R. Vesicarius L. má nefroprotektívny účinok proti oxidačnému stresu vyvolanému cisplatinou
Mar 26, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Pán Mahmudul Hasan1, Most. Sayla Tasminová2, Ahmed M. El-Shehawi3, Mona M. Elseehy4, MUDr. Abu Reza1a Ariful Haque2*
Abstraktné
Pozadie:Cisplatina je vynikajúce protirakovinové liečivo, ale jej použitie sa výrazne znížilo v dôsledku závažnej nefrotoxicity. R. vicarious L. je listová zelenina, ktorá má antiangiogénny, protizápalový, antiproliferatívny, hepatoprotektívny a nefroprotektívny potenciál. Preto bola táto štúdia navrhnutá tak, aby skontrolovala jeho metanolový extrakt (RVE) na možný nefroprotektívny účinok.
Metódy:Primárne in vitro bola antioxidačná aktivita RVE potvrdená na základe schopnosti zachytávať voľné radikály 2, 2-difenyl-1-pikrylhydrazyl (DPPH). Potom sa samcom myší Swiss Albino liečila cisplatina (2,5 mg/kg) počas 5 po sebe nasledujúcich dní, aby sa vyvolala nefrotoxicita. Zotavenie z nefrotoxicity sa skúmalo liečením zvierat RVE (25, 50 a 100 mg/kg) intraperitoneálne (ip) počas nasledujúcich 5 po sebe nasledujúcich dní. Po dokončení liečby sa myši usmrtili a odobrali sa obličky. Časť sa homogenizovala v tlmivom roztoku fosforečnanu sodného na vyhodnotenie hladiny malondialdehydu (MDA), ďalšia časť sa použila na vyhodnotenie expresie génu (NQO1, p53 a Bcl{12}}). Okrem toho bola neutralizačná kapacita RVE na peroxid vodíka (H2O2) hodnotená v bunkách HK-2 in vitro. Nakoniec boli bioaktívne fytochemikálie v RVE stanovené pomocou plynovej chromatografie-hmotnostnej spektrometrie (GC-MS).
Výsledky:RVE vykazovala in vitro antioxidačnú aktivitu v závislosti od dávky s hodnotou IC50 37,39 ± 1,89 ug/ml.
Liečba RVE výrazne (p < {{0}}.05)="" znížila="" obsah="" mda="" v="" tkanive="" obličiek.="" okrem="" toho="" expresia="" génov="" nqo,="" p53="" a="" bcl-2="" bola="" významne="" (p="">< 0,05)="" zmiernená="" spôsobom="" závislým="" od="" dávky="" v="" dôsledku="" podávania="" rve.="" rve="" významne="" (p="">< 0,05)="" zvrátilo="" hladinu="" h2o2="" v="" hk-2="" bunkách="" na="" takmer="" normálnu.="" z="" gc-ms="" desať="" zlúčenín="" vrátane="" troch="" známych="" antioxidantov="" „4h-pyran-4-one,="" 2,="" 3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-metyl-“="" boli="" detegované="" "hexadekánová="" kyselina"="" a="" "skvalén".="" extrakt="" bol="" bohatý="" na="" alkaloid="">
Záver:Celkovo má RVE ochranný účinok proti poškodeniu obličiek vyvolanému cisplatinou.
Kľúčové slová:Cisplatina, R. vicarious, myši, obličky, bunky HK{0}}, oxidačný stres, gén NQO1
Cistanche deserticola zabraňuje ochoreniu obličiek, kliknite sem a získajte vzorku
Úvod
Oxidačný stres je výsledkom disproporcie medzi tvorbou reaktívnych foriem kyslíka (ROS) a pravidelnými antioxidačnými obrannými mechanizmami [1]. Pravidelné biochemické reakcie, časté vystavovanie sa nepriaznivému prostrediu a zvýšený príjem xenobiotík vedú k tvorbe ROS [1]. ROS interagujú s cysteínovými zvyškami redox-senzitívnych signálnych molekúl vrátane transkripčných faktorov, proteínových tyrozínfosfatáz a proteínkináz; následne oxidácia tiolových skupín na týchto zvyškoch vedie k zmenám cieľových proteínov, biologických účinkov, signalizačných kapacít, imunity a doplnkových paradigiem živých/mŕtvych buniek [2]. Chemické látky obsahujúce kyslík s reaktívnymi vlastnosťami sú známe ako ROS, ktoré zahŕňajú voľné radikály a neradikálové molekuly, ako je superoxid a H2O2, v tomto poradí [3]. Oxidačný stres vyvolaný ROS je spojený s etiológiou mnohých chorôb vrátane rakoviny. Akútna myeloidná leukémia (AML) je rakovinový rast krvných buniek v kostnej dreni. Bunkové a molekulárne udalosti, ktoré sú základom AML, zahŕňajú poškodenie DNA, klonálnu propagáciu, zvýšenú smrť buniek a ďalšiu genetickú nestabilitu, ktoré sú výsledkom oxidačného stresu vyvolaného ROS [4]. Fyziológia človeka je obdarená mnohými mechanizmami, ktoré dokážu generovať antioxidanty na ochranu pred oxidačným stresom, čo vedie k ochrane buniek pred toxickými účinkami a slúži na prevenciu chorôb [5]. Bunky si však vyvíjajú endogénne mechanizmy na pôsobenie proti oxidačnému stresu a na zachovanie požadovaného ROS [6].
