Kvantitatívne hodnotenie zápalových infiltrátov v biopsiách po transplantácii obličky pomocou multiplexnej amplifikácie tyramidového signálu a hlbokého učenia

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Meyke Hermsen¹Valery Volk²Ján Hinrich Bräsen²a kol

Abstraktné

Oneskorená funkcia štepu (DGF) je silným rizikovým faktorom pre rozvoj intersticiálnej fibrózy a tubulárnej atrofie (IFTA) pri transplantáciách obličiek. Kvantitatívne hodnotenie zápalových infiltrátov v biopsiách obličiek pacientov s DGF môže odhaliť prediktívne markery vývoja IFTA. V tejto štúdii sme kombinovali multiplexnú amplifikáciu tyramidového signálu (mTSA) a konvolučné neurónové siete (CNN), aby sme zhodnotili zápalové mikroprostredie v biopsiách obličiek pacientov s DGF (n=22) odobratých 6 týždňov po transplantácii. Pacienti boli stratifikovaní podľa vývoja IFTA (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" one="" mtsa="" panel="" was="" developed="" for="" visualization="" of="" capillaries,="" t-="" and="" b-lymphocytes,="" and="" macrophages,="" and="" a="" second="" mtsa="" panel="" for="" t-helper="" cell="" and="" macrophage="" subsets.="" the="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged="" and="" custom-made="" python="" scripts="" enabled="" conversion="" to="" artificial="" brightfield="" whole-slide="" images="" (wsi).="" we="" used="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" with="" cytoplasmatic="" staining="" patterns="" in="" immunohistochemistry="" and="" developed="" two="" new="" cnns="" for="" the="" detection="" of="" macrophages="" and="" nuclear-stained="" lymphocytes.="" f1="" scores="" were="" 0.77="" (nuclear-stained="" lymphocytes),="" 0.81="" (cytoplasmatic-stained="" lymphocytes),="" and="" 0.82="" (macrophages)="" on="" a="" test="" set="" of="" artificial="" brightfield="" wsi.="" the="" cnns="" were="" used="" to="" detect="" inflammatory="" cells,="" after="" which="" we="" assessed="" the="" peritubular="" capillary="" extent,="" cell="" density,="" cell="" ratios,="" and="" cell="" distance="" in="" the="" two="" patient="" groups.="" in="" this="" cohort,="" the="" distance="" of="" macrophages="" to="" other="" immune="" cells="" and="" peritubular="" capillary="" extent="" did="" not="" vary="" significantly="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" between="" patient="" groups.="" cd163+="" cell="" density="" was="" higher="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (p="" <="" 0.05).="" cd3+cd8−/cd3+cd8+="" ratios="" were="" higher="" in="" patients="" with=""><10% ifta="" development="" (p="" <="" 0.05).="" we="" observed="" a="" high="" correlation="" between="" cd163+="" and="" cd4+gata3+="" cell="" density="" (r="0.74," p="" <="" 0.001).="" our="" study="" demonstrates="" that="" cnns="" can="" be="" used="" to="" leverage="" reliable,="" quantitative="" results="" from="" mtsa-="" stained,="" multi="" spectrally="" imaged="" slides="" of="" kidney="" transplant="">

Cistanche deserticola zabraňuje ochoreniu obličiek, kliknite sem a získajte vzorku

Úvod

Oneskorená funkcia štepu (DGF) po transplantácii obličky je multifaktoriálna a súvisí najmä s charakteristikami darcu a časom ischémie. DGF sa vo všeobecnosti opisuje ako potreba dialýzy do 7 dní po transplantácii a je silným rizikovým faktorom pre chronické poškodenie obličkového štepu [1–3]. Klasickou súčasťou chronického poškodenia obličiek je prítomnosť intersticiálnej fibrózy a tubulárnej atrofie (IFTA). Nie všetci pacienti s DGF však postupujú k rozvoju IFTA a komplexný vzťah medzi DGF a IFTA je stále nedostatočne pochopený. Je to po prvé kvôli oneskoreniu medzi potenciálne kauzálnymi udalosťami a funkčným poklesom a po druhé kvôli variabilným a komplexným účinkom potenciálnych induktorov, ako je odmietnutie a vedľajšie účinky liekov [1, 4]. Všeobecná prítomnosť zápalu a špecifických makrofágov bola opísaná v mnohých štúdiách ako prediktor straty štepu [5–8]. Základné patologické procesy však nie sú úplne pochopené a vysoké úrovne zápalu nevedú vždy k dlhodobej strate štepu. V dôsledku environmentálnych stimulov získavajú makrofágy špecializované funkcie a polarizujú sa na rôzne fenotypy. Početné štúdie naznačujú, že špecifické podtypy makrofágov (alternatívne aktivované makrofágy) sa podieľajú na remodelácii tkaniva indukciou opravy tkaniva alebo fibrózy. Je známe, že polarizácia smerom k fenotypu remodelácie tkaniva (niekedy pro-fibrotického) závisí od širokého spektra environmentálnych stimulov, okrem iného poskytovaných subtypmi T-helper lymfocytov [9–11]. Hodnotenie populácií T-helper buniek v štepe v čase DGF odhalilo prevládajúci subtyp T-helper 1, ale korelácie s výsledkom štepu alebo progresiou do IFTA neboli doteraz skúmané [12]. Komplexné hodnotenie zápalového mikroprostredia špecificky zamerané na makrofágy a podskupiny T-pomocných buniek v starostlivo vybraných kohortách pacientov by mohlo poskytnúť pohľad na to, prečo niektorí, ale nie všetci pacienti s DGF postupujú k rozvoju IFTA.

Komplexnému vyšetreniu zápalových infiltrátov však bránia viaceré (technické) obmedzenia. Tradičná imunohistochémia (IHC) a imunofluorescenčné techniky podporujú vizualizáciu len obmedzeného počtu bunkových markerov v jednom tkanivovom reze. Sériové rezy malých, cenných fragmentov tkaniva, ako sú biopsie obličiek, nie sú žiaduce a interpretácia vzťahov medzi bunkami v rôznych rezoch je ťažká. Okrem toho kvantitatívne hodnotenie zápalových infiltrátov vizuálnym odhadom prináša značnú mieru variability medzi pozorovateľmi [13]. Tradičné techniky spracovania obrazu, ako je prahovanie pixelov, povodie a segmentácia založená na morfológii, sa spoliehajú na predchádzajúce znalosti o všetkých morfologických reprezentáciách buniek a intenzite farbenia tkaniva v rámci súboru údajov [14–16]. Preto týmto metódam často chýba robustnosť pre biologické a technické variácie obrazu a zle sa prenášajú do nových alebo externých súborov údajov. Vzostup digitálnej patológie urýchlil vývoj alternatívnych metód hodnotenia celosnímkových obrázkov (WSI) [17, 18]. Modely hlbokého učenia, konkrétne konvolučné neurónové siete (CNN), sa ukázali ako schopné segmentovať a detegovať relevantné biologické štruktúry na histopatologických snímkach [19–23]. Tieto techniky majú potenciál prejsť od subjektívneho vizuálneho odhadu a tradičného spracovania obrazu k presnej, objektívnej a reprodukovateľnej detekcii buniek.

