Renálny ochranný účinok predošetrenia šošovice Beluga na ischemicko-reperfúzne poranenie

Syng-ook Lee,¹ Tak Young Chun,²EunHye Lee,²Bomi Kim,²Bohyun Yoon,² a kol

Pozadie a cieľ. Ischemické/reperfúzne (I/R) poškodenie spôsobené akútobličkyškodyspôsobuje histopatologické zmeny, apoptózu tubulárnych buniek, zápal, oxidáciu a stratu funkcie obličiek. Hodnotili sme ochranné účinky pred I/R poranením beluga lentilkou. Materiály a metódy. Myši boli rozdelené do štyroch skupín: normálne, neošetrené, nízko (2 mg) a vysokodávkové (8 mg) liečené skupiny beluga šošovkou. Šošovica Beluga sa podávala perorálne počas 2 týždňov, potom nasledovala bilaterálna renálna ischémia počas 20 minút a reperfúzia počas 30 minút. Vzorky krvi aobličkytkanivá sa odobrali a analyzovali, aby sa preskúmala funkcia obličiek, histopatológia, epiteliálne a endotelové bunkyškodyapoptóza, oxidačný stres a zápalové reakcie. Výsledky. Vopred liečené skupiny si zachovali funkciu obličiek s výrazne nižšími hladinami močovinového dusíka v krvi (BUN) a kreatinínu v porovnaní s ostatnými skupinami. Histopatologická analýza ukázala znížené poškodenie proximálneho tubulu a zníženú molekulu súvisiacu s poranením (obličkyporanenia molekula 1 (KIM-1) a sekrécia lipokalínu asociovaného s neutrofilnou gelatinázou (NGAL) u vopred ošetrených skupín v porovnaní s ostatnými skupinami. Terminálna deoxynukleotidyltransferáza dUTP-pozitívne bunky na značenie nick-end (TUNEL-) a sekrécia molekúl súvisiacich s apoptózou (Fas a kaspáza 3) boli v predliečených skupinách v porovnaní s ostatnými skupinami významne znížené. Vopred ošetrené skupiny vykazovali pozitívnu expresiu génu asociovaného s mikrocievami (zhluk diferenciácie (CD31)) a expresiu negatívnej adhéznej molekuly (intracelulárna adhézna molekula 1 (ICAM-1)). V skupinách pred liečbou sa pozoroval antioxidačný účinok so zníženou expresiou malónaldehydu (MDA) a zvýšenou sekréciou antioxidačného enzýmu (superoxiddismutáza (SOD), kataláza (CAT), glutatión (GSH) a glutatiónperoxidáza (GPx)). V predliečených skupinách boli F4/80 plus makrofágy a infiltrácia CD4 plus T buniek inhibované a hladiny prozápalových cytokínov (interleukín- (IL-) 1, IL-6 a tumor nekrotizujúci faktor- (TNF-)) sa znížili; avšak hladiny protizápalových cytokínov (transformujúci rastový faktor- (TGF-), IL-10 a IL-22) sa zvýšili. Závery. Predbežná úprava šošovice Beluga preukázala ochranné účinky proti poškodeniu obličiek vyvolanému I/R prostredníctvom antiapoptotických, protizápalových a antioxidačných aktivít.

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

cistanche propiedadesdeserticola zabraňujeobličkychoroba, kliknite sem a získajte vzorku

1. Úvod

Ischemické/reperfúzne (I/R) poškodenie počas parciálnej nefrektómie alebo transplantácie obličky spôsobuje akútneobličkovéporanenie [1, 2] a môže viesť k ireverzibilnému zhoršeniu funkcie obličiek [3]. Ischémia spúšťa apoptózu v renálnych tubulárnych epiteliálnych bunkách, čo zosilňuje zápalové reakcie intersticiálnych buniek. Reperfúzia indukuje mikrovaskulárne poškodenie, ktoré podporuje migráciu zápalových buniek prostredníctvom expresie adhézneho faktora na povrchu endotelových buniek [4– 8]. Poškodenie I/R tiež spôsobuje oxidačný stres, zvyšuje reaktívne formy kyslíka (ROS) a znižuje aktivitu antioxidačných enzýmov [9], čo vedie k zvýšenej produkcii prozápalových faktorov [10], aktivácii kaspázovej dráhy a zvýšenej apoptotickej bunkovej smrti, ktorá prípadne spôsobiť stratu funkcie obličiek [11]. Na prevenciu I/R-indukovaného poškodenia obličiek bolo navrhnuté použitie antioxidačných činidiel s protizápalovými a antiapoptotickými funkciami [10–14].

