Ochranný účinok esenciálneho oleja Thymus Serrulatus na kadmiom indukovanú nefrotoxicitu u potkanov prostredníctvom potlačenia oxidačného stresu a zníženia expresie NF-KB, INOS a Smad2 MRNA
Mar 17, 2022
Kontakt: ali.ma@wecistanche.com
Mohd Nazam Ansari1,*, Najeeb Ur Rehman1,*, Aman Karim2, Faisal imám3 a Abubaker M. Hamad4,5
Cistanche deserticola ma na ochorenie obličiek, kliknite sem a získajte vzorku
Abstrakt:
Cieľom výskumu bolo preskúmať ochranný účinok esenciálneho oleja z týmusu serru latus Hochst. bývalý Benth. (TSA olej) protikadmium(Cd)-indukovanéobličkovétoxicita. Experimentálny protokol bol navrhnutý s použitím 30 zdravých dospelých bielych potkanov Wistar rozdelených do skupín súborov obsahujúcich šesť zvierat v každej skupine. Skupina 1 bola liečená ako normálna kontrola a skupiny 2, 3, 4 a 5 boli liečenékadmiumchloridu (CdCl2, 3 mg/kg, IP) počas 7 dní. Skupina 3 bola tiež liečená silymarínom (100 mg/kg, PO) ako štandardná skupina, zatiaľ čo skupinám 4 a 5 sa podával TSA olej v dávkach 100 a 200 mg/kg PO. Nefrotoxicita bola meraná rôznymi parametrami ako naprobličkyfunkčné markery, markery oxidačného stresu (glutatión (GSH) a malondialdehyd (MDA)) a hladiny expresie mediátorovej ribonukleovej kyseliny (mRNA) zápalových faktorov. Histologické štúdie boli tiež hodnotené v experimentálnom protokole. Skupiny liečené CdCl2-vykázali významné zvýšenie hladín séraobličkyfunkčných markerov spolu s hladinami MDA v obličkovom homogenáte. všakobličkovéZistilo sa, že hladina GSH sa výrazne znížila. Zistilo sa, že CdCl2 významne upreguloval hladiny jadrového faktora kappaB (NF-KB p65), indukovateľnej syntázy oxidu dusnatého (iNOS) a malých matiek proti dekapentaplegike (Smad2) v porovnaní s normálnou kontrolnou skupinou. Na druhej strane TSA olej výrazne zlepšil zvýšené hladiny markerov funkcie obličiek v sére, neenzymatických antioxidantov a peroxidácie lipidov. Okrem toho olej TSA významne znížil zvýšenú expresiu NF-KBp65, iNOS a Smad2 u potkanov intoxikovaných Cd. Okrem toho, histologické zmeny vo vzorkách tkaniva obličiek skupín liečených Cd sa významne zlepšili v skupinách liečených silymarínom a TSA olejom. Táto štúdia ukazuje, že TSA olej zlepšuje Cd-indukovanéobličkovéporanenia a tiež sa navrhuje, že pozorovaný nefroprotektívny účinok by mohol byť spôsobený antioxidačným potenciálom TSA oleja a hojením vďaka jeho protizápalovému účinku.
Kľúčové slová:kadmium; zápal; NF-KB; poškodenie obličiek; Smad 2; Thymus serrulatus
1. Úvod
Expozícia chemikáliám v životnom prostredí zostáva celosvetovo hlavným problémom verejného zdravia. Expozícia kadmiu (Cd), jednému z najreaktívnejších toxických kovov, sa v biosfére zvýšila z prírodných aj antropogénnych zdrojov [1]. Expozícia Cd je tiež spôsobená kontamináciou pôdy, vzduchu, vody a potravín, ako aj cigaretovým dymom [2]. Výrazne zvýšená absorpcia spolu so zníženou rýchlosťou vylučovania vedie k zvýšenej záťaži Cd v rôznych orgánoch. Cd môže poškodiť viaceré orgány v závislosti od jeho dávky, cesty a trvania, ale hlavne ovplyvňujeobličkya spôsobuje poruchu funkcie obličiek [3].
Theobličkysú životne dôležité orgány v ľudskom tele a sú zodpovedné za rôzne základné funkcie, vrátane odstraňovania škodlivých metabolitov, dusíkatých odpadov a niektorých liečiv močom [4]. Skoršie štúdie uvádzali, že toxicita Cd vedie k ireverzibilnej dysfunkciiobličkovétubuly [5] a spôsobuje znížené odstraňovanie toxických chemikálií, liekov alebo oboch, ktoré vedú k akútobličkyzlyhanie. navyšeobličkovéporanenie spôsobené chronickou expozíciou Cd môže viesť k chronickému zlyhaniu obličiek a ak sa nelieči, môže viesť k smrti [6,7]. Akumulácia Cd v proximálnych stočených tubuloch bráni tubulárnej reabsorpcii a vedie k polyúrii a proteinúrii. Uskutočnili sa štúdie o bežných abnormálnych účinkoch Cd na funkciu obličiek, stále však chýbajú podrobné informácie o molekulárnych mechanizmoch a je potrebné ich ďalej preskúmať [8].