Cieľom tejto štúdie je vyvinúť metódu na objektívne, kvantitatívne hodnotenie viacerých markerov zápalových buniek, čím sa obíde potreba rozsiahleho sériového rezu. Aby sme to dosiahli, kombinujeme multiplexné IHC, multispektrálne zobrazovanie a modely hlbokého učenia. Aby sme demonštrovali použiteľnosť týchto techník, študujeme korelácie zápalového mikroprostredia, kvantifikované modelmi hlbokého učenia, s vývojom IFTA v biopsiách štepu pacientov s DGF.

cistanche extrakt na liečenie ochorení obličiek

Materiály a metódy

Na posúdenie zápalového mikroprostredia v biopsiách obličiek pacientov s DGF sme vykonali multiplexné IHC na biopsiách dohľadu odobratých 6 týždňov po transplantácii. Pacienti boli stratifikovaní podľa vývoja IFTA (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" multiplex="" ihc="" was="" performed="" using="" tyramide="" signal="" amplification="" (mtsa)="" panels.="" one="" mtsa="" panel="" was="" designed="" for="" the="" visualization="" of="" capillaries,="" macrophages,="" and="" t="" and="" b="" lymphocytes="" (panel="" i),="" and="" one="" mtsa="" panel="" for="" the="" visualization="" of="" polarized="" t-helper="" lymphocytes="" and="" macrophages="" (panel="" ii).="" second,="" the="" mtsa="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged,="" and="" custom-made="" python="" scripts="" were="" used="" to="" convert="" the="" multispectral="" images="" to="" artificial="" brightfield="" ihc="" wsi.="" converting="" the="" slides="" to="" artificial="" ihc="" wsi="" allowed="" for="" the="" application="" of="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" in="" ihc="" [22].="" this="" existing="" cnn="" was="" designed="" for="" cytoplasmatic="" lymphocyte="" markers.="" hence,="" a="" second="" and="" third="" cnn="" was="" developed="" in="" this="" study="" for="" the="" quantification="" of="" macrophages="" and="" nuclear="" lymphocyte="" markers="" in="" ihc="" wsi.="" these="" three="" cnns="" were="" subsequently="" used="" to="" quantitatively="" assess="" the="" inflammatory="" infiltrates="" in="" the="" two="" patient="" groups="" and="" to="" study="" the="" correlations="" of="" the="" inflammatory="" microenvironment="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" with="" the="" development="" of="" ifta="" 6="" months="" after="">

Vzorky tkaniva

Použili sme monitorovacie biopsie od príjemcov transplantovanej obličky na Hannover Medical School (Hannover, Nemecko), získané v kontexte prospektívneho programu biopsie dohľadu. Kritériá zaradenia boli: výskyt DGF (definovaný ako<500 ml="" urine="" production="" within="" the="" first="" 24="" h="" after="" transplantation="" and/or="" the="" need="" for="" dialysis="" within="" 7="" days="" post-transplantation),="" absence="" of="" rejection="" in="" any="" of="" the="" surveillance="" biopsies="" or="" biopsies="" for="" cause="" within="" the="" first="" year="" post-transplantation,="" and="" absence="" of="" ifta="" in="" the="" surveillance="" biopsy="" taken="" at="" 6="" weeks="" after="" transplantation="" (based="" on="" the="" pathology="" report="" and="" graded="" according="" to="" the="" banff="" lesion="" grading="" system="" [24]).="" all="" patients="" were="" treated="" with="" dialysis="" because="" of="" no,="" or="" insufficient="" graft="" function,="" variably="" manifested="" by="" (combinations="" of)="" anuria,="" oliguria,="" metabolic="" de-arrangement="" with="" acidosis,="" or="" hyperkalemia.="" none="" of="" the="" patients="" had="" hyperkalemia="" or="" hypervolemia="" alone.="" formalin-fixed,="" paraffin-embedded="" tissue="" (ffpe)="" from="" biopsies="" taken="" 6="" weeks="" and="" 6="" months="" post-transplantation="" was="" collected.="" six="" patients="" did="" not="" undergo="" a="" surveillance="" biopsy="" procedure="" 6="" months="" after="" transplantation.="" instead,="" the="" surveillance="" biopsy="" was="" taken="" at="" 3="" months="" post-transplantation="" was="" included="" (n="3)" or="" the="" nearest="" cases="" with="" sufficient="" cortical="" tissue="" (here="" defined="" as="" ≥4="" glomeruli)="" in="" both="" the="" 6="" weeks="" and="" the="" 6="" months="" biopsy="" were="" included="" in="" the="" study="" (n="24)." one="" case="" was="" excluded="" because="" of="" interstitial="" nephritis="" of="" unknown="" cause="" and="" one="" more="" case="" due="" to="" fixation="" artifacts.="" a="" final="" number="" of="" 22="" patients="" were="" included="" in="" this="" study="" (table="">

hodnotenie IFTA

Rozsah intersticiálnej fibrózy (ci) a tubulárnej atrofie (ct) (IFTA) po 6. týždni a 6. mesiaci, vyjadrený pomocou Banffovho systému klasifikácie lézií [24], bol získaný z patologickej správy. Na podrobnejšie posúdenie vzťahu medzi včasnými zápalovými infiltráciami a vývojom IFTA boli všetky sklíčka zafarbené PAS digitalizované na opätovné vyšetrenie pomocou digitálneho skenera sklíčok Pannoramic 25{9} Flash II (3DHistech, Maďarsko) s 20 × objektív s rozlíšením 0,24 μm/ pixel. PAS WSI oboch časových bodov (6 týždňov a 6 mesiacov) boli hodnotené tromi obličkovými patológmi pre rozsah IFTA (percento plochy povrchu s 10-percentnými intervalmi). Priemerné skóre IFTA patológov sa použilo ako konečné skóre na výpočet zmeny v IFTA medzi 6 týždňami a 6 mesiacmi po transplantácii. Pacienti boli stratifikovaní podľa absolútneho zvýšenia skóre IFTA o 10 percent alebo viac (n=13) a bez alebo<10% increase="" of="" ifta="" (n="9)" (table="" 1).="" recipient="" characteristics,="" donor="" characteristics,="" and="" banff="" ci,="" ct,="" ti,="" i,="" and="" i-ifta="" lesion="" scores="" (obtained="" from="" the="" pathology="" report)="" are="" listed="" in="" table="" 1="" for="" both="" patient="" groups.="" significant="" differences="" between="" patient="" groups="" were="" assessed="" using="" the="" independent="" samples="" mann–whitney="" u="" test="" or="" fisher's="" exact="" test="" and="" are="" displayed="" in="" table="">

Okrem toho sa skóre Banffových lézií porovnávalo medzi časovými bodmi pomocou testu Wilcoxon sign ranks. To odhalilo významné rozdiely medzi 6-týždňovými a 6-mesačnými biopsiami pre Banff kategórie ti (p=0,017), ci (p=0,004) a ct (p=0,011) .

