliminácie (ti/2) a stredný čas zotrvania (MRT). Odhad farmakokinetických parametrov bol uskutočnený kombináciou lichobežníkovej metódy pre odhad plochy pod parciálnou krivkou a nelineárnou regresiou terminálnej fázy krivky plazmatickej hladiny. Pre štúdiu nefroprotekcie sa na porovnanie medzi skupinami uskutočnila analýza rozptylu (ANOVA) so Scheffeho testami alebo Kruskal-Wallisovým testom. Štatistická analýza sa uskutočnila pomocou softvéru IBM SPSS Statistics 20.0 (International Business Machines, Armonk, NY, USA). Na vytvorenie kresby a ilustrácií boli použité programy Microsoft Office Excel a PowerPoint 2016 (Microsoft, Redmond, WA, USA).

Referencie

1. Awdishu, L.; Mehta, RLThe6R's of Drug-InducedNefrotoxicita. BMCNephrol.2017,18,124. [CrossRefl[PubMed]

2. Perazella, MADrug Použitie aNefrotoxicitana Jednotke intenzívnej starostlivosti.ObličkyMedzin.2012,81,1172-1178. [CrossRef] [PubMed]

3. Taber, SS; Mueller, renálna dysfunkcia spojená s BADrug. Crit.Care Clin.2006,22,357-374, vi. [CrossRef] Huang, JX; Blaskovich, MA; Cooper, MACell a biomarkerové analýzy na predpovedanieNefrotoxicita.

Poznámka:vyššie uvedené nie je úplný referenčný zoznam