Štúdie za posledných niekoľko desaťročí ukázali, že maximálna pravdepodobnosťobličkovépoškodenie je spôsobené uvoľňovaním Cd v bunke, ktoré vyvoláva oxidačný stres [9,10]. Jedným z navrhovaných mechanizmov je narušenie prirodzeného antioxidačného obranného systému, ktoré ďalej spôsobuje nadprodukciu voľných kyslíkových radikálov (OFR) [11] a vedie k zníženiu hladín glutatiónu (GSH) a následne k apoptóze súvisiacej s oxidačným stresom [ 12]. Z niekoľkých hlásených mechanizmov je za peroxidáciu lipidov zodpovedný najmä znížený obsah GSH a poškodenie buniek indukované OFR [13,14].
Predchádzajúca literatúra tiež zistila, že korelácia medzi oxidačným stresom a zápalom zvyšuje rôzneobličkovéchoroby [15]. Preto možno predpokladať, že renálna toxicita je spôsobená Cd prostredníctvom komplexných intracelulárnych signálnych dráh, ktoré sú riadené hlavne oxidačným stresom. Nukleárny faktor-κB (NF-κB) riadi niekoľko zápalových génov vo všetkých typoch buniek [16]. NF-κB je hlavnou príčinou rôznychobličkyochorenia a môžu byť aktivované expozíciou Cd. Chronické ochorenie obličiek sa zistilo na ľudských aj zvieracích modeloch prostredníctvom upregulácie proteínov Smad2 [9]. Skoršie štúdie uviedli, že downregulácia NF-κB a Smad2 môže byť prospešným mechanizmom pre protizápalové lieky [17].
V rámci liečebných postupov sa predpokladá, že za hlavný možný prístup na liečbu nefrotoxicity vyvolanej Cd sa považuje zoslabenie oxidačného stresu vyvolaného Cd pomocou antioxidantov buď z prírodných alebo syntetických zdrojov. Preto výskumníci nedávno hľadali obranné mechanizmy proti toxicite spôsobenej chemikáliami alebo liekmi a zvažovali aj biologicky aktívne zlúčeniny s antioxidačným a zápalovým účinkom [18,19].
V rôznych častiach sveta sa rôzne druhy rodu Thymus tradične používajú na liečbu rôznych porúch, ako je bronchitída, astma, čierny kašeľ, laryngitída, tonzilitída a kašeľ [20]. Thymus serrulatus Hochst. Ex Benth (čeľaď Lamiaceae) rastie v Etiópii a tradične sa používa na liečbu chrípky [21] a kašľa [22]. T. serrulatus je veľmi rozvetvený trvalý podker, ktorý rastie v afromontánskych a afroalpínskych zónach Etiópie a Eritrei [23].
Uvádza sa, že T. serrulatus má anthelmintické, antibakteriálne, fungicídne [23], diuretické [22], vazodilatačné [24] a antihyperlipidemické [25] účinky. Ďalej sa uvádza, že esenciálny olej z T. serrulatus (TSA olej) má okrem iného antiseptické, antifungálne a červivé vlastnosti [26]. Esenciálny olej rastliny z rôznych etiópskych lokalít vykazoval sľubnú hepatoprotektívnu aktivitu u potkanov [27]. Predchádzajúce štúdie navyše ukázali, že farmakologické aktivity esenciálneho oleja pozitívne korelujú s prítomnosťou aktívnych zložiek, ako je tymol, karvakrol, p-cymén, -terpinén a kyselina rozmarínová [26,27]. Na druhej strane, tymol a karvakrol, ktoré boli nájdené ako hlavné zložky esenciálneho oleja, sú dôležité prírodné produkty s aktivitami zachytávajúcimi voľné radikály a antioxidačnými vlastnosťami [28]. Predchádzajúca štúdia uviedla, že kombinácia tymolu a karvakrolu mala synergické nefroprotektívum
účinok, ktorý možno pripísať antioxidačným, protizápalovým a antiapoptickým aktivitám [29]. Okrem toho tymol a karvakrol, ktoré boli nájdené ako hlavné zložky v rastlinách obsahujúcich esenciálne oleje, tiež spôsobili pokles imunoglobulínu E (IgE), interleukínu-4 (IL-4), interleukínu{ hladiny {6}} (IL-5) a interleukínu-13 (IL-13), ako aj počet zápalových buniek, ktoré spôsobujú poruchy dýchacích ciest [30].