Multiplexné farbenie TSA

Vykonali sme multiplexnú IHC s použitím mTSA na vizualizáciu viacerých bunkových markerov v 6-týždňových biopsiách. Po inkubácii s primárnou a sekundárnou protilátkou bolo tkanivo ošetrené fluorescenčne značeným tyramidom. Chrenová peroxidáza zo sekundárnej protilátky katalyzuje tvorbu aktívnych tyramidových radikálov. Tyramidové radikály sa kovalentne viažu na tyrozínové zvyšky na antigéne. Táto trvalá väzba umožnila teplom indukované odstránenie komplexu primárnej a sekundárnej protilátky pri zachovaní fluorescenčného tyramidu [25]. To umožnilo následnú následnú inkubáciu s ďalšími protilátkami z rovnakého druhu proti cieľovým antigénom.

mTSA sa uskutočňovala na dvoch po sebe idúcich sklíčkach zo 6 týždňových kontrolných biopsií. Vyvinuli sme dva panely mTSA na hodnotenie zápalového infiltrátu a rozsahu peritubulárnych kapilár v našich skupinách pacientov. Panel I obsahoval protilátky anti-CD3, CD4, CD8, CD20, CD68 a CD34. Panel II sa použil na skúmanie polarizácie T-helper buniek a makrofágov pomocou anti-CD4, Tbet, GATA3, CD68 a CD163 protilátok. Špecifikácie protilátok, riedenia a poradia farbenia sú uvedené v doplnkovej tabuľke 1. Všetky sklíčka boli zbavené parafínu v xyléne, dehydratované v 95% etanole, premyté vo vode z vodovodu a varené na získanie epitopu v 10x zriedenom trisborát-EDTA (TBE 10x , 0658, VWR Life Sciences, US). Po ochladení sa sklíčka premyli v 3 percentnom roztoku peroxidázy vodíka na blokovanie endogénnej peroxidázy a premyli sa tris-pufrovaným fyziologickým pufrom s 0,05 percentami Tween 20 (822184, Merck KGaA, Nemecko) (TBS-T). Blokovanie proteínov sa uskutočnilo pomocou TBS-T s 1 percentom hovädzieho sérového albumínu (BSA) (mTSA krok 1). Primárne protilátky boli inkubované počas 1 hodiny pri teplote miestnosti alebo cez noc pri štyroch stupňoch Celzia (mTSA krok 2). Po premytí v TBS-T boli sklíčka inkubované s HRP-konjugovanou sekundárnou protilátkou (Poly-HRP-GAMs/Rb IgG, VWRKDPVO999HRP, Immunologic, Holandsko) počas 30 minút pri teplote miestnosti (mTSA krok 3). Ďalej sa vykonalo TSA s použitím fluoroforov Opal TSA z Opal 7-color Manual IHC Kit (NEL811001KT, Akoya Biosciences, USA) (mTSA krok 4) (fluorofory a ich zodpovedajúce protilátky sú uvedené v doplnkovej tabuľke 1). Komplex protilátka-TSA sa odstránil cyklom varu v TBE pufri (mTSA krok 5). Kroky 1–5 mTSA sa opakovali, kým sa sklíčka nezafarbili všetkými protilátkami z príslušného panelu. Sklíčka boli pokryté fluoromount-G s DAPI (00-4959-52, Thermo Fisher, USA).

herba cistanche

Multiplexné overenie TSA

Opakované cykly varu môžu ovplyvniť afinitu k cieľovému epitopu. Niektoré protilátky vykazujú slabší vzor zafarbenia po viacnásobnom prevarení tkaniva, iné protilátky potrebujú na dosiahnutie optimálnej intenzity zafarbenia viac cyklov varu a iné nie sú ovplyvnené vôbec. Tento účinok sme hodnotili pre všetky protilátky pomocou chromogénnej IHC na FFPE kontrolné tkanivo mandlí. Pre každú testovanú protilátku (n=9) sa vyrezalo šesť rezov (hrúbka 4 μm). Všetky sklíčka boli zbavené parafínu v xyléne, dehydratované v 95 percentnom etanole, premyté vo vode z vodovodu a povarené na získanie epitopu v 10x zriedenom TBE (cyklus varu jeden). Po ochladení sa jedno sklíčko na testovanú protilátku skladovalo vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS). Zostávajúce sklíčka sa znova uvarili. Tento cyklus sa opakoval päťkrát. Všetky sklíčka sa následne premyli v 3% roztoku peroxidázy vodíka a nasledovalo opláchnutie v PBS. Primárne protilátky (doplnková tabuľka 1) sa inkubovali počas 1 hodiny pri teplote miestnosti. Po inkubácii sa sklíčka premyli v PBS. Sklíčka zafarbené protilátkami anti-CD68, Tibet a GATA3 vyžadovali ďalšiu inkubáciu s post-protilátkovým blokovaním (PAB) počas 15 minút (blokovanie VWRKDPVB, Immunologic, Holandsko). Po inkubácii sa sklíčka premyli v PBS a inkubovali sa s HRP-konjugovanou sekundárnou protilátkou (podľa PAB VWRKDPVB110HRP, Immunologic, Holandsko, pre ostatné pozri sekundárnu protilátku doplnkovú tabuľku 1). Vizualizácia sa uskutočnila pomocou 3,3'-diaminobenzidínu (DAB) (Bright-DAB, VWRKBS04, Immunologic, Holandsko). Výsledky sú vizualizované na doplnkovom obrázku 1. Na základe týchto výsledkov sme určili optimálne poradie protilátok pre experimenty mTSA, ako je uvedené v doplnkovej tabuľke 1.

Ak sú epitopy záujmu ko-lokalizované, depozitá tyramidu môžu navzájom interferovať. Na testovanie tejto stérickej inhibície sme použili sklíčka tkaniva na kontrolu mandlí a zafarbili sme ich našimi panelmi mTSA. Expresia protilátky v mTSA sa porovnávala s expresiou na jednofarebných sklíčkach, ktoré prešli rovnakým počtom cyklov varu. Nepozorovali sme rozdiely vo vzorcoch farbenia medzi jednotlivo a multiplexne zafarbenými sklíčkami (príklady zahrnuté z panelu I, doplnkové obrázky 2 a 3). Všetky primárne protilátky v mTSA sa použili v rovnakom riedení, aké sa použilo na chromogénny IHC. Intenzita fluorescenčného signálu bola optimalizovaná úpravou riedení TSA roztoku.

Multiplexné TSA zobrazovanie

Multispektrálne zobrazovanie sa uskutočnilo pomocou systému Vectra Polaris Imaging System (CLS143455, Akoya Biosciences, USA) s objektívom 20x, s rozlíšením 0,49 μm na pixel a pomocou DAPI, FITC, CY3, Texas Red a Cy5 spektrálne kocky. Systém Vectra umožňuje manuálny výber oblastí pre multispektrálny zber, ktoré sú následne systémom rozdelené na dlaždice (obr. 1.1). Spektrá autofluorescencie a všetkých fluorofórov Opal TSA boli vopred zaznamenané v spektrálnej „knižnici“ pomocou softvéru Inform Advanced Image Analysis Software 2.4.6. (Akoya Biosciences, USA). Spektrálna knižnica umožnila rozložiť multiplexnú dlaždicu na viacero samostatných dlaždíc reprezentujúcich príspevok každého fluorofóru ("nezmiešanie"). Výsledkom boli monochrómové, viackanálové dlaždice, pričom každý kanál zodpovedal jednému fluorofóru a teda protilátke (obr. 1.2).

