skJazyk
Domov / Vedomosti / Obsah

Vedomosti

Ochranné účinky Cistanche proti H2O2/UVB-indukovanej degradácii dermálneho fibroblastového kolagénu prostredníctvom Hsa-microRNA-4535-sprostredkovanej signalizácie TGF/Smad

May 06, 2023

ABSTRAKT

Cieľom tejto štúdie bolo preskúmať mechanizmus, ktorý je základomochranné účinky cistancheproti poškodeniu vyvolanému H2O2/UVB pomocou in vitro a in vivo modelov fotopoškodenia. Okrem toho sme identifikovali zapojenie regulácie miRNA do tohto procesu. Ľudské dermálne fibroblasty HS68 ošetrené H202/UVB a nahé myši C57BL/6J indukované UVB sa použili ako in vitro a in vivo modely poškodenia svetlom. Ukázali to výsledkycistanche liečbazmiernil H2O2/UVB-indukované zníženie životaschopnosti buniek, Porucha signalizácie TGF/Smada dermálne starnutie. Na základe výsledkov analýz mikroRNA poľa a prehľadávania databáz bol has-miR-4535 identifikovaný akopotenciálny kandidát miRNA, ktorý sa zameriava na Smad4. In vitro liečba cistanche aktivovala komplex Smad2/3/4 a inhibovala expresiu hsa-miR-4535 v bunkách vystavených H2O2/UVB. In vivo lokálna aplikácia nízkych (12 mg/kg) a vysokých dávok (24 mg/kg) cistanche na dorzálnu kožu nahých myší C57BL/6J významne zmiernila fotopoškodenie kože vyvolané UVB žiarením podporou signalizácie syntézy kolagénu TGF/Smad, zníženie epidermálnej hyperplázie, tvorby vrások a starnutia kože, ako aj inhibíciu expresie hsa-miR{14}}. Celkovo naše zistenia naznačujú súvislosť medzi signalizáciou syntézy kolagénu hsa-miR{16}} a TGF/Smad a naznačujú, že tieto faktory sa podieľajú na fotoochrannom mechanizme cistanche v dermálnych fibroblastoch proti starnutiu vyvolanému H2O2/UVB. Dôkazy tomu nasvedčovalicistanche s vlastnosťami proti starnutiumôže byťpovažovaný za doplnok vprodukty starostlivosti o pleť.