Pokiaľ je nám známe, účinok T. serrulatus na nefrotoxicitu nebol zaznamenaný. V tejto štúdii sme teda predpokladali a pokúsili sme sa preskúmať nefroprotektívny účinok esenciálneho oleja extrahovaného z T. serrulatus etiópskeho pôvodu proti nefrotoxicite vyvolanej Cd pomocou potkanov Wistar albino vyhodnotenímobličkyfunkčné markery, zápalové markery, antioxidačný stav a histologické zmeny.
2. Výsledky
2.1. Výťažok esenciálneho oleja ( percentá )
Hydrodestilácia nadzemnej časti T. serrulatus poskytla 0,09 % (obj./hmot.) svetložltý esenciálny olej s charakteristickým zápachom.
2.2. Účinok TSA oleja na biomarkery funkcie obličiek
Zistilo sa, že hladiny močoviny v krvi, kyseliny močovej, kreatinínu a dusíka močoviny v krvi (BUN) boli významne zvýšené (p < 0,01)="" u="" potkanov,="" ktorí="" boli="" liečení="" iba="" cd="" (3="" mg/kg,="" ip="" )="" na="" 7="" dní.="" avšak="" podávanie="" tsa="" oleja="" a="" silymarínu="" potkanom="" intoxikovaným="" cd="" podstatne="" zlepšilo="" indukciu="">obličkypoškodenie špecifikované zníženými hladinami močoviny v krvi, kyseliny močovej, kreatinínu a BUN (obrázok 1A–D).
2.3. Účinok TSA oleja na peroxidáciu lipidov a oxidačný stres
Theobličkovétkanivo potkanov vykazovalo významne zvýšené hladiny peroxidácie lipidov v zmysle MDA a zníženie obsahu GSH po podaní Cd. Okrem toho liečba TSA olejom v dávkach 100 a 200 mg/kg znižuje hladiny MDA v závislosti od dávky u potkanov intoxikovaných Cd. Ďalej boli hladiny GSH významne zvýšené v skupinách liečených TSA olejom a silymarínom v porovnaní so skupinou Cd (obrázok 2A, B).
2.4. Účinky TSA oleja na expresiu mRNA p65, NF-KB, iNOS a Smad2
Zmeny v signalizačných udalostiach sa hodnotili pomocou Western blottingu. Analýza Western blot naznačila, že expozícia Cd významne (p < 0="" 0,001)="" upregulovala="" expresiu="" nf-kb="" p65,="" inos="" a="" smad2="" mrna="" v="" porovnaní="" s="" referenčnou="" skupinou.="" liečba="" tsa="" olejom="" významne="" znížila="" expresiu="" mrna="" p65,="" nf-kb,="" inos="" a="" smad2="" spôsobom="" závislým="" od="" dávky="" v="" porovnaní="" s="" potkanmi="" vystavenými="" iba="" expozícii="" cd="" (obrázok="">
2.5. Účinok TSA oleja na histopatológiu
Histopatologická analýza kontrolnej skupiny potkanov ukázala normálneobličkyhistologická architektúra s normálnymi stočenými tubulmi, glomerulom a Bowmanovou kapsulou s normálnym priestorom, ako aj s normálnym stavom kolagénových vlákien a materiálov pozitívnych na kyselinu periodickú – Schiff (PAS), ako je bazálna membrána (obrázok 4). Mikrofotografie toxickej skupiny ukazujú abnormálne glomeruly (G), degeneráciu (D) a nekrózu (N) stočených tubulov a degenerovaný a takmer chýbajúci Bowmanov priestor. Abnormálne stočené tubuly naznačujú histologické narušenie (T), blokované poškodeným tkanivom (B) a nekrózu. Mikrosnímka toxickej skupiny zafarbenej Massonovým trichómom (MT) ukazuje zvýšené množstvo kolagénových materiálov (C). Okrem toho mikrofotografia toxickej skupiny zafarbenej PAS ukazuje abnormálne ukladanie PAS-pozitívnych materiálov (P), ktoré vytlačili parenchým obličiek; tiež ukazuje slabosť alebo stratu intaktnej bazálnej membrány (L). Liečba TSA olejom v nízkej dávke obnovila normálne glomeruly a normálne stočené tubuly, aj keď stále dochádzalo k miernemu utrpeniu toxickými účinkami vo forme blokovania tubulov (B) a malého zvýšenia kolagénového materiálu (C), ako aj abnormálneho ukladania PAS-pozitívne materiály (P). Ošetrenie TSA olejom vo vysokej dávke poskytlo histologické snímky takmer normálneho histologického vzhľadu veľmi blízkeho tomu pri štandardnom ošetrení (zväčšenie 400x a mierka 20 um pre všetky mikrofotografie).