Konverzia na IHC s umelým jasným poľom

Na základe uložených súradníc boli dlaždice zošité na vytvorenie viackanálového WSI pomocou vlastného python skriptu (obr. 1.3). Kanály reprezentujúce signál DAPI (IDAPI) a kanály reprezentujúce jednu z protilátok (IIHC) boli prevedené na farbenie umelým hematoxylínom a DAB (obr. 1.4 a 1.5). Na základe známeho chromatického hematoxylínu a DAB Cx, Cy súradníc po transformácii hue-saturation-density (HSD) boli vektory farbenia získané v predchádzajúcich štúdiách [26, 27]. Tieto vektory farbenia sa použili na výpočet hodnôt červeno-zeleno-modrej pre IHC s umelým jasným poľom (obr. 1.5), ako:

s CR, st absorpcia svetla farbiva st v cervenej casti spektra. Hodnoty pre B a G sa vypočítali podobným spôsobom.

Analýza obrazu

Oblasti záujmu (NI)

Oblasti záujmu (ROI) boli anotované pre každý prípad v kohorte pomocou softvéru platformy automatizovanej analýzy diapozitívov (ASAP; verzia 1.9, dostupná ako softvér s otvoreným zdrojom na GitHub). Tieto oblasti záujmu pozostávajú z kortikálneho tubulointerstícia, teda vylučujú kapsulu, glomeruly a artérie. Pretože zápal v obličkových subkapsulárnych oblastiach sa v transplantačnej patológii považuje za nešpecifický, biopsie v tejto štúdii boli primárne analyzované s výnimkou subkapsulárnej oblasti (definovanej ako 400 µm pod kapsulou). Sekundárne sme zopakovali analýzy vrátane subkapsulárnej oblasti. Vizuálne príklady oblastí záujmu sú zahrnuté na doplnkovom obrázku 4.

Detekcia lymfocytov CNN I

Umelé IHC obrazy v jasnom poli predstavujúce farbenie CD3, CD4, CD8 a CD20 sa analyzovali pomocou existujúceho CNN s architektúrou U-Net [22, 28]. Táto sieť bola špeciálne navrhnutá na detekciu cytoplazmatických lymfocytových markerov v IHC. Výkon CNN možno vyjadriť v presnosti, zapamätateľnosti a skóre F1-, kde:

CNN dosiahla presnosť {{0}},76, stiahnutie 0,79 a F1-skóre 0,78 na testovacej súprave ktorý bol použitý v pôvodnom článku, ktorý obsahuje tradičné IHC WSI. Detekcia jednotlivých pozitívnych buniek vyžaduje prahovanie výstupu CNN, po ktorom nasleduje postprocessing. Pretože farbenie CD3 v paneli mTSA bolo silnejšie v porovnaní s CD4, CD8 a CD20, použil sa nižší prah detekcie objektu pre posledné tri (0,4) a pôvodný prah detekcie objektu pre CD3 (0,7). Na posúdenie výkonu CNN na IHC WSI s umelým jasným poľom v tejto štúdii sa v tejto štúdii použili štyri umelé IHC WSI s jasným poľom (CD8 a CD20 od dvoch pacientov). Bodkové anotácie (n=1115) boli vygenerované pomocou softvéru ASAP. Po použití siete sa vypočítala presnosť, zapamätanie a skóre F{19}} na posúdenie výkonu CNN. Detekcie sa považovali za skutočne pozitívne, ak sa našli do 4 µm (priemerný priemer lymfocytov) od anotácie základnej pravdy. Keď sa našli dve detekcie v rozsahu 4 µm, iba detekcia, ktorá bola najbližšie k anotácii, sa považovala za skutočne pozitívnu. Následne bola detekcia lymfocytov CNN I použitá na analýzu všetkých umelých jasných IHC WSI reprezentujúcich cytoplazmatické lymfocytové markery (CD3, CD4, CD8 a CD20).

Detekcia lymfocytov CNN II

Analýza umelého svetlého poľa IHC WSI s jadrovými farbiacimi vzormi (ako sú prezentované T-bet a GATA3) kanály reprezentujúce DAPI a CD4 boli vybrané tak, aby sa spojili v jednom WSI (4). Farbiace vektory získané v predchádzajúcich štúdiách sa použili na umelé zafarbenie signálu DAPI modrou (hematoxylín) a signálom CD4 hnedou (DAB), čo viedlo k umelému jasnému poli IHC WSI (5).

požadované školenie, overenie a testovanie novej CNN. Na tento účel sa vyrezalo deväť sklíčok z kontrolného tkaniva obličiek, mandlí a apendixu FFPE. Tieto sklíčka boli zafarbené IHC s anti-Tibet (klon 4B1{{1{16}}}}, 14-5825-82, Thermo Fisher Scientific, USA) a anti-GATA3 (klon L50-823, CM -405B, Biocare Medical, Holandsko) protilátky. Diapozitívy boli digitalizované pomocou digitálneho skenera diapozitívov Pannoramic 25{18}} Flash II s rozlíšením 0,12 μm/pixel. Dvaja pozorovatelia vytvorili 5726 bodových anotácií v rôznych regiónoch pomocou softvéru ASAP. Anotácie z piatich snímok sa použili na trénovanie architektúry U-Net CNN pomocou záplat 256 × 256 pixelov s veľkosťou pixelov 0, 49 μm / pixel. Dva WSI sa použili na validáciu CNN a na určenie prahu detekcie objektu (0,4). Výkon CNN na tradičnom IHC WSI bol hodnotený na zadržanom testovacom súbore dvoch IHC WSI. Výkon CNN na IHC WSI s umelým jasným poľom bol hodnotený na sekundárnom testovacom súbore pozostávajúcom zo štyroch IHC WSI s umelým jasným poľom (Tibet a GATA3 od dvoch pacientov) s 1082 bodovými anotáciami. Presnosť, zapamätanie a F1-skóre boli vypočítané na posúdenie výkonnosti v oboch testovacích súboroch. Detekcie sa považovali za skutočne pozitívne, ak sa našli do 4 µm od anotácie základnej pravdy. Keď sa našli dve detekcie v rozsahu 4 µm, iba detekcia, ktorá bola najbližšie k anotácii, sa považovala za skutočne pozitívnu. Následne bola detekcia lymfocytov CNN II použitá na analýzu všetkých umelých jasných IHC WSI reprezentujúcich jadrové (lymfocytové) markery (Tibet a GATA3).

