Kvantitatívna proteomická štúdia odhaľuje cestu fibrinogénu pri polycystickej chorobe pečene

Abstrakt:(1) Pozadie: Polycystická choroba pečene (PLD) je heterogénna skupina vrodených porúch charakterizovaných dilatáciou žlčovodu a vývojom cysty odvodenej od cholangiocytov. Mechanizmus cystogenézy je však v súčasnosti neznámy a liečba PLD je obmedzená na transplantáciu pečene. Potrebné sú preto nové a účinné terapeutické prístupy. V tomto kontexte má táto práca hlavný cieľ nájsť nové molekulárne dráhy, ako aj nové terapeutické ciele, ktoré sa podieľajú na procese cystogenézy pečene. (2) Metódy: Kvantitatívna proteomika založená na technológii SWATH–MS bola vykonaná porovnaním pečeňových proteómovDivoký typa mutantné/polycystické pečene v apolycystické ochorenie obličiek(PKD) myšací model (Pkd1cond/cond; Tam-Cre−/+). (3) Výsledky: Identifikovali sme niekoľko proteínov zmenených v hojnosti, s dvojnásobnou hraničnou up-reguláciou alebo down-reguláciou a upravenoup-hodnota významne súvisí s cystogenézou pečene. Potom sme vykonali obohatenie a analýzu proteín-proteín identifikujúcu klaster zameraný na pečeňové fibrinogény. Nakoniec sme overili výber cieľov pomocou RT-qPCR,Western blotting,a imunohistochémia, pričom sa zistila vysoká korelácia s kvantitatívnymi proteomickými údajmi a potvrdil sa komplex fibrinogénu. (4) Závery: Táto práca identifikovala novú molekulárnu dráhu pri cystickom ochorení pečene, pričom zdôraznila komplex fibrinogénu ako možný nový terapeutický cieľ pre PLD.

Kľúčové slová:PLD; SWATH; kvantitatívna proteomika; terapeutické ciele

1. Úvod

Polycystické ochorenie pečene(PLD) je heterogénna skupina vrodených porúch charakterizovaných dilatáciou žlčových ciest a vývojom cysty odvodenej z cholangiocytov (epiteliálnych buniek zo žlčovodu). Početné cysty sa šíria a postupujú po celom pečeňovom parenchýme, čo ohrozuje jeho funkciu [1]. PLD sa dedia v dominantnej alebo recesívnej forme a môžu sa vyskytovať izolovane (izolované polycystické ochorenie pečenealeboPLD) alebo bežnejšie ako anextrarenálny prejavautozomálnedominantné polycystické ochorenie obličiek u dospelých(PKD) [2]. Inautozomálne dominantné polycystické ochorenie obličiek(ADPKD) sa u ~85 % pacientov vyvinú pečeňové cysty v celom pečeňovom parenchýme a ich závažnosť sa môže pohybovať od niekoľkých cýst až po závažnú cystogenézu pečene [3,4]. Medzitým vautozomálne recesívne polycystické ochorenie obličiek(ARPKD) sa môžu vyvinúť pečeňové cysty, ale hlavnou hepatálnou komplikáciou je defektná remodelácia duktálnej platničky s vrodenou fibrózou pečene [5,6]. Pre oboch je PLD hlavným extrarenálnym prejavom a vyžaduje klinický manažment a liečbu [2,5]. Hlavným klinickým prístupom pre pacientov s PLD je zníženie ich klinických symptómov. Manažment komplikácií žlčových ciest je hlavným klinickým znakom, ktorý treba kontrolovať, a konečnou liečebnou stratégiou je zvyčajne transplantácia pečene [7], keďže neexistuje účinná farmakologická liečba PLD [2,5]. S ochorením sa spája viacero molekulárnych dráh [8], ako je zvýšená sekrécia tekutín [9,10], proliferácia [11], fibróza [12,13], ciliárne defekty [14] a iné [7,8]; ale hlavný mechanizmus podstupujúci cystogenézu zostáva ešte objasniť. Naliehavo sa vyžaduje identifikácia nových potenciálnych terapeutických cieľov. Všetky tieto štúdie boli založené na molekulárnych štúdiách s použitím rôznych klasických molekulárnych nástrojov: 3D bunková kultúra [7,8], imunohistochémia [7–9,11,12], ELISA [9,11], transmisná elektrónová mikroskopia (TEM) [12]. , imunocytochémia [11], RT-qPCR (kvantitatívna PCR v reálnom čase) [7,8,10,11] a Western blot [7,8,10–12]. Priblíženie sa k štúdiu chorôb z nových perspektív, dobre zavedených predklinických zvieracích modelov a využitie nových technológií môže byť prínosom pri objavovaní nových molekulárnych mechanizmov chorôb s cieľom premeniť molekulárne objavy na nové terapie.