3. Diskusia
V prostredí sú zvyčajne prítomné ťažké kovy, ktoré sú náchylné na absorpciu, oxidáciu a zasahovanie do osudu buniek. Najmä Cd je prírodná priemyselná zlúčenina, ktorá spôsobuje množstvo toxických a nebezpečných účinkov, vrátane nefrotoxicity, na ľudské zdravie [31,32]. Jeho ukladanie v rôznych orgánoch spôsobuje oxidačný stres, ktorý oslabuje funkciu prirodzeného antioxidačného systému a v dôsledku toho vedie k rozvoju rôznych závažných patologických ochorení [33]. Cesta Cd-indukovanej toxicity zahŕňa produkciu reaktívnych foriem kyslíka (ROS), ktorá následne spôsobuje poškodenie obličiek [34]. Preto možno predpokladať, že antioxidanty môžu byť dobrým cieľom pre možný terapeutický prístup k toxicite súvisiacej s Cd [35]. V tejto správe sme študovali sľubný zlepšujúci účinok oleja TSA na oxidačný stres vyvolaný Cd a poškodenie obličiek pomocou potkanov.
Závažné poškodenie obličiek vyvolané Cd môže byť spojené so zvýšenými hladinami močoviny, kyseliny močovej a kreatinínu v sére v dôsledku úniku do krvného obehu [36,37]. V tejto štúdii boli tiež hlásené významne zvýšené hladiny močoviny, kyseliny močovej a kreatinínu v sére po expozícii Cd počas 7 dní, čo potvrdilo vážne poškodenie obličiek (obrázok 1). Pozorované výsledky potvrdzujú predchádzajúce štúdie [19,38]. Podávanie TSA oleja v oboch dávkach (100 a 200 mg/kg, PO) významne zlepšuje renálnu dysfunkciu vyvolanú Cd, ktorá bola podporená zníženými hladinami močoviny, kyseliny močovej a kreatinínu v sére. V tejto štúdii sa zistilo, že expozícia Cd má za následokobličkypoškodenie zvýšením peroxidácie lipidov a narušením prirodzeného antioxidačného systému, čo naznačuje zvýšený oxidačný stres. Pozorované zistenia naznačujú, že TSA olej by mohol zabrániť zmenám vyvolaným Cd v premenných súvisiacich s antioxidantmi u potkanov. Tieto zistenia sú v súlade so zisteniami Kawamota a kol. [39], ktorí uviedli zvýšenú peroxidáciu lipidov po expozícii Cd. Skoršie štúdie uvádzali, že chronická expozícia Cd viedla k zníženiu neenzymatických (tkanivový GSH) antioxidantov [40]. Zistenia z tejto štúdie potvrdzujú zistenia Koyuturka a kol. [41], ktorí opísali znížený obsah GSH v obličkách u potkanov intoxikovaných Cd. Znížený obsah GSH môže byť spôsobený jeho konzumáciou pri prevencii peroxidácie lipidov spôsobenej oxidačným stresom [41] a detoxikácii ťažkých kovov [42,43]. Naše zistenia však nesúhlasia so zisteniami Kamiyama et al. [44], ktorí opísali zvýšenú hladinu renálneho GSH u potkanov liečených Cd. Peroxidácia lipidov a hladina antioxidantov u potkanov liečených Cd boli významne modulované podávaním TSA oleja, čo naznačuje zníženie ROS, opätovné vyváženie antioxidačného obranného systému alebo oboje. Tieto zistenia potvrdzujú zistenia z predchádzajúcej štúdie, ktorá opísala zlepšujúci účinok tymochinónu proti chemicky indukovanému poškodeniu obličiek [45].
Apoptóza sa vyskytuje v tkanivách a mení sa od nekrózy pri určitých funkčných poruchách [46]. Apoptóza je jednou z hlavných charakteristík súvisiacich s Cdobličkyzranenie. Už skôr bolo opísané, že toxicita Cd spôsobuje apoptózu v proximálnych tubuloch prostredníctvom stimulácie NF-kB dráhy, ktorá prispieva k renálnej dysfunkcii [47,48]. V tejto štúdii sa tiež pozorovala zvýšená expresia proteínu NF-kBp65 u potkanov liečených Cd. Avšak podávanie TSA oleja potkanom liečeným Cd podstatne obnovilo expresiu proteínu NF-kBp65. Pozorované zistenia sú v zhode s predchádzajúcimi zisteniami [18,19]. Preto inhibícia NF-kB u potkanov intoxikovaných Cd preukázala protizápalovú schopnosť TSA oleja.
