Môže byť perorálny melatonín novým nástrojom neuroprotekcie u predčasne narodených novorodencov?
Mar 26, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Francesca Garofoli1, Stefania Longo1, Camilla Pisoni1*, Patrizia Accorsi2, Micol Angelini1, Salvatore Aversa3, Camilla Caporali4,5,
Sara Cociglio4, Annalisa De Silvestri6, Elisa Fazzi2,7, Vittoria Rizzo8, Chryssoula Tzialla1, Marco Zecca1 a Simona Orcesi4,5
Abstraktné
Pozadie: Prevencianeurovývojovépoškodenie v dôsledku predčasného pôrodu je veľkou zdravotnou výzvou. Napriek vyspelej pôrodníckej a novorodeneckej starostlivosti je ich k dnešnému dňu máloneuroprotektívnedostupné molekuly. Preukázalo sa, že melatonín má antioxidačné/protizápalové účinky a znižuje poškodenie mozgu, hlavne po hypoxicko-ischemickej encefalopatii. Plánovaná štúdia bude prvou zameranou na vyhodnotenie schopnosti melatonínu zmierniť poškodenie mozgu v dôsledku predčasného pôrodu.
Metóda: V našej plánovanej prospektívnej, multicentrickej, dvojito zaslepenej, randomizovanej verzus placebo štúdii, prijmeme do 96 hodín od narodenia 60 predčasne narodených novorodencov s gestačným vekom menším alebo rovným 29 týždňov plus 6 dní; tieto deti budú náhodne rozdelené na perorálny melatonín, 3 mg/kg/deň alebo placebo počas 15 dní. Po období podávania zmeriame plazmatické hladiny malondialdehydu, produktu peroxidácie lipidov, ktorý sa považuje za včasný biologický marker účinnosti liečby melatonínom (primárny výsledok). V ekvivalentnom veku zhodnotíme neurologický stav (cerebrálnym ultrazvukom, cerebrálnou magnetickou rezonanciou, hodnotením zraku a sluchu, klinickým neurologickým vyšetrením a skríningom retinopatie nedonosených), ako aj výskyt bronchosplázie a sepsy. Budeme tiež sledovaťneurovývojovévýsledky počas prvých 24 mesiacov upraveného veku (pomocou modifikovaného Faganovho testu inteligencie dojčiat po 4–6 mesiacoch a štandardizovaných neurologických a vývojových hodnotení po 24 mesiacoch).
Cistanche má veľmi dobrý neuroprotektívny účinok
Diskusia: Osoby, ktoré prežili predčasný pôrod, sa často vyskytujú dlhodoboneurovývojovénásledky, ako sú motorické problémy, problémy s učením, sociálno-behaviorálne a komunikačné problémy. Naším cieľom je posúdiť úlohu melatonínu ako neuroprotektíva počas prvých týždňov mimomaternicového života, keď ho predčasne narodené deti nie sú schopné spontánne produkovať. Tento prístup je založený na predpoklade, že jeho antioxidačný mechanizmus by mohol byť užitočný pri prevenciineurovývojovéoslabenie. Vzhľadom na krátkodobú a dlhodobú morbiditu spojenú s predčasným pôrodom a finančné a sociálne náklady na starostlivosť o predčasne narodené deti pri pôrode aj v priebehu času navrhujeme, aby podávanie melatonínu mohlo viesť k značnej úspore zdrojov. Toto by bola prvá štúdia zaoberajúca sa úlohou melatonínu u predčasne narodených novorodencov s veľmi nízkou pôrodnou hmotnosťou a mohla by poskytnúť základ pre ďalšie štúdie o melatoníne akoneuroprotekciastratégie v tejto zraniteľnej populácii.
Registrácia na skúšku: ClinicalTrials.gov NCT04235673. Výhľadovo zaregistrované 22. januára 2020.
Kľúčové slová: Predčasne narodený novorodenec, Dojčatá, Melatonín, Malondialdehyd,Neuroprotekcia, Anti-oxidant, Neuro-kognitívny vývoj
Neuroprotektívne účinky cistanche
Úvod
Pozadie a zdôvodnenie {6a}
Pôrodnosť v Taliansku je približne 552,{1}}/rok a 1 percento z týchto novorodencov sú deti s veľmi nízkou pôrodnou hmotnosťou (menej alebo rovné 1 500 g pri narodení) alebo narodené v gestačnom veku (GA) menšom ako 29 týždňov plus 6 dní [1]. Osoby, ktoré prežili predčasný pôrod, sa často vyskytujú dlhodoboneurovývojovénásledky, ako sú motorické problémy, problémy s učením, sociálno-behaviorálne a komunikačné problémy [2–4]. Poškodenie difúznej bielej hmoty (WM), defekty konektivity a dysmaturačné poruchy mozgových štruktúr WM a šedej hmoty sú teraz považované za neuropatologický substrát týchto ťažkostí [5]. Nálezy na snímke magnetickej rezonancie (MRI) potvrdzujú, že WM je veľmi náchylný na poranenie súvisiace s predčasným pôrodom [6] a nedávne štúdie [5] ukázali, že intervencie zamerané na prevenciu alebo zmiernenie „encefalopatie nedonosených“ (tj toto kombinácia poranenia WM a štrukturálnych porúch šedej hmoty).