Kvapalinová chromatografia spojená s tandemovou hmotnostnou spektrometriou (LC–MS/MS) bola najčastejšie používanou technológiou na charakterizáciu proteómov ochorenia, ako aj na identifikáciu možných biomarkerov ochorenia alebo na skríning liekov [15,16]. Vznikajúca stratégia s názvom SWATH–MS (sekvenčné získavanie okien všetkých teoretických fragmentovo-iónových spektroskopických hmotnostných spektrometrií) umožňuje reprodukovateľnú, spoľahlivú, vysoko výkonnú kvantifikáciu s až tisíckami proteínov analyzovaných na biologickú vzorku a s možnosťou súčasného vykonávania veľké množstvo testov [16,17]. Pre túto technológiu sa vzorky štiepia trypsínom a analyzujú sa kvapalinovou chromatografiou spojenou s tandemovou hmotnostnou chromatografiou pracujúcou v takzvanom režime získavania nezávislej na dátach (DIA) [16] (pozri Materiál a metódy). Proteomika novej generácie Technológia SWATH–MS umožňuje kvantifikovať proteóm a identifikovať rozdiely v množstve proteínov v rôznych vzorkách a podmienkach.

V tejto štúdii sme vykonali diferenciálnu proteomickú kvantitatívnu analýzu založenú na technológii SWATH–MS pri polycystickom ochorení pečene z mutantných zvieracích modelov. Uvádzame zoznam proteínov so štatistickou významnosťou rozdielneho zastúpenia proteínov, ktoré boli charakterizované rôznymi analýzami obohatenia a spracovaním údajov. Nakoniec sme overili údaje SWATH identifikáciou a zvýraznením komplexu fibrinogénu ako nového mechanizmu ochorenia a možného nového terapeutického cieľa pre PLD.

2. Materiály a metódy

2.1. Model myšiaka

V tejto štúdii sme použili myšací zvierací model s podmieneným vyradením Pkd1, C57/BL6 k Pkd1cond/cond; Tam-Cre [18,19]. Myší model Cre bol použitý ako divoké typy (WT) a Cre+ ako mutant (KO). Genotypy boli potvrdené štandardnou PCR podľa opísaných podmienok a primerov [18]. Delécia Pkd1 bola vždy v postnatálnych dňoch 10 a 11 (p10 a p11) jednou intraperitoneálnou injekciou tamoxifénu (10 mg/40 g) (Sigma®, St. Louis, MO, USA č. T5648), zriedeného v kukuričnom oleji (Sigma–Aldrich®, St. Louis, MO, USA č. C8267), oba dni v matke vrhov, ktoré sa majú vyvolať. Zvieratá boli usmrtené na 30. deň po narodení (p30). Skupiny boli založené rôznymi jednotlivcami a organizované náhodne (randomizácia) pri zachovaní pomeru 1:1 medzi mužmi a ženami vo všetkých skupinách. Anatomické charakteristické znaky sa použili na identifikáciu pohlavia zvierat. Myši boli umiestnené v zariadení bez patogénov (SPF) podľa stanovených podmienok univerzity v Santiagu.

