Predchádzajúce učenie o strachu umožňuje rýchlu asimiláciu nových spomienok na strach priamo do kortikálnych sietí 2. časť

Predchádzajúce kontextové učenie strachu umožňuje prednej cingulárnej kôre okamžite zakódovať nové spomienky

Doteraz sme skúmali dynamiku konsolidácie systému v spomienkach na sluchový strach. Model konsolidácie systému však väčšinou pochádza zo štúdií o pamäti závislej od hipokampu.

Sluchový strach je veľmi častým psychologickým problémom, ktorý môže mať veľký vplyv na každodenný život ľudí. Keď sa objaví sluchová fóbia, ľudia sa môžu cítiť veľmi nepríjemne a môžu dokonca spôsobiť rôzne zdravotné problémy. Zároveň však existujú aj experimenty, ktoré dokazujú, že sluchový strach môže tiež zlepšiť pamäť.

V posledných rokoch vedci zistili, že ľudia so sluchovou fóbiou sú pozornejší a citlivejší ako ostatní. Ich mozgy reagujú silnejšie a rýchlejšie na zvukovú stimuláciu. Táto reakcia ich robí citlivejšími na zvuky v ich živote. V niektorých prípadoch dokážu lepšie spracovať rôzne informácie a dokonca získať užitočnejšie podnety zo zvukov, čo môže potenciálne zlepšiť ich celkovú pamäť.

Keď je človek v napätom alebo úzkostnom emočnom stave, mozog uvoľňuje látku zvanú adrenalín. Táto látka dokáže podporovať činnosť mozgových neurónov a zvyšovať koncentráciu ľudí. Preto počas stavu sluchového strachu vedie uvoľňovanie adrenalínu k väčšej koncentrácii a pamäti poslucháča.

Zároveň, keď zvukový podnet strachu pretrváva, mozog sa dokáže tomuto podnetu prispôsobiť vybudovaním hlbšej pamäte zvuku. Táto pamäť môže pomôcť pacientom lepšie reagovať na rôzne zvukové podnety, čo im umožní stať sa sebavedomejšími a nezávislejšími.

Preto, aj keď sluchový strach môže spôsobiť veľa nepríjemností v každodennom živote ľudí, môže mať tiež pozitívny vplyv na pamäť. Keď sa ľudia naučia, ako sa vysporiadať s týmto psychologickým problémom, môžu prekonať svoje obavy a dokonca z nich profitovať. To nám tiež pripomína, že by sme sa mali správne pozerať na psychické problémy, venovať pozornosť duševnému zdraviu a používať pozitívny prístup na riešenie ťažkostí, aby sme si zlepšili život. Je vidieť, že si musíme zlepšiť pamäť. Cistanche deserticola môže výrazne zlepšiť pamäť, pretože Cistanche deserticola dokáže regulovať aj rovnováhu neurotransmiterov, ako je zvýšenie hladín acetylcholínu a rastových faktorov. Tieto látky sú veľmi dôležité pre pamäť a učenie. Okrem toho môže mäso zlepšiť aj prietok krvi a podporovať prísun kyslíka, čo môže zabezpečiť, že mozog dostane dostatok živín a energie, čím sa zlepší mozgová vitalita a vytrvalosť.

Kliknite na vedieť doplnky na zlepšenie pamäte

Predpokladá sa, že tieto spomienky sa tvoria spočiatku na hipokampálnej aj kortikálnej úrovni. V priebehu času vedie koordinovaná súhra medzi hipokampom a kortikálnymi sieťami k postupnej prestavbe kortikálnych okruhov, ktoré nakoniec ukladajú vzdialené spomienky [1–5]. V súlade s tým u naivných zvierat sú spomienky na strach závislé od hipokampu, menovite kontextové spomienky na strach, spočiatku závislé od hipokampu a postupne sa stávajú závislými od kortikálnej siete, ktorá zahŕňa ACC a prefrontálny kortex [1,2,6–8 ].

Zvažovali sme teda, či táto časovo závislá reorganizácia nastala inak, ak predtým došlo k systémovej konsolidácii predchádzajúcej pamäte. Potkany boli vycvičené tak, aby spájali kontext s USA. Dva týždne predtým sa 1 skupina potkanov naučila ďalšie spojenie medzi iným kontextom a USA (CtxA-CtxB), zatiaľ čo iná skupina dostala iba okamžité bolestivé podnety, ktoré bránili kontextovému učeniu strachu (šok-CtxB) (obr. S1A). Zvieratám sa injikoval CNQX alebo fyziologický roztok do ACC 24 hodín po kontextovom učení (obrázky 4A a S1B).

