Renoprotektívny účinok izoliquiritigenínu na akútne poškodenie obličiek vyvolané cisplatinou prostredníctvom inhibície FPR2 v makrofágu

Pre viac informácií kontaktujte: ali.ma@wecistanche.com

Tan Rui-Zhi a kol

Kliknite na Cistanche pre liečbu ochorenia obličiek

Abstraktné

Akútne poškodenie obličiek (AKI) je závažnou komplikáciou u kriticky chorých pacientov. Hromadné dôkazy naznačujú, že makrofágy hrajú dôležitú prozápalovú úlohuAkútne poškodenie obličieka izoliquiritigenín (ISL) môže inhibovať makrofágový zápal, ale jeho úloha vAkútne poškodenie obličieka základný mechanizmus nie je známy. Cieľom tejto štúdie je preskúmať renoprotektívny účinok ISL na AKI a úlohu formylpeptidových receptorov 2 (FPR2) v tomto procese. V tejto štúdii sa na uskutočnenie experimentov in vivo a in vitro použili model AKI indukovaný cisplatinou a model zápalu makrofágov indukovaného lipopolysacharidmi. Výsledky ukázali, že ISL výrazne uľavilopoškodenie obličieka inhibovali zápal obličiek in vivo a potláčali makrofágovú zápalovú reakciu in vitro. Dôležité je, že sa zistilo, že FPR2 bola významne upregulovaná v porovnaní s kontrolnou skupinou v AKI a LPS-indukovaných makrofágoch, zatiaľ čo bola silne potlačená ISL. Je zaujímavé, že nadmerná expresia FPR2 s transfekciou pcDNA3.1-FPR2 účinne zvrátila protizápalový účinok ISL v makrofágoch, čo naznačuje, že FPR2 môže byť potenciálnym cieľom ISL na prevenciu zápalu a zlepšeniepoškodenie obličiekzAkútne poškodenie obličiek. Celkovo tieto zistenia naznačujú, že ISL zlepšila indukciu cisplatinypoškodenie obličiekinhibíciou FPR2 zapojeného do makrofágového zápalu, ktorý môže poskytnúť potenciálnu terapeutickú možnosť pre AKI.

1. Úvod

Akútnaobličkyporanenie (AKI) je bežný ťažký typobličkyochorenie s vysokou mortalitou.1 Je charakterizované rýchlym poklesom funkcie obličiek, ku ktorému dôjde do 7 dní alebo skôr. Nedávne publikácie uvádzajú, že výskyt AKI je až 5 percent hospitalizovaných a 30 percent ťažkých pacientov aAKIspôsobuje každoročne 2 milióny úmrtí na celom svete, čo sa stalo globálnym zdravotným problémom. Hoci definícia je bežná a jednotná, AKI môže byť spôsobená rôznymi príčinami, vrátane príjmu nefrotoxických liekov, ischemicko-reperfúzneho poškodenia (Ischemicko-reperfúzne poškodenie, IRI), sepsy, kardiovaskulárnych operácií, hypertenzie a cukrovky.2,3 vek, cukrovka a srdcové zlyhanie zvyšujú riziko AKI, čo zvyčajne vedie k ireverzibilnej chronickej obličkovej chorobe (CKD) a konečnému štádiu obličkovej choroby (ESRD) u niektorých pacientov.4 Je pozoruhodné, že štúdie ukázali, že sú zapojené takmer všetky imunitné bunky pri imunitnom zápale obličiek pri AKI.5 Spomedzi nich sa ukázalo, že makrofágy majú dôležitú úlohu pri podpore zápalu obličiek.6 Odstránenie makrofágov zlepšuje poškodenie a zápal obličiek AKI.7 Preto môže byť účinná inhibícia makrofágového zápalu prospešná pre zlepšenie súčasných terapeutických prístupov k manažmentu AKI.