2.2. Extrakcia a trávenie bielkovín

V bode usmrtenia p30 boli vypreparované pečene skladované pri -80 ◦C. Celá pečeň bola rozomletá v tekutom dusíku pomocou trecej misky chladenej tekutým dusíkom (DD Biolab®, Barcelona, ​​Španielsko č. 088763), pričom polovica tkaniva bola pridelená na extrakciu proteínu a druhá polovica na extrakciu RNA. Proteínové extrakty boli pripravené s RIPA lyzačným pufrom (10 mM TRIS, 5 mM EDTA, 150 mM NaCI, 0,1 % SDS, 1 % TRITON X-100 a 1 % deoxycholát sodný). Pridali sa tiež 1 % inhibítory proteázy a fosfatázy (Sigma® č. P8340 y č. P0044). Tento tkanivový lyzát prešiel procesom odstreďovania (30 minút pri 4 °C a 14,000 otáčkach za minútu). Supernatant bol potom znovu odobratý a kvantifikovaný Bradfordovým proteínovým testom (Bio-Rad® č. 5000001). Proteínové alikvóty (100 ug) boli koncentrované v jednom páse v 10% dodecylsulfát-polyakrylamidovej gélovej elektroforéze (SDSPAGE), narezané a podrobené manuálnemu štiepeniu, ako bolo opísané vyššie [20]. Nakoniec sa extrahované peptidy rozpustili v 0,1 % kyseline mravčej na ďalšiu analýzu.

2.3. Proteomika

2.3.1. DDA-údaje

Závislá analýza 4 µl každej vzorky (viac ako 4 µg proteínu) sa analyzovali metódou shotgun data-dependent Acquisition (DDA) pomocou mikro-LC–MS/MS. Vzorky boli separované mikro-LC systémom Ekspert nLC425 (Eksigen®, Dublin, CA, USA) s použitím zachytávacej kolóny YMC-TRIART C18 s veľkosťou častíc 3 mm a veľkosťou pórov 120 Å (YMC Technologies, Teknokroma, Barcelona, ​​Španielsko) a kolóna Chrom XP C{{10}} mm × 0,30 mm, veľkosť častíc 3 mm a veľkosť pórov 120 Å (Eksigen® ) pri prietoku 10 ul/min. Použité rozpúšťadlá boli rozpúšťadlo A (voda, 0,1 % kyselina mravčia) a rozpúšťadlo B (ACN, 0,1 % kyselina mravčia). Gradient bol od 5 % do 95 % B počas 30 minút, 5 minút pri 90 % B a nakoniec ďalších 5 minút pri 5 % B na ekvilibráciu kolóny, celkovo 40 minút. Pripojený hmotnostný spektrometer bol hybridný kvadrupólový-TOF hmotnostný spektrometer, 6600 (SCIEX®, Framingham, MA, USA) pracujúci s dátovo závislým akvizičným systémom v režime kladných iónov. Pomocou hmotnostného spektrometra sa uskutočnilo 250 ms prieskumné skenovanie pri 400 až 1250 m/z, po ktorom nasledovali MS/MS experimenty pri 100 až 1500 m/z (25 ms akvizičného času) s celkovým časom cyklu 2,8 s. Fragmentované prekurzory boli pridané do zoznamu dynamických vylúčení na 15 s, akýkoľvek ión s nábojom +1 bol vylúčený z analýzy MS/MS. Prehľadávania súborov MS raw a databáz boli skombinované a uskutočnené pomocou softvéru ProteinPilot v.5.0.1. (SCIEX®, Framingham, MA, USA) pomocou databázy UniProt Swiss-Prot špecifickej pre myši. Je potrebné špecifikovať alkyláciu jódacetamidového cysteínu ako fixnú modifikáciu a štiepenie trypsínom. Miera falošného objavenia (FDR) bola nastavená na 1 pre peptidy a proteíny so skóre spoľahlivosti vyšším ako 99 % [21].

2.3.2. Generovanie referencií

Spektrálna knižnica Spektrálna knižnica sa uskutočnila metódou DDA, ako je opísané vyššie, ale namiesto každej nezávislej vzorky sa uskutočnila skupina každej skupiny so 4 ul každej vzorky (viac ako 4 ug proteínu), aby sa získal reprezentatívnejší proteín. identifikácia v spektrálnej knižnici. Všetky nespracované súbory boli spustené spoločne do databázy Uniprot, aby sa získala spektrálna knižnica s použitím proteínových pilotných podmienok uvedených v predchádzajúcej časti.