V súlade s predchádzajúcimi štúdiami [1,6,8] inaktivácia ACC u zvierat, ktoré sa predtým nenaučili inú asociáciu strachu, ponechala zmrazenie na CtxB nedotknuté, čo naznačuje, že táto manipulácia neovplyvnila nedávnu pamäť. Avšak podobne ako údaje získané pri učení sa sluchového strachu, inaktivácia ACC znížila zmrazenie na nedávne CtxB u potkanov, ktoré sa naučili predchádzajúce kontextové spojenie strachu (obr. 4B a 4C).

Tento jav bol v príčinnej súvislosti s vývojom pomalej systémovej konsolidácie prvej pamäte, pretože chýbal u zvierat, u ktorých boli 2 udalosti strachu oddelené iba 7 alebo 24 hodinami, a u zvierat, kde bol ACC inaktivovaný 24 hodín po oboch. prvé a druhé kontextové učenie strachu. Okrem toho chýbal u potkanov, ktoré zažili prieskum prvého kontextu v neprítomnosti akýchkoľvek US (skupina Context-CtxB) (obr. 4D a 4E).

Je kritické, že inaktivácia ACC vykonaná 1 hodinu po učení ovplyvnila aj nedávnu pamäť strachu (obr. 4F a 4G). V tomto časovom bode podávanie anisomycínu znížilo zmrazenie na CtxB u zvierat, ktoré predtým zažili kontextové učenie strachu (obr. 4H a 4I). Tieto údaje podporujú myšlienku, že akonáhle sa zapamätá prvá udalosť strachu, neokortex sa okamžite stane nevyhnutným pre nové spomienky tým, že použije iba synaptické konsolidačné mechanizmy.

Predchádzajúce kontextové učenie strachu reorganizuje projekcie ACC-to-BLA tak, aby podporovali nedávne spomienky

Ďalej sme skúmali, či sa nervová konektivita, ktorá sa získava počas vzdialeného uchovávania pamäte u naivných zvierat, môže podieľať aj na nedávnom uchovávaní pamäte u zvierat, ktoré sa predtým naučili inú kontextovú pamäť strachu. Na tento účel sme skúmali zapojenie projekcií z ACC do BLA do uchovávania nedávnych a vzdialených kontextových spomienok.

Predchádzajúca štúdia ukázala, že optogenetická inhibícia axónových zakončení premietaná z prefrontálneho kortexu do BLA narušila u naivných zvierat uchovávanie kontextovej pamäte strachu vo vzdialených, ale nie nedávnych časových bodoch [7]. Adeno-asociovaný vírusový vektor (AAV5-CaMKIIa-eNpHR3.{5}}mCherry) alebo kontrolný vektor (AAV5-CaMKIIa-mCherry) boli injikované do ACC v 2 skupinách, ako napr. vyššie opísané experimenty (obrázky 5A–5C a S3C). Optogenetická inhibícia terminálov ACC v BLA počas nedávneho kontextuálneho uchovávania pamäte strachu zhoršila zmrazenie na CtxB iba u zvierat, ktorým bol injekčne podaný eNpHR3.0-vektor mCherry a ktoré sa predtým naučili zreteľnú súvislosť s USA (obr. 5D ).

V tejto skupine následná inhibícia terminálov ACC v BLA tiež spôsobila významné zníženie zmrazenia na CtxA, čo naznačuje, že ovplyvnila aj zachovanie asociácie vzdialeného kontextu a USA (obr. 5E). Tieto výsledky podporujú myšlienku, že rovnaká nervová dráha je nevyhnutná na uchovanie vzdialenej pamäte prvej udalosti strachu a nedávnych spomienok na nové analogické udalosti. Tieto údaje tiež naznačujú, že preskupenie kortikálnych dráh zostupujúcich do BLA, vyvolané prvou spomienkou, je bežným procesom pre sluchové aj kontextové spomienky na strach.

Po predchádzajúcom učení strachu sú dorzálny hipokampus a ACC potrebné na vytvorenie nových spomienok

Tieto zistenia nastoľujú otázku, či hipokampus vytvára nové spomienky, aj keď došlo k predchádzajúcemu kontextuálnemu učeniu strachu. Alternatívne môže kôra vytvárať nové spomienky, dokonca aj bez hipokampu. Aby sme odpovedali na tieto otázky, deaktivovali sme hipokampus 1 hodinu po kontextovom učení strachu v 2 skupinách podobných vyššie uvedeným experimentom.