Kultivary šošovice (zelená, červená, francúzska alebo beluga) obsahujú rôzne bioaktívne zlúčeniny, najmä antioxidanty [15]. Ich celkový obsah polyfenolov a flavonoidov sa pohybuje od 27,30 – 30,30 mg (ekvivalenty kyseliny trieslovej)/g po 13,14 – 16,29 mg (ekvivalenty kvercetínu)/g [16]. Ukázalo sa, že šošovica Beluga má výrazne vysoký obsah polyfenolov a účinky zachytávania ROS [16]. Náš tím informoval o antioxidačných účinkoch šošovice pomocou in vitro experimentu s pečeňovými bunkami [16]. Šošovica Beluga preukázala významné ochranné účinky proti alkoholom indukovanej cytotoxicite v bunkách AML{13}} v porovnaní s inými kultivarmi šošovice. Protizápalové účinky šošovice beluga boli tiež pozorované v bunkách RAW264.7 ošetrených lipopolysacharidom [17]. Liečba šošovicou Beluga významne znížila produkciu oxidu dusnatého (NO) a indukovateľnú expresiu NO syntázy (iNOS) prostredníctvom zvýšenia regulácie hemu sprostredkovaného jadrovým faktorom E2-faktorom 2- (Nrf{21}}) oxygenázová-1 (HO-1) dráha. Tieto in vitro experimenty naznačili antioxidačné a protizápalové účinky šošovice beluga.

Aby sme rozšírili aplikácie šošoviek beluga, aplikovali sme ich na myšací model I/R poranenia obličiek a vyhodnotili sme renálne ochranné účinky. Pre tento experiment sa šošovica beluga podávala počas 2 týždňov ako predbežná liečba, po ktorej nasledovala ischémia počas 20 minút a reperfúzia počas 30 minút. Renálne ochranné účinky predošetrenia beluga šošovkou boli overené analýzou renálnej funkcie, histopatológie, poškodenia epitelových a endotelových buniek, apoptózy, oxidačného stresu a zápalových reakcií. Predpokladali sme, že predbežné ošetrenie šošovicou beluga zabráni I/R-indukovanému poškodeniu obličiek prostredníctvom antioxidačných, protizápalových a antiapoptotických aktivít.

2. Materiály a metódy

2.1. Skupiny zvierat a podmienky liečby.

Všetky postupy sa uskutočňovali pomocou zvieracieho protokolu, ktorý bol schválený Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť o zvieratá a používanie zvierat na univerzite Yeungnam (AEC2019-003). Myši (ICR, 8 týždňov staré, samce, 23–25 g, Orient, Seongnam, Kórea) boli náhodne rozdelené do nasledujúcich 4 skupín (n =7 na skupinu): (1) Normálna, normálna kontrolná skupina; (2) Neošetrená skupina liečená fyziologickým roztokom; (3) Nízka, nízka dávka (2 mg/100 μl fyziologického roztoku/myš BioMed Research International), 14-denná perorálne podávaná skupina so šošovicou beluga pred liečbou; a (4) vysoká, vysoká dávka (8 mg/100 μl fyziologického roztoku/myš), 14-deň perorálne podávaná beluga šošovica, skupina pred liečbou. Šošovicu Beluga poskytol prof. Syng-Ook Lee (Keimyung University, Daegu, Kórea) a príprava extraktu a analýza bioaktívnych zlúčenín boli uvedené v predchádzajúcej štúdii [16]. Po ošetrení boli zvieratá umiestnené do polohy na bruchu v anestézii a bol im urobený dorzálny rez [1]. Renálna artéria a žily pre obe obličky boli uzavreté cievnou svorkou na 20 minút, po čom nasledovala reperfúzia na 30 minút, podľa predtým opísaného protokolu [18, 19]. Krv bola odobratá srdcovou punkciou a boli extrahované obličky. Obličky sa premyli fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom; jedna oblička sa použila na extrakciu RNA a proteínu, zatiaľ čo druhá oblička sa použila na histologickú analýzu.

2.2. Histopatologické a imunohistochemické (IHC) analýzy.

Histopatologické vyšetrenia sa uskutočňovali pomocou farbenia hematoxylínom a eozínom (H&E) a poranenia sa hodnotili na základe nasledujúcich faktorov: prítomnosť buniek tubulov spadajúcich do lúmenu, strata jadra v exfoliovaných bunkách, luminálny odpad, zrútený luminálny priestor a infiltrácia imunitných buniek . Skóre bolo dosiahnuté patologickým špecialistom: skóre 0, žiadne tubulárne poranenie; skóre 1,<10% of="" tubules="" injured;="" score="" 2,="" 10–25%="" of="" tubules="" injured;="" score="" 3,="" 25–50%="" of="" tubules="" injured;="" score="" 4,="" 50–74%="" of="" tubules="" injured;="" and="" score="" 5,="">75 percent tubulov je zranených. Na analýzu IHC bola oblička fixovaná 4 percentami paraformaldehydu a vzorky zaliate do parafnu boli narezané na 5 μm rezy. Vykonalo sa farbenie H&E a IHC podľa rutinných procesov. Na rezy sa aplikovali primárne protilátky proti markerom imunitných buniek (F4/80 a klaster diferenciácie 8 (CD8), Abcam, Cambridge, UK) a endotelových buniek (CD31 a intracelulárna adhézna molekula 1 (ICAM-1), Abcam). 24 hodín pri 4 stupňoch (riedenie 1:200), potom sekundárna protilátka (Alexa Fluor 594, Life Technology, Waltham, MA, USA) na 1 hodinu pri izbovej teplote a 4′,6-diamidino{ {19}}fenylindol (DAPI) sa použil na farbenie jadier.