NAD(P)H: chinónoxidoreduktáza 1 (NQO1) je flavoenzým [7], ktorý môže katalyzovať dvoj- alebo štvorelektrónovú redukciu a túto vlastnosť využíva na detoxikáciu chinínov [8]. Môže chrániť bunky pred oxidačným poškodením tým, že bráni redoxnému cyklu a znižuje produkciu voľných radikálov [8]. Okrem xenobiotickej detoxikácie sa NQO1 podieľa aj na neutralizácii superoxidu, modulácii proteazomálnej degradácie p53 [9], inhibícii Bcl{10}} [10] a zvýšenej náchylnosti na poškodenie buniek [11].
Cisplatina je prvým protirakovinovým liekom na báze platiny, ktorý schválil Úrad pre potraviny a liečivá (FDA) [12]. Cisplatina prejavuje apoptózu indukciou oxidačného stresu a nadmernou expresiou tumor supresorového génu p53 [12]. Niekoľko nežiaducich účinkov vrátane nefrotoxicity, hepatotoxicity, gastrotoxicity, ototoxicity, myelosupresie a neurotoxicity je výsledkom oxidačného stresu vyvolaného cisplatinou [12]. Tieto vedľajšie účinky výrazne znížili používanie cisplatiny, hoci má vynikajúcu protirakovinovú aktivitu. Je dobre známe, že cisplatina vyvoláva oxidačný stres a potláča gén NQO1 v obličkách myší [13]. Preto sa hľadanie a overovanie účinných prírodných zdrojov antioxidantov stáva oblasťou povedomia. Príjem rastlinných antioxidantov, ako sú flavonoidy, karotenoidy a fenolové zlúčeniny, môže viesť k ochrane pred kardiovaskulárnymi ochoreniami, šedým zákalom a rakovinou [14].
R. vicarious (Polygonaceae) je v bengálčine známy ako "Takpalong/ Chukapalong/Amlabetom" [15]. Rastie v púštnych a polopúštnych oblastiach Ázie, Austrálie a severnej Afriky [16]. Je to málo prebádaná ohrozená rastlina v Bangladéši. V Bangladéši ľudia konzumujú celú rastlinu ako zeleninu po varení so soľou, rôznymi koreninami a olejom. Niekedy ľudia používajú iba čerstvé listy v miešanom šaláte ako alternatívu k šalátu. Surový list je mierne kyslý, ale po uvarení sa stáva vysoko kyslým. Okrem toho sa do pokrmov z rýb počas varenia zvyčajne primieša malý počet listov, aby mali jemne kyslú chuť.
Táto rastlina sa celosvetovo používa ako zelenina a liečivá bylina [17]. Listy a semená sa používajú ako protijed na hadí a škorpiónový jed [17]. V ľudovom liečiteľstve sa R. vicarious oddávna používa na liečenie chorôb pečene, zlého trávenia, zápchy, hromadenia, vracania, plynatosti, srdcových ťažkostí, bolestí, porúch sleziny, dyspepsie, bolesti zubov, bronchitídy, astmy, svrabu, leukodermie a ako laxatívum, stomachikum, predjedlo, tonikum, diuretikum a analgetikum [18]. Táto rastlina obsahuje množstvo biologicky dôležitých zlúčenín vrátane flavonoidov, antrachinónov, karotenoidov, vitamínov, lipidov a organických kyselín, ktoré sú dobre známe ako antioxidačné, antimikrobiálne a protirakovinové látky [19]. Každá časť tejto rastliny obsahuje kvercetín (flavonoidy) vo zvýšenom množstve [15]. Táto rastlina obsahuje 0,25 mg vitamínu A, 1,33 mg vitamínu C, 2,37 mg vitamínu E [15], 3,38 mg flavonoidov a 5,66 mg polyfenolov [20] na 100 g sušiny.
Shahat a kolegovia [21] preukázali antiangiogénne a antiproliferatívne účinky metanolového (80 percentného) extraktu R. vicarious aerial part proti hepatocelulárnemu karcinómu na modeli potkanov. Ďalšia štúdia preukázala in vitro antiangiogénny potenciál extraktu R. vicarious [22]. Metanolový extrakt z celej R. vicarious poskytuje ochranu proti hepatotoxicite vyvolanej tetrachlórmetánom in vivo [23]. Protizápalový účinok u králikov bol evidentný pri metanolovom extrakte listov R. vicarious [24]. Nedávna štúdia [25] uvádza in vivo nefroprotektívny účinok frakcionovaného etanolového extraktu z R. proti toxicite gentamicínu a dvojchrómanu draselného.
Pri zohľadnení vyššie uvedených informácií sme sa zamerali na kontrolu účinku extraktov R. vicarious (RVE) z hľadiska zotavenia sa z nefrotoxicity vyvolanej cisplatinou prostredníctvom zachovania expresie génu NQO1 na zvieracom modeli.
cistanche zdravotné prínosy: liečba ochorení obličiek
Materiály a metódy
Chemikálie a činidlá
Cisplatina a 2, 2-difenyl-1-pikrylhydrazyl (DPPH) boli zakúpené od SIGMA-ALDRICH (USA).