Pretože väčšina literatúry o konsolidácii systému pochádza zo štúdií, kde bol hipokampus natrvalo zničený, začali sme nezvratným poškodením dorzálneho hipokampu 1 hodinu po učení (obr. 6A–6C). Hipokampálne lézie spôsobili významné zníženie zmrazenia na CtxB v oboch skupinách (obr. 6C). Pretože excitotoxické lézie môžu prechodne interferovať s aktivitou oblastí mozgu mimo hipokampu, ako je ACC, opakovali sme tento experiment inaktiváciou dorzálneho hipokampu pomocou CNQX, aby sme zablokovali lokálne receptory glutamátu AMPA a zistili sme amnesické účinky v oboch skupinách (obr. 6D a 6E ).

Tieto výsledky ukázali, že hipokampus je nevyhnutný na vytvorenie nových kontextových spomienok bez ohľadu na to, či došlo k predchádzajúcemu učeniu strachu. Spolu s vyššie uvedenými výsledkami tieto údaje tiež naznačujú, že u zvierat, ktoré sa naučili predchádzajúcu kontextovú udalosť strachu, sú hipokampus aj ACC potrebné na vytvorenie nedávnych spomienok na strach a ani jedno z týchto miest samo osebe nemôže podporovať vytváranie pamäte v neprítomnosti. toho druhého.

Potom sme skúmali časový priebeh postihnutia hipokampu oddialením hipokampálnych lézií na 1 týždeň po učení. V súlade s predchádzajúcimi zisteniami [46] hipokampálne lézie stále ovplyvňovali formovanie pamäti u zvierat, ktoré sa nikdy predtým nenaučili iné asociácie strachu. Naopak, v skupine, ktorá sa naučila predchádzajúcu udalosť strachu, hipokampálne lézie neovplyvnili zachovanie pamäti (obr. 6F a 6G), čo naznačuje, že predchádzajúca pamäť strachu skracuje časové okno postihnutia hipokampu (z 2 týždňov na 1 týždeň), pretože pozorované aj pre priestorové učenie [3,20,21].

Diskusia

V tejto štúdii sme zistili, že predchádzajúca systémová konsolidácia pamäte sluchového strachu umožňuje Te2 okamžite zakódovať novú pamäť sluchového strachu prostredníctvom synaptickej konsolidácie. Navyše, zostupné projekcie z Te2 do BLA, ktoré boli aktivované počas konsolidácie predchádzajúceho učenia, sa stávajú nevyhnutnými pri vytváraní nových spomienok na sluchový strach.

Podobné výsledky boli pozorované pri kontextovom učení strachu závislom od hipokampu. V poslednej úlohe sme tiež zistili, že predchádzajúce učenie skracuje trvanie zapojenia hipokampu do nedávneho kontextového učenia strachu. Celkovo naše zistenia naznačujú, že predchádzajúce učenie reorganizuje mozgové okruhy, takže nové analogické informácie sa okamžite naučia v kortikálnych štruktúrach.

Súčasná koncepcia systémovej konsolidácie spomienok závislých od hipokampu predpokladá, že hipokampus je zapojený časovo obmedzeným spôsobom a že v priebehu času dochádza k sprievodnému postupnému procesu reorganizácie mozgového okruhu, takže kortikálne siete sa stávajú postupne dôležitejšími [1–5].

Hoci existujú aj alternatívne teórie [47], početné štúdie podporujú dočasne obmedzenú úlohu hipokampu v pamäťových procesoch na ľudských aj zvieracích modeloch [1–3]. Naopak, reorganizácia mozgových okruhov, ktoré podporujú pamäť v priebehu času, bola preukázaná väčšinou na zvieracích modeloch, zatiaľ čo dôkazy u ľudí sú kontroverznejšie [3].

Niektoré štúdie ukázali, že aktivita hipokampu počas obnovy pamäte u ľudí progresívne klesá v priebehu týždňov a mesiacov, zatiaľ čo aktivita vo ventrálnej mediálnej prefrontálnej oblasti [48], v temporálnom neokortexe [49] alebo konektivita medzi kortikálnymi oblasťami [48] sa výrazne zvýšila. Naopak, novšie štúdie ukázali, že hoci aktivita hipokampu postupom času klesala, kortikálna aktivita zostala časom stabilná [50] alebo sa tiež znížila [51]. U zvierat sa získali konzistentnejšie dôkazy o reorganizácii mozgových okruhov, ktoré podporujú pamäť v priebehu času [1–3]. Tieto štúdie sa uskutočnili na experimentálne naivných zvieratách.