2.3. Proteínový test.

Na analýzu funkcie obličiek sa sérum oddelilo bez antikoagulantu a koncentrácie sérového kreatinínu a dusíka močoviny v krvi (BUN) sa detegovali pomocou súpravy na kolorimetrický test kreatinínu a súpravy na testovanie Quanti-Chrom Urea (BioAssay Systems LLC, Hayward, CA, USA ), resp. Na vyhodnotenie poškodenia obličkových tubulov/ciev, oxidačného stresu, antioxidačných enzýmov a apoptózy sa tkanivo obličiek homogenizovalo s každým príslušným pufrom. Na analýzu poškodenia epitelových buniek obličkových tubulov boli hodnotené koncentrácie molekuly poškodenia obličiek-1 (KIM-1) a neutrofilného lipokalínu spojeného s gelatinázou (NGAL) pomocou enzýmového imunosorbentového testu (ELISA) (USCN Life Science Inc ., Wuhan, Čína). Na analýzu apoptózy sa merali koncentrácie Fas a kaspázy 3 s použitím príslušných súprav ELISA (Abcam). Na vyhodnotenie oxidačného stresu sa merali hladiny malónaldehydu (MDA) pomocou testovacej súpravy MDA (Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute, Nanjing, Čína). Antioxidačné enzýmy, vrátane superoxiddismutázy (SOD), katalázy (CAT), glutatiónu (GSH) a glutatiónperoxidázy (GPx), sa merali pomocou súpravy na stanovenie celkovej SOD (Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute), súpravy na analýzu CAT ( Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute), súpravu fluorometrického testu GSH a súpravu testu GPx (BioVision Inc.). Všetky súpravy boli použité podľa pokynov výrobcu.

2.4. Analýza génovej expresie.

Celková RNA sa extrahovala pomocou činidla TRIzol a cDNA sa syntetizovala z 20 ug celkovej RNA pomocou súpravy na syntézu cDNA (Invitrogen, Waltham, MA, USA). Podmienky PCR v reálnom čase boli nasledovné: 95 stupňov počas 10 minút, po ktorých nasledovalo 40 cyklov 95 stupňov počas 10 sekúnd, 60 stupňov počas 50 sekúnd a 72 stupňov počas 20 sekúnd. Génová amplifikácia sa detegovala pomocou SYBR green a na analýzu expresie sa použila metóda 2-ΔACt. Experimenty sa uskutočnili trojmo s použitím nasledujúcich sekvencií primérov: interleukín- (IL-)1, 5'-gcccatcctctgagactcat{17}}' a 5'-aggccacagg- tattttgtcg-3′; IL-6, 5′-agttgccttcttgggactga-3′ a 5′ -tccacgatttcccagagaac-3′; tumor nekrotizujúci faktor- (TNF-), 5'-agcccccagtctgtatcctt-3′ a 5′-ctccctttgcagaactcagg-3′; transformujúci rastový faktor- (TGF-), 5'-tggttgtagaggg- caaggac-3′ a 5′-ttgcttcagctccacagaga-3′; IL-10, 5′ -acctggtagaagtgatgccc-3′ a 5′-agggtcttcagcttctcacc-3′; IL- 22, 5′-tccaacttccagcagccata-3′ a 5′-tagcactgactcctcggaac- 3′; a glyceraldehyd 3'-fosfátdehydrogenáza (GAPDH), 5'-tgtgtccgtcgtggatctga-3′ a 5′-cctgcttcacc- caccttcttga-3′.

2.5. TUNEL test.

Na vyhodnotenie apoptózy sa uskutočnil test značenia dUTP sprostredkovaného TdT (TUNEL) pomocou súpravy na detekciu apoptózy (Chemicon, Bedford, MA, USA) podľa pokynov výrobcu. Stručne, deparafinizované a rehydratované sklíčka boli štiepené 2 0 ug/ml proteinázy K pri 37 stupňoch počas 15 hodín, aby sa odstránili proteíny, a ošetrené 3,0 percentami peroxidu vodíka, aby sa uhasila endogénna peroxidáza. Sklíčka sa ponorili do 1x TdT ekvilibračného pufra a pridala sa pracovná sila enzýmu TdT na 1 hodinu pri 37 °C. Konjugát anti-digoxigenínu bol aplikovaný na 3'-OH DNA koniec počas 30 minút a farba bola vyvolaná pomocou peroxidázového substrátu počas 3 minút. Po ošetrení DAPI boli sklíčka namontované. TUNEL-pozitívne jadrá sa spočítali vo všetkých zorných poliach v každej vzorke tkaniva pri 200-násobnom zväčšení.

2.6. Štatistická analýza.

Všetky hodnoty sú vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka. Významné rozdiely v skupine s I/R poškodením obličiek a v skupine s beluga lentil-I/R pred liečbou boli vyhodnotené pomocou analýzy rozptylu, po ktorej nasledoval Tukeyho post hoc test v SPSS (Statistical Package for the Social Sciences v. 9). 2}}, Chicago, IL, USA). hodnoty p < 0,05="" sa="" považovali="" za="">

výhody cistanche salsa

3. Výsledky

3.1. Účinky predbežného ošetrenia šošovice Beluga na funkciu obličiek.