Inducibilná syntáza oxidu dusnatého (iNOS) je vysoko exprimovaná pri zápalových stavoch a infekciách. Je teda dôležitou súčasťou adaptívnej reakcie hostiteľa na škodlivé stimuly. Už skôr bolo uvedené, že poškodenie obličiek indukované Cd je sprostredkované syntézou oxidu dusnatého stimuláciou iNOS [49]. V tejto štúdii sa tiež zistilo, že expozícia Cd spôsobuje zvýšenú expresiu iNOS (obrázok 3B), zatiaľ čo olej TSA v oboch dávkach môže významne zvrátiť expresiu iNOS u potkanov intoxikovaných Cd.
Predchádzajúca literatúra uvádzala, že Cd je jedným z najtoxickejších ťažkých kovov a je absorbovaný najmä proximálnymi tubulmi a akumulovaný väčšinou v renálnej kôre, čo vedie k léziám v proximálnych stočených tubuloch [50]. Tieto zistenia potvrdzujú zistenia tejto štúdie. Majorobličkypoškodenie bolo overené prítomnosťou významného poškodenia glomerulov u potkanov liečených Cd. Tieto nálezy potvrdzujú nálezy Damka Poprawu a Sawicka-Kapustu [51], ktorí hlásili atrofiu glomerulárnych kapilár a nekrózu proximálnych tubulov. Zistenia oobličkyfunkčné markery a markery oxidačného stresu – kde TSA olej zlepšil degeneratívne zmeny vyvolané Cd a zlepšilobličkyfunkcia vďaka svojim možným antioxidačným a protizápalovým účinkom – bola potvrdená histopatologickými pozorovaniami.
4. Materiály a metódy
4.1. Chemikálie a činidlá
Chlorid kademnatý (CaCl2) bol získaný od Sigma Chemicals Co. (St. Louis, MO, USA).Obličkysúpravy na diagnostiku funkcií boli získané od Crescent Diagnostics (Jeddah, KSA). Protilátky (primárne aj sekundárne) boli získané zo Santa Cruz (Dallas, TX, USA). Použité chemikálie boli analytickej kvality a vysokej kvality, ktoré nevyžadovali ďalšie čistenie.
4.2. Rastlinný materiál a ťažba
Čerstvé nadzemné časti T. serrulatus Hochst. ex Benth bol zozbieraný z oblasti pohoria Amba Alaje, Južný Tigray, Etiópia. Rastlinný materiál overil botanik Dr. Getinet Masresha z Katedry biológie Univerzity v Gondare a exemplár bol uložený v herbári univerzity (TH{0}}/2011).
Čerstvé nadzemné časti boli narezané na malé kúsky a podrobené hydrodestilácii počas 3 hodín pomocou prístroja Clevenger. Hydrodestilácia sa uskutočnila 11-krát, kým sa nezozbieralo dostatočné množstvo. Získaný esenciálny olej bol vysušený pomocou bezvodého síranu sodného a uskladnený v tesne uzavretej nádobe pri teplote 4 ◦C až do ďalšieho použitia [26]. Vypočítaný výťažok esenciálneho oleja bol vyjadrený v percentách (% obj./hmot.) na základe hmotnosti čerstvého rastlinného materiálu.
4.3. Zvieratá
Tridsať samcov albínov s hmotnosťou 180 až 220 g bolo získaných z Animal House, College of Pharmacy, Prince Sattam Bin Abdulaziz University (PSAU), KSA. Potkany sa aklimatizovali počas 1 týždňa a udržiavali sa v 12-hodinových cykloch svetlo/tma so štandardnými laboratórnymi zariadeniami. Počas experimentálneho a aklimatizačného obdobia boli zvieratá kŕmené peletovou stravou a voľným prístupom k vode. Pri vykonávaní všetkých experimentov boli dodržané pokyny a usmernenia poskytnuté jednotkou starostlivosti o zvieratá, PSAU, KSA. Protokol bol vopred schválený Výborom pre bioetický výskum (BERC), PSAU (BERC-004-12-19).
4.4. Experimentálny dizajn
Na vyhodnotenie nefroprotektívneho účinku TSA oleja proti toxicite vyvolanej Cd boli potkany náhodne rozdelené do piatich skupín (n=6). Skupina 1 (normálna kontrola) dostávala fyziologický soľný roztok (0,9 percent NaCl) denne počas 7 dní. Skupina 2 (toxická kontrola) dostávala chlorid kademnatý (3 mg/kg, IP, 7 dní). Skupine 3 (pozitívna kontrola) sa súbežne podával CdCl2 a silymarín (100 mg/kg, PO) počas 7 po sebe nasledujúcich dní. Skupinám 4 a 5 sa súčasne podával CdCl2 a TSA olej v dávkach 100 a 200 mg/kg (PO, 7 dní). Dávka CdCl2 bola vybraná na základe predtým publikovanej literatúry [19,52].