Skúmaním tohto problému na zvieratách, ktoré si vytvorili predchádzajúcu pamäť strachu, sme zistili, že hipokampus je nevyhnutný na vytvorenie nových spomienok, bez ohľadu na to, či došlo k predchádzajúcemu učeniu strachu. Reorganizácia mozgových okruhov spustená prvým učením však umožňuje neokortexu okamžite zakódovať nové spomienky, jednoducho prostredníctvom bunkových mechanizmov synaptickej konsolidácie. Tento jav sa vzťahuje na spomienky na strach závislé aj nezávislé od hipokampu a bol špecificky vyvolaný pomalou konsolidáciou systému spustenou počiatočnou udalosťou učenia.

Chýbalo u potkanov, kde boli 2 pokusy učenia sa dočasne blízko seba (niekoľko hodín alebo 1 deň) a u tých, kde kortikálna inaktivácia po prvom učenia zabránila preskupeniu kôry a jej následnému zapojeniu do rýchlej asimilácie nových spomienky. Navyše, akonáhle prvé učenie strachu reorganizuje mozgovú konektivitu, cesty zostupujúce z kôry do BLA nie sú potrebné len na uchovanie vzdialených spomienok ako u naivných potkanov, ale aj pre nedávne. Dospeli sme k záveru, že ak bola predtým zakódovaná analogická pamäť, reorganizácia mozgových okruhov už nastala a už nemusí byť potrebná na vytvorenie nových spomienok, ktoré naopak okamžite zapoja kôru a jej súhru s podkôrovými miestami.

Napriek veľkému počtu štúdií demonštrujúcich časovo závislú reorganizáciu mozgových okruhov u naivných zvierat nie je presný účel tohto procesu ani zďaleka definovaný. Pretože behaviorálne reakcie spojené s pamäťou môžu časom zostať podobné, predpokladá sa, že tento proces slúži na zlepšenie stability pamäte v priebehu času [1,2,52]. Na základe našich zistení navrhujeme, že keď k udalosti strachu dôjde prvýkrát, mozgové okruhy prejdú predĺženým procesom reorganizácie, ako je opísané v modeli konsolidácie systému. Tento proces môže slúžiť na preusporiadanie neurónových sietí, ktoré permanentne uchovávajú pamäť strachu, aby mohli okamžite získať nové analogické informácie prostredníctvom mechanizmov synaptickej konsolidácie. Tento operačný mechanizmus môže skutočne urobiť nové učenie „ekonomickejším“, pretože môže znížiť výdavky na zdroje na získavanie nových súvisiacich informácií, čím sa uvoľní viac zdrojov na učenie sa nových, nesúvisiacich informácií.

Dôležitou otázkou, ktorá vyvstáva z našich zistení, je, či predchádzajúce učenie trvalo mení neurónové siete tak, aby podobné skúsenosti mohli byť okamžite uložené v neokortexoch, aj keď sa vyskytujú vo veľmi vzdialených časových intervaloch. Alternatívne sa môže stať, že systém sa prestaví na počiatočnú úroveň naivných zvierat, ak sa v krátkom čase nevyskytnú nové podobné skúsenosti. Experimenty hodnotiace zapojenie neokortexu v rastúcich časových intervaloch medzi prvým a druhým učením objasnia tento bod.

Zistili sme tiež, že blokáda neokortexu počas skorej konsolidácie prvej skúsenosti zabránila okamžitému prideleniu nových podobných skúseností neokortexu (pozri obrázky 1F a 4D). Tieto výsledky naznačujú, že bunkové procesy, ktoré sa vyskytujú bezprostredne po prvom učení v neokortexe, sú nevyhnutné na jeho nábor v procese konsolidácie systémovej pamäte. Táto myšlienka je v súlade so zisteniami, že niektoré „označené“ bunky sa aktivujú v neokortexe pri učení u naivných zvierat a slúžia na ukladanie vzdialených, ale nie nedávnych spomienok [7,8,12,44]. Budúce štúdie sú potrebné na objasnenie, či tieto bunky hrajú túto úlohu aj po predchádzajúcom učení, alebo či sa podieľajú aj na vytváraní nedávnych spomienok.

Pôvodne model konsolidácie systémov viedol k ďalšej myšlienke, že hipokampus sa učí nové informácie rýchlo, zatiaľ čo neokortex sa ich učí pomaly, ale následné štúdie ukázali, že neokortex je schopný aj rýchlych procesov učenia [3,20,21,53]. Naše údaje ukázali, že 2 rôzne kôry (Te2 a ACC) sa môžu okamžite dozvedieť nové informácie, ak sa predtým vyskytla podobná udalosť.