Obe vopred ošetrené skupiny vykazovali významné ochranné účinky proti I/R poraneniu (obrázok 1). Priemerné koncentrácie BUN a sérového kreatinínu v neliečenej skupine boli 89 :92 ± 7:29 mg/dl a 0:48 ± 0:16 mg/dl, v uvedenom poradí. Vopred liečené skupiny vykazovali výrazne znížený BUN (nízky: 22 : 6 ± 3: 67 mg/dl; vysoký: 21 : 6 ± 3: 17 mg/dl) a sérový kreatinín ( nízky: 0: 25 ± {{19} }:04 mg/dl; vysoké: 0:23 ± 0:04 mg/dl) koncentrácie v porovnaní s koncentráciami v neliečenej skupine (p<0:01), and="" no="" significant="" differences="" were="" observed="" between="" the="" two="" pretreatment="" groups.="" these="" results="" indicated="" that="" pretreatment="" with="" beluga="" lentils="" can="" protect="" against="" acute="" renal="" functional="">

3.2. Účinky predbežného ošetrenia šošovky Beluga na poškodenie tubulárnych epiteliálnych buniek a apoptózu.

Tubulárne poškodenie, najmä atrofia epiteliálnych buniek, bolo často pozorované vo vonkajšej dreni obličky a v obličkách boli príležitostne identifikované nukleárne straty exfoliovaných buniek, luminálne zvyšky na obličkovom tubule, kolaps luminálneho priestoru a intersticiálne infiltráty neutrofilov. neliečenej skupine (obrázok 2(a)). Na rozdiel od toho obličky z vopred liečených skupín vykazovali takmer normálne bunkové morfológie a tubulárne poškodenie bolo menej často pozorované v skupine s vysokou dávkou ako v skupine s nízkou dávkou. Keď bolo zranenie vyjadrené ako percento na jednotku plochy, skóre zranenia sa znížilo v predliečených skupinách (nízke: 2:0±{7}}:93; vysoké: 1:5± {{ 11}}:53) v porovnaní s neliečenou skupinou (2:87 ± 1:25) (obrázok 2(b)). Pri skúmaní sekrécie KIM-1 a NGAL (obrázok 2(c)) výsledky ELISA ukázali, že obsah KIM{20}} sa znížil v predliečených skupinách (nízka: 1, 922:83 ± 199:42 pg/ mg, vysoká: 1 827:83 ± 278:26 pg/mg) v porovnaní s neliečenou skupinou (1 977:83 ± 184:49 pg/mg). Expresia NGAL bola významne znížená v skupine s vysokou dávkou (489:34 ± 19 : 95 pg/mg) v porovnaní so skupinou s nízkou dávkou (527:36 ± 15: 19 pg/ml) a neliečenou (537:05 ± 15: 70 pg/mg) skupiny (str<>

Potom sa analyzovalo, či poškodenie tubulárnych epitelových buniek spôsobilo apoptózu. Bunková apoptóza bola hodnotená detekciou fragmentovanej chromozomálnej DNA pomocou testu TUNEL (obrázok 2(d)). TUNEL-pozitívne bunky boli zriedkavo pozorované v predliečených skupinách (nízka: 5:00 ± 1:22; vysoká: 2:25 ± 1:09). Naopak, neliečená skupina vykazovala relatívne zvýšený počet TUNEL-pozitívnych buniek vo vonkajšej oblasti drene (47:50 ± 16:77) (p<0:01), showing="" apoptotic="" bodies="" that="" extruded="" into="" the="" tubular="" lumen="" (figure="" 2(e)).="" when="" the="" secretion="" of="" apoptosis-related="" molecules="" (fas="" and="" caspase="" 3)="" was="" analyzed="" by="" elisa="" (figure="" 2(f)),="" fas="" expression="" was="" high:="" 3:96="" ±="" 0:55ng/mg)="" compared="" with="" that="" in="" the="" untreated="" group="" (7:10="" ±="" 0:87ng/mg),="" and="" caspase="" 3="" expression="" showed="" similar="" results="" (low:="" 8:44="" ±="" 2:05ng/mg;="" high:="" 8:25="" ±="" 1:28ng/="" mg;="" and="" untreated:="" 11:99="" ±="" 0:63ng/mg)="" (p=""><0:05). these="" results="" indicated="" that="" beluga="" lentil="" pretreatment="">

apoptóza tubulárnych epitelových buniek indukovaná I/R.

3.3. Účinky predbežného ošetrenia šošovky Beluga na poškodenie endotelových buniek.

Účinky predbežného ošetrenia šošovice beluga na endotelové bunky sa overili pomocou IHC s použitím protilátky CD31 (obrázok 3 (a)). V normálnej skupine boli identifikované CD31-pozitívne krvné cievy, ale CD31-pozitívne bunky neboli identifikované v neošetrenej skupine, čo naznačuje I/R-indukovanú vaskulárnu disrupciu. Skupina s predošetrením vysokými dávkami vykazovala CD31-pozitívne bunky v peritubulárnych kapilárach, čo poukazuje na ochranný účinok na cievy pri predbežnom ošetrení vysokou dávkou šošovice beluga. Endotelové bunky boli vyšetrené detekciou ICAM- 1, adhéznej molekuly, a pozitívne bunky boli častejšie identifikované v tubulárnej oblasti neošetrenej skupiny (46:4±41:7 buniek/sklíčko) v porovnaní s vopred ošetrenými skupinami ( nízka: 5:77 ± 1:01 buniek/sklíčko; vysoká: 3:72 ± 1:05 buniek/sklíčko) (obrázok 3(b)). Tieto výsledky ukázali, že predbežná úprava šošovice beluga zachovala kapiláry a inhibovala aktiváciu adhéznych molekúl na povrchu endotelových buniek.