Isoliquiritigenin (ISL) je flavonoid s chalkónovou štruktúrou, ktorý má korene v známej tradičnej čínskej bylinnej medicíne.8 V posledných rokoch priťahuje veľkú pozornosť vedcov vďaka svojmu antioxidačnému, protizápalovému, proti zhlukovaniu krvných doštičiek, antibakteriálnemu , antivírusové, protinádorové, hepatoprotektívne, neuroprotektívne, srdcovej ochrany a detoxikačné vlastnosti.9 Ukázalo sa, že ISL inhibuje bunkovú proliferáciu, znižuje ROS a v rôznej miere indukuje apoptózu, nekrotiku a smrť rakovinových buniek.10 Nedávne správy naznačujú, že izoliquiritigenín môže inhibovať produkciu IL-6 a TNF-a indukovanú lipidovou A časťou LPS v makrofágoch RAW264.7 a oslabiť tvorbu komplexu LPS-TLR4/MD-2. Okrem toho môže ISL indukovať apoptózu buniek HepG2 prostredníctvom signálnych dráh MAPK, STAT3 a NF-kB sprostredkovaných ROS.11 Experimentálne dôkazy tiež ukázali, že ISL indukuje vnútornú aktiváciu sprostredkovanú ROS a aktivuje mechanizmus mitochondriálnej-cytochróm c-cysteín proteázy apoptózy PC{22}} buniek. Stojí za zmienku, že ISL sa často používa ako doplnok stravy pre ženy.12 Nedávne štúdie ukázali, že ISL má významný protizápalový účinok na AKI, ale konkrétny mechanizmus účinku je stále nejasný.

Predchádzajúci výskum nášho tímu zistil, že Mincle, makrofágmi indukovaný lektín typu C, je transmembránovým receptorom rozpoznávania vzoru zapojeným do zápalu obličiek,13 prostredníctvom ktorého sme skrínovali formylpeptidové receptory 2 (FPR2), ktoré majú určitý vzťah s Mincle z roku databázy GEO. Jeho úloha pri akútnom ochorení obličiek však nebola overená. FPR2 je gén kódujúci proteín, ktorý patrí do rodiny receptorov spojených s G proteínom a obsahuje 351 aminokyselinových zvyškov.14,15 Sú to 7- transmembránové receptory spojené s G proteínom, ktoré môžu sprostredkovať imunitnú reguláciu, sekréciu zápalových faktorov, bunková chemotaxia a bunková adhézia, ktoré úzko súvisia s výskytom a rozvojom rôznych ochorení.16 Jeho homológia s FPR1 a FPR3 je až 69 percent a 83 percent. Subbunky FPR2 sú lokalizované v bunkovej membráne a sú to viacpriechodové membránové proteíny. Sú exprimované hlavne v neutrofiloch, eozinofiloch, monocytoch, epitelových bunkách, fibroblastoch, gliových bunkách, mezangiálnych bunkách atď., distribuovaných v rôznych orgánoch, ako sú pľúca, slezina a pečeň. Je pozoruhodné, že FPR2 je hojne exprimovaný v renálnom interstíciu, 17 kde sídlia zápalové bunky. Hlavnou funkciou FPR2 je kombinovať určité špecializované médiá podporujúce rozklad (SPM) na sprostredkovanie aktivity týchto metabolitov pri potláčaní a odstraňovaní zápalu. Úloha FPR2 pri zápale AKI a či sa môže použiť ako cieľ pre liekovú intervenciu však stále nie je známa.

V tejto štúdii sme použili model myšieho AKI indukovaného nefrotoxickým liekom a cisplatinou a model zápalových buniek indukovaný LPS, aby sme preskúmali zlepšenie účinku ISL na poškodenie a zápal obličiek pri AKI, ako aj kľúčovú úlohu FPR2 pri zápale obličiek. a ISL liečbu AKI. Táto štúdia poskytne nové smery pre pochopenie mechanizmu zápalového poškodenia a liečebných stratégií pre AKI.

2. Materiály a metódy

2.1. Drogy

Isoliquiritigenin (purity>98 percent) je izoflavónová zlúčenina extrahovaná z koreňa sladkého drievka. Jeho molekulový vzorec je C15H12O4. V tejto štúdii bol izoliquiritigenín zakúpený od Chengdu Bio purify Phytochemicals Ltd. (BP0787), rozpustený v 10 percentách DMSO (ST038, Beyotime, Čína) a myšiam indukovaným cisplatinou sa intragastricky podávali v dávke 7,5 mg/kg a 30 mg. /kg, resp.

2.2. Izolácia BMDM

Na izoláciu buniek BMDM sa vybrali samce myší C57BL/6 vo veku 6 až 8 týždňov. Opatrne oddeľte kosť zadnej nohy od stehennej kosti a odstráňte pripojené svaly. Kosti rozdrvte v PBS mažiarom, kým sa farba kostí nezmení z červenej na bielu. Následne sa odoberie supernatant a prefiltruje sa cez 70 sitko, nasleduje centrifugácia pri 1500 otáčkach za minútu počas 5 minút. Erytrocyty boli rozbité vo filtrovanej kvapaline s 10 - PBS, ktorá bola potom prefiltrovaná cez 40 mm bunkové sitko. Inkubujte získané bunky v 10 cm kultivačnej miske a indukujte 30 percentným supernatantom L929 počas 7 dní. Bunky BMDM boli stimulované 100 ng/ml LPS, aby sa vytvoril model zápalových buniek.