Medzi najsľubnejšie molekuly v tomto scenári možno považovať melatonín (ME) za hlavného kandidáta na udelenieneuroprotekciau predčasne narodených detí. Tento hormón a jeho metabolity sú vysoko účinné antioxidanty a lapače voľných radikálov. ME sa metabolizuje v pečeni, ale môže byť metabolizovaný aj voľnými radikálmi a oxidantmi a premenený na c3-hydroxyME, ktorý zasa priamo zachytáva voľné radikály. V mozgu sa metabolizuje na deriváty kynurenínu, ktoré sú zodpovedné za jeho antioxidačnú/protizápalovú odpoveď [7, 8]. ME už preukázalo, že pôsobí ako neuroprotektant pri cerebrálnej ischémii u dospelých [9] a čoraz väčší počet štúdií dôsledne preukazuje, že ME chráni vyvíjajúci sa mozog tým, že zabraňuje abnormálnej myelinizácii a zápalovej gliálnej reakcii [10, 11]. hlavné príčiny poranenia WM [12]. Ukázalo sa tiež, že ME je schopná znížiť poškodenie mozgu po neonatálnej hypoxicko-ischemickej encefalopatii (HIE) a predchádzať poruchám súvisiacim s preeklampsiou, intrauterinným obmedzením rastu plodu, ventiláciou indukovaným poškodením a bronchopulmonárnou dyspláziou (BPD) [13–16 ]. V prospektívnych štúdiách na novorodencoch s HIE [17, 18] sa ukázalo, že intravenózny ME zlepšuje výsledky poranenia mozgu a významne znižuje koncentrácie produktu peroxidácie lipidov malondialdehydu (MDA) a dusitanov/nitrátov. Okrem toho mnohé prebiehajúce štúdie zaoberajúce sa podávaním ME u novorodencov (registrované na ClinicalTrials.gov) uvádzajú absenciu nežiaducich udalostí (AE) spojených s ME a potvrdzujú jej užitočnosť v novorodeneckom prostredí (tj v HIE). Plod nevylučuje ME, ale prijíma ho transplacentárnym prenosom podľa vzoru cirkadiánnej sekrécie matky. K funkčnej produkcii ME dochádza až asi 12 týždňov po pôrode, aj keď dojčený novorodenec môže využiť výhody materského ME, ktorého koncentrácia sa v noci zvyšuje [19]. Naopak, predčasne narodené deti boli zbavené materského ME, ktoré by normálne dostali počas posledných týždňov/mesiacov tehotenstva, a navyše ich endogénna produkcia hormónu môže byť oneskorená aj o mesiace [20]. Exogénne podávanie ME počas prvých týždňov mimomaternicového života by preto mohlo pomôcť pri prevencii/zmierňovaní negatívnych účinkov predčasne narodených detí na vývoj mozgu.
Okrem toho farmakokinetika ME u predčasne narodených detí [19] vykazuje predĺžený polčas a klírens a znížený distribučný objem. Výsledky inej farmakokinetickej štúdie [21] poukázali na možnosť udržania aktívnych koncentrácií ME v krvi prostredníctvom jednorazového perorálneho podania, ktoré sa opakuje každých 12/24 hodín.
Doteraz sa žiadna štúdia u veľmi predčasne narodených detí nepokúsila posúdiť schopnosť ME chrániť mozog pred poškodením spôsobeným oxidačným stresom spôsobeným predčasným pôrodom. To je cieľom nášho projektu, pretože veríme, že lepšie znalosti v tejto oblasti by mohli ovplyvniť, ba dokonca natrvalo zmeniťneurovývojovévýsledky u predčasne narodených detí. Z relevantnej literatúry o predčasne narodených [19, 21] a donosených dojčatách [13–18] sme zlúčili všetky dostupné informácie o dávkovaní, spôsobe podania, dávkovacom intervale a dĺžke liečby. Vzhľadom na novosť štúdie bola zvolená dávka 3 mg/kg/deň počas 15 dní.
cistanche zdravotné prínosy: anti-Alzheimerova choroba
Ciele {7}
Táto štúdia má 3 špecifické ciele:
1. Zmerať vo vzorke predčasne narodených novorodencov po 15 dňoch slepého podávania ME alebo placeba plazmatickú MDA a jej koreláciu s plazmatickou ME (primárny cieľ štúdie).
2. Vyhodnotiť v ekvivalentnom veku (TEA 40 týždňov), či po 15 dňoch podávania ME majú dojčatá lepší klinický a inštrumentálny výsledok, čo dokazuje zníženie neonatálnej morbidity, ako je BPD, infekcia/sepsa, porucha sluchu zhoršenie zraku (retinopatia nedonosených (ROP) alebo abnormálne vizuálne správanie), patologické neurologické vyšetrenie a poranenie mozgu hodnotené pomocou cerebrálneho ultrazvuku (cUS) a MRI mozgu.
3. Na posúdenie dojčiatneurovývojovévýsledok korelujúci výsledky s liečbou ME verzus placebom. Konkrétnejšie, vo veku 4–6 mesiacov korigovaného veku (CA) budeme hodnotiť preferenciu novosti a trvanie fixácie pomocou Faganovho testu modifikovaného sledovaním očí [22], ktorý je stredne prediktívny pre neskoršie kognitívne schopnosti; v 18-24 mesiacoch CA sa výsledok posúdi pomocou antropometrických meraní, neurologických a vývojových hodnotení a štandardizovaných vývojových prieskumov podávaných rodičom.
Skúšobný dizajn {8}
Plánovaná štúdia bude mať nadradenú, prospektívnu, multicentrickú, paralelnú skupinu, randomizovanú, dvojito zaslepenú oproti placebom kontrolovanému dizajnu. Účastníci budú náhodne pridelení do intervenčnej skupiny alebo kontrolnej skupiny v pomere 1:1. Intervenčné obdobie bude trvať 15 dní. Predčasné komorbidity aneurovývojovévýsledky budú hodnotené počas prvých 24 mesiacov CA. Tabuľka 1 ukazuje hodnotenia, ktoré sa majú vykonať na začiatku a bezprostredne po intervencii. Tento skúšobný protokol je navrhnutý v súlade s položkami štandardného protokolu: Odporúčania pre intervenčné pokusy (SPIRIT) 2013.
na čo sa cistanche používa: chrániť neuróny
Metódy: účastníci, intervencie a výsledky
Nastavenia štúdie {9}
Úlohu koordinačného centra si rozdelia Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo, Pavia, a nadácia IRCCS Mondino, Pavia, pričom spolupracujúcim centrom bude detská nemocnica ASST „Spedali Civili“ v Brescii (kde to schváli miestna etická komisia proces stále prebieha). Predčasne narodení novorodenci budú prijatí do 96 hodín od narodenia na jednotkách neonatálnej intenzívnej starostlivosti (NICU) týchto dvoch centier. ME a placebo sa budú podávať na týchto JIS. Plazmatické koncentrácie MDA a ME budú stanovené v laboratóriu koordinačného centra. Pracovníci NICU spolupracujúceho centra preto pošlú vzorky kryokonzervovanej neonatálnej plazmy do koordinačného centra. Plánované hodnotenia
Tabuľka 1 Položky štandardného protokolu: Počet odporúčaní pre intervenčné skúšky (SPIRIT) s časovým harmonogramom náboru, hodnotení a intervencií
Skratky: sluchovo evokované odpovede mozgového kmeňa BAER, bronchopulmonálna dysplázia BDP, vek korigovaný CA, kontrolný zoznam správania dieťaťa CBCL, ultrazvuk mozgu cUS, deň D, gestačný vek GA, všeobecné pohyby GM, mesiac M, MDA malondialdehyd, ME melatonín, zobrazenie magnetickou rezonanciou MRI NAVEG Neonatal Assessment Visual European Grid, sieť neurobehaviorálnej škály jednotiek intenzívnej starostlivosti NNNS, ROP retinopatia nedonosených, W týždeň miesto v TEA sa vykoná na JIS pôrodu. Na detských neuropsychiatrických jednotkách v Pavii a Brescii sa vykonajú následné hodnotenia, ktoré sa majú uskutočniť po 4–6 mesiacoch a po 18–24 mesiacoch CA.