3.4. Účinky predbežnej úpravy šošovice Beluga na oxidačný stres.

To evaluate the antioxidant effects of beluga lentil pretreat- ment, MDA, SOD, CAT, GSH, and GPx levels were detected by ELISA (Figure 4). MDA levels decreased in the pretreated groups (low: 0:85 ± 0:23nmol/mg; high: 0:81 ± 0:22nmol/ mg) compared with that in the untreated group (0:96 ± 0:11nmol/mg) (p >0:05) (Figure 4(a)). However, the antioxidant enzyme activities increased in the pretreated groups (Figure 4(b)) compared with those in the untreated group (p >{{{{20}}}}:05), pre SOD (nízka: 360:21 ± 56:42U/ml; vysoká: 362:7{{ 36}} ± 70 :32 U/ml a neošetrené: 333:52 ± 41:58 U/ml), CAT (nízka: 3:64 ± 1:09 nmol/g; vysoká: 3:21 ± 0:76 nmol/g; a neošetrené: 3:18 ± 0:40 nmol/g), GSH (nízka: 4:13 ± 0:53 nmol/mg; vysoká: 4:56 ± 0:69 nmol/mg; a neošetrená: 3:59 ± 0 :53 nmol/mg) a GPx (nízka: 198:89 ± 48:43 U/ug; vysoká: 219:61 ± 138:08 U/ug; a neošetrená: 165:14 ± 34:73 U/ug). Hoci tieto rozdiely neboli štatisticky významné, tieto výsledky naznačujú, že predbežná úprava šošovice beluga zabránila I/R-indukovanému renálnemu oxidačnému stresu zvýšením antioxidačnej účinnosti v obličkách.

3.5. Účinky predbežného ošetrenia šošovky Beluga na infiltráciu imunitných buniek, cytokíny a zápal. Analyzovala sa infiltrácia makrofágov (F4/80 plus) a T buniek (CD4 plus) a uvoľňovanie prozápalových cytokínov (IL-1, IL{7}} a TNF-), aby sa vyhodnotil zápal vyvolaný apoptózou. Menej F4/80 plus a CD4 plus infiltrujúcich imunitných buniek bolo pozorovaných v predliečených skupinách ako v neošetrenej skupine, ako bolo hodnotené IHC analýzou (obrázok 5 (a)). Analýza PCR v reálnom čase ukázala, že hladiny renálnej mRNA prozápalových cytokínov (IL-1, TNF- a IL6) sa znížili v predliečenej skupine v porovnaní s hladinami v neliečenej skupine (obrázok 5(b )). Avšak hladiny mRNA protizápalových cytokínov (TGF- a IL-22) sa zvýšili v predliečených skupinách v porovnaní s neošetrenou skupinou, s výnimkou IL-10 (obrázok 5(c)). Tieto výsledky ukázali, že I/R-indukovanému zápalovému poškodeniu obličiek možno predchádzať predliečením beluga lentilkou v dôsledku protizápalových účinkov, hoci IL-10 nebol ovplyvnený.

antokyanínový doplnok

4. Diskusia

Poškodenie obličiek vyvolané I/R je tradične charakterizované rýchlo klesajúcou funkciou obličiek [20]. Funkciu obličiek možno odhadnúť pomocou hodnôt BUN a sérového kreatinínu, čo sú dusíkaté metabolické koncové produkty, ktoré indikujú funkciu glomerulárneho filtra [21]. Neliečená skupina vykazovala významne zvýšené hodnoty BUN (89:92 ± 7:29 mg/dl) a kreatinínu (0:48 ± {{20}}:16 mg/dl), čo naznačuje funkčné zlyhanie obličiek vyvolané I/R. Avšak skupiny predliečené beluga šošovicou vykazovali významne znížený BUN (nízky: 22 : 6 ± 3: 67 mg/dl; vysoký: 21: 6 ± 3: 17 mg/dl) a sérový kreatinín (nízky: 0: 25 ± 0:04 mg/dl; vysoké: 0:23 ± 0:04 mg/dl) hodnoty (p<0:01) compared="" with="" those="" in="" the="" untreated="" group.="" these="" values="" are="" similar="" to="" those="" observed="" in="" normal="" mice="" (male,="" 6wks;="" bun:="" 22:68="" ±="" 3:05mg/dl;="" creatinine:="" 0:25="" ±="" 0:06mg/dl)="" [22].="" the="" significantly="" decreased="" bun="" and="" serum="" creatinine="" values="" observed="" in="" the="" pretreated="" groups="" relative="" to="" the="" untreated="" group="" indicated="" that="" beluga="" lentil="" pretreatment="" exerted="" protective="" effects="" on="" renal="" function="" against="" i/r-induced="" renal="">

