Kontakt:jerry.he@wecistanche.com

Lin Bai|Gui-ying Shi|Ya‐jun Yang|Wei Chen|Lian‐feng Zhang|Chuan Qin

Cistanche pôsobí proti starnutiu

Abstraktné

Pozadie: Hlavnou črtou je pokles regeneračnej kapacity a homeostázy orgánov v závislosti od časustarnutie. Rehmannia glutinosa a Astragalus membranaceus sa používajú ako tradičné čínske bylinné lieky na posilnenie imunity a predĺženie života. Mechanizmus, ktorým tento bylinný liek spomaľuje starnutie, však nie je známy. V tejto štúdii sme skúmali mechanizmus pôsobenia bylínúčinok proti starnutiu.

Metódy: Myši boli kŕmené stravou suplementovanou R. glutinosa alebo A. membranaceus počas 10 mesiacov; kontrolná skupina bola kŕmená štandardnou stravou. Fenotypy sa hodnotili pomocou systému hodnotenia a analýzy prežitia. Percento senescenčných fenotypov hematopoetických kmeňových buniek (HSC) sa určilo analýzou triedenia buniek aktivovanou fluorescenciou. Funkcia a mechanizmus HSC boli analyzované klonogénnym testom a polymerázovou reťazovou reakciou v reálnom čase.

Výsledky: Theúčinok proti starnutiuR. glutinosa je spôsobená zvýšenou funkciou HSC. Myši kŕmené R. glutinosa vykazovali charakteristiky spomaleniastarnutievrátane zníženej starnutia a zvýšenej miery prežitia. Analýza prietokovou cytometriou ukázala znížený počet buniek Lin–Sca1 plus c‐kit– (LSK), dlhodobých HSC (LT‐ HSC) a krátkodobých HSC (ST‐ HSC) v skupine R. glutinosa. Klonogénne testy in vitro ukázali zvýšenú schopnosť samoobnovy LT‐ HSC zo skupiny R. glutinosa, ako aj udržanie pokoja LSK prostredníctvom upregulovanej expresie p18. Skupina R. glutinosa tiež vykazovala znížené hladiny reaktívnych foriem kyslíka a percento ‐gal plus buniek prostredníctvom downregulácie proteínu p53 a p16 spojeného so starnutím buniek.

Záver: Rehmannia glutinosa pôsobíproti starnutiuúčinky udržiavaním pokoja a znižovaním starnutia HSC.

KĽÚČOVÉ SLOVÁ: anti-aging, hematopoetické kmeňové bunky, pokoj, Rehmannia glutinosa

1|ÚVOD

Starnutie je definované ako časovo závislý funkčný úpadok, ktorý postihuje väčšinu živých organizmov.1 Životnosť organizmov udržujú najmä kmeňové bunky.2 Tkanivovo špecifické kmeňové bunky majú schopnosť samoobnovy a diferencujú sa na rôzne efektorové bunky. 3 Počas procesu starnutia však táto schopnosť samoobnovy klesá, čo nakoniec vedie k akumulácii neopravených, poškodených tkanív v starnúcich organizmoch.4 Strata schopnosti udržiavať rovnováhu medzi pokojom a diferenciáciou v kmeňových/progenitorových bunkách. Kompartment môže mať za následok smrť alebo choroby súvisiace s vekom.2 Nedávne štúdie navyše naznačujú, že omladzovanie kmeňových buniek môže zvrátiť fenotyp starnutia.5,6 V hematopoetickom systéme sú za produkciu krviniek zodpovedné hematopoetické kmeňové bunky (HSC). U starých myší hematopoetický systém vykazuje poškodenie T- a B- lymfoidných buniek a počet myeloidných buniek je zvýšený. Staršie HSC vykazovali zníženú samoobnovovaciu aktivitu a zníženú schopnosť rekonštrukcie hematopoézy. Predovšetkým zmeny súvisiace s vekom v kompartmente HSC sa prejavujú u starnúceho hostiteľa ako anémia, zvýšený sklon k myeloproliferatívnym novotvarom, znížená imunitná funkcia a zvýšený výskyt rakoviny.{11}} Mechanizmus starnutia HSC a účinky rastlinných liekov na starnutie HSC nie sú známe.10

Ľudia sa už od staroveku zaoberali oddialením procesu starnutia a zachovaním mladostiproti starnutiuje v súčasnosti stredobodom výskumu. Tradičnej čínskej medicíne sa venuje čoraz väčšia pozornosť pri liečbe rôznych chorôb súvisiacich so starnutím. Mnohé bylinky používané v tradičnej čínskej medicíne sú známe tým, že prostredníctvom rôznych mechanizmov poskytujú pozitívne účinky proti starnutiu. Rehmannia glutinosa a Astragalus membranaceus sa týmto spôsobom široko používajú už tisíce rokov.