Kritériá oprávnenosti {10}
Do každého z dvoch študijných ramien bude zaradených tridsať predčasne narodených novorodencov. Zaradené dojčatá budú náhodne dostávať ME (3 mg/kg/deň) alebo placebo počas 15 dní.
Kritériá zaradenia sú:
GA Menšie alebo rovné 29 plus 6 (týždne plus dni)
Schopnosť prijímať 20 ml/kg/deň materského alebo umelého mlieka do 96 hodín po pôrode
Písomný informovaný súhlas podpísaný oboma rodičmi.
Kritériá vylúčenia sú:
GA > 29 plus 6 (týždne plus dni)
Neschopnosť prijímať minimálnu enterálnu výživu
Genetické, vrodené, metabolické a/alebo TORCH ochorenia
Periventrikulárne/intraventrikulárne krvácanie (PVH/IVH) > III. stupeň [23] a/alebo periventrikulárna leukomalácia (PVL) Väčšie alebo rovné ako II. stupeň [24] do 96 hodín od narodenia (podľa cUS)
Informovaný súhlas odmietnutý.
Kto získa informovaný súhlas? {26a}{101}
Klinici NICU, ktorí sa zúčastňujú vyšetrovania, prijmú účastníkov a získajú informovaný súhlas od oboch rodičov. Rodičia budú o štúdiu plne informovaní počas poradenského stretnutia a následne im bude poskytnutý informačný list.
Dodatočné ustanovenia o súhlase so zberom a používaním údajov účastníkov a biologických vzoriek {26b} Neuplatňuje sa, pretože sa neplánujú žiadne doplnkové štúdie.
cistanche tubolosa
Zásahy
Vysvetlenie výberu komparátorov {6b} ME sa porovná s placebom. V súčasnosti nie sú zaregistrované žiadne iné neuroprotektívne molekuly na použitie u pacientov na NICU.
Popis zásahu {11a}
Intervencia bude pozostávať z dvojito zaslepeného podania ME alebo placeba podľa randomizačného zoznamu. Predčasne narodené deti vhodné na zaradenie po uplatnení všetkých zaraďovacích a vylučovacích kritérií budú náhodne rozdelené tak, aby dostávali 3 mg/kg/deň ME v kvapkách alebo ekvivalentné množstvo placeba v kvapkách počas 15 dní. Koordinátor štúdie po skontrolovaní zoznamu dá neonatológovi príslušnú fľaštičku kvapiek. Každá fľaša bude označená „A“ alebo „B“ — v súlade s protokolom dvojito zaslepeného podávania ani personál, ani pacienti (rodičia) nebudú vedieť, ktorá obsahuje ME a ktoré placebo, a tiež bude uvedená totožnosť pacienta, dátum prvé podanie a číslo šarže. Neonatológ stanoví a zaznamená dávku podávanú každý večer na základe hmotnosti pacienta, meranej denne. Sestra bude podávať kvapky každý večer o 23:00 po enterálnom kŕmení počas 15 po sebe nasledujúcich dní. Toto načasovanie je určené na napodobnenie koncentrácií ME v materskom mlieku, ktoré sú najvyššie počas noci.
Kritériá na prerušenie alebo úpravu pridelených zásahov {11b}
Štúdia môže byť prerušená u daného účastníka štúdie z dôvodu: nástup AE, ktoré môžu súvisieť s intervenciou, úsudkom lekára alebo zrušením súhlasu rodičmi.
Stratégie na zlepšenie dodržiavania zásahov {11c}
ME/placebo sa bude podávať počas 15 dní počas hospitalizácie na NICU pod priamym dohľadom a zodpovednosťou výskumníkov štúdie.
Príslušná sprievodná starostlivosť je povolená alebo zakázaná
počas skúšobného obdobia {11d}
Všetci účastníci štúdie dostanú potrebnú štandardnú starostlivosť: budú povolené všetky liečby, ktoré pacienti potrebujú podľa ich klinického stavu. Každú súbežnú medikáciu alebo intervenciu klinickí lekári zaznamenajú.
Ustanovenia pre starostlivosť po súdnom konaní {30}
Klinické a inštrumentálne sledovanie je plánované do 24 mesiacov CA, ako je uvedené v časti „Popis intervencie“, a je súčasťou štúdie. Neplánuje sa žiadna doplnková ani špecifická starostlivosť po skončení súdneho konania.
extrakt z cistanche tubolosa
Výsledky {12}
1. Výsledky relevantné pre primárny cieľ:
Štatisticky významný pokles plazmatickej koncentrácie MDA (nmol/ml) v skupine liečenej ME po 15 dňoch podávania ME/placeba predstavoval rozdiel medzi týmito dvoma skupinami.
V rovnakom časovom bode sa predpokladalo, že za vyššie uvedené zníženie MDA je zodpovedné štatisticky významné zvýšenie koncentrácie ME v plazme (ug/ml), čo predstavuje rozdiel medzi týmito dvoma skupinami.
2. Výsledky relevantné pre sekundárny cieľ: výskyt do 40 týždňov CA:
Prípady cerebrálneho poranenia odhalené pomocou cUS a MRI mozgu.
Prípady ROP, sluchového deficitu, sepsy, BPD
Prípady s abnormálnym neurologickým vyšetrením [25], abnormálnymi všeobecnými pohybmi (GM) [26], abnormálnym vizuálnym správaním, ako bolo hodnotené pomocou Neonatal Assessment Visual European Grid (NAVEG) [27].
3. Výsledky relevantné pre tretí cieľ:
➣ Po 4–6 mesiacoch CA:
Skóre vizuálnej funkcie v modifikovanom Faganovom teste [22].