Znížená funkcia obličiek poukazuje na problémy s glomerulárnou filtráciou spôsobené spätným presakovaním glomerulárneho filtrátu cez tubulárny epitel, ktorý predstavuje oblasť, ktorá je najťažšie poškodená I/R [23]. I/R viedla k strate jadra exfoliovaných buniek, luminálnych úlomkoch na renálnom tubule a kolapsu luminálnych priestorov v tubulárnych epiteliálnych bunkách. Vopred liečené skupiny vykazovali znížené histopatologické tubulárne poškodenie spôsobom závislým od dávky. Pozorované histopatologické poškodenie tubulov bolo potvrdené hodnotením molekulárnych markerov, KIM{2}} a NGAL [24]. KIM-1 je fosfatidylserínový receptor, ktorý pôsobí ako apoptotická bunka rozpoznávajúca molekula, prenášajúca poranenú bunku do lyzozómu na apoptickú/nekrotickú bunkovú fagocytózu, klírens apoptotickej drviny a obmedzenie prozápalovej odpovede [25]. NGAL je malý sideroforový proteín, ktorý sa viaže na želatinázy odvodené z ľudských neutrofilov. NGAL je zriedkavo exprimovaný v normálnych obličkách, ale akútne, ischemické alebo toxické poškodenie obličiek vedie k sekrécii NGAL epitelovými bunkami v proximálnych/distálnych tubuloch, čím sa zvyšujú koncentrácie NGAL v moči a krvi; teda NGAL môže byť použitý ako nový skorý biomarker pre I/R-indukované akútne zlyhanie obličiek [26]. Vopred liečené skupiny vykazovali zníženú sekréciu KIM-1 a NGAL a skupina s vysokou dávkou pred liečbou vykazovala významné zníženie sekrécie NGAL v porovnaní s neliečenou skupinou. Pozorované zníženia tubulárneho poškodenia a sekrécie proteínov KIM{10}} a NGAL ukázali, že predbežné ošetrenie šošovkou beluga vyvolalo ochranné účinky proti poškodeniu tubulárnych epitelových buniek vyvolanému I/R.

Keď je I/R poranenie závažné, poškodené bunky sa odstraňujú apoptotickou cestou, čo je patofyziologický mechanizmus bunkovej smrti [27]. Poškodenie DNA špecifické pre apoptózu možno zistiť pomocou testu TUNEL.

TUNEL-pozitívne bunky boli často pozorované v neošetrenej skupine, zatiaľ čo beluga lentil vopred ošetrené skupiny vykazovali významne znížený počet TUNEL-pozitívnych buniek v závislosti od dávky. Tento histologický dôkaz apoptózy bol potvrdený skúmaním expresie Fas a kaspázy 3. Fas je ligand, ktorý sa viaže na receptor bunkovej smrti a spočiatku sa pozoruje počas programovanej bunkovej smrti [28]. Kaspáza 3 je intracelulárny vykonávací enzým apoptotickej dráhy bunkovej smrti, čo vedie k tvorbe apoptotického tela [29]. Syntézy proteínov Fas a kaspázy 3 boli významne znížené v predliečenej skupine v porovnaní s tými v neošetrenej skupine, čo potvrdzuje, že predbežné ošetrenie šošovicou beluga môže inhibovať apoptotickú signálnu transdukciu po poranení I/R.

Poškodenie I/R tiež indukuje stratu renálnych mikrociev [30], čo vedie k patohistologickým zmenám v endotelových bunkách [20]. Poškodenie obličkových mikrociev sa detegovalo pomocou protilátky proti CD31, markeru endotelových buniek [30]. Expresia CD31 nebola detegovaná v neliečenej skupine, čo naznačuje stratu obličkových mikrociev. Skupina predliečená vysokou dávkou však vykazovala pozitívnu expresiu CD31 s podobnou vaskulárnou hustotou, aká bola pozorovaná v normálnej skupine, čo naznačuje, že predbežné ošetrenie šošovicou beluga pri vysokých dávkach malo ochranný účinok na zachovanie endotelových buniek. Poškodené endotelové bunky exprimujú adhézne molekuly endotelu a leukocytov, ako je ICAM-1 [31]. Zvýšené adhézne molekuly môžu viesť k aktivácii leukocytov, obštrukcii kapilár, produkcii cytokínov a prozápalovým reakciám [32]. Neošetrená skupina vykazovala pozitívnu expresiu ICAM{13}}, čo naznačuje zvýšenú expresiu adhéznych molekúl indukovanú poškodením endotelových buniek. Skupina predliečená vysokou dávkou však vykazovala negatívnu expresiu ICAM-1, čo naznačuje ochranné účinky predliečby beluga šošovkou na udržanie endotelových buniek, a to funkčne aj fyziologicky. Udržiavané vaskulárne štruktúry môžu poskytovať konzistentný prietok krvi, dodávať kyslík a živiny tkanivám a bunkám poškodeným I/R, čím napomáhajú funkčnej a histologickej obnove obličiek.

Reperfúzia obnovuje prísun kyslíka do poškodených buniek, čo môže spustiť expresiu enzýmov súvisiacich s oxidačným stresom, ktoré premieňajú kyslík na ROS [33]. ROS sú nestabilné a vysoko reaktívne produkty, ktoré vytvárajú voľné radikály, ktoré spôsobujú poškodenie DNA, apoptózu a nekrózu prostredníctvom zmeny bunkových proteínov, lipidov a nukleových kyselín. Voľné radikály poškodzujú nenasýtené mastné kyseliny v bunkovej membráne, čo vedie k peroxidácii lipidov [34]. Peroxid lipidov sa potom degraduje na MDA, čo znižuje aktivity antioxidačných enzýmov, ako sú SOD, GPx, GSH a CAT [35]. SOD katalyzuje dismutáciu superoxidu na kyslík a peroxid vodíka, ktorý je ďalej degradovaný CAT. GPx je kľúčový antioxidačný enzým, ktorý eliminuje peroxid pomocou GSH. GSH môže detoxikovať rôzne oxidačné produkty v kombinácii s GPx. Hladiny MDA a antioxidačných enzýmov preukázali inverzný vzťah v analýze ELISA. V predliečených skupinách bola expresia MDA relatívne nízka, ale antioxidačné enzýmy boli vysoko exprimované v porovnaní s ich príslušnými hladinami v neošetrenej skupine.