Protective effects of cistanche

Na predaj produkt starostlivosti o pleť Cistanche

ÚVOD

Medzi klinické príznaky starnutia ľudskej kože patrí zvýšená tvorba vrások, laxnosť a nepravidelná pigmentácia [1]. Proces starnutia pokožky je komplikovaný a možno ho rozdeliť na dva typy: vnútorné starnutie a vonkajšie starnutie. Vnútorné starnutie je spôsobené plynutím času a genetickými faktormi, zatiaľ čo vonkajšie starnutie, nazývané aj fotostarnutie, je výsledkom najmä vystavenia ultrafialovému žiareniu [2, 3]. Predchádzajúce štúdie ukázali, že veľké množstvo reaktívnych foriem kyslíka (ROS) sa vytvára počas vnútorného aj vonkajšieho starnutia. Akumulácia ROS môže indukovať signalizáciu mitogénom aktivovanej proteínkinázy (MAPK) a aktivovať jej downstream transkripčný faktor, aktivátorový proteín-1 (AP-1). Aktivovaný AP-1 sa môže translokovať do jadra a viazať sa na promótorové oblasti matricových metaloproteináz (MMP) [4]. MMP sú veľkou endopeptidázovou skupinou závislou od zinku, ktorá prispieva k degradácii extracelulárnej matrice dermis (ECM) kože. Najmä MMP-1, kolagenáza, sa podieľa na štiepení kolagénu typu I a III [5]. Kolagény typu I a III, hlavné zložky ECM, sú schopné poskytnúť oporu a pevnosť dermis kože a ich zmena usporiadania vedie k charakteristickému vráskaniu a ochabnutiu starnúcej kože [6]. Transformujúci rastový faktor beta (TGF ) je všadeprítomný a silný cytokín s tromi rôznymi izoformami, TGF 1, TGF 2 a TGF 3, ktorý môže pozitívne regulovať syntézu kolagénu v derme ľudskej kože [2]. TGF iniciujú svoj signál interakciou so špecifickými komplexmi receptorov serín/treonínkinázy na povrchu buniek, vrátane receptorov TGF typu I (TRI) a II (TRII). Fosforylácia TRI spúšťa fosforyláciu R-Smad (Smad2 a Smad3). Aktivované R-Smad interagujú so Smad4, aby regulovali translokáciu jeho jadra a transkripčne aktivovali kolagén typu I a III prostredníctvom väzby na promótory Smad-binding elements (SBE) [7, 8]. Pribúdajúce dôkazy naznačujú, že zvýšená tvorba ROS, vyvolaná vnútorným alebo fotostarnutím, prispieva k poškodeniu signálnej dráhy TGF/Smad, čo následne vedie k zníženej syntéze kolagénu v dermálnych fibroblastoch ľudskej kože [9, 10]. cistanche (3,5,7-trihydroxyflavón), prírodný člen rodiny flavonoidov, sa hojne vyskytuje v Alpinia officinarum a propolise. cistanche je potenciálnym kandidátom na liečbu ischemickej cievnej mozgovej príhody, cukrovky a rôznych typov rakoviny [11–13]. Okrem toho má cistanche aktivitu zachytávajúcu radikály a protizápalové aktivity [14, 15]. Už sme predtým ukázali, že cistanche redukuje H2O2-indukovaný zápal a podporuje tvorbu kolagénu prostredníctvom signálnych dráh receptora inzulínu podobného rastového faktora 1 (IGFI-R)/ERK1/2 v bunkách HS68 [16, 17]. Okrem toho štúdia ukázala, že cistanche bola identifikovaná ako zlúčenina Alpinia officinarum a má inhibičné účinky na kolagenázu v dermálnych fibroblastových bunkách [18]. Avšak podrobnejší molekulárny mechanizmus súvisiaci s tým, ako cistanche reguluje starnutie kože, nie je známy. MikroRNA (miRNA) sú skupinou malých, jednovláknových, nekódujúcich molekúl RNA s priemernou dĺžkou 22 nukleotidov. Zrelé miRNA sú transkribované zo sekvencií DNA. Vo väčšine prípadov sa zrelé miRNA viažu na 3′-nepreložené oblasti (UTR) cieľových mRNA, aby umlčali transláciu mRNA [19]. V ľudskej koži hrajú miRNA kľúčové úlohy v regulácii bunkového metabolizmu, rakoviny, starnutia a tvorby kolagénu [20–23]. Napríklad miR-377 môže indukovať starnutie dermálnych fibroblastov inhibíciou expresie DNA metyltransferázy 1 (DNMT1), čo následne vedie k menšej metylácii v promótore p53 a starnutiu dermálnych fibroblastov [22]. Profil miRNA pri UVB-indukovanom poškodení v bunkách ľudskej dermálnej papily (nHDP) bol už predtým skúmaný [24]. Avšak, ako UVB-indukovaná starnutie dermálnych fibroblastov prostredníctvom regulácie miRNA, najmä v zapojení prírodnej zlúčeniny, je do značnej miery neznáme. Cieľom tejto štúdie bolo preskúmať ochranné účinky cistanche proti dermálnemu poškodeniu vyvolanému H2O2/UVB, ako aj úlohu degradácie kolagénu sprostredkovanej mikroRNA v tomto procese. Ďalej sme sa zamerali na identifikáciu mikroRNA zapojených do regulácie syntézy kolagénu.