➣ V 18-24 mesiacoch CA:
Antropometrické merania
Neurovývoja správanie, ako bolo hodnotené pomocou Griffithsovej škály vývoja dieťaťa 3. vydanie [28] a kontrolného zoznamu správania dieťaťa (CBCL) [29].
Časová os účastníka {13}
Pozri tabuľku 1.
Veľkosť vzorky {14}
Literatúra obsahuje iba jeden článok dostatočne podobný našej štúdii [30]; tento dokument bol použitý ako referenčný zdroj na výber primárneho výsledku (koncentrácia MDA v dvoch skupinách) a výpočet veľkosti vzorky pre našu navrhovanú štúdiu. Celkovo 26 pacientov na skupinu sa považuje za dostatočné na zistenie štatisticky významného rozdielu rovnajúceho sa 8 nmol/ml (štandardná odchýlka v dvoch skupinách rovnajúcej sa 7) so silou vyššou ako 80 percent medzi nulovou hypotézou (H0) rovnaká koncentrácia MDA 16 nmol/ml v dvoch skupinách a alternatívna hypotéza (H1) o znížení koncentrácie MDA na 8 nmol/ml v skupine 2 (t-test pre nezávislé skupiny s chybou alfa=5 percent) . Ak vezmeme do úvahy potenciálnu mieru predčasného ukončenia školskej dochádzky vo výške 15 percent, bude zaradených 30 novorodencov na skupinu.
Všetci zúčastnení pacienti budú zaregistrovaní dvoma zúčastnenými NICU.
Nábor {15}
Nábor sa uskutoční vo Fondazione IRCCS
Policlinico S. Matteo, Pavia, Taliansko (spoločné koordinačné centrum) a ASST „Spedali Civili“ di Brescia, Brescia, Taliansko (zúčastnené centrum). Koordinačné centrum získalo potrebné zákonné povolenie na začatie procesu skôr ako zúčastnené centrum, ktoré v súčasnosti čaká na etické schválenie. Obe nemocnice sú centrami tretieho stupňa a prijímajú novorodencov od 23. týždňa GA. Hlavný skúšajúci (PI) a ďalší neonatológovia, ktorí sa zúčastňujú skúšania, aktívne pracujú na oddeleniach s časovým rozvrhom, ktorý zaručuje stálu prítomnosť (24 hodín denne) PI alebo aspoň jedného zo spoluriešiacich zodpovedných za nábor pacientov poskytovanie primeraných informácií rodičom a sledovanie prebiehajúceho štúdia. Centrá majú incidenciu približne 4 až 8 vhodných pacientov/mesiac (pacienti s GA kratšou alebo rovnou 29 týždňom plus 6 dní, ktorí sú schopní prijať 20 ml/kg/deň enterálnej výživy do 96 hodín od narodenia). To by malo zaručiť nábor celkovo 60 pacientov (aj pri započítaní výpadkov).
Obe centrá sú podobné, pokiaľ ide o dostupné nástroje a obe majú špecializovanú službu detskej neurológie a psychiatrie. Výskumníci zapojení do štúdie majú podobne vysokú úroveň odbornosti, absolvovali rovnaký odborný výcvik a používajú rovnaké metodologické nástroje. Okrem toho väčšina z nich v posledných rokoch často spolupracovala na iných výskumných projektoch.
Pridelenie zásahov: pridelenie
Generovanie sekvencie {16a}
Randomizáciu vygeneruje Jednotka klinickej epidemiológie a biometrie (nezaslepený tím) v koordinačnom centre, podľa pomeru pridelenia 1:1, pomocou počítačom generovaných náhodných čísel, ktoré umožnia pridelenie ďalších pacientov v prípade výpadkov. Randomizačná sekvencia bude generovaná generátorom náhodných čísel v tej istej jednotke. PI dvoch NICU postupne rozdelia účastníkov do dvoch skupín na základe vygenerovaných zoznamov.
Utajovací mechanizmus {16b}
Pracovníci oddelenia klinickej epidemiológie a biometrie, ktorí generujú randomizačný zoznam, budú slúžiť ako nezaslepený tím, zodpovedný za generovanie a uchovávanie randomizačného zoznamu a za komunikáciu s ostatnými spoluriešiteľmi alebo v prípade potreby s dodávateľmi ME/placeba. ME/placebo budú uchovávané v anonymných liekovkách s alfanumerickými kódmi, číslami šarží a dátumami exspirácie. Tieto liekovky budú zaznamenané a uložené v uzamknutej miestnosti na každej JIS.
Implementácia {16c}
Miestny koordinátor štúdie po skontrolovaní vhodnosti pacienta a zoznamu randomizácie odovzdá príslušnú fľaštičku kvapiek neonatológovi. Každá fľaša bude označená „A“ alebo „B“ a bude na nej uvedená aj totožnosť pacienta, dátum prvého podania a číslo šarže.
Priradenie zásahov: oslepenie
Kto bude oslepený {17a}
S výnimkou personálu Oddelenia klinickej epidemiológie a biometrie v koordinačnom centre bude celý študijný personál (zdravotnícky personál, hodnotitelia výsledkov a analytici údajov) zaslepený, ako aj rodičia každého účastníka. Jednotka klinickej epidemiológie a biometrie bude zodpovedná za odslepenie v prípade potreby (závažné AE pravdepodobne súvisiace s intervenciou).
Postup na odslepenie v prípade potreby {17b}
Odslepenie sa vykoná po dokončení štúdie. Za normálnych okolností budú všetci účastníci odslepení súčasne po dokončení databázy. Naliehavé, neplánované odslepenie pred týmto bodom sa vykoná, ak je to potrebné na zaistenie bezpečnosti účastníka, napr. na identifikáciu lieku počas akútnej reakcie. Nezaslepené informácie budú zdieľané iba na základe potreby vedieť.
Zber a správa údajov
Plány hodnotenia a zberu výsledkov {18a}
Všetci členovia personálu štúdie sú dobre vyškolení v protokolových postupoch a požiadavkách správnej klinickej praxe (GCP), správnej laboratórnej praxe a správnej experimentálnej praxe a už pracovali na klinických skúškach; okrem toho bude proces počas celého jeho priebehu monitorovaný tímom pre zabezpečenie kvality etického výboru (ECQT) koordinačného centra. Všetci zamestnanci zapojení do štúdie sú súčasťou klinického tímu, ktorý sa bežne stará o predčasne narodené deti od 23. týždňa GA. Každý operátor zapojený do hodnotenia výsledkov má konsolidované skúsenosti s používaním zvolených nástrojov a v prípade potreby prešiel špecifickým školením (napr. na hodnotenie GM alebo na vykonávanie protokolu NAVEG na hodnotenie zrakových schopností). Všetky testy, postupy a klinické hodnotenia, ktoré sa budú vykonávať, sú validované. V nasledujúcom odseku sú všetky hodnotenia, ktoré sa majú použiť na zber výsledkov, podrobne opísané a podložené príslušnými referenciami, ktoré potvrdzujú ich validáciu a súčasné použitie.