2.3.3. Kvantifikácia pomocou SWATH a analýzy údajov

Akvizícia SWATH–MS sa uskutočnila pomocou metódy DIA. Použili sme 4 skupiny so 4 biologickými replikátmi na skupinu a 3 technickými replikátmi na vzorku (ďalšie podrobnosti nájdete v tabuľke S1). Tkanivá boli analyzované a vo všetkých prípadoch porovnané v podmienkach divokého typu (z Pkd1cond/cond; Tam-Cre-myš) a Mutant (z Pkd1cond/cond; Tam-Cre+ myš). 4 ug proteínu na vzorku a technické replikáty boli uskutočnené s použitím metódy SWATH. Pre každú sadu vzoriek bola šírka 100 variabilných okien optimalizovaná podľa iónovej hustoty zistenej v knižnici DDA s použitím tabuľkového procesora Sciex SWATH s variabilným oknom. Preto bola metóda SWATH založená na cykle opakovaní, ktorý pozostával zo získania 100 TOF MS/MS skenov (400 až 1500 m/z, režim vysokej citlivosti, 50 ms akvizičného času) izolačných okien sekvenčných prekrývajúcich sa prekurzorových premenných so šírkami (1 m/z prekrytie) pokrývajúci hmotnostný rozsah 400 až 1250 m/z s predchádzajúcim TOF MS skenom (400 až 1500 m/z, 50 ms akvizičný čas) pre každý cyklus. Celkový čas cyklu bol 6,3 s.

2.3.4. Analýza dát

Všetky proteíny v iónovej knižnici, ktoré boli identifikované pomocou ProteinPilot s FDR pod 1 %, boli kvantifikované metódou SWATH. Po získaní jednotlivých vzoriek sa vykonalo spektrálne porovnanie a cielená extrakcia údajov pomocou PeakView v.2.2. (SCIEX®, Framingham, MA, USA) zodpovedajúce referenčnej spektrálnej knižnici, ako je opísané nižšie [22–26]. Retenčné časy peptidov, ktoré boli vybrané pre každý proteín, boli prerovnané v každom cykle podľa iRT peptidov prítomných v každej vzorke a boli eluované pozdĺž celej časovej osi. Extrahované iónové chromatogramy sa potom generovali pre každý ión vybraného fragmentu; plochy píkov pre peptidy sa získali pridaním plôch píkov iónov zodpovedajúcich fragmentov. PeakView vypočítal FDR a skóre pre každý priradený peptid podľa chromatografických a spektrálnych komponentov; na kvantifikáciu proteínu sa použili iba peptidy s FDR pod 5 %. Podobne, aby sa získali oblasti na kvantifikáciu proteínov ako funkcia intenzity signálu, bolo vybraných až 10 peptidov na proteín a sedem fragmentov na peptid. Všetky zdieľané a modifikované peptidy boli vylúčené zo spracovania. Na extrakciu iónových chromatogramov sa použili päťminútové okná a šírka 30 ppm.

2.3.5. Analýza signálnej dráhy

Uskutočnila sa odlišná funkčná analýza s použitím rozdielne exprimovaných proteínov na vyhodnotenie najrelevantnejších interakčných sietí, súvisiacich dráh alebo bunkových komponentov a iných pridružených proteínov alebo dráh. Použili sa prístupové čísla proteínov UniProt (https://www.uniprot.org/, 28. augusta 2021). Proteíny s rozdielmi v množstve proteínov boli podrobené: String® (https://string-db.org/, 25. októbra 2021) s použitím termínov Gene Ontology (GO) a FunRich® (http://funrich.org/index.html 21. októbra 2021) na štúdium proteínových sietí a biologického spojenia medzi proteínmi; a Reactome® (https://reactome.org/, 25. októbra 2021) na štúdium dráh zapojených do vzťahu alebo interakcie s významne exprimovanými proteínmi.

2.4. Histológia a meranie cystického indexu

Najväčší lalok pečene zvierat bol vždy fixovaný v paraformaldehyde (4 % roztok pufrovaný paraformaldehydom, pH=7, Labbox č. FORM-D0P-10K) cez noc pri 4. ◦C. Pečene sa potom dehydratovali xylénom a etanolom a nakoniec sa zaliali do parafínu. Zozbierali sa prierezy 4,5 um. Na farbenie hematoxylín-eozín (HE) a Masson trichróm sa použili štandardné protokoly.

Na kvantifikáciu sa ako reprezentatívne snímky vždy odobrali sklíčka pozdĺžnych rezov najväčšieho laloku pečene a na kvantifikáciu sa použilo najmenej šesť rôznych rezov na zviera, vizualizovaných pod mikroskopom Olympus BX51 pripojeným k fotoaparátu Olympus DP70. cystický index a množstvo cýst. Kvantifikácia oboch parametrov sa vypočítala pomocou softvérového nástroja na automatické rozpoznávanie cysty s názvom CystAnalyser (https://citius.usc.es/transferencia/software/cystanalyser, 1. júla 2020), ako už bolo opísané [35].