Detekcia makrofágov CNN

Na rozdiel od detekcie lymfocytov nie je identifikácia jednotlivých makrofágov jednoznačná. Najmä v zoskupených scénach možno očakávať značnú mieru variability pozorovateľov. Preto sa použil oveľa väčší počet prípadov a ľudských anotácií na trénovanie vyhradenej tretej CNN na detekciu makrofágov CD68 plus a CD163 plus. Boli odobraté IHC-zafarbené sklíčka (n=111) z natívneho a transplantovaného obličkového tkaniva. Farbenie IHC sa uskutočnilo s použitím anti-CD68 (klon PG-M1, GA61361-2, Dako Omnis, Dánsko alebo klon KP1, M0876, Dako, Dánsko) alebo anti-CD163 (klon MRQ -26 alebo 10D6, NCL-L-CD163, Leica Biosystems, UK) protilátka. Diapozitívy IHC boli digitalizované pomocou panoramatického 250 digitálneho skenera diapozitívov Flash II alebo skenera diapozitívov Aperio AT2 (Leica Biosystems, Wetzlar, Nemecko) v rozlíšení 0,24 alebo 0 0,25 μm/pixel, resp. Štyria pozorovatelia vytvorili 37 709 bodových anotácií naprieč viacerými oblasťami záujmu vo WSI pomocou protokolu pre anotáciu makrofágov, ktorý bol dohodnutý po počiatočných pilotných experimentoch. Anotácie zo 101 snímok boli použité na trénovanie architektúry YoloV2 CNN [29]. Yolo je špeciálne vhodný pre úlohy zamerané na detekčné úlohy. Sieť pozostávajúca zo siedmich konvolučných vrstiev bola trénovaná na náplastiach 256 × 256 pixelov extrahovaných s rozlíšením 0, 98 μm/pixel s ohraničujúcimi rámčekmi 21 μm (na základe priemernej veľkosti makrofágov). Desať WSI sa použilo na validáciu CNN a na určenie prahu detekcie objektu (0,45) a parametrov nemaximálneho potlačenia (0,05). Výkon CNN na tradičnom IHC WSI bol hodnotený na zadržanom testovacom súbore desiatich IHC WSI. Výkon CNN na IHC WSI s umelým jasným poľom bol hodnotený na sekundárnom testovacom súbore pozostávajúcom zo štyroch IHC WSI s umelým jasným poľom (CD68 a CD163 od dvoch pacientov) s 1033 bodovými anotáciami. Skóre presnosti, vybavovania a F1 boli vypočítané na posúdenie výkonu v oboch testovacích súboroch. Detekcie sa považovali za skutočne pozitívne, ak sa našli do 21 um (priemerný priemer makrofágov) od anotácie základnej pravdy. Keď sa v rozsahu 21 µm našlo viac detekcií, za skutočne pozitívnu sa považovala iba detekcia, ktorá bola najbližšie k anotácii. Následne bola detekcia makrofágov CNN použitá na analýzu všetkých umelých IHC WSI vo svetlom poli reprezentujúcich makrofágové markery (CD68 a CD163).

cistanche tubolosa testosterón

Dvojitá pozitivita

Pozitivita buniek pre dva markery (dvojitá pozitivita) sa hodnotila stanovením počtu pixelov medzi detekciami buniek v rôznych kanáloch. Ak bola vzdialenosť medzi dvoma detekciami lymfocytov<4 µm,="" the="" cell="" was="" considered="" double-positive.="" for="" macrophages,="" this="" was="" set="" to=""><21µm. this="" was="" used="" to="" assess="" cd3+cd4+,="" cd3+cd8+,="" cd4+tbet+,="" cd4+gata3+,="" and="" cd68+cd163+="">

Počty buniek boli vypočítané vo vnútri oblastí záujmu a hustoty buniek boli založené na počte buniek a ploche anotovanej oblasti záujmu.

Priestorové vzťahy

Automatizovaná detekcia buniek vo WSI umožňuje skúmanie priestorových vzťahov medzi bunkami. Priemerná najkratšia vzdialenosť bola určená (v oblastiach okrem subkapsulárnej oblasti) pre bunky CD68 plus a bunky CD3 plus, CD3 plus CD8 plus a CD20 plus vo WSI panelu I pre obe skupiny pacientov a medzi bunkami CD163 plus a CD4 plus , CD4 plus Tbet plus a CD4 plus GATA3 plus vo WSI pre obe skupiny pacientov.

Peritubulárny kapilárny rozsah

Aby bolo možné posúdiť rozsah peritubulárnych kapilár, nezmiešané WSI reprezentujúce kanál CD34 boli analyzované na Fidži (ImageJ verzia 2.0.0, USA, makrá a doplnky: "Open and Duplicate", "ASAP" ROI Reader") [30]. Pozitívne pixely boli určené pomocou automatického prahovania a následne vyjadrené ako percento z celkového počtu pixelov vo vnútri oblasti záujmu.

Štatistická analýza

V 6-týždňových biopsiách sa vypočítali hustoty nasledujúcich bunkových populácií: T-lymfocyty (CD3 plus), cytotoxické T-lymfocyty (CD3 plus CD8 plus), B-lymfocyty (CD20 plus), makrofágy (CD68 plus, panely I a II), polarizované makrofágy (CD68 plus CD163 plus, CD163 plus), lymfocyty T-helper 1 (CD4 plus Tbet plus) a T-helper 2 lymfocyty (CD4 plus GATA3 plus). Spearmanove korelačné koeficienty boli vypočítané na posúdenie, či je prítomná korelácia medzi hustotou lymfocytov T-helper 1 a T-helper 2 (CD4 plus Tbet plus, CD4 plus GATA3 plus) a hustotou polarizovaných makrofágov (buď CD68 plus CD163 plus alebo CD163 plus). Signál CD68 (fluorofór 540 nm) sme pozorovali v umelom CD4 (fluorofór 520 nm) IHC panelu I. Preto dodatočne uvádzame bunkové hustoty pre bunky CD3 plus CD8−. Na posúdenie rozdielov medzi skupinami pacientov s rôznymi výsledkami IFTA uvádzame priemerné, minimálne a maximálne hodnoty hustoty buniek na skupinu. Významné rozdiely v hustote buniek a rozsahu peritubulárnych kapilár (definované ako CD34-pozitívne percento pixelov) medzi skupinami boli hodnotené pomocou Mann-Whitneyho U testu pre nezávislé vzorky. Či pacienti s rôznymi výsledkami IFTA vykazujú signifikantne odlišné pomery CD3 plus CD8-/CD3 plus CD8 plus buniek, sa hodnotilo pomocou t-testu pre nezávislé vzorky. Rozdiely medzi skupinami pacientov v priestorových vzťahoch buniek CD68 plus a CD163 plus s inými imunitnými bunkami sa hodnotili na významnosť pomocou Mann-Whitneyho U testu pre nezávislé vzorky.

Výsledky

Detekcia IHC pozitívnych buniek založená na CNN

Aby sa aplikovali existujúce CNN, ktoré boli pôvodne vyvinuté pre mikroskopiu vo svetlom poli, fluorescenčné obrazy mTSA boli transformované na obrazy s umelým svetlom. Príklady oblastí zafarbených mTSA s ich zodpovedajúcimi IHC obrázkami s umelým jasným poľom sú zahrnuté na obrázku 2. Príklad umelého svetlého poľa IHC WSI je znázornený na doplnkovom obrázku 4. WSI s viacerými rozlíšením je možné otvoriť a prezerať v digitálnom zobrazení diapozitívov softvér ako ASAP a Aperio ImageScope [v12.4.3.5008]. Ako je znázornené na obr. 2, umelé svetlé pole IHC WSI bolo vhodné na automatizovanú analýzu pomocou CNN, ktoré boli pôvodne vyvinuté pre tradičné IHC WSI.

Tri CNN boli použité na kvantitatívne hodnotenie zápalových buniek v 6-týždňových mTSA zafarbených transplantačných biopsiách: na detekciu lymfocytov s cytoplazmatickým (CNN I) a nukleárnym (CNN II) IHC farbením a na detekciu makrofágov. Tabuľka 2 ukazuje výkonnosť CNN (presnosť, vybavovanie a F1-skóre) pre zdržané sady IHC WSI zafarbených DAB a IHC WSI s umelým svetlom. Výkon CNN bol zvyčajne taký dobrý alebo lepší ako základná úroveň CNN opísaná predtým (so skóre F1- 0,78), pri ktorej sa ukázalo, že má výkon porovnateľný so skúsenými manuálnymi pozorovateľmi [22] . Zatiaľ čo detekcia lymfocytov CNN II vykazovala trochu znížený výkon na virtuálnych snímkach s jasným svetlom v porovnaní so skutočnými snímkami DAB (na ktorých bola CNN trénovaná), pri detekcii makrofágov sa pozoroval opak u CNN.