Po 24 hodinách liečby sa všetky samce potkanov anestetizovali malým množstvom dietyléteru, aby sa odobrali vzorky krvi z retroorbitálneho plexu, po čom nasledovala centrifugácia a vykonala sa separácia séra a uskladnila sa pri -20 °C až do ďalšieho použitia. na určenieobličkyfunkčné markery (ako kyselina močová, kreatinín a močovina). Po úspešnom odbere séra boli od všetkých potkanov izolované obe obličky. Ľavýobličkysa okamžite skladoval pri -80 ◦C až do ďalšej analýzy markera oxidačného stresu (MDA a GSH) a analýzy Western blot. Medzitým bola pravá oblička uložená na histopatologické štúdie.
4.5. Stanovenie biomarkeru funkcie obličiek
sBiomarkeryobličkyfunkcia, tj kyselina močová, močovina a kreatinín, boli hodnotené s použitím špecifických komerčných súprav podľa metód uvedených v protokoloch výrobcov.
4.6. Stanovenie markerov oxidačného stresu v obličkách
Tkanivá sa homogenizovali a rozomleli (10 % hmotn./obj.) v ľadovo studenom 0,1 M fosfátovom pufri pri pH 7,4 a roztok sa centrifugoval 30 minút pri 12,000× g a 4 ◦ C. Získaný homogenát sa použil na odhad hladín GSH a MDA.
Marker peroxidácie lipidov MDA sa odhadol pomocou skôr opísanej metódy [53]. Stručne, 0,25 ml homogenátu sa inkubovalo pri teplote 37 stupňov počas 1 hodiny v metabolickej trepačke. Po inkubácii sa pridalo 0,5 ml 0,67 % kyseliny tiobarbiturovej (TBA) a 0,5 ml 5 % (w/v) vychladenej kyseliny trichlóroctovej (TCA). Potom nasledovala centrifugácia (1000 x g, 15 minút). Potom sa supernatant udržiaval vo vriacom vodnom kúpeli počas 10 minút. Vyvinutá absorbancia bola meraná pri 535 nm, tj pozorovaná ružová farba.
Pokiaľ ide o GSH, Jollow et al. [54] bola dodržaná metóda. Stručne povedané, po vyzrážaní 1 ml PMS s 1 ml kyseliny sulfosalicylovej (4 percentá) sa testované vzorky inkubovali (4 ◦C, 1 h), po čom nasledovala centrifugácia (1200× g , 15 min, 4 ◦C). Testovacia zmes obsahovala supernatant (0,1 ml), fosfátový pufor (0,1 M, pH 7,4) (1,7 ml) a kyselinu ditiol-bis-2-nitrobenzoovú (DTNB) (0,4 percent vo fosfátovom pufri, 0,1 M, pH 7,4) (0,2 ml) v celkovom objeme 2,0 ml. Absorbancia vzoriek sa analyzovala pri 412 nm do 5 minút po pridaní DTNB do reakčných zmesí.
4.7. Technika Western Blot
Analýza Western blot a extrakcia proteínov sa uskutočnili tak, ako bolo uvedené v predchádzajúcej štúdii [55].Obličkytkanivá boli rozomleté a homogenát bol pripravený v zmesi inhibítora proteázy a studenom pufri na lýzu proteínov [55]. Na izoláciu celkových proteínov sa tkanivové lyzáty uchovávali v ľade počas 60 minút s alternatívnym vortexovaním (po 10 minútach) a pokračovalo sa v centrifugácii pri 12, 000 x g (4 ◦C, 10 minút). Metóda Lowryho a kol. [56] sa sledovalo stanovenie celkového proteínu. Na analýzu Western blot sa proteín (25–50 ug) krátko izoloval z každej skupiny a presunul sa na nitrocelulózové membrány získané od Bio-Rad USA. Okamžité blokovanie proteínových blotov sa uskutočnilo pri 4 °C (24 hodín); potom sa uskutočnila inkubácia s primárnymi protilátkami proti NF-KB p65, iNOS a Smad2 a sekundárnymi protilátkami konjugovanými s peroxidázou pri teplote miestnosti. Proteíny sa analyzovali pomocou chemiluminiscenčnej detekčnej súpravy (GE Health Care, Mississauga, Kanada). Intenzita proteínových pásov bola normalizovaná na beta-aktínové pásy pomocou ImageJ (NIH, Bethesda, USA). Obrázky boli zachytené pomocou chemiluminiscenčného Western blot skenera aC-Digit získaného od LI-COR, USA.