Cieľ experimentálneho dizajnu 1
V súlade s dvojito zaslepeným dizajnom štúdie s paralelnými ramenami celkovo 60 predčasne narodených novorodencov s GA menším alebo rovným 29 plus 6 (týždne plus dni), ak sú schopní dostať enterálnu výživu 20 ml/kg/deň do 96 h od narodenia, budú náhodne pridelení tak, aby dostávali 3 mg/kg/deň ME kvapiek alebo ekvivalentné množstvo placebových kvapiek počas 15 dní. Na konci 15 dní sa zameriavame na vyhodnotenie rozdielov v plazmatických koncentráciách MDA a ME v suplementovanej vs. nedoplnenej skupine a oproti východiskovej situácii.
Pri odbere a potom po 15 dňoch liečby sa získa 250 ul vzoriek plazmy z 500 ul vzoriek krvi novorodencov pomocou kyseliny etyléndiamíntetraoctovej. Tieto vzorky plazmy sa použijú na meranie koncentrácie MDA (nmol/ml) pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC, Chromsystems Instruments & Chemicals; Grafelfing/Nemecko) a koncentrácie ME (pg/ml), kvantifikovanej v jednom chromatografickom cykle HPLC s fluorimetrickou detekciou [31] (LC-10AD pumpa, RF-551 fluorescenčný detektor a SIL-10AD autosampler, Shimadzu Italia, Taliansko).
Všetky merania sa budú vykonávať v Laboratóriu klinickej chémie koordinačného centra (Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo, Pavia, Taliansko).
Cieľ experimentálneho dizajnu 2
Pôrodnícke a perinatálne údaje budú zaznamenané pre každé dieťa podľa kritérií Vermont Oxford Network [32]. Okrem toho pri TEA (40 týždňov) sa klinické a inštrumentálne výsledky vyhodnotia zhromaždením/vykonaním nasledovného:
Antropometrické merania;
Incidencia a stupeň ROP, merané nepriamou oftalmoskopiou (Ophthalmic Imaging System, RetCam 3, Clarity Medical Systems, Pleasanton, CA, USA);
Výskyt sluchovej abnormality hodnotený sluchovo vyvolanými odpoveďami mozgového kmeňa (Otodynamics Audiology Systems, Hatfield, Herts, UK);
Výskyt a závažnosť infekcie/sepsy;
Výskyt a závažnosť BPD;
Výsledky neurologického vyšetrenia vykonaného podľa Amiel-Tisonovej metódy [25];
Hodnotenie GM [26];
Hodnotenie vizuálneho správania, vykonávané pomocou nového štandardizovaného nástroja (NAVEG) a skúmanie rôznych aspektov neonatálnej zrakovej funkcie [27];
Správa neurobehaviorálnej škály siete jednotiek intenzívnej starostlivosti o novorodencov [33];
cUS nálezy: PVH/IVH podľa klasifikácie Papileho [23], PVL podľa klasifikácie de Vriesa [24] a ventrikulárna dilatácia podľa Menta [34] (ultrazvukový model: Hitachi ALOKA Arietta V70, Hitachi Medical Systems Europe Holding AG, Zug , Švajčiarsko, www.hitachi-medical-systems.com). Nálezy cUS budú tiež klasifikované a zoskupené podľa Rademakera [35];
MRI mozgu počas spontánneho spánku, vykonaná pomocou 1.{1}}Tesla MRI skenera (Siemens) rádiografmi zaslepenými voči zaradeniu účastníkov do skupiny s placebom alebo ME; kvalitatívne a kvantitatívne objemové techniky sa použijú na odhad celkových a regionálnych objemov mozgu pre rôzne typy tkanív; Zobrazovanie tenzorov difúzie sa použije na vyhodnotenie integrity a dozrievania WM podľa zdanlivého difúzneho koeficientu a frakčnej anizotropie. Harmonizácia skenov v rôznych centrách bude zaručená.
Hodnotenie rodičovského stresu s overenými prieskumami ako kontrolným faktorom, aby sa zohľadnil vplyv rodičovského stresu na vývoj detí [33]. To sa uskutoční podávaním škály rodičovského stresu: Jednotka intenzívnej starostlivosti o novorodencov, Modifikovaného dotazníka o perinatálnej posttraumatickej stresovej poruche, Štátneho inventára úzkosti a Edinburskej škály postnatálnej depresie. Všetky prieskumy sú overené a budú spravované vyškoleným personálom.
Cieľ experimentálneho dizajnu 3
Po 4–6 mesiacoch CA zhromaždíme/vykonáme nasledovné:
Antropometrické merania;
Neurologické vyšetrenie;
Modifikovaný Faganov test inteligencie dojčiat [22], ktorý stredne predpovedá neskoršie kognitívne schopnosti. Test sa uskutoční pomocou inovatívnej novej metódy zahŕňajúcej automatizované sledovanie očí (Tobii TX 300, Tobii AB, publ, Danderyd, Stockholm, SE. https://www.tobiipro.com), zameranú na zabezpečenie presnosti a objektivity. Prvým cieľom je preferencia novosti, čo je podiel času, ktorý dieťa strávi pozeraním sa na nový stimul, v porovnaní s časom stráveným pozeraním sa na predtým prezentovaný stimul. Druhým cieľom je trvanie fixácie, tj priemerné trvanie pohľadu na stimul.
V 18-24 mesiacoch CA,neurovývojovévýsledky v dvoch skupinách budú hodnotené prostredníctvom:
Antropometrické merania; Neurologické vyšetrenie; Štandardizované vývojové hodnotenie, uskutočnené pomocou Griffithsových škál pre vývoj dieťaťa 3. vydanie [28]; CBCL je prieskum, ktorý si sami spravujú rodičia [29].