Súprava na kolorimetrický test kreatinínu (ID produktu – 700 460) bola zakúpená od Cayman Chemical (USA). Dulbeccovo modifikované Eaglovo médium (DMEM), fetálne bovinné sérum (FBS) a antibiotikum (10,{3}} U/ml penicilínu a 10,000 ug/ml streptomycínu) boli zakúpené od Gibco (Gibco Laboratories, USA). ROS-Glo™ H202 Assay kit a GoTaq® qPCR Master Mix boli získané od Promega (USA). Súprava na reverznú transkripciu TIAN-Script M-MLV bola zakúpená od TIANGEN (Čína) a priméry od IDT (Integrated DNA Technologies, Malajzia). Všetky ostatné chemikálie a činidlá použité v tomto experimente boli analytickej kvality.
Odber vzoriek rastlín a príprava extraktu
Čerstvé rastliny R. vicious boli zakúpené z miestneho trhu v Sonadighi, Rajshahi, Bangladéš. Vzorku rastliny identifikoval a overil Dr. Ahmad Humayan Kabir, Katedra botaniky, Univerzita v Rajshahi, Bangladéš. Vzor pod voucherom č. 00095 bol uložený v herbári Katedry botaniky Univerzity v Rajshahi. Nadzemné časti závodu boli vyčistené, vysušené pri 37 stupňoch, rozdrvené na hrubý prášok pomocou elektronickej sušičky a uskladnené v zapečatenej nádobe pri 4 stupňoch. Jemný prášok (10 g) sa rozpustil v metanole (500 ml). Obsah bol sonikovaný (Soni-prep 150, Čína) pri 20 kHz počas 10 minút. Filtrácia extraktu sa uskutočnila s použitím filtračného papiera zo sklenených vlákien (Macherey NAGEL, GmBH, Nemecko) s DURAN Filtering Apparatus (nemecky). Nakoniec sa filtrát skoncentroval pomocou lyofilizátora (VirTis Benchtop Pro, SP SCIENTIFIC, USA). Extrakt dostal nakoniec názov RVE.
Test antioxidačnej aktivity in vitro
In-vitro antioxidačná kapacita RVE bola stanovená na základe vychytávania DPPH, ako už bolo opísané [26] s malou modifikáciou. Schopnosť RVE zachytávať radikály DPPH bola hodnotená na základe premeny fialovej farby DPPH na žltú farbu. Reakčná zmes v každej mikrocentrifugačnej skúmavke (2 ml) pozostávala z 950 μl metanolového roztoku DPPH radikálov (0,1 mM) a 50 μl RVE z piatich rôznych koncentrácií (200, 500, 1000, 2000 a 4000 ug /ml metanolu), aby sa dosiahli konečné koncentrácie 10, 25, 50, 100 a 200 ug/ml. Ďalšia skúmavka obsahujúca 50 ul metanolu a 950 ul metanolového roztoku DPPH bola ponechaná ako kontrola. Skúmavky sa nechali 30 minút na tmavom mieste. Absorbancia zmesí bola meraná pri 517 nm pomocou GENESYS 10S UV-VIS spektrofotometra (Thermo SCIENTIFIC, USA). Nakoniec sa vypočítalo percento aktivity zachytávania radikálov (RSA) na základe odfarbenia DPPH pomocou nasledujúceho vzorca percento RSA=[(ADPPH − ARVE)/ADPPH] × 100, kde ADPPH je absorbancia roztoku DPPH (kontrola) a ARVE je absorbancia roztoku RVE. Koncentrácia, pri ktorej RVE viedla k 50 percentám RSA, sa označila ako hodnota IC50 a vypočítala sa pomocou grafu, v ktorom sa uvádzalo percento RSA oproti rôznym použitým koncentráciám RVE.
Experimentálne zvieratá a experimentálny dizajn
Samce myší Swiss Albino vo veku 42 dní (30–32 g telesnej hmotnosti) sa aklimatizovali 1 týždeň pred začatím experimentu v miestnosti (teplota približne 25 ± 2 stupne a ~ 50 percent vlhkosti, 12-hodinový cyklus tma/svetlo). Pitná voda a jedlo boli poskytované ad libitum.
Myši boli náhodne rozdelené do ôsmich skupín (n {{0}}). Prvá (kontrolná) skupina bola ošetrená 0,2 ml 0,9 % NaCl. Ďalšie štyri skupiny boli liečené cisplatinou v dávke 2,5 mg/kg počas 5 dní v intervale 24 hodín. Po podaní cisplatiny bola jedna skupina (druhá skupina) ponechaná bez akejkoľvek ďalšej liečby a priradená ako stresovaná kontrolná skupina. Tretia, štvrtá a piata skupina boli ďalej liečení RVE v dávkach 25, 50 a 100 mg/kg, v tomto poradí, počas 5 dní. Ďalšie tri skupiny boli liečené iba RVE v dávkach 25, 50 a 100 mg/kg počas 5 dní. Cisplatina a RVE sa rozpustili v destilovanej vode. Všetky liečby boli podávané intraperitoneálne. Po 24 hodinách od poslednej liečby boli zvieratá usmrtené po cervikálnej dislokácii [25]. Potom sa pobrušnica otvorila nožnicami, krv sa odobrala po punkcii srdca a obličky sa odobrali pomocou klieští. Krv bola podrobená kontrole hladiny kreatinínu v sére. Obličky sa podrobili hodnoteniu hladiny malondialdehydu a génovej expresie.
Meranie sérového kreatinínu
Kreatinín v sére bol meraný pomocou súpravy Creatinine Colorimetric Assay Kit-700,460 (Cayman Chemical, USA) podľa protokolu výrobcu dodaného so súpravou.