2.3. Knock-down a nadmerná expresia FPR2 v BMDM

FPR2 bol down-regulovaný transfekciou s Zeta LifeAdvanced Transfection Reagent (AD600050, Zeta life, USA) a FPR2 siRNA na BMDM (sekvencie FPR2 siRNA: Sense, 5'-GGAGAUGUGUAUUGUACAUTT-3'; Antisense, 5'-AUGUGUA CAUCUCCTT-3'. Sangon Biotech, Čína). Podobne aj pcDNA3.{12}}Plazmid FPR2 (Skonštruovaný Fenghui Biotech, Čína) sa transfekoval do BMDM pomocou ZETA, aby sa v bunkách nadmerne exprimoval FPR2.

2.4. Pokusy na zvieratách

Všetky pokusy na zvieratách sa uskutočnili podľa pokynov Etického výboru Southwest MedicalUniversity. 32 samcov myší C57BL/6 bolo zakúpených od ChengduDaShuo Animal Co., Ltd., ktoré boli náhodne rozdelené do 4 skupín: simulovaná skupina, modelová skupina (skupina AKI indukovaná cisplatinou), skupina s nízkou dávkou ISL (7,5 mg/kg, skupina L), a skupina s vysokou dávkou (30 mg/kg, skupina H). Modelovej skupine sa prvý deň injekčne podávalo 20 mg/kg cisplatiny (P4394, Sigma-Aldrich, USA), zatiaľ čo skupine s nízkou dávkou sa podávalo 7,5 mg/kg ISL a skupine s vysokou dávkou 30 mg/kg ISL počas 3 dní. . Po 3 dňoch sa sérum a obličky odobrali z usmrtených myší.

2.5. Test funkcie obličiek

Po odbere séra každej skupiny myší sa dôsledne riaďte pokynmi súprav na zistenie hladín sérového kreatinínu (C011-2-1, Jiancheng Biotech, Čína) a močovinového dusíka (C013-2-1, Jiancheng Biotech, Čína).

2.6. Patologické sfarbenie

Farbenie H&E: Bežné odparafínovanie a rehydratácia sekcie, farbenie hematoxylínom po dobu 5 minút, opláchnutie RO vodou, oddelenie alkoholu 1 percentom kyseliny chlorovodíkovej na 2 s, opláchnutie vodou z vodovodu, ponorenie do 75 percent etanolu na 2 s, 1 percenta eozínu rozpustného v alkohole na 30 s , opláchnutie vodou z vodovodu, 100 percentný etanol Dehydratujte 1 minútu, vysušte, xylén transparentný 10 minút, vysušte, utesnite neutrálnym balzamovým montážnym médiom (36313ES60, Yepsen, Čína).

Farbenie PAS: Plátky sa umiestnili do roztoku kyseliny jodistej pri teplote miestnosti na 5 až 8 minút, po čom nasledovalo dvakrát opláchnutie RO vodou. Potom vložte tieto plátky do Schiffovho činidla na 10 až 20 minút, opláchnite vodou z vodovodu na 10 minút, zafarbite v hematoxylíne na 1 až 2 minúty, dehydratujte a priehľadné v 100 percentnom alkohole, vysušte, zalepte neutrálnym balzamovým montážnym médiom.

2.7. Imunoflfluorescencia

Zmrazené rezy tkaniva vložte do PBS, dvakrát premyte, fixujte 10 percentným formaldehydom počas 10 minút. Tkanivo na rezoch bolo blokované 5 percentným kozím sérom počas 30 minút, po čom nasledovala inkubácia s primárnym myšacím anti-myším FPR2 (1:200, sc-57141, Santa Cruz, USA) a potkaním anti-myším F4/80 protilátky (1:200, sc-52664, Santa Cruz, USA) pri4 - C cez noc. Nasledujúci deň premyte rezy dvakrát PBS, inkubujte so sekundárnou protilátkou (1: 200) pri teplote miestnosti počas 1 hodiny a zafarbite jadro pomocou DAPI. Snímky boli zachytené systémom EVOS.

2.8. Elisa

Koncentrácia IL-1b, IL-6, TNF-a v sére a bunkovom supernatante sa analyzovala pomocou súprav ELISA (EMC001B, EMC004, EMC102A, Neobioscience, Čína) podľa pokynov súpravy.