2.5. Klinická chémia

Krv sa odobrala pred eutanáziou a sérum sa získalo pomocou skúmaviek BD Vacutainer SST II Advance. Sérová alaníntransamináza (ALT) a alkalická fosfatáza (ALP) boli merané pomocou ADVIA 2400 Chemistry System (Siemens Healthineers, Erlangen, Nemecko).

2.6. Extrakcia RNA

RNA bola izolovaná, ako už bolo opísané [36], pomocou protokolu TRIzol (TRI Reagent, Sigma®, St. Louis, MO, USA, č. T9424), v ktorom chloroform (Sigma® č. C2432) slúžil ako denaturačné činidlo pre bunky. a izopropanol (Sigma® č. 650447) bol precipitačným činidlom pre RNA. Precipitát sa zriedil vo vode DEPC (Ambion®, Austin, TX, USA, č. AM9920), ktorá tiež obsahuje 1 % inhibítora SUPERaseIn RNázy (Thermo Fisher®, Waltham, MA, USA, č. AM2694).

2.7. Kvantitatívna PCR v reálnom čase

Jeden mikrogram celkovej pečeňovej RNA bol ošetrený DNázou I (Invitrogen®, Carlsbad, CA, USA, č. 18068015). Potom sa uskutočnila reverzná transkripcia pomocou súpravy SuperScript® III First-Strand Synthesis System (Invitrogen®, č. 18080051) a analýza génovej expresie pomocou kvantitatívnej PCR v reálnom čase s použitím FastStart Universal SYBR GREEN Master (ROX) (Roche® č. 04913914001 ) v systéme Mx3005P (Agilent Technologies®, Santa Clara, CA, USA). Priméry použité pre túto štúdiu boli navrhnuté pomocou Primer 3 Plus (http://tiny.cc/pf928y, 11. marca 2020) a sú založené na referenčných sekvenciách cDNA publikovaných v prehliadači genómu Ensembl (http://www.ensembl.org /index.html, 11. marca 2020). Úplné sekvencie všetkých primérov použitých v štúdii sú uvedené v tabuľke S2. Pre všetky kompletné PCR reakcie bol použitý nasledujúci program: denaturačný krok s 30 s pri 95 ◦C; 45 cyklov po 30 s pri 95 ◦C, 1 min pri 60 ◦C a 30 s pri 72 ◦C; nasleduje krok chladenia. Ako sme už predtým vykonali [36], každá vzorka (n=6 pre každú skupinu) sa v každom experimente uskutočnila trojmo. Výsledky boli analyzované metódou absolútnej kvantifikácie. Následne sa v teste použila štandardná krivka so známymi koncentráciami a okrem toho sa každá vzorka normalizovala na gén konštantnej expresie. V tejto štúdii bol gén Gapdh (glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza) použitý ako housekeeping gén.

2.8. Western blotting

Testy Western blotting sa uskutočňovali na celých pečeňových lyzátoch. Celkový obsah proteínov bol stanovený pomocou Bradfordovho proteínového testu (Bio-Rad®, Hercules, CA, USA, č. 5000001) a rovnaké množstvo každého proteínu (20–30 µg) bolo varené pri 95 °C počas 5 minút a separované v 10% SDS-PAGE za redukčných podmienok. Ako štandard molekulovej hmotnosti proteínu sa použil PageRulerTM Prestained Protein Ladder (Thermo Fisher®, Waltham, MA, USA, č. 26616). Následne boli proteíny prenesené na nitrocelulózové membrány (Bio-Rad® č. 1620115). Aby sa zabránilo nešpecifickej väzbe, boli membrány blokované počas 1 hodiny pri teplote miestnosti s použitím 2,5 % roztoku BSA (NZYTech®, Lisboa, Portugalsko, č. MB046) pre fosforylované proteíny alebo blokovacieho pufra SuperBlock (Thermo Fisher®, Waltham, MA, USA, č. 37515). Následne boli membrány inkubované cez noc pri 4 °C s primárnymi protilátkami a následne premyté v 0,3 % Tween-20 v PBS. Nakoniec sa nitrocelulózové membrány inkubovali počas 1 hodiny pri teplote miestnosti so sekundárnymi protilátkami spojenými s HRP. Signály boli vyvinuté pomocou súpravy chemiluminiscenčného substrátu SuperSignal™ West Pico PLUS (Thermo Fisher®, Waltham, MA, USA, č. 34580) alebo súpravy substrátu PierceTM ECL Western Blotting Substrate (Thermo Fisher®, Waltham, MA, USA č. 32109). na vizualizáciu v zobrazovacom systéme ChemiDoc™ (Bio-Rad®, Hercules, CA, USA). Proteínové pásy boli kvantifikované pomocou softvéru ImageJ® Lab (v 4.0.1, https://imagej. nih.gov/ij/, 26. marca 2021). Hladiny proteínovej denzitometrie boli normalizované na upratovacie proteíny GAPDH alebo -ACTIN. Pre každú skupinu. N=6 bol použitý vo všetkých experimentoch.