Podľa našich predchádzajúcich štúdií [10,16,17,34,43,45] používame termín Te2 na označenie najzadnejšej oblasti sluchovej oblasti pásu, ktorá na základe Zillesových štúdií [24,25] zahŕňa väčšinou časové asociácie a ektorhinálne oblasti. Hoci nemôžeme vylúčiť, že naše výsledky môžu odrážať príspevky účinkov liekov aj v okolitých regiónoch, konkrétne v priľahlej zrakovej kôre, primárnej sluchovej kôre a peririnálnej kôre, údaje, ktoré sme získali u naivných zvierat, naznačujú, že boli primárne spôsobené inaktiváciou Te. .

Zistili sme, že u naivných zvierat bol Te2 nevyhnutný pre vzdialené, ale nie nedávne sluchové spomienky, zatiaľ čo inaktivácia priľahlej zrakovej kôry zanechala vzdialené sluchové spomienky nedotknuté [10]. Naopak, kombinovaná blokáda primárnej a Te2 kôry narušila aj recentnú pamäť [34]. Podobne inaktivácia prednej peririnálnej kôry zhoršila spomienky na strach [32,54], zatiaľ čo inaktivácia zadnej peririnálnej kôry neovplyvnila nedávne [54] a vzdialené [10] spomienky na strach.

Aj v prípade ACC a kontextových strachových spomienok inaktivácia priľahlej primárnej a sekundárnej motorickej kôry neovplyvnila nedávne a vzdialené spomienky [55], zatiaľ čo inaktivácia susednej prelimbickej kôry narušila nedávne aj vzdialené spomienky [11].

Čo sa týka úlohy, ktorú tieto kôry zohrávajú v pamäťových procesoch, Te2 sa podieľa na zapamätaní emocionálnej hodnoty spárovanej so zvukmi [10,13,16,56]. Táto myšlienka bola nedávno preukázaná aj vo zrakovej kôre vyššieho rádu [57,58]. Na druhej strane ACC môže vytvárať a uchovávať spomienky, ale tiež môže modulovať aktivitu iných kortikálnych oblastí [1–3,6].

Napriek veľkému počtu štúdií, ktoré ukazujú, že Te2 a ACC sú potrebné pre vzdialené, ale nie nedávne spomienky, niektoré nedávne štúdie uviedli, že tieto kôry môžu byť potrebné aj na uchovanie nedávnych zvukových [34,59] a kontextových [55] spomienok na strach. Presné hraničné podmienky, ktoré môžu určovať nevyhnutnosť týchto kortexov pre nedávne spomienky, sú zle pochopené.

Jedna z týchto štúdií naznačila, že intenzita emocionálneho zážitku môže zohrávať dôležitú úlohu [34], ale budúce štúdie by sa mali tejto problematike lepšie venovať. Budúce štúdie budú tiež musieť objasniť, či bunky, ktoré sa aktivujú v neokortexe pri učení u naivných zvierat a ktoré slúžia na ukladanie vzdialených, ale nie nedávnych spomienok [7,8,12,44], tiež zohrávajú túto úlohu po predchádzajúcich učenia, alebo či sa podieľajú na formovaní nedávnych spomienok.

Pokiaľ ide o účasť hipokampu na pamäťových procesoch, zistili sme, že dorzálny hipokampus je potrebný na učenie sa novej kontextovej pamäte, aj keď došlo k predchádzajúcemu kontextovému učeniu. Podobný výsledok sa pozoroval vykonaním návrhu v rámci subjektov na potkanoch, ktoré sa naučili vzdialené aj nedávne kontextové pamäte [60]. Na druhej strane sa tiež ukázalo, že bunkové mechanizmy, ktoré sprostredkúvajú následné učenie v hipokampe, sa môžu líšiť od mechanizmov zahrnutých počas predchádzajúcej štúdie učenia [22,61].

Zistili sme tiež, že u zvierat, ktoré po prvýkrát zažili kontextový strach, je hipokampus potrebný aj 1 týždeň po učení, v súlade s predchádzajúcim zistením u naivných zvierat [46]. Naopak, v druhej skupine hipokampálne lézie neovplyvnili uchovanie pamäti v tomto časovom intervale, čo naznačuje, že predchádzajúce učenie strachu skracuje časové okno postihnutia hipokampu, ako sa tiež pozorovalo pri priestorovom učení [3,20,21]. Tieto štúdie a súčasná štúdia preto poskytujú zbližujúci sa dôkaz, že časové okno dočasnej amnézie vyvolanej hipokampálnymi léziami závisí od predchádzajúcich naučených skúseností v priestorových aj emocionálnych spomienkach.