Plány na podporu udržania si účastníkov a dokončenie sledovania {18b}
Skúšobný personál bude zodpovedný za sledovanie pacientov. Pri prvom sledovaní (40 týždňov GA) budú pacienti prevažne ešte hospitalizovaní. Následné následné návštevy budú naplánované s rodičmi. Aby sa podporilo dodržiavanie plánovaných hodnotení, koordinátor štúdie zatelefonuje rodičom týždeň pred každým plánovaným hodnotením. V prípade, že pacienti zmeškajú schôdzku, budú zavolaní aj rodičom s upozornením.
Správa údajov {19} a dôvernosť {27}
Všetky informácie súvisiace so štúdiou sa najskôr zhromaždia vo formulároch hlásení o prípade (CRF) a potom ich vložia do databázy špecializovaní zamestnanci skúšania. Všetky zozbierané údaje budú následne bezpečne uložené v koordinačnom centre. Dvojité zadávanie údajov špecializovaným personálom zabezpečí súlad medzi CRF a databázovými údajmi. Rozsahy hodnôt údajov použité v štúdii budú tie pre predčasne narodené deti, ktoré skontroluje neonatológ a manažér údajov v koordinačnom centre. Všetky informácie o účastníkoch budú uložené v uzamknutých kartotékach v zabezpečených miestnostiach prístupných len určeným študijným pracovníkom (PI, spoluriešitelia, analytici údajov). Všetky záznamy, ktoré obsahujú mená alebo iné osobné identifikátory, budú uchovávané oddelene od študijných záznamov, anonymizované a chránené identifikačným kódom, ku ktorému majú prístup iba oprávnení pracovníci. Informácie o štúdii účastníkov nebudú zverejnené mimo kontextu tejto štúdie bez písomného súhlasu účastníka (rodičov).
Plány odberu, laboratórneho hodnotenia a skladovania biologických vzoriek na genetickú alebo molekulárnu analýzu v tomto teste/budúcom použití {33}
Neuplatňuje sa, pretože v rámci tohto pokusu sa nebudú odoberať žiadne biologické vzorky na genetickú alebo molekulárnu analýzu.
prínos cistanche: ochrana neurónov a anti-Alzheimerovej choroby
Štatistické metódy
Štatistické metódy pre primárne a sekundárne výsledky {20a}
Pokiaľ ide o analýzu výsledkov pokusu, použije sa test normality (Shapiro-Wilkov test), aby sa určilo, či sú súbory údajov dobre modelované normálnym rozdelením. Kategorické premenné budú opísané ako počty a percentá a budú porovnávané medzi liečenými skupinami testom chí-kvadrát alebo Fisherovým presným testom. Spojité premenné budú vyjadrené ako priemer a štandardná odchýlka alebo medián a interkvartilový rozsah a porovnania medzi liečenými skupinami budú
urobené pomocou t-testu pre nezávislé skupiny alebo an
analogický neparametrický test, ak premenná nie je normálne rozložená. Potenciálna multivariačná analýza sa uskutoční pomocou regresných modelov. Na zohľadnenie nesamostatnosti pozorovaní v prípade, že sú zapísané dvojčatá, sa použijú všeobecné odhadové rovnice (GEE) alebo zmiešané regresné modely. Štatistickú analýzu vykoná jednotka klinickej epidemiológie a biometrie v koordinačnom centre pomocou štatistického balíka STATA (Stata, vydanie 16 alebo novšie, StataCorp, College Station, TX, USA).
Neboli naplánované žiadne predbežné analýzy, pretože sa nepredpokladajú žiadne problémy, ktoré by mohli byť pre účastníkov škodlivé.
Metódy pre ďalšie analýzy (napr. analýzy podskupín) {20b}
Toto neplatí. Neplánujú sa žiadne ďalšie analýzy.
Metódy analýzy na zvládnutie nedodržiavania protokolu a akékoľvek štatistické metódy na zvládnutie chýbajúcich údajov {20c} Analyzovaní budú všetci randomizovaní účastníci bez ohľadu na dodržiavanie protokolu. Chýbajúce údaje budú spracované pomocou viacerých imputácií.
Plánuje poskytnúť prístup k úplnému protokolu, údajom na úrovni účastníka a štatistickému kódu {31c}
Najneskôr do 3 rokov po skončení štúdie (vrátane fáz sledovania a štatistickej analýzy) doručíme úplne neidentifikovaný súbor údajov do príslušného archívu údajov na účely zdieľania.
Dohľad a monitorovanie
Zloženie koordinačného centra a riadiaceho výboru skúšania {5d}
Pracovníci koordinačného centra tvoria neonatológovia a detskí neuropsychiatri zodpovední za registráciu pacientov a hodnotenie klinických výsledkov a laboratórny personál, výskumníci a analytici údajov zodpovední za uchovávanie a poskytovanie placeba a ME neonatológom, meranie biomarkerov, zber údajov a zostavovanie CRF a databázy. Všetci títo pracovníci budú spoločne koordinovať činnosť ostatných lekárov a výskumníkov zo zúčastneného centra.
Riadiaci výbor (SC) sa skladá z PI z každého centra a „podpory výskumných pracovníkov“. Úlohou DV je dohliadať na pokrok v štúdii, identifikovať problémy a implementovať vhodné nápravné opatrenia.
Zloženie výboru na monitorovanie údajov, jeho úloha a štruktúra podávania správ {21a}
V našich nemocniciach máme špecializovaných pracovníkov na monitorovanie údajov, ktorí podporujú inštitucionálne etické komisie a PI a Co-PI; odkazujeme najmä na ECQT v koordinačnom centre. Uvedené ECQT je externé vzhľadom na plánovanú štúdiu a bude ju aktívne monitorovať a kontrolovať až do konca následného sledovania. Pracovníci výboru pre monitorovanie údajov (DMC) budú v pravidelných intervaloch (dvakrát ročne) monitorovať prebiehajúcu štúdiu.
Navyše vyhlasujeme, že nemáme žiadneho sponzora. Plánovaná štúdia je spontánna štúdia a nemáme žiadne konkurenčné záujmy.