4.8. Histopatologická analýza
Správnyobličkyvzorky tkaniva fixované v 10 percentnom neutrálnom formalíne boli spravované v zariadení na spracovanie tkaniva (ASP300s, Leica Biosystems, IL, USA); každá vzorka bola zaliata do parafínového vosku a nakrájaná na rezy s hrúbkou 4–5-μm. Z každej skupiny sa vybrali tri rezy a zafarbili sa hematoxylínovým a eozínovým (H&E) farbivom, farbivom kyselinou jodistou – Schiff (PAS) a farbivom Massonovým trichrómom (MT) [57]. Všetky rezy tkaniva boli analyzované pomocou mikroskopu (Olympus BX 52) na histopatologický popis, ktorý bol zaznamenaný histopatológom, zaslepeným voči experimentálnym skupinám. Na fotografovanie bol použitý fotoaparát Olympus DP21 upevnený nad mikroskopom.
4.9. Štatistická analýza
Hodnoty boli vyjadrené ako priemer ± SEM. Na meranie významnosti biochemických údajov rôznych skupín sa použila jednosmerná analýza ANOVA s použitím post hocTukeyho testu. Rozdiely boli namerané významne pri hodnotách p < 0.05="" v="" porovnaní="" s="" normálnou="" kontrolnou="" alebo="" toxickou="" kontrolnou="" skupinou.="" štatistické="" vyšetrovanie="" sa="" uskutočnilo="" pomocou="" graphpadprism="" v.="" 4.0="">
5. Závery
Táto štúdia dospela k záveru, že esenciálny olej T. serrulatus zlepšil Cd-indukované poškodenie obličiek, ktoré bolo pravdepodobne sprostredkované zlepšením zmenených parametrov biochemického a oxidačného stresu okrem zlepšenia histologických štruktúr. Okrem toho môže byť T. serrulatus vhodným činidlom, ktoré sa má v budúcnosti vyvinúť na ochranu obličiek aobličky-súvisiace poruchy.
Financovanie:Tento výskum nezískal žiadne externé financovanie.
Vyhlásenie o dostupnosti údajov:Zdieľanie údajov sa neuplatňuje.
Konflikt záujmov:Autori nedeklarujú žiadny konflikt záujmov. Investori nezohrávali žiadnu úlohu pri navrhovaní štúdie; pri zbere, analýzach alebo interpretácii údajov; pri písaní rukopisu; alebo v rozhodnutí o zverejnení výsledkov.
Dostupnosť vzorky:Vzorky esenciálneho oleja TSA sú dostupné u autorov.
Referencie
1. Dua, TK; Dewanjee, S.; Khanra, R.; Bhattacharya, N.; Bhaskar, B.; Zia-Ul-Haq, M.; De Feo, V. Účinky dvoch bežných jedlých bylín, Ipomoea aquatic a Enhydra fluctuans, na kadmiom indukovanú patofyziológiu: Zameranie na oxidačnú obranu a antiapoptotický mechanizmus. J. Transl. Med. 2015, 13, 245. [CrossRef] [PubMed]
2. Elkhadragy, MF; Abdel Moneim, AE Ochranný účinok metanolového extraktu Fragaria ananassa na hepatotoxicitu vyvolanú chloridom kademnatým (CdCl2) u potkanov. Toxicol. Mech. Metódy 2017, 27, 335–345. [CrossRef]
3. Wu, H.; Liao, Q.; Chillrud, SN; Yang, Q.; Huang, L.; Bi, J.; Yan, B. Environmentálna expozícia kadmiu: Hodnotenie zdravotného rizika a jeho asociácie s hypertenziou a poruchou funkcie obličiek. Sci. Rep. 2016, 6, 29989. [CrossRef]
4. Ferguson, MA; Vaidya, VS; Bonventre, JV Biomarkery nefrotoxického akútneho poškodenia obličiek. Toxikológia 2008, 245, 182–193. [CrossRef] [PubMed]
5. Ibrahim, MA; Almaden, AH; El Moneim, MA; Tammam, HG; Khalifa, AM; Nasibe, MN Hematologická, renálna a hepatálna toxicita vyvolaná kadmiom: zlepšenie Spirulina platensis. Saudi J. Forensic Med. Sci. 2018, 1, 5–13. [CrossRef]
6. Galley, HF Je možné predísť akútnemu zlyhaniu obličiek? JR Zb. Surg. Edinb. 2000, 45, 45–50. [PubMed]
7. Finn, W.; Porter, G. Močové biomarkery a nefrotoxicita. V Clinical Nephrotoxins, 2. vydanie; Kluwer Academic Publishers: Norwell, MA, USA, 2003; s. 621–655.