V týchto štúdiách autori tiež navrhli, že trénovanie potkanov počas dlhšieho obdobia v priestorovej úlohe vytvára „mentálnu“ schému vedomostí, v ktorej možno rýchlo asimilovať nové súvisiace informácie [3,20,21,53]. Aj keď naše zistenia môžu byť v súlade s touto myšlienkou, je veľmi ťažké povedať, či jedna skúška učenia strachu môže vytvoriť asociatívnu „schému“ vedomostí a či je možné do tejto schémy integrovať novú a odlišnú udalosť vyskytujúcu sa v inom prostredí. . Na objasnenie tohto problému sú potrebné ďalšie štúdie. V každom prípade, vzhľadom na to, že väčšina spomienok u ľudí a iných zvierat je postavená na minulých skúsenostiach, mozgové siete, ktoré po prvýkrát ukladajú spomienky na vzdialený strach, môžu byť tie, ktoré kódujú nedávne aj vzdialené spomienky na strach počas celého života.

Metódy experimentálneho modelu a detailov predmetu

Zvieratá

Zdravé samce potkanov kmeňa Wistar (vek, 65 až 70 dní; hmotnosť 250 až 350 g, divoký typ), pochádzajúce z chovu v internom chovnom zariadení pre zvieratá, boli umiestnené po 3 na klietku s potravou a vodou dostupnou ad libitum pri 12-hodinovom svetle. /cyklus tmy (svieti o 7:00 AM) pri konštantnej teplote 22 ± 1˚C. Všetky experimenty boli schválené talianskym ministerstvom zdravotníctva (č. autorizácie 408/2020-PR) a miestnou bioetickou komisiou Turínskej univerzity.

Experimentálny dizajn

Reprodukovateľnosť údajov sa hodnotila s rôznymi replikátmi (tabuľka S1). Prvé experimenty s inaktiváciou CNQX v Te2 (obr. 1A–1C) sa uskutočnili vo vyššom počte replikátov, pretože to boli prvé experimenty, ktoré sme uskutočnili a slúžili na testovanie hlavnej hypotézy našej štúdie. Zvieratá boli a priori priradené k rôznym behaviorálnym skupinám hmotnostne vyváženým spôsobom.

Do každej experimentálnej skupiny boli náhodne pridelení samci z rovnakého chovu. Najprv sme sa zaoberali hlavnou hypotézou našej štúdie, tj kortikálna inaktivácia môže odlišne ovplyvniť konsolidáciu novej pamäte strachu u experimentálne naivných potkanov a u zvierat, ktoré sa naučili predchádzajúce udalosti strachu. V prípade štatistických rozdielov medzi týmito skupinami sme nakoniec vykonali ďalšie kontrolné skupiny pomocou injekcie fyziologického roztoku. Podobný prístup bol aplikovaný na optogenetické experimenty, kde AAV-kontrolná skupina bola vykonaná až po zistení štatistických rozdielov medzi naivnými a predtým trénovanými potkanmi. Tieto harmonogramy pokusov nám umožnili vyhnúť sa zbytočným kontrolným skupinám a používaniu nepotrebných zvierat, čo je kľúčová otázka v európskej a talianskej legislatíve o pokusoch na zvieratách (princíp 3 Rs).

Behaviorálne postupy

Všetky experimenty sa uskutočnili počas svetelnej fázy dňa (8:00 až 16:00). Zvieratá boli prepravované jednotlivo zo zariadenia do experimentálnych miestností v rôznych malých priehľadných vedrách v závislosti od experimentálnych požiadaviek.

Sluchový tréning: Prvé správanie.

Zvieratá podmienené sluchovým strachom (CS1-CS2). V tejto skupine boli potkany jemne vybraté z ich domácej klietky a prenesené z ustajňovacej miestnosti do zvukotesnej miestnosti. Keď tam boli, zvieratá boli umiestnené do kondicionačného zariadenia pozostávajúceho z obdĺžnikovej čiernej klietky (35 × 40} cm) vybavenej tyčovou mriežkou z nehrdzavejúcej ocele (priemer 1 cm, vzdialené od seba 1,5 cm) pripojenou k aplikácii šoku. nastaviť. Potkany boli ponechané nerušené 1 minútu. Po tomto čase bolo podaných 7 podmienených stimulov (CS) pozostávajúcich z čistého tónu s frekvenciou 15 kHz (každý 15 s, 80 dB, 36 s interval pokusov). Posledná 1 s každého tónu bola spárovaná s bolestivým US (0,5 mA, 1 s). Na konci kondicionačnej relácie boli potkany privedené späť do ich domácej klietky.