Hlásenie nežiaducich udalostí a škôd {22}
Všetci pacienti budú liečení počas hospitalizácie na JIS a budú pod neustálym lekárskym dohľadom. Niektoré AE sa očakávajú kvôli povahe študovanej populácie: nekrotizujúca enterokolitída, BPD, ROP, sepsa, smrť. Pri podávaní ME sa neočakávajú žiadne nežiaduce reakcie. Rozdiely v sadzbách vyššie uvedených AE v týchto dvoch
študijné skupiny sa budú považovať za ukazovateľ účinnosti ME; tieto budú náležite zaregistrované a zapísané do štatistickej analýzy ako výsledok (výskyt udalostí) a ako AE. Všetky AE budú riadené v súlade s Medzinárodnou konferenciou o harmonizácii a usmerneniami GCP. Celý personál bol vyškolený v postupoch a načasovaní registrácie rôznych typov AE. Závažné nežiaduce reakcie a podozrenia na neočakávané závažné nežiaduce reakcie budú zaznamenané a oznámené príslušným kompetentným orgánom, etickým výborom a DMC do 24 hodín od ich zistenia.
Všetky menšie AE budú hlásené a opísané v CRF a databáze, štatisticky analyzované a zahrnuté do výsledkov.
Frekvencia a plány na vykonávanie skúšobných auditov {23}
ECQT koordinačného centra vykoná audit štúdie až do konca následného sledovania.
Plány na komunikáciu dôležitého protokolu
dodatky relevantným stranám (napr. účastníkom súdneho konania, etickým výborom) {25}
Pracovníci koordinačného centra sú zodpovední za oznamovanie dôležitých úprav protokolu príslušným stranám. Akékoľvek odchýlky od protokolu budú plne zdokumentované pomocou formulára správy o porušení a všetky aktualizácie protokolu budú oznámené medzi koordinačnými a zúčastnenými centrami.
Plány šírenia {31a}
Naším cieľom je publikovať kvantitatívne a kvalitatívne výsledky skúšok v recenzovaných vedeckých časopisoch. Hoci sa a priori neplánuje žiadna prezentácia výsledkov na konferenciách/seminároch, táto možnosť nie je vylúčená.
Diskusia
Kombinácia cerebrálneho poranenia WM a dys-maturačných udalostí, ako vo WM, tak aj v neuroaxonálnych štruktúrach, vyplývajúce z predčasného pôrodu, je vážnym zdravotným problémom. Osoby, ktoré prežili predčasný pôrod, často trpia dlhodoboneurovývojovénásledky, ako sú motorické, učenie, sociálno-behaviorálne a komunikačné problémy [2–4]. Aj rodiny sú zasiahnuté ekonomickými dôsledkami, ktoré nepochybne zvyšujú celoživotnú psychickú záťaž, ktorú musia znášať. Pokiaľ ide o entitu známu ako „encefalopatia nedonosených detí“, je evidentné, že najmä u veľmi predčasne narodených novorodencov sa dysmaturačné udalosti vyvíjajú počas dlhého časového obdobia, čo znamená, že existuje relatívne dlhé okno pre intervencie zamerané na pri ich predchádzaní alebo zmierňovaní [5]. V súčasnosti je ich však máloneuroprotektívnemolekuly dostupné na liečbu týchto prípadov.
ME je prírodný hormón s preukázanými antioxidačnými/protizápalovými vlastnosťami, ľahko sa podáva (orálne), je lacný a má vysoký bezpečnostný profil. Ako sme podrobne uviedli vyššie, rôzne štúdie preukázali, že ME je kandidátom na prevenciu poranení WM a navyše tieto predčasne narodené deti sú zbavené materského ME a tiež nie sú schopné ho vylučovať. Tento rozsiahly súbor literatúry [7–18] nás vedie k silnému presvedčeniu, že podávanie exogénneho ME by mohlo zmierniť účinky poranenia mozgu v dôsledku predčasného pôrodu vrátane dlhodobých prejavov.
Vzhľadom na možné krátkodobé a dlhodobé morbidity súvisiace s predčasným pôrodom a finančné a sociálne náklady na poskytovanie starostlivosti o predčasne narodenú populáciu pri narodení a v priebehu času možno predpokladať, že podávanie ME, skoro po predčasnom pôrode, môže viesť k značným úspora sociálnych a ekonomických zdrojov.
Prostredníctvom našej štúdie sa zameriavame na sledovanie neurobehaviorálneho vývoja dojčiat počas prvých 2 rokov života. Zameriame sa na klinické príznaky a symptómy a na objektívne inštrumentálne nálezy, porovnávame prípady (pacienti liečení ME) s kontrolami (pacienti liečení placebom). Zistiť, či suplementáciu ME možno považovať za možnúneuroprotektívneliečbe poranenia mozgu, pokúsime sa určiť, ktorí pacienti a postihnutí profitovali zo suplementácie ME najviac a ktorí najmenej, a pochopiť prečo. Táto štúdia by mohla byť krokom k vytvoreniu preventívnej liečby prispôsobenej charakteristikám jedného pacienta, ako je GA, pôrodná hmotnosť, pohlavie alebo iné premenné a chorobnosti súvisiace s predčasným pôrodom.
Zdôrazňuje sa, že plánovaná štúdia by bola prvou štúdiou zaoberajúcou sa úlohou ME vneuroprotekciau predčasne narodených detí: plánujeme vyhodnotiť rôzne výsledky (metabolity, inštrumentálne a klinické hodnotenia), ale niektoré hypotézy sa môžu ukázať ako len čiastočne preukázateľné. Napriek tomu sme presvedčení, že naša štúdia prinesie výsledky, ktoré môžu poskytnúť základ pre ďalšie štúdie o podávaní ME ako aneuroprotekciastratégie. Ďalším potenciálnym problémom je, že výskyt predčasného pôrodu môže sledovať nepravidelnú sínusovú krivku, čo znemožňuje presné plánovanie miery náboru účastníkov. V prípade omeškania s náborom požadovaného počtu účastníkov sa môže časový rámec na zápis predĺžiť z 12 na 18 mesiacov. Ďalším riešením by mohlo byť nábor pacientov z iných centier, ktoré majú NICU a neuropsychiatrické jednotky, a použiť rovnakú metodiku hodnotenia ako my.
Na záver, táto štúdia má za cieľ posúdiť možnéneuroprotektívneúlohu ME u veľmi predčasne narodených novorodencov. Podávanie ME by mohlo byť potenciálne účinným prostriedkom na zmiernenie neurologických porúch, posilnením komplexnej podpornej terapie, ktorá sa už poskytuje na NICU. Jeho preventívne účinky by navyše mohli pomôcť znížiť náklady národného zdravotného systému spojené s rehabilitáciou vývinových porúch spôsobených predčasným pôrodom.