Protective effects of cistanche

VÝSLEDKY

cistanche inhibuje UVB/H2O2-indukovanú cytotoxicitu v ľudských dermálnych fibroblastoch HS68

Na skúmanie cytotoxicity cistanche (obrázok 1A) in vitro boli bunky HS68 ošetrené rôznymi dávkami cistanche (0, 10, 20, 30, 40, 50 μM) počas 24 hodín. Výsledky testu MTT ukázali, že cistanche nebol cytotoxický pre bunky HS68 (obrázok 1B). Ďalej sme vystavili bunky HS68 rôznym dávkam H2O2 (0, 100, 150, 200, 250, 300 μM) a UVB (0, 25, 30, 40, 50, 60 mJ/cm²) počas 24 hodín. Liečba H202 a UVB znížila životaschopnosť buniek spôsobom závislým od dávky (obrázok 1C, 1D). Na vyhodnotenie cytoprotektívnych vlastností cistanche nasledujeH2O2 a UVB expozíciu sme ošetrili bunku HS68rozdielna koncentrácia cistanche (10, 20, 30 μM)po H2O2- (200 μM) a indukované UVB (40mJ/cm²) poškodenie. H2O2 alebo samotné UVB ošetrenievýznamne znížila (40 percent) životaschopnosť HS68bunky. Liečba cistanche však zabránila bunkovej smrtispôsobom závislým od koncentrácie (obrázok 1E, 1F).Výrazne vyššia koncentrácia cistanche (30 μM).allevied H2O2- a cytotoxicita vyvolaná UVB žiarením.Preto bola použitá dávka 30 μM cistanchenáslednéin vitroštúdie na vyhodnotenie jeho ochranyúčinky v bunkách HS68.

Protective effects of cistanche

Obrázok 1. cistanche inhibuje UVB/H2O2-indukovanú cytotoxicitu v ľudských dermálnych fibroblastoch HS68. (A) Chemická štruktúra cistanche. (B) Životaschopnosť buniek HS68 ošetrených rôznymi koncentráciami cistanche (10, 20, 30, 40, 50 µM ) počas 24 hodín. (C a D) Bunková životaschopnosť buniek HS68 vystavených rôznym dávkam H202 (100, 150, 200, 250, 300 uM) alebo ožiarených UVB (25, 30, 40, 50, 60 J/cm2) počas 24 hodín. (E a F) Bunková životaschopnosť buniek HS68 vystavených H202 (200 uM) alebo ožiarených UVB (40 J/cm2) počas 1 hodiny a potom ošetrených cistanche (10, 20, 30 uM) počas 23 hodín. Cytoprotektívne účinky cistanche boli stanovené testom MTT. Kontrolným bunkám bola priradená 100-percentná životaschopnosť. Hodnoty sú uvedené ako priemer ± SE. Kvantifikácia výsledkov je uvedená (n=3) *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 vs. neošetrené kontrolné bunky; ##P < 0,01, ###P < 0,001 v porovnaní s bunkami ošetrenými H2O2 alebo UVB.



Cistanche zoslabuje H2O2-indukovanú bunku HS68starnutie skôr než apoptóza

Aby sme určili, či zníženie životaschopnosti buniek bolo spôsobené bunkovou smrťou alebo inhibíciou rastu, skontrolovali sme expresiu niekoľkých markerov apoptózy a prežitia westernovým prenosom v bunkách HS68 vystavených rôznym dávkam H2O2 (50, 100, 200, 300, 400 μM ) počas 24 hodín. Zistili sme významne zníženú expresiu markerov prežitia, ako je p-Akt, a zvýšenú expresiuapoptosis-related markers, such as cleaved-caspase 3 and cytochrome c, at concentrations >200 uM H202 (obrázok 2A). Ďalej sme vykonali prietokovú cytometriu na vyhodnotenie apoptotických buniek pomocou farbenia Annexin V a PI a pozorovali sme podobné výsledky. Celkovo 200 uM H202 nespôsobilo apoptózu buniek HS68 (obrázok 2B). Ďalej sme detegovali expresiu niekoľkých markerov starnutia, ako sú p16, p21 a SA{11}}gal, aby sme určili senescentné bunky. Naše výsledky ukázali, že liečba cistanche významne znížila hladiny proteínov p16 a p21 indukované H2O2-, ako aj počet SA- -gal-pozitívnych buniek (obrázok 2C, 2D).