Tieto výsledky ukázali, že predbežná úprava šošovice beluga môže znížiť poškodenie obličiek vyvolané I/R blokovaním dráhy oxidačného stresu inhibíciou peroxidácie membránových lipidov a aktiváciou antioxidačných enzýmov.

Reperfúzia tiež spúšťa aktiváciu vaskulárnych endotelových buniek, čo vedie k expresii ICAM-1 na bunkovom povrchu. Exprimovaný ICAM-1 sa spája s neutrofilmi prostredníctvom antigénu spojeného s funkciou lymfocytov-1 (LFA{4}}), čo má za následok pripojenie neutrofilov k endotelovým bunkám, infiltráciu neutrofilov a sekréciu zápalových cytokínov neutrofilmi [36]. Keď sa neutrofily objavia v poškodenej oblasti, dôjde k infiltrácii F4/80 plus makrofágov. Makrofágy sa v závislosti od času a okolitého prostredia rozlišujú na prozápalové fenotypy M1 a protizápalové M2. Makrofágy M1 vylučujú prozápalové cytokíny (IL-1, TNF- a IL- 6), ktoré sú spojené s poškodením obličiek indukovaným I/R, zatiaľ čo makrofágy M2 vylučujú protizápalové cytokíny (TGF-, IL{ {19}} a IL-22) [37, 38]. Makrofágy tiež stimulujú aktiváciu CD4 plus T buniek. Aktivované T bunky syntetizujú interferón- (IFN-), ktorý zosilňuje imunitnú odpoveď prostredníctvom aktivácie makrofágov M1 [39]. V tejto štúdii skupiny predliečené beluga šošovkou vykazovali inhibičné účinky proti infiltrácii F4/80 plus makrofágov a CD4 plus T buniek do oblasti kôry obličiek, čo malo za následok zníženú expresiu IL-1, IL-6, a TNF-mRNA a zvýšená expresia TGF-, IL-10 a IL-22 mRNA. Tieto výsledky ukázali, že predbežné ošetrenie šošovicou beluga môže znížiť zápalovú odpoveď inhibíciou infiltrácie imunitných buniek a znížením expresie zápalových cytokínov.

5. Závery

Stručne povedané, skupiny predošetrenej šošovkou beluga vykazovali znížené poškodenie proximálneho tubulu, zníženú sekréciu molekúl súvisiacich s poranením, znížené TUNEL-pozitívne bunky, zníženú sekréciu molekúl súvisiacich s apoptózou, pozitívnu expresiu mikrociev, negatívnu expresiu adhézneho markera, antioxidačný účinok a inhibíciu zápalu. odozvy. Preto predbežné ošetrenie šošovicou beluga vyvolalo ochranné účinky proti poškodeniu obličiek vyvolanému I/R prostredníctvom antiapoptotických, protizápalových a antioxidačných aktivít. Na základe výsledkov tejto štúdie môže byť funkcia obličiek zachovaná použitím liečby beluga šošovkou v klinických situáciách spojených s I/R poraneniami, ako je napríklad čiastočná nefrektómia.

doplnky flavonoidov v obličkách

Dostupnosť údajov

Údaje sú k dispozícii na vyžiadanie.

Zverejnenie

Abstrakt rukopisu bol oznámený na 72. výročnom stretnutí Kórejskej urologickej asociácie.

Konflikt záujmov

Neexistujú žiadne konflikty záujmov.

Príspevky autorov

Syng-ook Lee a So Young Chun prispeli k tejto práci rovnakým dielom.

Poďakovanie

Táto práca bola podporená grantom Biomedical Research Institute od Kyungpook National University Hospital (2019).

1Department of Food Science and Technology, Keimyung University, Daegu 42601, Kórejská republika

2BioMedical Research Institute, Kyungpook National University Hospital, Daegu 41940, Kórejská republika

3Oddelenie podporného tímu pre výskum laboratórnych zvierat, Univerzitná nemocnica Yeungnam, Daegu 42415, Kórejská republika

4Katedra interného lekárstva, Yeungnam University College of Medicine, Daegu 42415, Kórejská republika

5Urologická katedra, Lekárska fakulta, Národná univerzita Kyungpook, Daegu 41566, Kórejská republika

6 Katedra patológie, Lekárska fakulta, Národná univerzita Kyungpook, Daegu 41566, Kórejská republika

7Urologická klinika, Yeungnam University College of Medicine, Daegu 42415, Kórejská republika

Referencie

[1] SY Chun, DH Kim, JS Kim a kol., "Nová metóda dorzálnej štrbiny približujúca sa k neischemickej parciálnej nefrektómii na regeneráciu obličkového tkaniva na myšom modeli," Tkanivové inžinierstvo a regeneračná medicína, zv. 15, č. 4, s. 453–466,2018.