Zvieratá s iba šokom (šok-CS2). V tejto skupine boli potkany podobne umiestnené do rovnakého kondicionačného zariadenia. Bezprostredne potom bol každý potkan podrobený 7-šokom do nôh (1 s, 0 0,5 mA) jeden po druhom. Na konci stimulácie boli zvieratá privedené späť do ich domácej klietky. Časová stálosť v kondicionačnej klietke bola kratšia ako 9 sekúnd. Predchádzajúce štúdie ukázali, že tento postup umožňuje vyhnúť sa asociačným procesom medzi bolestivými podnetmi a zmyslovými podnetmi [29,30].

Zvieratá podmienené pachovým strachom (zápach-CS2). V tejto skupine boli potkany umiestnené do rovnakej obdĺžnikovej čiernej klietky, ktorá sa používala vo vyššie uvedených experimentálnych skupinách, a boli pripojené k zariadeniu na podávanie šoku. Potkany boli ponechané nerušené 2 minúty. Po tomto čase bolo podaných 7 CS pozostávajúcich z vanilkových vôní (každá trvá 10 s, skúšobný interval 24 s). Posledná 1 s každého zápachu bola spárovaná s bolestivým US (0,5 mA, 1 s). Kondicionačný modul bol umiestnený v blízkosti zdroja ventilácie, aby sa zabránilo pretrvávaniu dodaných stimulov po ich posune. Klietka bola zabezpečená hornou mriežkou. Pachy boli prezentované pomocou prietokového riediaceho čuchometra. Čistý vzduch (1,5 l/min.) bol nasmerovaný do solenoidového ventilu, ktorý pri prevádzke prepúšťal vzduch do 15 ml fľaše obsahujúcej 10 ml vanilkovej vône.

Tónové zvieratá (Tone-CS2). Potkany v tejto skupine boli umiestnené do rovnakej čiernej klietky a bol im prezentovaný tón 15- kHz (7 stimulov, trvanie 15 s, 36 s ITI) dodávaný bez prítomnosti USA.

Vopred vystavené zvieratá (Tone-CS1-CS2). Potkany sa umiestnili do kondicionačnej klietky a o 1 minútu neskôr im bol prezentovaný 20-krát samotný 15-kHz tón a o 24 hodín neskôr bol rovnaký tón spárovaný s tým, že USA sa stali CS1.

Zvieratá podmienené strachom z bieleho šumu (WN-CS2). V tejto skupine sa potkany umiestnili do obdĺžnikovej čiernej klietky a nechali sa nerušené 1 minútu. Po tomto čase bolo podaných 7 CS pozostávajúcich z WN (každá trvá 15 s, 75 dB, 36 s interval medzi pokusmi). Posledná 1 s každého tónu bola spárovaná s bolestivým US (0.5 mA, 1 s). Na konci kondicionačnej relácie boli potkany privedené späť do ich domácej klietky.

Učenie sa sluchovým strachom: Druhý tréning správania.

Dva týždne po postupoch opísaných v predchádzajúcom odseku boli zvieratá trénované v inej inej úlohe podmieňovania sluchového strachu. Potkany sa umiestnili do štandardného boxu na sťahovanie kože, ako v našej predchádzajúcej práci [10] a nechali sa nerušené 2 minúty. Po uplynutí tejto doby bolo dodaných 7 CS pozostávajúcich z čistých tónov s frekvenciou 3 kHz (každý s trvaním 8 s, 80 dB, interval medzi pokusmi 22 s). Posledná 1 s každého tónu bola spárovaná s bolestivým US (0,5 mA, 1 s). Na konci kondicionačnej relácie boli potkany privedené späť do ich domácej klietky.