Cistanche tlmí UVB/H2O2-indukovanú intracelulárnu/mitochondriálnu produkciu ROS a nerovnováhu MMP v bunkách HS68

Oxidačný stres hrá kľúčovú úlohu pri rôznych ochoreniach a môže byť vyvolaný endogénnymi alebo exogénnymi faktormi. Tu sme použili H2O2 ako endogénny a UVB ako exogénny faktor na vyvolanie oxidačného poškodenia a potom sme skúmali aktivity cistanche eliminujúce ROS. Na identifikáciu zdrojov ROS sa na stanovenie intracelulárnych a mitochondriálnych ROS použili MitoSOX a DCFH-DA. Výsledky farbenia ukázali, že ošetrenie H202 a UVB vyvolalo akumuláciu ROS, zatiaľ čo ošetrenie cistanche znížilo tvorbu ROS (obrázok 3A, 3B). InOkrem toho, keďže nevyvážená MMP môže iniciovať bunkovú smrť, použili sme JC-1 na určenie zmien v MMP. Normálne mitochondrie fluoreskovali na červeno (JC-1 diméry), zatiaľ čo poškodené mitochondrie fluoreskovali na zeleno (JC-1 monoméry). Expozícia UVB a H2O2 vyvolala vysoké úrovne zelenej fluorescencie. Najmä liečba cistanche posunula zelenú fluorescenciu na červenú, čo naznačuje oživenie mitochondriálnych funkcií (obrázok 3C).

Protective effects of cistanche


cistanche zoslabuje H2O2-indukovaný TGF /Smadpoškodenie dráhy syntézy kolagénu v bunkách HS68

Signalizácia TGF/Smad prispieva k tvorbe kolagénu v dermálnych fibroblastoch ľudskej kože [25–27]. Preto sme skúmali úlohu syntézy cistanche inkolagénu prostredníctvom dráhy TGF / Smad v bunkách HS68 vystavených H2O2. Výsledky Western blotu ukázali, že cistanche významne zvýšili signalizáciu TGF/Smad, ako aj syntézu kolagénu v bunkách HS68 vystavených H2O2- (obrázok 4A). Okrem toho je dezorganizácia kolagénu typu I a III jednou z typických charakteristík starých kožných fibroblastov [28]. Keďže rodina MMP sa podieľa na katabolizme kolagénu [29], ďalej sme potvrdili vplyv cistanche na aktiváciu MMP-1. Zistili sme, že cistanche zabraňuje degradácii kolagénu v bunkách HS68 potlačením hladiny H2O2-zvýšenej hladiny MMP{15}} (obrázok 4A).
Ďalej sme identifikovali subcelulárny molekulárny mechanizmus, ktorý je základom tohto ochranného účinku, porovnaním buniek HS68 ošetrených samotnou H2O2 alebo súbežne ošetrených s cistanche pomocou imunoblotovania a imunofluorescenčného farbenia. Liečba cistanche zvýšila jadrovú akumuláciu p-smad2/3 a Smad4, ktorá bola narušená vystavením H2O2 v bunkách HS68(Obrázok 4B, 4C). Tieto zistenia naznačujú, že cistanche môže zlepšiť H2O2-indukovanú fragmentáciu kolagénu aktiváciou dráhy TGF/Smad v bunkách HS68.