Rehmannia glutinosa sa používa na liečbu rôznych diabetických porúch, zvyšuje metabolizmus kostí pri osteoporóze a inhibuje zápal pečene a fibrózu. Okrem toho má táto bylinka aj ďalšie účinky vrátaneproti únave, antidepresívne a neuroprotektívne vlastnosti. V posledných rokoch sa farmakologické štúdie o R. glutinosa a jeho aktívnych zložkách zamerali hlavne na jeho široké pôsobenie na krv, endokrinný, kardiovaskulárny a nervový systém.11-14 Ukázalo sa teda, že R. glutinosa má silnú imunitu. ‐posilňovacia činnosť, ktorá poskytla teoretický základ pre ďalšie štúdie.

Astragalus membranaceus má tonické, hepatoprotektívne, diuretické a expektoračné vlastnosti15 a ukázalo sa, že vykazuje imunomodulačné,16protizápalové,aantioxidantÚčinky.17 Objasnenie molekulárnych mechanizmov, ktoré sú základom účinkov tradičnej čínskej medicíny v klinickej praxi, je kľúčovým krokom k ich celosvetovej aplikácii a táto téma je v súčasnosti predmetom intenzívneho výskumu.

V tejto štúdii sme teda kŕmili myši stravou doplnenou o R. glutinosa a A. membranaceus počas 10 mesiacov, aby sme preskúmali mechanizmus, ktorý je základom schopnosti R. glutinosa zvýšiť dlhovekosť.

2|MATERIÁLY A METÓDY

2,1|Zoskupovanie zvierat a liečba

Samice myší C57BL/6J boli udržiavané v prostredí bez patogénov a kŕmené štandardnou stravou. Použitie zvierat v tejto štúdii bolo schválené Výbormi pre starostlivosť o zvieratá a ich používanie Inštitútu vedy o laboratórnych zvieratách na Peking Union Medical College. Myši (vo veku 10 mesiacov) boli náhodne rozdelené do troch skupín (n=20/skupina). Kontrolná skupina bola kŕmená štandardnou stravou (Beijing HFK Biosicence, Peking, Čína). Strava ďalších dvoch skupín bola doplnená o mletú R. glutinosa a A. membranaceus (Beijing Tong Ren Tang Chinese Medicine, Peking, Čína) v dávke 200 mg/d počas 10 mesiacov. Táto dávka sa vybrala pomocou metódy normalizácie plochy povrchu tela na potvrdenie dávok liečiva zo štúdií na ľuďoch po štúdie na myšiach. Telesná hmotnosť sa určovala každé 2 mesiace a prežívanie sa zaznamenávalo denne.

2,2|Hodnotenie stupňa starnutia

Na vyhodnotenie stupňa starnutia podľa kritérií definovaných Takedom et al.18 bol prijatý systém klasifikácie skóre. Každá kategória uvedená v protokole bola vybraná z klinických príznakov spojených s procesom starnutia. Každá myš bola hodnotená vo veku 18 mesiacov a skóre v každej kategórii bolo sčítané, aby sa určilo celkové skóre.