Skúšobný stav
Skúšobný protokol sa vzťahuje na verziu v4 – 11/2019. Očakávalo sa, že nábor začne v apríli 2020, ale súčasná núdzová situácia týkajúca sa koronavírusovej choroby-19 ho oddialila. Očakáva sa, že šesťdesiat pacientov bude prijatých v nasledujúcich 12 – 18 mesiacoch a pre každého prijatého pacienta bude sledovanie trvať 18 – 24 mesiacov, pričom sú naplánované 4 body odčítania: po 15 dňoch, pri TEA, po 4 – 6. mesiacov CA a 18 – 24 mesiacov CA. Na konečnú analýzu údajov a fáz podávania správ môžu byť potrebné ďalšie dva mesiace. Budeme dodávať správy o činnosti ku každému z bodov čítania a budeme organizovať mesačné následné stretnutia na sledovanie pokroku.
Prvým míľnikom je 18 mesiacov od začiatku štúdie: do tejto doby sa snažíme dokončiť
registrácia pacientov a splnené ciele 1 a 2.
Druhým míľnikom je 36 mesiacov, počas ktorých očakávame splnenie cieľa 3, zhromaždenie konečných výsledkov a ukončenie štatistickej analýzy. Hneď ako budú k dispozícii konečné výsledky, začne sa príprava vedeckej práce.
Skratky
BPD: Bronchopulmonálna dysplázia; CA: Opravený vek; CBCL: Kontrolný zoznam správania dieťaťa; CRF: Formuláre hlásení prípadov; cUS: cerebrálny ultrazvuk; DMC: Výbor pre monitorovanie údajov; ECQT: tím pre zabezpečenie kvality etického výboru; GA: Gestačný vek; GCP: Správna klinická prax; GM: Všeobecné pohyby; HIE: hypoxická ischemická encefalopatia; HPLC: vysokoúčinná kvapalinová chromatografia; IVH: Intraventrikulárne krvácanie; MDA: malondialdehyd; ME: melatonín; MRI: Obraz z magnetickej rezonancie; NAVEG: Vizuálna európska mriežka hodnotenia novorodencov; NICU: Jednotky intenzívnej starostlivosti pre novorodencov;
PI: hlavný riešiteľ; PVH: Periventrikulárne krvácanie; PVL: periventrikulárna leukomalácia; ROP: Retinopatia nedonosených; SC: Riadiaci výbor; TEA: Termín ekvivalentný vek; WM: Biela hmota
Poďakovanie
Ďakujeme spoločnosti Buona Srl v osobe Steva Jonesa (Via Alfieri, 8 - 50019 Sesto Fiorentino - FI) za bezplatnú dodávku ME (kvapky BuOna Circadiem) a placeba, obmedzené na pacientov v štúdii a obdobie.
Príspevky autorov {31b}
FG a SO sú zodpovední za koncepciu štúdie, kritický návrh a písanie protokolu. CP prispel k napísaniu protokolu, bude zodpovedný za koordináciu časti klinických hodnotení počas sledovania a je korešpondujúcim autorom. SL, CT, SA a MZ budú zodpovedné za nábor a hodnotenie novorodencov a za podávanie ME a placeba. SO, CC, PA a EF budú zodpovedať zaneurovývojovéhodnotenie. MA kriticky navrhol CRF a databázu. ADS je zodpovedná za návrh oslepenia, za náhodné pridelenie, za posúdenie veľkosti vzorky a za všetky štatistické analýzy. SC kriticky zrevidovala všetky experimentálne postupy a vypracovala dokument. VR overila realizovateľnosť primárneho výsledku a validovala metodiku HPLC. Autor(i) prečítali a schválili konečný rukopis.
Konkurenčné záujmy {28}
Autori vyhlasujú, že nemajú žiadne konkurenčné záujmy.
Financovanie {4}
Táto publikácia je podporovaná grantmi talianskeho ministerstva zdravotníctva RC 2020 pre IRCCS Mondino Foundation, Pavia, Taliansko (obmedzené na anglické recenzie a poplatky za publikáciu). Neexistuje žiadny ďalší financujúci orgán zapojený do návrhu štúdie alebo do zberu, analýzy a interpretácie údajov alebo písania rukopisu.
Dostupnosť údajov a materiálov {29}
Všetky údaje generované alebo analyzované počas tejto štúdie budú zahrnuté do publikovaného článku (a jeho doplnkových informačných súborov).
Súhlas so zverejnením {32}
Rodičia všetkých novorodencov zapojených do štúdie podpíšu súhlas s anonymným použitím klinických údajov na vedecké účely, schválený bioetickou komisiou. Koordinačné centrum bude vlastníkom údajov a súhlasí so zverejnením výsledkov plánovaného pokusu a tiež so zverejnením tohto rukopisu.
Etický súhlas a súhlas s účasťou {24}
Bioetický súhlas už udelila bioetická komisia koordinačného centra: prot. 20180004210, Pavia, 17.01.2018; dodatok P- 20170030405, prot. 20190114388, Pavia, 30.12.2019. V kontexte štúdie sa požadovaný informovaný súhlas týka ochrany neplnoletých osôb a príslušný dokument schválila bioetická komisia.
Podrobnosti o autorovi
1 Novorodenecká jednotka a jednotka intenzívnej starostlivosti o novorodencov, Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo, Piazzale Golgi 1, 27100 Pavia, Taliansko. 2 Neuropsychiatrická jednotka pre deti a dorast, Detská nemocnica, ASST Spedali Civili, Brescia, 25123 Brescia, Taliansko. 3Novorodenecká jednotka a jednotka intenzívnej starostlivosti pre novorodencov, Detská nemocnica, ASST Spedali Civili, Brescia, 25123 Brescia, Taliansko. 4Jednotka detskej neurológie a psychiatrie, Katedra mozgových a behaviorálnych vied, Univerzita v Pavii, 27100 Pavia, Taliansko. 5Jednotka detskej neurológie a psychiatrie, IRCCS Mondino Foundation, 27100 Pavia, Taliansko. 6Jednotka klinickej epidemiológie a biometrie, Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo, 27100 Pavia, Taliansko. 7Katedra klinických a experimentálnych vied, Univerzita v Brescii, 25123 Brescia, Taliansko. 8 Laboratórium klinickej chémie a oddelenie molekulárnej medicíny, Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo, 27100 Pavia, Taliansko.