Meranie renálnej peroxidácie lipidov
Malondialdehyd (MDA) je konečným produktom lipidovej peroxidácie v obličkovom tkanive a zvyčajne sa meria ako indikátor produkcie ROS. Hladina MDA sa však merala v obličkovom tkanive podľa predchádzajúcej štúdie [27]. Najprv sa obličkové tkanivo homogenizovalo v tlmivom roztoku fosforečnanu sodného (0,1 M, pH 7,4). Do 100 μl homogenizovaného tkaniva a zmes sa potom inkubovala pri 95 stupňoch počas 1 hodiny. Po ochladení sa zmesi centrifugovali pri 10,000 g počas 10 minút pri 4 stupňoch a absorbancia supernatantu sa merala pri 532 nm so štandardným 1, 1, 3, 3- tetrametoxypropánom. Množstvo celkového proteínu sa meralo pomocou súpravy Bradford Protein Assay kit (BIO-RAD, USA) a porovnaním so štandardným hovädzím sérovým albumínom (BSA). Intenzita lipidových peroxidov bola vyjadrená ako nanomóly (nM) MDA na miligram (mg) proteínu.
Polymerázová reťazová reakcia v reálnom čase (PCR v reálnom čase)
PCR v reálnom čase sa uskutočnila tak, ako bolo opísané vyššie [28, 29]. Celková RNA z obličkového tkaniva sa izolovala s použitím činidla TRIzol® (Invitrogen) podľa protokolu dodaného výrobcom. Izolovaná RNA (1 ug) sa potom premenila na cDNA. Najprv sa odobrali 2 ul náhodného hexaméru (10 uM), 2 ul dNTP (10 mM), 1 ug RNA a HO bez nukleázy až do 15 ul a inkubovali sa 5 minút pri 70 stupňoch . Zmes sa okamžite umiestnila na ľad na 2 minúty. Potom sa do každej skúmavky pridali 4 μl tlmivého roztoku 1. vlákna (5x) a 1 μl M-MLV reverznej transkriptázy a inkubovali sa 10 minút a 50
min pri 25 stupňoch a 42 stupňoch. Nakoniec sa enzým M-MLV reverznej transkriptázy inaktivoval inkubáciou zmesi pri 95 stupňoch počas 5 minút. Syntetizované produkty cDNA sa podrobili PCR v reálnom čase na kvantifikáciu expresie génov NQ01, p53 a Bcl-2 pomocou špecifických primérov (tabuľka 1). Každá reakcia (10 μl) sa uskutočnila v troch vyhotoveniach zahŕňajúcich 5 μl GoTaq qPCR Master Mix (2x) (Promega, USA), 0,5 μl (10 mM) každého priméru, 3 μl vody bez nukleázy a 1 μl cDNA v 48-jamkových reakčných doštičkách. Tepelné cyklovanie sa uskutočnilo pomocou stroja PCR v reálnom čase (Eco™ Real-Time PCR System, Illumine®, USA) s nasledujúcimi podmienkami cyklovania: 95 stupňov počas 10 minút, po ktorých nasledovalo 40 cyklov 95 stupňov počas 30 sekúnd, 50 stupňov po dobu 30 s a 72 stupňov po dobu 25 s. Špecifickosť PCR reakcií bola potvrdená analýzou krivky topenia pri 95 stupňoch počas 15 s, 45 stupňoch počas 15 s a 95 stupňoch počas 15 s. Špecifickosť PCR reakcií bola potvrdená analýzou krivky topenia pri 95 stupňoch počas 15 s, 45 stupňoch počas 15 s a 95 stupňoch počas 15 s. Relatívna kvantifikácia génovej expresie sa uskutočnila s použitím endogénneho génu GAPDH ako kontroly na základe metódy ACq.
Bunková kultúra a liečba
Bunková línia epiteliálnych buniek ľudského obličkového proximálneho tubulu, bunky HK{0}}, sa udržiavala v DMEM doplnenom 10 percentami FBS a antibiotikami (50 U/ml penicilínu a 50 ug/ml streptomycínu) v inkubátore s 5 % CO2 a 95 % percent vlhkosti pri 37 stupňoch.
Test merania H2O2
Hladina H2O2 v HK-2 bunkách bola odhadnutá pomocou súpravy ROS-Glo™ H2O2 Assay kit (Promega, USA) podľa protokolu poskytnutého výrobcom súpravy. HK-2 bunky (1000 buniek) v 70 ul DMEM sa umiestnili do jamiek 96-jamkovej mikrotitračnej platne. Po umožnení pripojenia buniek na povrch steny sa 10 μl DMEM z jamiek mikrotitračnej platne nahradilo 10 μl cisplatiny (25 μM v DMEM) a uchovávalo sa v inkubátore počas 12 hodín. Potom sa pridalo 10 ul RVE, aby sa dosiahli konečné koncentrácie 125, 250 a 500 ug/ml v DMEM a inkubovalo sa ďalších 12 hodín. Potom sa do každej jamky pridalo 20 μl H2O2 substrátového roztoku a 100 μl ROS-Glo™ detekčného roztoku. Reakcia bola inkubovaná pri teplote miestnosti počas 20 minút. Nakoniec sa luminiscencia merala pomocou GloMax Luminometer (Promega, USA).