2,3|Prietoková cytometria

Bunky sa odobrali z týmusu, sleziny, periférnej krvi (PB) a kostnej drene (BM). Slezina a týmus boli okamžite vyrezané, premyté fyziologickým roztokom a odvážené. Sleziny a týmusy boli jemne homogenizované v sklenenom homogenizátore a bunky boli suspendované v sterilnom fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS). Bunky z PB sa aplikovali na lýzu krvných červených krviniek (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Bunky z BM boli izolované prepláchnutím holennej kosti a stehennej kosti sterilným PBS. Všetky bunky sa izolovali filtráciou cez sterilnú nylonovú sieťku a farbili sa 30 minút pri 4 stupňoch s nasledujúcimi protilátkami konjugovanými s fluorofórom: anti-CD3 konjugovaný s fykoerytrínom (PE) (G4.18), anti-konjugovaný s alofykokyanínom (APC) - CD4 (OX35) a PE-Cy7-konjugovaný anti-CD8a (OX8). Pre bunky BM boli markery línie zafarbené pomocou biotín-konjugovaných anti-myších CD4 (RM4-5), CD5 (53-7.3), CD8a (53-6.7), CD11b (M1/70), B220 (RA3-6B2), TER119 (TER‐ 119) a Gr1 (RB6‐8C5), po ktorých nasledovalo farbenie s protilátkou APC‐eFluor 780- konjugovaný streptavidín bol tiež získaný od eBioscience (San Diego, CA, USA). Na farbenie povrchu boli použité tieto protilátky: APC imunoglobulín (Ig)M (II/41), fluoresceín izotiokyanát (FITC) IgD (11‐26), PE‐Cy7 Sca‐ 1 (D7), PE Flt3 ( A2F10), FITC B220 (RA3‐6B2), FITC CD34 (RAM34), PerCP‐Cy5.5 CD127 (A7R34), PE CD16/CD32 (93) a PerCP‐Cy5.5 CD3e (145‐2C11). Všetky protilátky boli získané od eBiosciences (San Diego, CA, USA). Údaje boli získané pomocou FACS

Aria II (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) a analyzované pomocou softvéru FlowJo (Three Star, Ashland, OR, USA).

2,4|Analýza bunkového cyklu

Na analýzu bunkového cyklu boli celkové bunky BM zafarbené na povrchové markery kmeňových buniek (Lin–Sca‐ 1 plus c‐ KitHigh; LSTKs), potom fixované a permeabilizované (00‐5123‐43; Becton Dickinson ) pred farbením pomocou FITC Ki‐

67 protilátka a 7‐aminoaktinomycín D (7‐AAD). Získavanie údajov sa uskutočnilo na FACS Aria II (Becton Dickinson). Dáta boli analyzované pomocou softvéru FlowJo.

2,5|Farbenie gal spojené so starnutím

Aktivita spojená so starnutím (SA)‐gal bola tiež testovaná prietokovou cytometriou s použitím C12FDG, ako je opísané výrobcom (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Stručne, kmeňové bunky sa najskôr zafarbili na markery bunkového povrchu a potom sa inkubovali so 100 nmol L-1 bafilomycínu A1 počas 1 hodiny pri 37 stupňoch, aby sa vyvolala lyzozomálna alkalizácia. Po premytí PBS sa bunky inkubovali s 2 mmol L-1 C12FDG počas 1-2 hodín pri 37 stupňoch a potom sa analyzovali pomocou FACS Aria I (Becton Dickinson).

2,6|Stanovenie produkcie reaktívnych foriem kyslíka (ROS).

Bunky boli inkubované s dichlór-dihydro-fluoresceín diacetátom (DCFH-DA; Beyotime, Shanghai, Čína) pri 37 stupňoch počas 20 minút. DCFH‐ DA pasívne difunduje do buniek, kde je deacetylovaný esterázami za vzniku nefluorescenčného 2′,7′‐dichlórfluoresceínu (DCFH). Množstvo emitovanej fluorescencie koreluje s množstvom ROS v bunke. Dáta sa získali na FACS Aria I (Becton Dickinson) a analyzovali sa pomocou softvéru FlowJo.

2,7|Analýza polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) v reálnom čase

Celková RNA sa extrahovala z buniek pomocou činidla TRIzol (Invitrogen, San Diego, CA, USA) podľa pokynov výrobcu. Požadované gény boli amplifikované z celkových RNA ošetrených DNázou I pomocou M-MLV reverznej transkriptázy (Promega, Madison, WI, USA)