Príklad úspešného automatického hodnotenia dvojitej pozitivity je na obr.

Korelácia rôznych typov buniek

Najsilnejšia korelácia bola pozorovaná medzi CD4 plus GATA3 plus bunkovou hustotou a CD163 plus bunkovou hustotou (Spearmanov koeficient 0,75, p < 0.001)="" v="" 6="" týždňová="" biopsia="" (doplnkový="" obrázok="" 5a).="" táto="" korelácia="" bola="" slabšia="" medzi="" cd4="" plus="" tbet="" plus="" hustota="" buniek="" a="" cd163="" plus="" hustota="" buniek="" (spearmanov="" koeficient="" 0.61,="" p="">< 0.01)="" (doplnkový="" obrázok="" 5b)="" .="" pri="" obmedzení="" bunkovej="" populácie="" na="" dvojito="" pozitívne="" makrofágy="" (cd68="" plus="" cd163="" plus),="" spearmanov="" korelačný="" koeficient="" bol="" 0,65="" (p="">< 0,01)="" s="" bunkami="" cd4="" plus="" gata3="" plus="" a="" 0,66="" (p="">< 0,01)="" s="" cd4="" plus="" tbet="" plus="" bunky="" (doplnkový="" obrázok="" 5c,="" d).="" zahrnutie="" subkapsulárnej="" oblasti="" do="" analýz="" nezmenilo="">

Porovnanie zápalových infiltrátov medzipacienti s progresiou do IFTA oproti non-IFTA

Pacienti s progresiou do IFTA po 6 mesiacoch vykazovali signifikantne vyššie hustoty CD163 plus buniek v biopsiách odobratých 6 týždňov po transplantácii (medián 505 buniek/mm2) v porovnaní s pacientmi, ktorí neprešli do IFTA (medián 370 buniek/mm2; p=0 0,043) (tabuľka 3). Zahrnutie subkapsulárnej oblasti malo za následok mierne zníženie tohto účinku (p=0,051). V oboch paneloch boli použité CD68 a CD4. Sklíčka zafarbené panelom mTSA I vykazovali väčšiu pozitivitu CD68 ako sklíčka zafarbené panelom mTSA II. Hustota CD4 buniek je vyššia v mTSA paneli II v porovnaní s mTSA panelom I (tabuľka 3).

Rozsah peritubulárnych kapilár bol podobný v 6-týždňových biopsiách pacientov s DGF s rôznymi výsledkami IFTA (tabuľka 3), a to pri vylúčení (p=0 0,74) a vrátane (p=0 0,90) subkapsulárnej oblasti z/v analýze.

Hodnotenie pomerov CD3 plus CD8-/CD3 plus CD8 plus buniek ukázalo výrazne vyšší pomer u pacientov s<10% ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (ratio="" of="" 17.5)="" than="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" (ratio="" of="" 9.80;="" p="0.043)" (table="">

Priemerná najkratšia vzdialenosť od buniek CD68 plus k bunkám CD3 plus, CD3 plus CD8 plus a CD20 plus (panel I) a od buniek CD163 plus k bunkám CD4 plus, CD4 plus Tbet plus a CD4 plus GATA3 plus bunkám (panel II) bola sa medzi skupinami pacientov výrazne nelíšia. Výsledky sú znázornené na obr.

extrakt z cistanche: zlepšuje funkciu obličiek a fyzickú silu

Diskusia

V tejto štúdii sme vyvinuli metódu na presnú a objektívnu kvantifikáciu infiltrátov zápalových buniek v biopsiách štepu pacientov s transplantovanou obličkou s DGF, ktorá obchádza rozsiahle sériové rezanie materiálu obličkovej biopsie. Na tento účel sme skombinovali multiplexné IHC, amplifikáciu tyramidového signálu, multispektrálne zobrazovanie a kvantifikáciu pomocou CNN. Boli sme prví, ktorí previedli dlaždicové multispektrálne údaje na jeden umelý chromogénny obraz na bunkový marker, čím sme uľahčili analýzu WSI a aplikáciu CNN navrhnutých pre svetlé pole IHC. Navrhli sme dve nové CNN na detekciu jadrových zafarbených lymfocytov a makrofágov a demonštrovali sme zovšeobecniteľnosť CNN vyvinutých na tradičnom IHC WSI na umelé svetlé pole IHC WSI. Použiteľnosť našej metódy bola preukázaná použitím kvantitatívnych výsledkov získaných CNN na štúdium korelácií zápalového mikroprostredia v 6-týždňových biopsiách pacientov s DGF s rozvojom IFTA 6 mesiacov po transplantácii.

Použili sme komerčne dostupnú súpravu na manuálne farbenie pre multiplexné IHC na vizualizáciu imunitných buniek a peritubulárnych kapilár v biopsiách dohľadu získaných 6 týždňov po transplantácii. Postup multiplexného farbenia pozostával z viacerých krokov premývania, inkubácie a varu tkaniva a zahŕňa niekoľko roztokov činidiel. Rozsiahle validácie metód a kontroly kvality sú preto veľmi dôležité a odporúča sa použitie špecifických protilátok, ktoré poskytujú konzistentnú intenzitu farbenia. Napriek vykonaným validačným krokom boli v CD4 kanáloch sklíčok z mTSA panelov I a II pozorované zafarbenie podobné makrofágom. Cykly farbenia CD4 a CD68 sa neuskutočnili po sebe, takže tento jav nemohol byť spôsobený neúplným stripovaním protilátky CD68 (doplnková tabuľka 1). Hoci boli opísané zriedkavé prípady duálnej pozitivity makrofágov s CD4 [31], vierohodnejšie vysvetlenie spočíva v blízkosti emisných spektier fluoroforov, ktoré sa použili na vizualizáciu CD4 (520 nm) a CD68 (540 nm), pričom obe sú pokryté filtračnou kockou FITC fluorescenčného mikroskopu. To môže spôsobiť "prepúšťanie" silného signálu CD68 do kanála CD4. Veľká časť tohto signálu bola vylúčená z analýzy v paneli I, pretože na všeobecnú analýzu pomocných T-buniek sa použili iba bunky CD4 plus, ktoré boli dvojito pozitívne na CD3. Napriek tomu sme sa rozhodli nepriamo hodnotiť aj všeobecné T-pomocné bunky pomocou CD3 plus CD8- ako náhrady. V paneli II sa CD4 použil výlučne v kombinácii s Tibetom a GATA3, čím sa obmedzilo riziko použitia falošne pozitívnych detekcií.

Nižšia CD68 pozitivita bola pozorovaná v paneli II v porovnaní s panelom I. Predpokladáme, že ide o výsledok stérickej inhibície depozitom tyramidu patriacim k CD163 („dáždnikový efekt“) [32]. Pozorovali sme výrazne viac CD163-pozitívnych buniek v študovanej kohorte ako v tkanive mandlí, ktoré sa použilo na kontrolu stérickej inhibície, čo možno vysvetľuje, prečo tento účinok nebol objavený počas validácie.