2.9. RealTime-PCR

Celková RNA sa extrahovala pomocou súpravy na extrakciu RNA (Tiangen, Čína) podľa pokynov výrobcu. Po reverznej transkripcii extrahovanej RNA do cDNA, jej pridaní do 10ml reakčného systému, aby sa vykonala real-time PCR systémom Roche LightCycler 480 a reakčný systém je nasledovný: Eastep® qPCR MasterMix 2 -, 5 ml; cDNA templát, 1 ml; upstream primer (10 mM), 0,5 ml; downstream primer (10 mM), 0,5 ml; Voda bez nukleázy, 3 ml. Priméry použité v tomto experimente boli syntetizované spoločnosťou Sangon (Shanghai, Čína) a sekvencie všetkých primérov sú uvedené v tabuľke 1.

2.10. Western blot

Lýzovací pufor RIPA sa použil na extrakciu proteínu z tkanív obličiek a buniek BMDM. Po rozpustení proteínu v 10-percentnom SDS-PAGEgéli a prenose na PVDF membránu, blokovanie membrány v 5-percentnom BSA počas 1 hodiny a premytie TBST 3-krát, nasledovala inkubácia membrány s primárnymi protilátkami pri 4 - C cez noc (pripravená s 5 percentami BSA, 1:1000). Potom sa membrány inkubovali so sekundárnou protilátkou (peroxidázou konjugovaný kozí anti-myší IgG (ZB-2305, 1:3000), kozí anti-králičí IgG (ZB-2301, 1:3000)) pri teplote miestnosti počas 1 hodiny. Obrázky boli zachytené gélovým zobrazovacím systémom (BIORAD, USA). Intenzita šedej pásov bola vypočítaná softvérom Image J.

2.11. Štatistická analýza

Výsledky boli uvedené ako priemer ± štandardná odchýlka. Analýza údajov sa uskutočnila pomocou jednosmerného testu ANOVA, po ktorom nasledovalo viacnásobné porovnanie s testom LSD pomocou softvéru SPSS 21.0. P < 0,05="" sa="" považovalo="" za="" štatisticky="" významné.="" každá="" skupina="" experimentov="" sa="" duplikuje="">

3. Výsledky

3.1. Isoliquiritigenín zlepšil poškodenie obličiek vyvolané cisplatinou a inhiboval zápal obličiek

Aby sme preskúmali renoprotektívne a protizápalové účinky izoliquiritigenínu v AKI, detegovali sme hladiny sérového Cre a BUN každej skupiny, ako aj expresiu a sekréciu zápalového cytokínu pomocou PCR a ELISA v reálnom čase. Okrem toho sa renálna patológia merala farbením H&E a PAS. Výsledky ukázali, že v porovnaní s normálnou skupinou boli hladiny sérového Cre a BUN v modeli AKI zvýšené, zatiaľ čo liečba 7,5 mg/kg alebo 30 mg/kg ISL významne znížila hladiny sérového Cre a BUN, medzi nimi dávka 30 mg/kg má najlepší terapeutický účinok (obr. 1A a B). Najmä 30 mg/kg ISL môže zlepšiť poškodenie renálnych tubulov podľa vyhodnoteného percenta tubulárnej nekrózy (obr. 1C). Výsledky ELISA a PCR ukázali, že sekrécia IL-1b, IL-6 a TNF-a sa po intervencii ISL (7,5 mg/kg a 30 mg/kg) znížila a expresia mRNA IL-1b, IL-6 a TNF-a boli tiež pozoruhodne znížené podaním 30 mg/kg ISL (obr. 1DeI). Na druhej strane výsledky farbenia H&E a PAS ukázali, že obličky v skupine AKI vykazovali vážne poškodenie renálnych tubulov, uvoľnenie renálneho epitelu, mezangiálne bunky a mezangiálnu intersticiálnu hyperpláziu a infiltráciu zápalovými bunkami, prekvapivo 30 mg/kg ISL môže účinne zvrátiť poškodenie obličiek pri AKI (obr. 1J). Všetky výsledky odhalili, že podávanie 7,5 mg/kg a 30 mg/kg ISL môže zlepšiť poškodenie obličiek vyvolané cisplatinou a inhibovať zápal obličiek, pri ktorom má 30 mg/kg ISL najlepší účinok.