a poly‐dT priméry. Priméry použité pre PCR boli nasledovné: p21 (5′‐TCCAGACATTCAGAGCCACA‐3′ a 5′‐CGAAGAGACAACGG-CACACT‐3′, Tm=60 stupeň, 30 cyklov), p53 (5′ACCG-GACCGATCGATC 3′ a 5′′‐TCCCGGAACATCTCGAGGC‐3′, Tm=62 stupeň, 35 cyklov), p16 (5′‐CGAACTCTTTCGGTCGTACCC‐3′ a 5‐′′TCCC‐3′ a 5‐′TCCC1}m GTAGTTG3CCACA{2}m, GTAGTTG3CCACA cykly), p57 (5′‐ AGGAGCAGGACGAGAATCAA‐3′ a 5′‐ TTCTCCTGCGCAGTTCTC TT‐3′, Tm=61 stupeň, 30 cyklov), p19 (5‐′′TCTAG′TCTAG′TTGCT3GTC5 a 5′‐ CATGTTGTTGTC5 ′, Tm=61 stupeň, 35 cyklov), p18 (5′‐GGGACCTAGAGCAACTTACT‐3′ a 5′‐TGACAGCAAAAC-CAGTTCCA‐3′, Tm=61 stupeň, 30 cyklov glyceraldehydu), 30 cyklov dehydrogenáza (5′‐GAGCGAGACCCCACTAACAT‐3′ a 5′‐TTCACACCCATCACAAACAT‐3′, Tm=60 stupeň, 25 cyklov). Real-time (RT)-PCR sa uskutočnila pomocou SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa Shuzo, Kyoto, Japonsko) na detekčnom systéme ABI StepOne™ (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

2,8|Klonogénne testy

Dlhodobé (LT)‐ HSC boli triedené fluorescenčne aktivovaným triedením buniek (FACS) a potom kultivované na 96-jamkových doštičkách s bunkami s použitím média na báze metylcelulózy (HSC007; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). . Pre každú vzorku sa pripravilo desať duplikátov. Použili sme 96-jamkovú doštičku na kultiváciu buniek, tri bunky na jamku. Dva týždne po nanesení sa počet a veľkosť kolónií spočítala pod mikroskopom.

2,9|Štatistická analýza

Údaje boli analyzované jednosmernou ANOVA pomocou softvéru Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA) a GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Údaje boli prezentované ako priemer ± SD. P < 0.05="" sa="" považovalo="" za="" ukazovateľ="" štatistickej="">

3|VÝSLEDKY

3.1|R. glutinosa a A. membranaceus vykazovali účinky proti starnutiu

Na potvrdenieúčinky proti starnutiuz R. glutinosa a A. membranaceus sme skúmali účinky podávania ako doplnok stravy (200 mg/d). Následne sme zaznamenali telesnú hmotnosť, stupeň starnutia a mieru prežitia myší. Telesná hmotnosť myší kŕmených R. glutinosa alebo A. membranaceus bola normálna v porovnaní s myšami v kontrolnej skupine, hoci došlo k zníženiu telesnej hmotnosti v skupine R. glutinosa a A. membranaceus po 20 mesiacoch (obrázok 1A). Analýza stupňa starnutia odhalila stabilný a nezvratný nárast skóre s postupujúcim vekom v skupinách R. glutinosa a A. membranaceus v porovnaní s kontrolnou skupinou, hoci zvýšenie bolo výraznejšie v A. membranaceus. skupina (obrázok 1B). Vysoké skóre bolo spôsobené skorším nástupom straty pasivity a reaktivity, stratou lesku kože a zvýšenou hrubosťou, vypadávaním vlasov, perioftalmickými léziami, zvýšenou lordokyfózou chrbtice a výraznejším zvýšením ich závažnosti.18 Myši v A Skupina myší membranaceus vykazovala výraznejšie fenotypové charakteristiky starnutia, vrátane straty lesku kože a vypadávania vlasov. Krivky prežitia ukázali, že dĺžka života myší v skupinách R. glutinosa a A. membranaceus bola o niečo dlhšia ako v kontrolnej skupine (obrázok 1C). Tieto údaje potvrdiliúčinky proti starnutiuR. glutinosa aj A. membranaceus, hoci sa zistilo, že R. glutinosa je účinnejšia pri spomaľovaní procesu starnutia.