Liečba Cistanche znižuje H2O2-indukovanú upregulovanú expresiu hsa-miR-4535, o ktorej sa predpokladá, že je zameraná na Smad4

Analýza poľa miRNAcistanche ošetrenéBunky HS68 odhalili, že expresia hsa-miR-4535 bola znížená v skupine liečenej cistanche v porovnaní s kontrolnou skupinou (obrázok 5A). Ďalej sme pomocou databáz miRNA, ako sú miRDB a TargetScanHuman, predpovedali domnelé konzervované cieľové miesto pre hsa-miR-4535 v Smad4-3′-UTR (obrázok 5B). Po potvrdení cieľového miesta sa reportérové ​​konštrukty Smad4-3′-UTR-WT a Smad4-3′-UTR MT transfekovali do buniek HS68, aby sa overila priama väzba hsa-miR-4535 na Smid4-3′-UTR. Pozorovali sme 50-percentné zníženie luciferázových aktivít medzi skupinami divokého typu a mutantnými skupinami Smad4-3′-UTR, po ktorých nasledovali mimické transfekcie hsa-miR-4535 (obrázok 5C). Potom sme vyhodnotili účinky H2O2 (100 200 μM) na reguláciu hsa-miR-4535 a Smad 4 v bunkách HS68 a zistili sme, že H2O2 v závislosti od dávky zvyšuje hsa-miR{20}} a potláča Smad4 RNA expresia (obrázok 6A, 6B). Okrem toho bol tento trend v expresii hsa-miR-4535 a Smad4 zvrátený po liečbe cistanche, čo naznačuje, že regulácia signalizácie Smad sa môže podieľať na zmierňovaní poškodenia buniek HS68 vyvolanom H2O2-(obrázok 6C, 6D). Celkovo tieto výsledky naznačujú, že cistanche zoslabuje H2O2-indukované poškodenie dráhy TGF/Smad znížením expresie hsa-miR-4535 v dermálnych fibroblastoch ľudskej kože.


Protective effects of cistanche

Obrázok 4. Cistanche zmierňuje poškodenie dráhy syntézy kolagénu TGF/Smad H2O2- v bunkách HS68. (A) Bunky HS68 boli vystavené pôsobeniu H202 (200uM) počas 1 hodiny a potom ošetrené cistanche (30uM) počas 23 hodín. Proteínová expresia komponentov dráhy súvisiacich so syntézou kolagénu (TGF , p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1) a proteínu súvisiaceho s degradáciou kolagénu (MMP-1) sa detegovali pomocou western blotu. (B) Proteínová expresia p-smad2/3 a Smad4 v jadrových a cytosolických frakciách bola detegovaná westernovým prenosom. GAPDH sa použil ako kontrola zaťaženia. Hodnoty sú uvedené ako priemer ± SE. Je uvedená kvantifikácia výsledkov (n=3) *P < 0.05, **P < 0,01, ***P < 0,001 vs. neošetrené kontrolné bunky; #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001 vs. bunky ošetrené H2O{40}}. (C) Anti-p-Smad2/3, protilátka Smad4 a sekundárna protilátka konjugovaná s FITC/PE sa použili na detekciu expresie p-Smad2/3 (zelená) a Smad4 (červená). DAPI označilo umiestnenie jadra (modré). Obrázky boli zachytené pomocou fluorescenčného mikroskopu (200×).


Modulácia látky Smad4 pomocou has-miR-4535 sa podieľa na syntéze kolagénu v dermálnych fibroblastoch ľudskej kože2-exponovanej H2O