Multiplexná IHC bola kombinovaná s multispektrálnym zobrazovaním na vyšetrenie mikroprostredia nádoru v niekoľkých onkologických štúdiách a nedávno aj na analýzu rejekcie obličkového aloštepu [33–35]. Na extrakciu príspevku všetkých markerov na sklíčkach mTSA sa rezy zobrazujú systémom Vectra alebo podobným fluorescenčným mikroskopom s multispektrálnym nastavením. Po zaznamenaní prehľadovej snímky s nízkym zväčšením systém Vectra rozdelí tkanivo na dlaždice a automaticky dlaždice multispektrálne skenuje. Výsledkom sú dlaždice obrazu s viacerými prispievajúcimi spektrami. Pretože spektrá jednotlivých fluorofórov sú známe z vopred zaznamenanej spektrálnej „knižnice“, je možné rozložiť multiplexné dlaždice na viacero jednotlivých dlaždíc reprezentujúcich príspevok každého fluorofóru („nezmiešanie“). Vo väčšine štúdií sa nezmiešané obrázky následne analyzujú pomocou komerčného softvéru. V mnohých prípadoch tieto programy nepodporujú analýzu WSI, majú problémy s analýzou zoskupených buniek a často nie sú odolné voči artefaktom a variáciám farbenia. Konverzia nezmiešaných dlaždíc na umelé svetlé pole IHC WSI nám umožnila použiť existujúci CNN špeciálne navrhnutý na detekciu lymfocytov v IHC [22] (označovaný ako detekcia lymfocytov CNN I). Táto sieť dokáže detegovať jednotlivé a zoskupené lymfocyty s vysokou presnosťou, pričom je odolná voči farbeniu pozadia (obr. 2, CD3). Okrem toho sme trénovali dve nové CNN na detekciu buniek so vzormi farbenia jadra (Tibet, GATA3) (detekcia lymfocytov CNN II) a na detekciu makrofágov. Makrofágy sa notoricky ťažko detegujú kvôli ich rozptýlenému vzoru farbenia. Detekcia makrofágov CNN bola preto trénovaná pomocou anotácií štyroch rôznych odborníkov. Pred vytvorením anotácií bolo naplánovaných viacero stretnutí, na ktorých sa prediskutovali a posúdili kritériá pre anotovanie makrofágov. To viedlo k sieti, ktorá dokáže detegovať makrofágy reprodukovateľným spôsobom, pričom je robustná pre nešpecifické farbenie (tabuľka 2, obr. 2 a doplnkový obrázok 6). Pokiaľ je nám známe, toto je prvý algoritmus na detekciu makrofágov v skenovaných histopatologických rezoch. Výkon všetkých troch sietí sme testovali na testovacej sade zloženej z tradičného IHC WSI (podobné tým, ktoré sa používajú počas tréningu) a na sekundárnej testovacej sade, ktorá pozostávala z umelého svetlého poľa IHC WSI, generovaného z multispektrálne zaznamenaných snímok. Všetky CNN vykazujú veľmi dobrý výkon v primárnych testovacích súboroch a podobné F1-skóre v sekundárnych testovacích súboroch. Výkonnostné metriky detekcie lymfocytov CNN I boli vypočítané na normálnom tkanive, artefaktoch a bunkových zhlukoch. Umelé svetlé pole IHC druhej testovacej sady neobsahovalo žiadne tkanivové artefakty a menej bunkových zhlukov. To môže vysvetliť celkovo lepší výkon tejto siete na druhej testovacej sade. Detekcia makrofágov CNN bola trénovaná a testovaná na anotáciách od štyroch rôznych anotátorov. Hoci sa diskutovalo najmä o kritériách anotácie, napriek tomu boli pozorované rozdiely v štýle anotácie. Citlivosť CNN je teda pravdepodobne niekde v strede extrémov štýlu anotácií. Anotácie pre druhý testovací súbor boli generované jedným anotátorom, zdanlivo zodpovedajúce citlivosti CNN.

Použitie opísaných CNN nám umožnilo vyšetriť zápalový infiltrát s bezprecedentnou presnosťou v jedinečnej sérii dôsledne vybraných včasných biopsií pacientov po transplantácii s DGF.

Nanešťastie, viaceré vzorky museli byť z analýzy vylúčené, väčšinou z dôvodu nedostatočného zvyškového tkaniva po diagnostickom spracovaní. Aj pri obmedzenej veľkosti súboru údajov sme našli významne vyššie hustoty buniek CD163 plus v biopsiách pacientov s DGF, u ktorých sa vyvinula IFTA, čo je v súlade s potenciálne profibrotickou úlohou týchto buniek [11]. Zatiaľ čo pozorovaný trend bol v súlade s publikovanými údajmi, nemohli sme potvrdiť škodlivý účinok skorej prítomnosti CD68 plus makrofágov, ktoré boli predtým hlásené u iných skupín pacientov s transplantovanou obličkou [7, 36, 37]. Našli sme pozitívnu koreláciu medzi hustotami CD4 plus GATA3 plus buniek a CD163 plus buniek, čo by mohlo potvrdiť príspevok T-helper 2 lymfocytov k pro-fibrotickému mikroprostrediu. Aj keď v tejto štúdii neboli objavené žiadne nové prediktívne biomarkery pre vývoj IFTA u pacientov s DGF, úspešne sme vyvinuli metódy na presné, reprodukovateľné a škálovateľné hodnotenie zápalového infiltrátu v riedkom tkanive, ako sú transplantačné biopsie. Tieto metódy sú cenné pre budúce kvantitatívne štúdie zápalu v histopatologickom tkanive.

Ak chcete zmierniť únavu nadobličiek pomocou cistanche, kliknite sem a získajte ďalšie podrobnosti

Dostupnosť údajov

Požiadavky na spoluprácu zahŕňajúce použitie údajov prezentovaných v tejto štúdii možno adresovať príslušnému autorovi (jeroen.vanderlaak@radboudumc.nl) alebo FF (Feuerhake. Friedrich@mh-hannover.de).

Poďakovanie

Ďakujeme Markovi Gorrisovi a Kiekovi Verrijpovi za ich rady týkajúce sa farbenia a zobrazovania mTSA, Merijn van Erp za vývoj prispôsobených funkcií ImageJ a Sophie van den Broek, Milly van de Warenburg a Martijn Otten za generovanie základnej pravdy pre sieť detekcie makrofágov. Okrem toho ďakujeme Irine Scheffnerovej za jej pomoc pri zbere klinických údajov.

Autorské príspevkyMH, VV, JS, WG, FF, BS, LBH a JAWML

navrhol štúdiu. Materiál pacienta a klinické údaje zozbierali a poskytli JS, WG a FF. FF koordinoval úsilie vynaložené na MHH. JHB, EJS a JK zaznamenali skóre PAS v percentách IFTA. MH vykonala farbenie mTSA, validáciu panelov I a II a zobrazenie a rozmiešanie panelu I. VV zobrazený a nezmiešaný panel II. DJG vyvinul metódy na konverziu dlaždíc mTSA na umelé svetlé pole WSI. MH vykonala prepočty. ZS-C vyvinul CNN na detekciu lymfocytov a napísal skripty na kvantifikáciu lymfocytov. JL vyvinul CNN detekcie makrofágov a napísal skripty na kvantifikáciu makrofágov. MH vykonala kvantifikáciu buniek a kapilár. NSS vypočítal vzdialenosti buniek. MH, BS, LBH a JAWML analyzovali údaje. MH urobila čísla a vypracovala dokument. Konečná verzia rukopisu bola revidovaná a schválená všetkými autormi.