GC-MS analýza
GC-MS analýza RVE (rozpusteného v metanole) sa uskutočnila tak, ako je opísané vyššie [30] s použitím GCMS-QP2020 (SHIMADZU) obsahujúceho automatický vzorkovač (AOC{ {5}}s), autoinjektor (AOC-20i) a plynový chromatograf (GC-2010 Plus) prepojený s hmotnostným spektrometrom vybaveným SH-Rxi{{1{{ 37}}}}Kilárna kolóna Sil MS (30 m × 0,25 μm ID × 0,25 μm DF). Nosný plyn hélium sa udržiaval na konštantnej prietokovej rýchlosti 1,72 ml/min a vstrekovaný objem 5 ul sa podrobil deliacemu pomeru 10:1. Teplota injektora bola udržiavaná na 220 stupňoch, teplota iónového zdroja bola 280 stupňov, teplota pece bola naprogramovaná od 80 stupňov (podržanie 2 minúty), so zvýšením o 5 stupňov/min na 150 stupňov (doba zdržania 5,0 min), potom 5 stupňov/min na 280 stupňov, končiac 8 minútovou izotermou pri 280 stupňoch. Hmotnostné spektrá boli odobraté pri 1, 5 kV s intervalom skenovania 0, 5 s a vzorka bola spustená v rozsahu 45 až 350 m/z. Oneskorenie rozpúšťadla bolo od 0 do 3 minút a celkový čas GC-MS bol 55 minút. Relatívna koncentrácia detegovaných zlúčenín sa merala porovnaním priemernej plochy píku s celkovou plochou. Interpretácia hmotnostného spektra v GC-MS bola vykonaná pomocou databáz National Institute Standard and Technology (NIST) vrátane NIST08, NIST08s a NIST14.
Štatistická analýza
Štatistické analýzy boli uskutočnené pomocou ANOVA po Dunnettovom T3 teste s použitím softvéru IBM SPPS (verzia 20). Údaje sú vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka (SD). Významné porovnanie bolo uvažované na str<0.05. all="" of="" the="" graphs="" were="" prepared="" using="" microsoft="" excel="" (version="">
Výsledky
Test antioxidačnej aktivity in vitro
Aj keď sa predtým uvádzalo, že RVE má antioxidačnú aktivitu, znova sme skontrolovali antioxidačnú aktivitu nášho extraktu pomocou kapacity zachytávania voľných radikálov DPPH. RVE neutralizoval DPPH v závislosti od dávky (obr. 1). RVE odhalila značnú antioxidačnú aktivitu in vitro a vypočítaná hodnota IC50 RVE bola 37,39 ± 1,89 ug/ml.
Meranie sérového kreatinínu
Hladina sérového kreatinínu u myší bola významne (p < {{0}}},05)="" zvýšená="" po="" podaní="" cisplatiny="" (tabuľka="" 2).="" liečba="" rve="" výrazne="" (p="">< 0,05)="" zlepšila="" hladinu="" kreatinínu="" v="" závislosti="" od="" dávky="" (tabuľka="">
Meranie renálnej peroxidácie lipidov
V porovnaní s kontrolou cisplatina značne (p < {{0}}="" 0,05)="" zvýšila="" obsah="" mda="" v="" obličkovom="" tkanive="" myší="" (tabuľka="" 3).="" na="" rozdiel="" od="" toho="" liečba="" rve="" značne="" (p="">< 0,05)="" obnovila="" mda="" takmer="" do="" normálu="" spôsobom="" závislým="" od="" dávky="" (tabuľka="">
PCR v reálnom čase
Cisplatina významne (p < {{0}}.05)="" znížila="" expresiu="" mrna="" nqo1="" o="" 0.15-násobne="" a="" zvýšila="" p53="" a="" bcl-2="" mrna="" vyjadrenie="" 24="" a="" 4.2-násobkom="" (obr.="" 2).="" rve="" značne="" (p="">< 0.05)="" zmiernil="" expresiu="" mrna="" nqo1,="" p53="" a="" bcl-2="" spôsobom="" závislým="" od="" dávky="" (obr.="" 2).="" v="" porovnaní="" s="" jedinou="" skupinou="" liečenou="" cisplatinou="" sa="" expresia="" mrna="" nqo1="" zvýšila="" 3,57,="" 6,36="" a="" 9.28-násobne="" 25,="" 50="" a="" 100="" mg/kg="" rve="" (obr.="" 2a).="" expresia="" mrna="" p53="" sa="" opäť="" znížila="" o="" 0,63,="" 0,46="" a="" 0.21-násobne="" pri="" 25,="" 50="" a="" 100="" mg/kg="" rve="" (obr.="" 2b).="" expresia="" bcl-2="" mrna="" bola="" tiež="" znížená="" o="" 0,71,="" 0,40="" a="" 0.{47}}násobne="" pri="" 25,="" 50="" a="" 100="" mg/kg="" rve="" (obr.="" 2c).="" neboli="" však="" zistené="" žiadne="" významné="" (p=""> 0,05) zmeny v úrovni expresie génov NQO1, p53 a Bcl-2 v dôsledku liečby RVE (obr. 3).