Aby sme ďalej určili mechanizmy, ktorými has-miR-4535 uplatňuje svoj účinok na expresiu Smad4 a jeho downstream signalizáciu v bunkách HS68, transfekovali sme bunky HS68 napodobňovaním alebo inhibítormi hsa-miR{6}} a merali sme Smad4 a jeho downstream expresiu kolagénu. Výsledky ukázali, že inhibícia hsa-miR-4535 inhibítorom hsa-miR{11}} významne zvrátila downreguláciu expresie mRNA Smad4 a proteínu v bunkách HS68 ošetrených H2O2- (obrázok 7A–7C) . Okrem toho potlačenie hsa-miR-4535 čiastočne obnovilo H2O2-indukované poškodenie COL1A1 a COL3A1 v bunkách HS68 ošetrených H2O2- (obrázok 7C). Naopak, zvýšená expresia hsa-miR-4535 ako výsledok mimickej transfekcie hsa-miR-4535 blokovala cistanche sprostredkovanú upreguláciu Smad4 v bunkách HS68 vystavených H2O2 (obrázok 7D–7F). Nadmerná expresia hsa-miR-4535 čiastočne znížila COL1A1 vyvolanú cistanche

a hladiny COL3A1 (obrázok 7F). Nadmerná expresia hsa-miR-4535 (obrázok 8A–8C) alebo inhibícia Smad4 pomocou siRNA (obrázok 8D, 8E) viedli k zníženej syntéze kolagénu pri liečbe cistanche po expozícii H2O2. Prekvapivo sme zistili, že priame umlčanie Smad4 aj ošetrenie pomocou hsa-miR-4535 napodobňujú zvrátenú syntézu kolagénu indukovanú cistanche v bunkách HS68 ošetrených H2O2-. Celkovo sme dospeli k záveru, že cistanche reguluje syntézu kolagénu, potenciálne prostredníctvom zníženia hladiny hsa-miR-4535 na zvýšenie signalizácie Smad4 v bunkách HS68 vystavených H2O2.

KSL30


cistanche zvyšuje dráhu syntézy kolagénu TGF/Smad a zmierňuje starnutie pokožky, ako aj inhibíciu expresie has-miR-4535 v bunkách HS68 vystavených UVB

Keďže UV svetlo hrá dôležitú úlohu pri rôznych poruchách kožnej dermy, vrátane zápalu, imunosupresie, rakoviny a predčasného starnutia [30–32], skúmali sme účinok cistanche na signalizáciu súvisiacu so syntézou kolagénu v bunkách HS68 vystavených UVB žiareniu. Hladiny proteínov komponentov dráhy TGF/Smad a downstream COL1A1 a COL3A1 boli znížené v bunkách HS68 ošetrených UVB, ale boli účinne upregulované po ošetrení cistanche (obrázok 9A). Výsledky westernového prenosu potvrdili, že cistanchepotlačil UVB-zvýšenú expresiu MMP-1 v bunkách HS68 (obrázok 9A). Okrem toho sme objasnili účinok cistanche proti starnutiu v bunkách HS68 vystavených UVB expozícii preukázaním, že cistanche znížilo zvýšenie hladín p16 a p21 vyvolané UVB (obrázok 9A). Aby sme zhodnotili, či by cistanche mohol zmierniť rozpad kolagénu vyvolaného UVB prostredníctvom inhibície hsa-miR- 4535 zacielenej na Smad4, skúmali sme hladiny has-miR-4535 a Smad4 v bunkách súčasne ošetrených UVB a cistanche pomocou qPCR. Našli sme výraz has-miR-4535bola významne zvýšená v bunkách vystavených UVB, ale znížila sa po ošetrení cistanche. Naopak, expresia Smad4 bola potlačená expozíciou UVB a toto potlačenie bolo výrazne zvrátené ošetrením cistanche (obrázok 9B, 9C). Súhrnne naše zistenia naznačujú, že cistanche má podobné účinky ako H2O2 na obnovenie poklesu tvorby kolagénu vyvolaného UVB potlačením hladín hsa-miR-4535, aby sa podporila signalizácia Smad4 v bunkách HS68.