FinancovanieTáto práca bola podporená iniciatívou ERACoSysMed (projekt SysMIFTA) ako súčasť rámcového programu Európskej únie Horizont 2020, ktorý ponúka ZonMw (grant č. 9003035004), so spolufinancovaním nemeckého ministerstva pre výskum a vzdelávanie (BMBF), grant č. . FKZ031L-0085A (SysMIFTA), FKZ01ZX1710A (MicMode-I2T) a FKZ01ZX1608A (SYSIMIT). Spoločnosť JAWML získala poplatky za poradenstvo od spoločnosti Philips (Holandsko) a granty od spoločnosti Philips

ContextVision, Philips (Holandsko) a Sectra (Švédsko), mimo predloženej práce. JK získal finančnú podporu od Holandskej nadácie pre obličky (projekt DEEPGRAFT, grant č. 17OKG23).

Dodržiavanie etických noriem

Konflikt záujmovAutori nedeklarujú žiadne konkurenčné záujmy.

Etický súhlas a súhlas s účasťouZber údajov a analýza sa uskutočnili s informovaným súhlasom pacienta a so súhlasom etickej komisie (č. 2765) Hannoverskej lekárskej fakulty.

Poznámka vydavateľaSpringer Nature zostáva neutrálny, pokiaľ ide o jurisdikčné nároky v publikovaných mapách a inštitucionálnych pridruženiach.

Otvorený prístupTento článok je licencovaný na základe Creative Commons Attribution 4.{1}} Medzinárodná licencia, ktorá povoľuje používanie, zdieľanie, adaptáciu, distribúciu a reprodukciu na akomkoľvek médiu alebo formáte, ak uvediete pôvodného autora (autorov) ) a zdroj, uveďte odkaz na licenciu Creative Commons a uveďte, či boli vykonané zmeny. Obrázky alebo iný materiál tretích strán v tomto článku sú zahrnuté v licencii Creative Commons článku, pokiaľ nie je uvedené inak v úverovom limite k materiálu. Ak materiál nie je zahrnutý v licencii Creative Commons k článku a vaše zamýšľané použitie nie je povolené zákonnými predpismi alebo prekračuje povolené použitie, budete musieť získať povolenie priamo od držiteľa autorských práv.

Referencie

1. Siedlecki A, Irish W, Brennanová DC. Oneskorená funkcia štepu pri transplantácii obličky. Am J Transplant. 2011;11:2279–96.

2. Khalkhali HR, Ghafari A, Hajizadeh E, Kazemnejad A. Rizikové faktory dlhodobej straty štepu u príjemcov obličkového transplantátu s chronickou dysfunkciou štepu. Exp Clin Transplant. 2010;8:277–82.

3. Yarlagadda SG, Coca SG, Formica RN, Poggio ED, Parikh ČR. Asociácia medzi oneskorenou funkciou štepu a aloštepu a prežitím pacienta: systematický prehľad a metaanalýza. Transplantácia nefrolového číselníka. 2009;24:1039–47.

4. Schröppel B, Legendre C. Oneskorená funkcia obličkového štepu: od mechanizmu k translácii. Kidney Int. 2014;86:251–8.

5. Mengel M, Reeve J, Bunnag S, Einecke G, Jhangri GS, Sis B a kol. Hodnotenie celkového zápalu je lepšie ako súčasné Banffovo skóre zápalu pri predpovedaní výsledku a stupňa molekulárnej poruchy v obličkových aloimplantátoch. Am J Transplant. 2009;9:1859–67.

6. Cosio FG, Grande JP, Wadei H, Larson TS, Griffin MD, Stegall

MUDr. Predpovedanie následného poklesu funkcie aloštepu obličiek z včasných biopsií dohľadu. Am J Transplant. 2005;5:2464–72.

7. Toki D, Zhang W, Hor KLM, Liuwantara D, Alexander SI, Yi Z a kol. Úloha makrofágov vo vývoji fibrózy ľudského renálneho aloštepu v prvom roku po transplantácii. Am J Transplant. 2014;14:2126–36.

8. Ikezumi Y, Suzuki T, Yamada T, Hasegawa H, Kaneko U, Hara M a kol. Alternatívne aktivované makrofágy v patogenéze chronického poškodenia obličkového aloštepu. Pediatr Nephrol. 2015;30:1007– 17.

9. Biswas SK, Mantovani A. Plasticita makrofágov a interakcia s podskupinami lymfocytov: rakovina ako paradigma. Nat Immunol. 2010;11:889–96.

10. Anders HJ, Ryu M. Renálne mikroprostredia a makrofágové fenotypy určujú progresiu alebo vymiznutie renálneho zápalu a fibrózy. Kidney Int. 2011;80:915–25.

11. Ordikhani F, Pothula V, Sanchez-Tarjuelo R, Jordan S, Ochando J. Makrofágy pri transplantácii orgánov. Frontiers Immunol. 2020;11:582939.

12. Loverre A, Divella C, Castellano G, Tataranni T, Zaza G, Rossini M, et al. Podskupiny buniek pomocných T 1, 2 a 17 u pacientov po transplantácii obličky s oneskorenou funkciou štepu. Transpl Int. 2011;24:233–42.

13. Klauschen F, Müller KR, Binder A, Bockmayr M, Hägele M, Seegerer P, et al. Hodnotenie lymfocytov infiltrujúcich nádor: od vizuálneho odhadu po strojové učenie. Seminár Cancer Biol. 2018;52:151–7.

14. Lauren J, Häyry P, Paavonen T. Metóda založená na analýze obrazu na kvantifikáciu parametrov indexu chronického poškodenia aloštepu. AMPS. 2006;114:440–8.

15. Malpica N, Solórzano CO, de, Vaquero JJ, Santos A, Vallcorba I, García-Sagredo JM, et al. Aplikácia algoritmov povodia na segmentáciu klastrových jadier. Cytometria. 1997;28:289-97.

16. Lai YK, Rosin PL. Efektívne kruhové prahovanie. IEEE Trans Med Imaging. 2014;23:992–1001.

17. Litjens G, Kooi T, Ehteshami Bejnordi B, Setio AAA, Ciompi F, Ghafoorian M a kol. Prieskum hlbokého učenia v analýze medicínskych obrazov. Med Image Anal. 2017;42:60–88.

18. Madabhushi A, Lee G. Analýza obrazu a strojové učenie v digitálnej patológii: výzvy a príležitosti. Med Image Anal. 2016;33:170–5.

19. Ehteshami Bejnordi B, Veta M, Diest PJ, van, Ginneken B, van, Karssemeijer N, Litjens G, et al. Diagnostické hodnotenie algoritmov hlbokého učenia na detekciu metastáz v lymfatických uzlinách u žien s rakovinou prsníka. JAMA. 2017;318:2199–210.

20. Hermsen M, Bel T, de, Boer M, den, Steenbergen EJ, Kers J, Florquin S, et al. Histopatologické hodnotenie obličkového tkaniva založené na hĺbkovom učení. J Am Soc Nephrol. 2019;30:1968–79.