H2O2merací test
V teste merania H2O2 H2O2úroveň sa považovala za úmernú luminiscencii. Podávanie cisplatiny významne (p < {0}}.05)="" zvýšilo="" hladinu="" h2o2="" 2.2-krát="" (obr.="" 4).="" liečba="" pomocou="" rve="" značne="" znížila="" (p="">< 0.05)="" hladinu="" h2o2="" o="" 0,25,="" 0,38="" a="" 0.{16}}krát="" zodpovedajúcim="" spôsobom="" pri="" 125,="" 250="" a="" 500="">
GC-MS analýza
Celkom 10 zlúčenín (tabuľka 4 a obr. 5) vrátane "izoborneolu, pentametyldisilanyléteru (seskviterpénalkohol)", "tymínu (pyrimidínovej nukleobázy)", "4H-Pyran-4-one, 2,{{ 8}}dihydro-3,5-dihydroxy-6-metyl- (saponín), "Hexadekánová kyselina, metylester (metylester mastnej kyseliny)", "9,12- Kyselina oktadekadiénová, metylester (metylester mastnej kyseliny), "9-Kyselina oktadecénová (Z)-, metylester (metylester mastnej kyseliny)", "Metylstearát (metylester mastnej kyseliny)", "diizooktylftalát" (ester)“, „13-dokosenamid, (Z)-(alkaloid)“ a „skvalén (triterpén)“ boli zistené v RVE.
výhody cistanche tubolosa: zníženie krvných lipidov
Diskusia
Prírodné a syntetické antioxidanty boli komplexne študované a ukázalo sa, že sú funkčné buď na prevenciu alebo zmiernenie toxicity vo fyziológii zvierat [31]. Antioxidačné doplnky sú zložkou vyvinutou buď chemickou syntézou alebo extrakciou z prirodzenej potravy, ale nie sú svojím zložením totožné s antioxidantmi dostupnými v potravinách [5]. Názory na to, či syntetické antioxidanty poskytujú podobné zdravotné výhody ako prírodné antioxidanty, sa preto časom oddeľujú [32]. Prichádza potreba znížiť používanie syntetických antioxidačných doplnkov a hľadať alternatívne, lacné, obnoviteľné, prírodné a možno aj bezpečnejšie zdroje účinných prírodných antioxidantov.
Jedným z najdôležitejších mechanizmov je dráha nukleárneho faktora erytroidného{0}} faktora súvisiaceho s-2 (Nrf2), ktorý vo všeobecnosti chráni bunky pred oxidačným stresom vyvolaným exogénnymi alebo endogénnymi stresormi [27]. Účinné antioxidanty indukujú expresiu Nrf2, ktorý sa ďalej presúva do jadra a viaže sa na prvok antioxidačnej odozvy (ARE), ktorý vyvoláva expresiu detoxikačného a antioxidačného génu NQO1 fázy II [33, 34]. NQ01 je široko a diferencovane exprimovaný tkanivovo špecifickým spôsobom. NQO1 je cytosolický antioxidant flavoproteín, ktorý katalyzuje 2-elektrónovú redukciu chinónov na hydrochinóny, čo vedie k detoxikácii elektrofilov a anticipácii redoxného cyklu [35]. Podľa predchádzajúcej štúdie [36] -lapachón aktivuje NQO1, čo ďalej zvyšuje intracelulárnu hladinu NAD plus a chráni obličku pred akútnym poškodením vyvolaným cisplatinou.
Je známe, že cisplatina indukuje poškodenie glomerulárnej filtračnej membrány prostredníctvom oxidačného stresu, zápalu a apoptózy, čo celkovo vedie k zníženiu rýchlosti glomerulárnej filtrácie a strate normálnej membránovej permeability [37]. Preto bola zvýšená hladina kreatinínu v sére. Sérový kreatinín je jedným z potenciálnych markerov renálnej funkcie. Liečba cisplatinou zvýšila obsah MDA v obličkovom tkanive, ktorý je sekundárnym produktom peroxidácie lipidov a táto správa je konštantná s predchádzajúcimi štúdiami [27, 35, 37, 38]. Liečba RVE významne znížila obsah MDA v tkanive obličiek. Súčasne sa tiež znížila hladina kreatinínu, čo naznačuje zlepšujúci účinok RVE.
Okrem toho sa expresia NQO1 významne znížila a expresia p53 a Bcl-2 sa významne zvýšila po expozícii cisplatine. Pokiaľ ide o expresiu NQO1 a p53 in vivo, náš výsledok je v súlade s predchádzajúcou štúdiou [13]. Nedávna štúdia [39] ukázala, že cisplatina významne znížila expresiu Bcl-2 v obličkách myší, ale prekvapivo sme zistili zvýšenú expresiu. Tento rozdiel môže byť výsledkom rozdielu v dávke [40], keďže Mohamed a kolegovia [39] používali 8 mg/kg počas 12 dní, zatiaľ čo my sme používali 2,5 mg/kg iba 5 dní. Iná štúdia [41] uviedla, že cisplatina môže zvýšiť expresiu Bcl-2 v dávke, keď nie je cytotoxická. Opäť platí, že zvýšená expresia Bcl{18}} senzibilizuje bunky voči oxidačnému stresu [40].