Strach uchovávanie pamäti. Zachovanie pamäte sluchového strachu nedávno získanej v CS2 (3 kHz) bolo testované o 4 dni neskôr. Pre optogenetické experimenty bol test nedávnej pamäte vykonaný laserovým dodaním 24 hodín po CS2-učení v USA analogicky k časovému intervalu, v ktorom sme vykonali kortikálnu inaktiváciu podaním CNQX (tj 24 hodín po tréning). Potkany boli navyknuté na prístroj odlišný od prístroja používaného na kondicionovanie a umiestnené v inej miestnosti, aby sa vyhli podmienenému správaniu strachu voči kontextovým podnetom [10,62]. Nová aparatúra pozostávala z priehľadnej plastovej klietky s čiernou farbou natretej strany uzavretej v tlmiacom boxe vybavenom odsávacím ventilátorom, ktorý eliminoval zapáchajúci vzduch z krytu a poskytoval hluk pozadia 60 dB. Zvieratá sa nechali skúmať klietku 5 minút denne počas privykacej relácie. V deň testu uchovania pamäte strachu, po 2 minútach voľného skúmania, sme dodali 4 CS2 s frekvenciou 3 kHz (8 s – 22 ITI), po ktorých nenasledovali žiadne US.

Ak to experimentálna požiadavka vyžadovala, potkany sa potom testovali na uchovanie vzdialenej pamäte strachu, získanej 2 týždne pred druhou skúškou podmieňovania sluchového strachu. Za týmto účelom boli 7 dní po teste uchovania pamäte strachu pri tóne 3-kHz zvieratá umiestnené do nového prostredia (čiernobiela pruhovaná klietka) a potom im bol prezentovaný tón 15-kHz. Boli prezentované štyri tóny v 36s intervaloch.

Kontextový tréning: Prvá behaviorálna relácia.

Kontextová skupina podmieňujúca strach (CtxA-CtxB). V tejto skupine boli potkany jemne vybraté z ich domácej klietky, umiestnené do vedra a prenesené z ustajňovacej miestnosti do zvukotesnej miestnosti. Keď tam boli, zvieratá boli umiestnené do kondicionačného prístroja pozostávajúceho z vyššie uvedenej obdĺžnikovej čiernej klietky vybavenej tyčovou mriežkou z nehrdzavejúcej ocele pripojenou k zariadeniu na aplikáciu šoku. Potkany boli ponechané nerušené 1 minútu. Po tomto čase bolo podaných 5 US (0,5 mA, 1 s) v 51-sekundových časových intervaloch. Na konci sedenia boli zvieratá privedené späť do ich domácej klietky.

Skupina iba pre šok (shock-CtxB). Potkany, ktoré sa umiestnili do klimatizačného zariadenia, okamžite dostali jeden po druhom 5-šoky do nôh (1 s, 0 0,5 mA). Časová stálosť v kondicionačnej klietke bola menej ako 7 sekúnd. Predchádzajúce štúdie ukázali, že tento postup umožňuje vyhnúť sa asociačným procesom medzi bolestivými podnetmi a zmyslovými podnetmi [29,30].

Kontextové zvieratá (context-CtxB). Potkany sa umiestnili do rovnakej čiernej klietky, ktorá sa použila vo vyššie uvedených experimentoch, na 5 minút bez dodania akéhokoľvek US.

Nové kontextové podmieňovanie strachu a nedávne uchovávanie pamäte strachu. Dva týždne po procedúrach opísaných v predchádzajúcom odseku boli všetky skupiny trénované tak, aby spájali nové kontextové prostredie (modul skinner box umiestnený v inej miestnosti) s bolestivou US (0.5 mA, 1 s) . Každé zviera sa umiestnilo do novej komory a nechalo sa nerušené 2 minúty. Potom bol vystavený 5 US oddeleným intervalom 30 s.

Zachovanie kontextovej pamäte strachu sa testovalo 4 dni po procedúre podmieňovania strachu tak, že sa potkany opäť umiestnili do komory Skinnerovho boxu na 3 minúty. Pre optogenetické experimenty sa test nedávnej pamäte vykonal laserovým dodaním 24 hodín po učení CtxB-US analogicky k časovému intervalu, v ktorom sme vykonali kortikálnu inaktiváciu podaním CNQX (tj 24 hodín po tréningu). Ak to vyžaduje experimentálny dopyt, potkany sa potom testovali na uchovanie vzdialenej pamäte strachu umiestnením zvierat do kontextu spárovaného s USA 2 týždne pred novým spojením.

Zvieratá boli prenášané v 2 rôznych vedrách do klimatizačných komôr podľa rôznych kontextových postupov.

Zmrazovacie opatrenie. Vo všetkých experimentálnych postupoch bolo hodnotenie retencie pamäte strachu určené ako reakcia na zmrazenie [10], analyzovaná ako úplná absencia somatickej mobility s výnimkou respiračných pohybov. Pre každé zviera sa meralo množstvo času (v sekundách) stráveného zmrazením offline 2 nezávislými pozorovateľmi, ktorí boli slepí voči skupinám zvierat.

For more information:1950477648nn@gmail.com