[2] M. Agrawal a R. Swartz, "Acute renal failure," American Family Physician, zv. 61, č. 7, s. 2077–2088, 2000.

[3] KR Tuttle, "Ischemic nephropathy," Current Opinion in Nephrology and Hypertension, zv. 10, č. 2, s. 167–173,2001.

[4] K. Singbartl a K. Ley, "Ochrana pred závažným akútnym zlyhaním obličiek vyvolaným ischémiou-reperfúziou blokovaním E-selektínu," Critical Care Medicine, zv. 28, č. 7, s. 2507–2514, 2000.

[5] M. Takada, KC Nadeau, GD Shaw, KA Marquette a NL Tilney, "Kaskáda adhéznych molekúl cytokínov pri ischemickom/reperfúznom poškodení obličiek potkana. Inhibícia rozpustným ligandom P-selektínu," The Journal of klinické skúšanie, zv. 99, č. 11, s. 2682–2890, 1997.

[6] J. Niu, J. Wu, X. Li a F. Zhang, "Asociácia medzi endotelínom-1/endotelínovým receptorom A a zápalom v obličkách myší po akútnej ischémii/reperfúzii," Molecular Medicine Reports, zv. . 11, č. 5, s. 3981–3987, 2015.

[7] L. Wang, X. Liu, H. Chen a kol., "Účinok peroxidu II na apoptózu vyvolanú renálnym ischemickým/reperfúznym poškodením u potkanov," Experimental and Therapeutic Medicine, zv. 9, č. 3, s. 817–822, 2015.

[8] B. Dong, H. Zhou, C. Han a kol., "Ischémiou/reperfúziou indukovaná expresia sekania podporuje apoptózu a zhoršuje obnovu funkcie obličiek: úloha acidózy a Gpr4," PLoS One, zv. 9, č. 10, článok e110944, 2014.

[9] DL Cruthirds, L. Novak, KM Akhi, PW Sanders, JA Thompson a LA MacMillan-Crow, "Mitochondriálne ciele oxidačného stresu počas renálnej ischémie/reperfúzie," Archives of biochemistry and biophysics, vol. 412, č. 1, s. 27–33, 2003.

[10] B. Yang, S. Jain, IZ Pawluczyk a kol., "Zápal a aktivácia kaspázy pri dlhodobom renálnom ischemickom/reperfúznom poškodení a imunosupresii u potkanov," Kidney International, zv. 68, č. 5, s. 2050–2067, 2005.

[11] HH Wu, TY Hsiao, CT Chien a MK Lai, "Ischemické kondicionovanie krátkymi periódami reperfúzie zmierňuje renálnu ischémiu/reperfúziu indukovanú apoptózu a autofágiu u potkana," Journal of biomedical science, vol. 16, č. 1, 2009.

[12] EM El Morsy, MA Ahmed a AA Ahmed, "Zmiernenie renálneho ischemického/reperfúzneho poškodenia predkondicionovaním extraktu açai na potkanom modeli," Life sciences, zv. 123, s. 35–42, 2015.

[13] H. Ilhan, M. Eroglu, V. Inal a kol., "Hyperbarická oxygenoterapia zmierňuje oxidačný stres a poškodenie tkaniva pri renálnom ischemickom/reperfúznom poškodení u potkanov," Renal Failure, zv. 34, č. 10, s. 1305–1308, 2012.

[14] H. Chen, B. Xing, X. Liu a kol., "Ozónová oxidačná preconditioning inhibuje zápal a apoptózu u potkanieho modelu renálneho ischemického/reperfúzneho poškodenia," European Journal of pharmacology, zv. 581, č. 3, s. 306–314, 2008.

[15] BJ Xu, SH Yuan a SK Chang, "Porovnávacie analýzy fenolového zloženia, antioxidačnej kapacity a farby strukovín v chladnom období a iných vybraných potravinárskych strukovín," Journal of Food Science, zv. 72, č. 2, s. S167 – S177, 2007.

[16] SO Lee a SH Lee, "Obsah polyfenolov a antioxidačné aktivity extraktov zo šošovice z rôznych kultivarov", Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition, vol. 45, č. 7, s. 973–979, 2016.

[17] SO Lee a SH Lee, „Nrf2-sprostredkovaný protizápalový účinok metanolového extraktu zo šošovice beluga v bunkách RAW264.7 ošetrených LPS“, na medzinárodnom sympóziu a výročnom stretnutí KFN 2018, str. {{ 7}}, Pusan, Kórea, 2018.

[18] EE Hesketh, A. Czopek, M. Clay a kol., "Ischemicko-reperfúzne poškodenie obličiek: myšací model poranenia a regenerácie," JoVE (Journal of Visualized Experiments), č. 88, s. 8, 2014.

[19] Q. Wei a Z. Dong, Myší model ischemického akútneho poškodenia obličiek: technické poznámky a triky, American Journal of Physiology- Renal Physiology, zv. 303, č. 11, s. F1487 – F1494, 2012.

[20] JV Bonventre a L. Yang, "Celular pathophysiology of ischemic akútne poškodenie obličiek," The Journal of Clinical Investigation, zv. 121, č. 11, s. 4210–4221, 2011.