Expresia p53 je však za normálnych fyziologických podmienok nízka, ale očakáva sa, že po liečbe cisplatinou bude upregulovaná, pretože toto chemoterapeutické činidlo na báze platiny aktivuje apoptotickú dráhu závislú od p53. Keď sme myši ošetrili cisplatinou, p53 sa významne zvýšil v obličkách myší v porovnaní s kontrolou. Ďalší protoonkogén Bcl-2 tiež koreluje s úrovňou expresie NQO1. Napodobňovaním expresie p53 sme tiež zistili, že hladiny Bcl- 2 sa zvýšili pri liečbe cisplatinou, ale významne sa znovu pokryli po liečbe RVE. To je možné, v reakcii na oxidačný stres sa gén p53 aktivuje a vedie k zastaveniu bunkového cyklu, starnutiu alebo apoptóze [6]. Pri detoxifikácii sa nadmerná expresia NQO1 často považuje za korelovanú s apoptózou v rakovinových bunkách [10], hoci základný mechanizmus apoptózy a nadmernej expresie NQO1 je stále kontroverzný. Navyše pri hepatocelulárnom karcinóme nadmerná expresia NQO1 znižuje expresiu Bcl-2 [10]. Proto-onkogén Bcl- 2 má tiež p53 ako koreláciu s expresiou NQO1. p53 je sekvenčne špecifický transkripčný faktor, ktorý sa aktivuje mnohými typmi bunkového stresu [42], zatiaľ čo nadmerná expresia Bcl-2 pôsobila ako mitochondriálny stabilizátor pórov na uľahčenie uvoľňovania cytochrómu-c pri oxidačnom strese [12]. V našom prípade sme skontrolovali obe génové odpovede liečbou cisplatinou v normálnom tkanive obličiek a zistili sme ich zvýšenú expresiu. Liečba RVE vrátila expresiu p53 a Bcl-2 na takmer normálnu úroveň v závislosti od dávky. Tento typ zrušenia výrazu Bcl{34}} bol tiež preukázaný pomocou vychytávača ROS Trolox [43]. Okrem toho bola hladina H2O2 tiež výrazne zvýšená v bunkách HK-2 v dôsledku liečby cisplatinou in vitro. Po liečbe RVE sa hladina H2O2 významne obnovila na približne normálnu hodnotu. Je to možno kvôli účinku liečby RVE, ktorá zvýšila expresiu NQO1 [44], ktorá pôsobí na ochranu proti oxidačnému stresu [6].
GC-MS chromatogram potvrdil existenciu desiatich zlúčenín v RVE. Medzi nimi "4H-Pyran- 4-one, 2, 3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-metyl-", "Hexadekanoic acid" a " Skvalén“ sú dobre známe antioxidanty[45–47]. Tieto tri zlúčeniny spolu pravdepodobne vykazovali synergický nefroprotektívny účinok. Predchádzajúce štúdie tiež informovali o indukcii expresie NQO1 vitamínom A [48], vitamínom C [49], vitamínom E [50], flavonoidmi [51] a polyfenolmi [50]. Preto táto správa navrhuje objasniť, či tento konkrétny extrakt obsahuje niečo medzi vitamínom A, vitamínom C, vitamínom E, flavonoidmi a polyfenolom alebo nie.
Záver
Celkové zistenie naznačuje, že RVE je fyziologicky účinný pri ochrane obličiek pred poškodením spôsobeným cisplatinou. Preto je kľúčové objasniť presné zlúčeniny zodpovedné za zmiernenie nefrotoxicity vyvolanej cisplatinou, ktoré sa môžu stať prospešnými pre aplikáciu u ľudí.
Poďakovanie
Autori sú vďační Bangladéšskej rade pre vedecký a priemyselný výskum (BCSIR), pobočke Rajshahi za poskytnutie laboratórnej podpory na kvantifikáciu RNA.
Príspevky autorov
MMH vykonávala experimentálny dizajn, experimentovanie, analýzu a prípravu údajov, písanie a editovanie rukopisov, revízie a návrhy rukopisov; MST & MME vykonali experimenty a analýzu údajov; AME & MAR prispeli dohľadom a zdrojmi; AH bol zodpovedný za konceptualizáciu, dohľad, zdroje a úpravu rukopisov. Všetci autori
posúdil rukopis. Autori prečítali a schválili konečný rukopis.
Financovanie
Súčasnú prácu financovalo číslo projektu výskumných pracovníkov Univerzity Taif (TURSP - 2020/75), Univerzita Taif, Taif, Saudská Arábia.
Dostupnosť údajov a materiálov.
Všetky relevantné údaje sú dostupné a môžu byť na požiadanie poskytnuté príslušnému autorovi.
vyhlásenia
Etický súhlas a súhlas s účasťou
Etika na vykonanie tohto experimentu bola schválená Inštitucionálnym výborom pre zvieratá, lekársku etiku, biologickú bezpečnosť a biologickú bezpečnosť (IAMEBBC), Inštitút biologických vied (IBSc), Univerzita v Rajshahi a bola poskytnutá pod číslom poznámky 31/{{1} }IAMEBBC/IBSc. Všetky metódy sa uskutočňovali v súlade s usmerneniami a nariadeniami poskytnutými vyššie uvedenou etickou komisiou. Táto štúdia bola vykonaná v súlade s usmerneniami ARRIVE (Animal Research: Reporting of In vivo Experiments). „Súhlas s účasťou“ sa na túto štúdiu nevzťahuje.