OBRÁZOK 1 Rehmannia glutinosa a Astragalus membranaceus maliúčinky proti starnutiu. Myši boli kŕmené potravou doplnenou o mletú R. glutinosa alebo A. membranaceus (200 mg/d); kontrolná skupina bola kŕmená štandardnou stravou. A, Zmeny telesnej hmotnosti myší merané každé 2 mesiace. B, Zmeny v skóre starnutia myší s vekom. C, Krivky prežitia. Údaje predstavujú priemer ± SD; n=20 myší/skupina. Údaje predstavujú priemer ± SD; n=5 myší/skupina.*P < 0,05,="" ***p=""><>

3,2|R. glutinosa znížila počet krvotvorných kmeňových buniek

Vyčerpanie kmeňových buniek sa považuje za integračný dôsledok viacerých typov poškodenia súvisiaceho so starnutím a za jednu z hlavných príčin starnutia tkanív a organizmu.1 Nedávne štúdie naznačujú, že omladenie kmeňových buniek môže zvrátiť fenotyp starnutia na úrovni organizmu.5 predpokladal, žeúčinky proti starnutiuR. glutinosa sú sprostredkované zvýšením funkcie kmeňových buniek. Preto sme vykonali prietokovú cytometrickú analýzu počtu hematopoetických kmeňových/progenitorových buniek izolovaných z myší (vo veku 20 mesiacov) kŕmených stravou doplnenou R. glutinosa alebo A. membranaceus (200 mg/d) počas 10 mesiacov (obrázok 2A). . Percento LSK bolo znížené v skupinách R. glutinosa a A. membranaceus (obrázok 2B). Počty LT‐ a krátkodobých (ST)‐ HSC boli znížené približne dvojnásobne v skupine R. glutinosa v porovnaní s počtom v kontrolnej skupine (obrázok 2C‐ D). V skupine s R. glutinosa bol detegovaný väčší počet bežných lymfoidných progenitorov (CLP) v porovnaní s počtom v kontrolnej skupine (obrázok 2I). V počte multipotentných progenitorov (MPP), bežných myeloidných progenitorov (CMP), progenitorov granulocytov-makrofágov (GMP) a megakaryocytovo-erytroidných progenitorov (MEPs) v skupine R. glutinosa neboli žiadne rozdiely v porovnaní s počtom v skupine kontrolná skupina. V skupine A. membranaceus nebol žiadny významný rozdiel v počtoch LT‐ a ST‐ HSC v porovnaní s počtom v kontrolnej skupine (obrázok 2C‐ D). Okrem toho nebol žiadny rozdiel v počtoch buniek MPP, CMP, MEP a CLP v porovnaní s počtom v kontrolnej skupine (obrázok 2E, 2F, 2H a 2I); počet GMP sa však znížil v skupine A. membranaceus. Takže myši kŕmené potravou doplnenou o R. glutinosa vykazovali znížený počet hematopoetických kmeňových a progenitorových buniek.

3,3|R. glutinosa posilnila funkciu a udržala pokojový stav HSC

Na vyhodnotenie funkcie HSC bol skúmaný klonogénny potenciál LT‐ HSC in vitro. Bunky LT‐ HSCs sme triedili do média na báze metylcelulózy pomocou FACS a po 14 dňoch sme spočítali počet a veľkosť kolónií. V porovnaní s počtom a veľkosťou kolónií produkovaných bunkami z myší v kontrolnej skupine vykazovali bunky z myší v skupine R. glutinosa zvýšenie počtu kolónií, najmä pre malú veľkosť (P=0.0241 ) a klon veľkej veľkosti (P ​​= 0.0418), zatiaľ čo v počte myší v skupine A. membranaceus nebol žiadny rozdiel (obrázok 3). Zvýšená veľkosť a počet kolónií v skupine R. glutinosa naznačuje, že táto bylina zvyšuje potenciál sebaobnovy LT‐ HSC.

Väčšina HSC u dospelých myší zostáva v kľude;19 preto je udržiavanie bunkového pokoja základným mechanizmom pre samoobnovu kmeňových buniek.20,21 Pozorované poklesy HSC naznačujú zníženú proliferáciu buniek v R. glutinosa a skupiny A. membranaceus; preto sme skúmali stav bunkového cyklu HSC prostredníctvom analýzy proliferatívneho bunkového markera Ki‐67 v kombinácii so stanovením obsahu DNA 7‐AAD v populácii LSK. Pozorovali sme zvýšený počet buniek LSK vo fáze GO v skupinách R. glutinosa a A. membranaceus v porovnaní s kontrolnou skupinou (obrázok 4A). Tieto výsledky ukázali, že R. glutinosa a A. membranaceus si zachovali pokojový stav HSC.