8. Prozialeck, WC; Edwards, JR Mechanizmy poškodenia proximálneho tubulu vyvolaného kadmiom: Nové poznatky s dôsledkami pre biomonitoring a terapeutické zásahy. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2012, 343, 2–12. [CrossRef] [PubMed]
9. Lan, HY Rôzne úlohy TGF-8/Smads pri renálnej fibróze a zápale. Int. J. Biol. Sci. 2011, 7, 1056–1067. [CrossRef] [PubMed]
10. Luo, T.; Liu, G.; Long, M.; Yang, J.; Song, R.; Wang, Y.; Yuan, Y.; Bian, J.; Liu, X.; Gu, J.; a kol. Liečba kadmiom indukovaného renálneho oxidačného poškodenia u potkanov podávaním kyseliny alfa-lipoovej. Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 2017, 24, 1832–1844. [CrossRef] [PubMed]
11. Angeli, JK; Cruz Pereira, CA; de Oliveira Faria, T.; Stefanon, I.; Padilha, AS; Vassallo, DV Expozícia kadmia indukuje vaskulárne poškodenie v dôsledku endotelového oxidačného stresu: Úloha lokálneho angiotenzínu II a COX-2. Voľný Radic. Biol. Med. 2013, 65, 838–848. [CrossRef]
12. Orororo, OC; Asagba, SO; Tonukari, NJ; Okandeji, Ú. v. Mbanugo, JJ Účinky ibišteka Sabdarrifa L. Antokyány na oxidačný stres vyvolaný kadmiom u potkanov Wistar. J. Appl. Sci. Environ. Manag. 2018, 22, 465–470. [CrossRef]
13. Inoue, M. Ochranné mechanizmy proti reaktívnym formám kyslíka. In The Liver: Biology and Pathobiology, 5. ed.; Arias, IM, Boyer, JL, Fausto, N., Jokoby, WB, Schachter, DA, Shafritz, DA, Eds.; Raven Press: New York, NY, USA, 2011; s. 443–459.
14. Yadav, RK; Singh, M.; Roy, S.; Ansari, MN; Saeed, AS; Kaithwas, G. Modulácia reakcie na oxidačný stres ľanovým olejom: Úloha peroxidácie lipidov a základné mechanizmy. Prostaglandíny Iné lipidové mediátory. 2018, 135, 21–26. [CrossRef] [PubMed]
15. Gong, X.; Ivanov, VN; Davidson, MM; Hei, TK Tetrametylpyrazín (TMP) chráni pred nefrotoxicitou vyvolanou arzenitanom sodným potlačením produkcie ROS, mitochondriálnej dysfunkcie, prozápalových signálnych dráh a programovanej bunkovej smrti. Arch. Toxicol. 2015, 89, 1057–1070. [CrossRef] [PubMed]
16. Bonizzi, G.; Karin, M. Dve aktivačné dráhy NF-KB a ich úloha vo vrodenej a adaptívnej imunite. Trendy. Immunol. 2004, 25, 280-288. [CrossRef]
17. Imam, F.; Al-Harbi, NO; Al-Harbi, MM; Ansari, MA; Al-Asmari, AF; Ansari, MN; Al-Anazi, WA; Bahashwan, S.; Almutairi, MM; Alshammari, M.; a kol. Apremilast zabraňuje doxorubicínom indukovanej apoptóze a zápalu v srdci prostredníctvom inhibície aktivácie NF-B signálnych dráh sprostredkovanej oxidačným stresom. Pharmacol. Rep. 2018, 70, 993–1000. [CrossRef]
18. Erboga, M.; Kanter, M.; Aktas, C.; Sener, U.; Erboga, ZF; Donmez, YB; Gurel, A. Thymoquinone zlepšuje kadmiom indukovanú nefrotoxicitu, apoptózu a oxidačný stres u potkanov je založený na jeho antiapoptotických a antioxidačných vlastnostiach. Biol. Trace Elem. Res. 2016, 170, 165–172. [CrossRef]
19. Ansari, MN; Aloliet, RI; Ganaie, MA; Khan, TH; Rehman, N.; Imam, F.; Hamad, AM Roflumilast, inhibítor fosfodiesterázy 4, zmierňuje renálnu toxicitu vyvolanú kadmiom prostredníctvom modulácie aktivácie NF-KB a indukcie NQO1 u potkanov. Human Exp. Toxicol. 2019, 38, 588–597. [CrossRef]
20. Begrow, F.; Engelbertz, J.; Feistel, B.; Lehnfeld, R.; Bauer, K.; Verspohl, EJ Vplyv tymolu vo výťažkoch z tymianu na ich antispazmodický účinok a ciliárny klírens. Planta Med. 2010, 76, 311–318. [CrossRef]