Podrobnosti o autorovi
1 Laboratórium molekulárnej biológie a bielkoviny, Katedra genetického inžinierstva a biotechnológie, Fakulta vied o živote a Zemi, Univerzita v Rajshahi, Rajshahi 6205, Bangladéš. 2 Laboratórium molekulárnej patológie, Inštitút biologických vied, Univerzita v Rajshahi, Rajshahi 6205, Bangladéš. 3Department of Biotechnology, College of Science, Taif University, PO Box 11099, Taif 21944, Saudská Arábia. 4Katedra genetiky, Poľnohospodárska fakulta, Alexandrijská univerzita, Alexandria 21545, Egypt.
Referencie
1. Bagchi K, Puri S. Voľné radikály a antioxidanty v zdraví a chorobe: prehľad. East Mediterr Health J. 1998;4:350–60.
2. Koh EM, Lee EK, Song CH, Song J, Chung HY, Chae CH a kol. Ferulát, aktívna zložka pšeničných klíčkov, zlepšuje nerovnováhu PTK/PTP vyvolanú oxidačným stresom a inaktiváciu PP2A. Toxicol Res. 2018;34(4):333–41.
3. Hassan AI, Ibrahim RY. Niektoré genetické profily v pečeni Ehrlichových myší s nádorom ascites pod stresom z ožiarenia. J Radiat Res Appl Sci. 2014;7(2):188–97.
4. Zhou FL, Zhang WG, Wei YC, Meng S, Bai GG, Wang BY a kol. Zapojenie oxidačného stresu do relapsu akútnej myeloidnej leukémie. J Biol Chem. 2010;285(20):15010–5.
5. Pham-Huy LA, He H, Pham-Huy C. Voľné radikály, antioxidanty pri chorobách a zdraví. Int J Biomed Sci. 2008;4:89–96.
6. Srijiwangsa P, Na-Bangchang K. Úlohy NAD (P) H-chinón oxidoreduktázy 1 (NQO1) na progresiu rakoviny a chemorezistenciu. J Clin Exp Oncol. 2017;6:1–6.
7. Siegel D, Yan C, Ross D. NAD (P) H: chinónoxidoreduktáza 1 (NQO1) v citlivosti a rezistencii na protinádorové chinóny. Biochem Pharmacol. 2012;83(8):1033–40.
8. Dinkova-Kostova AT, Talalay P. NAD (P) H: chinónový akceptor oxidoreduktáza 1 (NQO1), multifunkčný antioxidačný enzým a výnimočne všestranná cytoprotekcia. Arch Biochem Biophys. 2010;501(1):116–23.
9. Cullen JJ, Hinkhouse MM, Grady M, Gaut AW, Liu J, Zhang YP a kol. Dikumarolová inhibícia NADPH: chinónoxidoreduktáza indukuje inhibíciu rastu rakoviny pankreasu mechanizmom sprostredkovaným superoxidom. Cancer Res. 2003;63(17):5513–20.
10. Zhang X, Han K, Yuan DH, Meng CY. Nadmerná expresia NAD (P) H: chinónoxidoreduktáza 1 inhibuje proliferáciu buniek hepatocelulárneho karcinómu a indukovanú apoptózu aktiváciou AMPK/PGC-1 dráhy. DNA Cell Biol. 2017;36(4):256–63.
11. Zeekpudsa P, Kukongviriyapan V, Senggunprai L, Sripa B, Prawan A. Potlačenie NAD (P) H-chinón oxidoreduktázy 1 zvýšilo citlivosť buniek cholangiokarcinómu na chemoterapeutické činidlá. J Exp. Clin Cancer Res. 2014;33(1):1– 13.
12. Dasari S, Tchounwou PB. Cisplatina v terapii rakoviny: molekulárne mechanizmy účinku. Eur J Pharmacol. 2014;740:364–78.
13. Zhu X, Jiang X, Li A, Zhao Z, Li S. S-Allylmerkaptocysteín zmierňuje nefrotoxicitu vyvolanú cisplatinou prostredníctvom potlačenia apoptózy, oxidačného stresu a zápalu. Živiny. 2017; 9 (2): 166.
14. Matkowski A. Rastlinná in vitro kultúra na produkciu antioxidantov – prehľad. Biotechnol Adv. 2008;26(6):548–60.
15. El-Bakry AA, Mostafa HAM, Alam EA. Antioxidačná aktivita Rumex vicarious L. vo vegetatívnom štádiu rastu. Asian J Pharm Clin Res. 2012;5:111–7.
16. Rechinger KH. Rumex (Polygonaceae) v Austrálii: prehodnotenie. Nuytsia. 1984;5:75–122.
17. Shahat AA, Alsaid MS, Alyahya MA, Higgins M, Dinkova-Kostova AT. NAD (P) H: Aktivita induktora chinónoxidoreduktázy 1 niektorých saudskoarabských liečivých rastlín. Planta Med. 2013;79(06):459–64.
18. El-Hawary SA, Sokkar NM, Ali ZY, Yehia MM. Profil bioaktívnych zlúčenín Rumex zástupného L. J Food Sci. 2011;76(8): C1195–202.
19. Barbosa-Filho JM, Alencar AA, Nunes XP, Tomaz AC, Sena-Filho JG, Athayde-Filho PF, a kol. Zdroje alfa-, beta-, gama-, delta- a epsilon-karoténov: prehľad z dvadsiateho storočia. Rev Bras. 2008;18(1):135–54.
20. Laouini SE, Ouahrani MR. Fytochemický skríning, in vitro antioxidačná a antibakteriálna aktivita extraktu Rumex vicarious L.. Science Study Res: Chem Chem Engi Biotech Food Ind. 2017;18:367–76.