PCR analýza regulátorov bunkového cyklu v bunkách LSK v reálnom čase odhalila, že p18, p19 a p57 zohrávali rozhodujúcu úlohu pri udržiavaní pokoja HSC.{4}} Pri p57 a p19 neboli pozorované žiadne zjavné zmeny (obrázok 4C‐ D) a p18 bol upregulovaný v skupine R. glutinosa v porovnaní s kontrolnou skupinou a mierne upregulovaný v skupine A. membranaceus (obrázok 4B).

OBRÁZOK 2 Rehmannia glutinosa a Astragalus membranaceus ovplyvnili počet hematopoetických kmeňových/progenitorových buniek. Myši (staré

20 mesiace) boli kŕmení potravou doplnenou o R. glutinosa alebo A. membranaceus (200 mg/d) počas 10 mesiacov (n=5/skupina); kontrolná skupina bola kŕmená štandardnou stravou. Čerstvo izolované bunky kostnej drene (BM) boli zafarbené uvedenými protilátkami a analyzované prietokovou cytometriou. A, Reprezentatívne profily farbenia populácií hematopoetických kmeňových buniek a progenitorových buniek BM. B, Percento buniek Lin–Sca1 plus c-kit– buniek (LSK) v bunkách BM. C‐ I, Počet buniek (C) dlhodobého (LT; Lin–, Sca‐ 1 plus, c‐ Kit, CD34 plus – , Flt3–); D, krátkodobé (ST; Lin–, Sca‐ 1 plus, c‐ Kit, CD34 plus plus, Flt3–); E, multipotentný progenitor (MPP; Lin–, Sca‐ 1 plus, c‐ Kit plus, Flt3 plus); F, spoločný myeloidný progenitor (CMP; Lin– ​​, Sca‐ 1– , c‐ Kit–, CD34 plus , CD16/ CD32–); G, progenitor granulocytov‐makrofág (GMP; Lin– ​​, Sca‐ 1– , c‐ Kit–, CD34 plus , CD16/CD32 plus ); H, megakaryocyt‐erytroidný progenitor (MEP; Lin–, Sca‐ 1–, c‐ Kit–, CD34–, CD16/CD32–); a ja, spoločný lymfoidný progenitor (CLP; Lin–, Sca‐ 1low, c‐ Kitlow, CD127 plus). Údaje predstavujú priemer ± SD; n=5 myší/skupina. *P < 0,05,="" **p=""><>

3,4|R. glutinosa oneskorila starnutie HSC

Dlhodobé dopĺňanie stravy s R. glutinosa môže predĺžiť životnosť myší. Starnutie buniek sa zvyšuje s vekom; preto sme skúmali starnutie HSC u starnúcich myší prietokovou cytometrickou analýzou HSC zafarbených SA‐ ‐gal s použitím fluorescenčného substrátu ‐gal (C12FDG).25 Percento SA‐‐gal‐pozitívnych buniek bolo znížené v skupina R. glutinosa, čo naznačuje, že R. glutinosa oneskoruje starnutie buniek LSK (obrázok 5A).

Reaktívne formy kyslíka hrajú hlavnú úlohu v starnutí HSC a strata pokoja HSC často koreluje so zvýšeným bunkovým ROS.26 Analýza intracelulárneho ROS v LSK ukázala, že hladiny boli znížené v skupine R. glutinosa v porovnaní s hladinami v kontrolnej skupine. skupina (obrázok 5B). Tieto údaje naznačujú, že R. glutinosa môže udržiavať pokojový stav HSC a zvyšovať funkciu HSC znížením hladín ROS.

Potom sme skúmali expresiu niekoľkých génov zapojených do starnutia buniek pomocou RT-PCR analýzy buniek LSK. Porovnané

OBRÁZOK 3 Funkcia hematopoetických kmeňových buniek posilnená suplementáciou stravy Rehmannia glutinosa. In vitro klonogénny potenciál dlhodobých pečeňových hviezdicových buniek z myší (n=3)

s kontrolnou skupinou bola expresia proteínov spojených so starnutím buniek p53 a p16 znížená v skupine R. glutinosa (obrázok 5D‐E). Ale expresia p53 a p16 nebola významne znížená medzi skupinou A. membranaceus a kontrolnou skupinou (obrázok 5D‐E). Celkovo tieto údaje ukazujú, že niekoľko kľúčových génov súvisiacich s bunkovým cyklom a starnutím buniek reguluje funkciu HSC u myší kŕmených stravou doplnenou o R. glutinosa.