Nasledujúce primárne protilátky boli použité pre Western blotting: anti-ANXA2 (1:500, Santa Cruz Biotechnology Inc.®, Dallas, TX, USA #sc-28385), anti- -SAMP (1:500, Santa Cruz Biotechnology Inc.®, Dallas, TX, USA, č. sc-393948), anti-FIBB (1:500, Santa Cruz Biotech nology Inc.®, Dallas, TX, USA, č. sc-271035), anti-FIBA (1:500, Santa Cruz Biotechnology Inc.®, Dallas, TX, USA, č. sc-398806), anti-FIBG (1:500 , Santa Cruz Biotechnology Inc.®, Dallas, TX, USA, č. sc-133157), anti-HAO2 (1:1000, Thermo Fisher®, Waltham, MA, USA, č. 113442), anti-GAPDH (1:1000, Cusabio®, Houston, TX, USA, č. CSB-RA009232A0HU) a anti- -ACTIN (1:1000, Cell Signaling Technology®, Danvers, MA, USA, č. 8457), as ako aj sekundárna protilátka kozia anti-králičia IgG HRP (1:5000, Thermo Fisher®, Waltham, MA, USA, č. 31460) alebo kozia anti-myšia IgG HRP (1:5000, Thermo Fisher®, Waltham, MA, USA, č. 31430).

2.9. Imunohistochémia a kvantifikácia

Na imunohistochémiu sa na získanie antigénu použil tlmivý roztok citrátu sodného pH=6 (Agilent Dako®, Glostrup, Dánsko č. S2369) a tkanivo sa blokovalo riedidlom protilátky (Agilent Dako® č. K8006). Protilátkou použitou na imunohistochemickú analýzu bol fibrinogén (Agilent Dako® č. A0080) a detekčný systém HPR-konjugovaný na imunodetekciu. Nakoniec sa imunohistochemická kvantifikácia uskutočnila pomocou funkcie „Split Channels“ (zelený kanál) zo softvéru Fiji-ImageJ® (https: //imagej.net/software/fiji/, 13. októbra 2021). Pre každú vzorku sa použilo n Väčšie alebo rovné 6 obrázkov.

2.10. Štatistická analýza

Data are presented as means ± SEM for all cases (bar or point plots). First, normal distribution was confirmed using the Kolmogorov–Smirnov test. A two-tailed t-test was used to determine the significance of differences between two groups. p < 0.05 was considered statistically significant. Furthermore, ** corresponds to p-values < 0.01 and *** to p-values < 0.001. All datasets were analyzed using GraphPad Prism software (version 9, https://www.graphpad.com/, 13 October 2021). For proteomic studies, a Student's t-test (using MarkerView software, 22 December 2017) was performed to compare the groups in pairs to identify proteins, which were significantly differentially represented using adjusted p-value < 0.05 (multiple correction FDR method) and fold change >2 ako odrezanie. Na porovnanie údajov naprieč vzorkami sa uskutočnila viacrozmerná štatistická analýza bez dozoru s použitím analýzy hlavných komponentov (PCA).

Podporná služba Wecistanche - Najväčší vývozca cistanche v Číne:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Nakupujte pre ďalšie špecifikácie Podrobnosti:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

ZÍSKAJTE PRÍRODNÝ BIO EXTRAKT CISTANCHE S 25 % ECHINAKOZIDU A 9 % AKTEOZIDU NA INFEKCIU OBLIČIEK