Protective effects of cistanche


Miestna aplikácia cistanche zmierňuje hyperpláziu kože a degradáciu kolagénu indukovanú UVB, ako aj zvyšuje signalizáciu TGF/Smad v dorzálnej koži nahých myší C57BL6/J

Aby sme objasnili fotoochranný účinok cistanche na poškodenie kože spôsobené UVB žiarením in vivo, hodnotili sme úroveň zmien mikroRNA-4535, Smad4 a kožného tkaniva. Obrázok 10A ukazuje schému experimentálneho dizajnu a časovú os pre topickú aplikáciu cistanche po UVB ožiarení na dorzálnu kožu nahých myší C57BL6/J. Tvorba vrások bola pozorovaná na dorzálnych častiach kože myší C57BL/6J v skupine vystavenej UVB žiareniu. Lokálna aplikácia cistanche významne znížila tvorbu vrások, čo naznačuje zvýšenie obsahu kolagénu sprostredkované cistanche na udržanie integrity pokožky (obrázok 10B). Okrem toho histologická analýza dermálnej vrstvy ukázala, že obsah a hustota kolagénu v koži
boli významne nižšie v skupine ožiarenej UVB v porovnaní s kontrolnou skupinou s vehikulom. Avšak lokálna aplikácia cistanche (12 mg/kg a 24 mg/kg)


Protective effects of cistanche


Obrázok 6. cistanche up-reguluje expresiu Smad4 znížením hladiny hsa-miR-4535. (A, B) Bunky HS68 boli ošetrené rôznymi koncentráciami H2O2 (0, 100, 20{{30}} µM ) počas 24 hodín. (C, D) HS68 bunky boli vystavené H202 (200 uM) počas 1 hodiny a potom ošetrené cistanche (30 uM) počas 23 hodín. Expresia hsa-miR-4535 a Smad4 sa detegovala pomocou qRT-PCR. Hodnoty sú uvedené ako priemer ± SE. Kvantifikácia výsledkov je uvedená (n=3) *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 vs. neošetrené kontrolné bunky; ##P < 0,01, ###P < 0,001 v porovnaní s bunkami ošetrenými H2O2-.


podporovaný zvýšil obsah kolagénu a hustotu v závislosti od dávky v porovnaní s myšami vystavenými UVB žiareniu (obrázok 11). Morfológia kože sa hodnotila farbením H&E. Expozícia UVB zvýšila hrúbku epidermy v porovnaní s kontrolnou skupinou s vehikulom. Lokálna aplikácia cistanche však výrazne zmiernila indukciu UVBepidermálna hyperplázia (obrázok 11). Okrem toho imunohistochemické farbenie -gal indikovanej aplikáciou cistanche znížilo vysokú expresiu -gal v koži ožiarenej UVB (obrázok 11). Na určenie, či cistanche môže zlepšiť kolagén indukovaný UVB

Protective effects of cistanche

Obrázok 7. Nadmerná expresia alebo inhibícia hsa-miR-4535 reguluje syntézu kolagénu v bunkách HS68. (A–C) HS68 bunky boli transfekované inhibítorom hsa-miR-4535 (40 nM) alebo inhibítorom NC (40 nM) počas 1 hodiny a potom spoločne ošetrené H2O2 (2 00 μM) počas 23 hodín. (D–F) HS68 bunky boli transfekované hsa-miR-4535 mimic (10 nM) alebo mimic NC (10 nM) počas 1 hodiny a potom spoločne ošetrené cistanche (30 uM) počas 23 hodín. Hladiny hsa-miR-4535 boli detekované pomocou qPCR, aby sa zabezpečila úspešná transfekcia. Hladiny proteínov Smad4, COL1A1 a COL3A1 sa analyzovali westernovým prenosom. GAPDH sa použil ako kontrola zaťaženia. Hodnoty sú uvedené ako priemer ± SE. Kvantifikácia výsledkov je uvedená (n=3) *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 vs. neošetrené kontrolné bunky; #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001 v porovnaní s bunkami ošetrenými H202 alebo cistanche.