3,5|R. glutinosa zvyšuje imunitu B-buniek

B a T lymfocyty sú dôležité pre imunologické odpovede. T lymfocyty hrajú rozhodujúcu úlohu v bunkovej imunite a jej regulácii, zatiaľ čo B lymfocyty sa podieľajú hlavne na humorálnej imunite. Proliferácia lymfocytov je najbezprostrednejší index odrážajúci organickú imunitu. Aby sa preskúmala úloha pri imunologickom posilnení, skúmali sa účinky R. glutinosa a A. membranaceus na proliferáciu lymfocytov.

Myši v skupine R. glutinosa vykazovali znížený počet HSC a zvýšený počet CLP. Analýza prietokovou cytometriou ukázala zvýšený počet zrelých B buniek (B220 plus) v PB, BM a slezine myší v skupine R. glutinosa v porovnaní s počtom zisteným v kontrolnej skupine (obrázok 6A); medzi týmito dvoma skupinami však neboli žiadne významné rozdiely v počte T buniek (CD4 plus a CD8 plus), monocytov a granulocytov (CD11b plus) (obrázok 6B‐D). Tieto výsledky teda naznačujú, že diéta R. glutinosa zvyšuje imunitu B-buniek.

OBRÁZOK 4 Výživové doplnky Rehmannia glutinosa a Astragalus membranaceus udržiavali pokojový stav hematopoetických kmeňových buniek. A, Percento buniek v každej fáze bunkového cyklu. Prietoková cytometrická analýza 7‐aminoaktinomycínu D (7‐AAD) a Ki‐67 farbenia Lin–Sca1 plus c‐kit– buniek (LSK). B, Analýza polymerázovej reťazovej reakcie v reálnom čase expresie triedených génov buniek LSK; Na normalizáciu sa použil GAPDH. Údaje predstavujú priemer ± SD z troch experimentov. *P < 0.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p=""><>

OBRÁZOK 5 Diétna suplementácia Rehmannia glutinosa znížila starnutie pečeňových hviezdicových buniek (HSC). Myši (vo veku 20 mesiacov) boli kŕmené potravou doplnenou o Rehmannia glutinosa alebo Astragalus membranaceus (200 mg/d) počas 10 mesiacov (n {{4 }}/skupina); kontrolná skupina bola kŕmená štandardnou stravou. A, Prietoková cytometrická analýza SA‐‐gal‐pozitívnych buniek Lin–Sca1 plus c‐kit– (LSK) s použitím fluorescenčného ‐galaktozidázového substrátu (C12FDG). B, Percento buniek pozitívnych na reaktívne formy kyslíka (ROS) v LSK. Prietoková cytometrická analýza ROS-pozitívnych LSK. Údaje predstavujú priemer ± štandardná odchýlka (SD). *P < 0,05,="" ***p="">< 0,001.="" c,="" vzor="" expresie="" génov="" spojených="" so="" starnutím="" buniek="" v="" lsk;="" na="" normalizáciu="" sa="" použil="" gapdh.="" údaje="" predstavujú="" priemer="" ±="" sd="" z="" troch="" experimentov.="" *p="">< 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p=""><>

4|DISKUSIA

V tejto štúdii sme skúmali mechanizmus vznikuúčinky proti starnutiuR. glutinosa alebo A. membranaceus doplnením potravy myší o bylinky v dávke 200 mg/d počas 10 mesiacov. Zistilo sa, že R. glutinosa vykazuje účinky proti starnutiu, vrátane zníženej starnutia a zvýšeného prežitia HSC, ako aj

zvýšená imunita B-buniek. Z hľadiska mechanizmuúčinky proti starnutiuzistili sme, že R. glutinosa znížil počet HSC, zatiaľ čo proliferačná kapacita sa zvýšila. Okrem toho si R. glutinosa udržala pokoj HSC a znížila počet SA‐‐gal‐pozitívnych buniek a hladiny ROS prostredníctvom regulácie p18, p53 a p16. V kombinácii naše výsledky potvrdili, žeúčinky proti starnutiuR. glutinosa u myší sú medikované udržiavaním pokoja a posilňovaním funkcie HSC.