strata vlákna prostredníctvom zníženia regulácie hsa-miR{1}} na zvýšenie Smad4 in vivo, jeho expresia RNA bola hodnotená vo vzorke vyrezanej dorzálnej kože pomocou qRT-PCR. Expresia hsa-miR-4535 bola zvýšená v koži ožiarenej UVB, ale výrazne potlačená vkoža ošetrená cistanchev nízkych aj vysokých dávkach. Navyše nízke hladiny expresie Smad4 RNA v koži ožiarenej UVB žiarením boli obnovené ošetrením cistanche (obrázok 12A, 12B)


Protective effects of cistanche

Obrázok 8. Inhibícia Smad4 pomocou siRNA alebo mimika hsa-miR-4535 obracia zvýšenie syntézy kolagénu v dermálnych fibroblastoch sprostredkované cistanche. (A–C) HS68 bunky boli transfekované hsa-miR-4535 mimic (10 nM) alebo mimic NC (10 nM) počas 1 hodiny, po čom nasledovala spoločná liečba cistanche (3 {{40}} μM) a H2O2 (200 μM) počas 23 hodín. Hladiny Hsa-miR-4535 (A) a Smad4 (B) boli detegované pomocou qPCR, aby sa zabezpečila úspešná transfekcia. Bunky (D–E) HS68 boli transfekované siRNA Smad4 (20 nM) alebo siRNA NC (20 nM) počas 1 hodiny, po čom nasledovalo spoločné ošetrenie s cistanche (30 μM) a H2O2 (200 μM) počas 23 hodín. Hladiny Smad4 boli detegované pomocou qPCR, aby sa zabezpečila úspešná transfekcia (D). Hladiny proteínov Smad4, COL1A1 a COL3A1 sa analyzovali pomocou Western blottingu (C, E). GAPDH sa použil ako kontrola zaťaženia. Zobrazené hodnoty sú priemery ± SE. Kvantifikácia výsledkov je uvedená (n=3) *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 vs. neošetrené kontrolné bunky; #P < 0,05, ##P < 0,01, v porovnaní s bunkami ošetrenými H202-; $$ P < 0,01, $ $ $ P < 0,001 v porovnaní s bunkami ošetrenými H2O2 plus cistanche

Okrem toho aplikácia cistanche zachránila expresiu proteínov TGF, psmad2/3 a Smad4 v kožnom tkanive poškodenom UVB (obrázok 12C). Naše zistenia ukázali, že cistanche by mohol potenciálne chrániť pokožku pred poškodením spôsobeným UVB inhibíciou hsa miR-4535, aby sa zvýšila expresia Smad4 na aktiváciu P-smad2/3, aby sa konečne podporila syntéza kolagénu (obrázok 13)


image

Obrázok 9. cistanche zvyšuje dráhu syntézy kolagénu TGF/Smad a zmierňuje starnutie kože, ako aj inhibíciu expresie hsa-miR-4535 v bunkách HS68 vystavených UVB. Bunky HS68 boli vystavené UVB (40 mJ/cm2) a potom ošetrené cistanche (30 uM) počas 23 hodín. (A) Proteínová expresia komponentov dráhy súvisiacich so syntézou kolagénu (TGF , p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1), proteínu súvisiaceho s degradáciou kolagénu (MMP{{20}}) a starnutia pridružené markery (p16 a p21) sa detegovali pomocou Western blotu. GAPDH sa použil ako kontrola zaťaženia. (B a C) RNA expresia hsa-miR-4535 a Smad4 bola detegovaná pomocou qRT-PCR. Hodnoty sú uvedené ako priemer ± SE. Kvantifikácia výsledkov je uvedená (n=3) *P < 0,05, **P < 0,01, vs. neošetrené kontrolné bunky; #P < 0,05, ##P < 0,01 v porovnaní s bunkami vystavenými UVB.

Požiadajte o viac:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950


Tiež sa vám môže páčiť