Rehmannia glutinosa, ktorá sa používa ako tradičná čínska bylinná medicína po tisíce rokov, sa môže použiť na liečbu hypoglykémie pri rôznych diabetických poruchách.27,28 Tiež sa uvádza, že extrakt z R. glutinosa zvyšuje metabolizmus kostí.29 Okrem toho, R. glutinosa inhibuje zápalové reakcie a syndrómy30,31 a chráni pred poškodením buniek vychytávaním voľných radikálov.14,32 V tejto štúdii sme zistili, že myšie doplnky stravy s R. glutinosa vyvíjaliúčinky proti starnutiua zvýšená imunita B-buniek zvýšením proliferačnej kapacity LT-HSC a znížením počtu SA‐‐gal‐pozitívnych buniek a hladín ROS.

Zistilo sa, že stupeň oxidačného poškodenia sa zvyšuje s vekom v rôznych bunkách a tkanivách. Oxidačný stres je kritickým determinantom samoobnovy HSC. Strata pokoja LT‐ HSC často koreluje so zvýšenou bunkovou ROS, ktorá je negatívne spojená so samoobnovením HSC.26 Katalpol je iridoidný glukozid, ktorý sa našiel v koreni R. glutinosa. Catalpol v predchádzajúcej štúdii preukázal inhibíciu oxidačného stresu, poškodenia DNA a skrátenia telomér prostredníctvom dráhy PGC‐ 1/TERT.33 V našej štúdii bola hladina ROS znížená v bunkách LSK zo skupiny R. glutinosa v porovnaní s kontrolnou skupinou. R. glutinosa teda predlžuje prežitie myší inhibíciou oxidačného stresu v HSC.

OBRÁZOK 6 Analýza prietokovou cytometriou percenta zrelých imunitných buniek v periférnej krvi (PB), kostnej dreni (BM), slezine a týmuse. Myši (vo veku 20 mesiacov) boli kŕmené stravou suplementovanou Rehmannia glutinosa alebo Astragalus membranaceus (200 mg/d) počas 10 mesiacov (n=5/skupina); kontrolná skupina bola kŕmená štandardnou stravou. A, Prietoková cytometrická analýza percenta B buniek (B220 plus) v PB, BM a slezine. B, Prietoková cytometrická analýza percenta monocytových a granulocytových buniek (CD11b plus) v PB a BM. C a D, Prietoková cytometrická analýza percenta buniek CD4 plus a CD8 plus v PB, slezine a týmusu. Údaje predstavujú priemer ± SD. *P <>

Astragalus membranaceus sa používa aj v tradičnej čínskej medicíne na podporu imunity, zníženie hladiny cukru v krvi a podporu apoptózy nádorových buniek.antioxidáciaaproti starnutiuvlastnosti. V tejto štúdii sme zistili, že suplementácia stravy s A. memranaceus počas 10 mesiacov nemala žiadne zjavné účinky v porovnaní s tými, ktoré boli pozorované u kontrolných myší, zatiaľ čo hmotnosť myší bola znížená po 20 mesiacoch. Preto A. membranaceus môže byť nevhodná na liečbu LT pre kŕmené myši.

Na záver, naše výsledky ukazujú, že R. glutinosa môže predĺžiť životnosť myší udržiavaním pokoja a zlepšením funkcie HSC. Okrem toho môže R. glutinosa znížiť medzibunkové hladiny ROS a počet SA‐‐gal‐pozitívnych buniek a zvýšiť imunitu B‐buniek.

POĎAKOVANIE

Táto štúdia bola čiastočne podporovaná Národnou vedeckou nadáciou pre Čínu (31672374), CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS) (2016-12M-1-012) a PUMC Youth Fund (2017310018).

KONFLIKT ZÁUJMOV

žiadne.

AUTORSKÉ PRÍSPEVKY

Všetci uvedení autori spĺňajú požiadavky na autorstvo. CQ a LFZ koncipovali a navrhli experimenty. LB vykonal experimenty a napísal hlavný rukopisný test. GYS vykonal a analyzoval údaje FACS. YJY navrhla experiment o čínskej tradičnej medicíne. WC spravovalo myši. Všetci autori si prečítali a schválili rukopis.