3.2. Isoliquiritigenín znížil expresiu FPR2 v makrofágoch myší AKI

Mnoho predchádzajúcich správ naznačilo, že FPR2 hrá dôležitú úlohu pri imunitnej odpovedi a ochoreniach súvisiacich so zápalom. Avšak potenciálny účinok FPR2 v obličkách AKI nie je definovaný. V tejto štúdii sme vykonali imunofluorescenciu na spoločné umiestnenie FPR2 a makrofágov (F4/80, výrobca makrofágov). Výsledky ukázali, že makrofágy (zelené škvrny) boli objemovo infiltrované v obličkách myší AKI, zatiaľ čo FPR2 (červené škvrny) boli umiestnené spolu s F4/80, čo ilustruje, že FPR2 sa exprimoval hlavne na makrofágoch a hladina FPR2 bola významne zvýšená v obličkách AKI myší (obr. 2A). Ďalej sme detegovali expresiu FPR2 mRNA a proteínov súvisiacich so zápalom pomocou PCR v reálnom čase a westernovým prenosom v obličkách a výsledky ukázali, že 30 mg/kg ISL môže účinne znižovať hladiny mRNA a proteínov FPR2 v obličkách. obličky AKI myší v porovnaní so 7,5 mg/kg skupiny ISL (obr. 2B, G, H). Dôležité je, že výsledky Western blotting ukázali, že 30 mg/kg ISL tiež inhibovalo aktiváciu p-65 a znížilo hladiny proteínov TNF-a, IL-6 a IL{{28} }b v obličkách AKI myší (obr. 2CeF). Všetky vyššie uvedené údaje naznačujú, že ISL zmiernený zápal obličiek AKI myší môže súvisieť so znížením expresie FPR2 v makrofágoch.

3.3. Isoliquiritigenín potlačil expresiu a sekréciu FPR2 a zápalových cytokínov v LPS-indukovaných BMDM bunkách

Aby sme ďalej detegovali účinky ISL na bunky BMDM indukované LPS, skúmali sme hladinu mRNA FPR2, expresiu a sekréciu zápalových cytokínov v bunkách BMDM indukovaných LPS po podaní ISL pomocou PCR v reálnom čase a ELISA. Výsledky ukázali, že ISL znížila hladinu mRNA FPR2, IL-1b, IL-6 a TNF-a (obr. 3AeD), ako aj sekréciu IL-1b IL-6 a TNF-a v bunkovom supernatante v bunkách BMDM indukovaných LPS (obr. 3EeG). Vyššie uvedené výsledky naznačujú, že ošetrenie ISL koncentráciou 40 mM silne inhibovalo zápal v LPS-indukovaných BMDM bunkách.

3.4. Izoliquiritigenín znížil hladinu proteínu FPR2 a zápalových cytokínov v bunkách BMDM indukovaných LPS

Tiež sme detegovali hladiny proteínov FPR2 a zápalových cytokínov v bunkách BMDM indukovaných LPS po podaní ISL westernovým prenosom. Údaje ukázali, že v porovnaní s kontrolnou skupinou boli hladiny proteínov FPR2, p-p65, IL-6 a TNF-a významne zvýšené v bunkách BMDM indukovaných LPS a výrazne znížené pri podávaní 40 mM ISL ( Obr. 4AeE). Tieto výsledky ďalej ilustrujú, že ISL môže potlačiť aktiváciu NF-kB a znížiť hladinu proteínov zápalových cytokínov v bunkách BMDM indukovaných LPS.

3.5. Inhibícia FPR2 potlačila LPS-indukovaný zápal v BMDM bunkách

Na preskúmanie úlohy FPR2 pri zápale makrofágov sme použili siRNA na zníženie FPR2 v bunkách BMDM. Výsledky ukázali, že transfekcia siRNA môže významne inhibovať expresiu FPR2 v LPS-indukovanom makrofágu (obr. 5A) a účinne znižovať expresiu IL-1b a TNF-a (obr. 5B a C). Okrem toho výsledky Western blotu preukázali, že po transfekcii siRNA bola hladina proteínu FPR2 významne inhibovaná, bez ohľadu na to, či bola stimulovaná LPS (obr. 5D a E). Je pozoruhodné, že knockdown FPR2 významne znížil hladiny proteínov zápalových cytokínov a inhiboval aktivitu NF-kB signalizácie (obr. 5FeK), čo naznačuje, že FPR2 hrá dôležitú úlohu pri podpore zápalovej reakcie v makrofágoch. Tiež môže byť kľúčovým cieľom ISL inhibovať zápal makrofágov.

3.6. Nadmerná expresia FPR2 pôsobila proti protizápalovému účinku izoliquiritigenínu v bunkách BMDM indukovaných LPS

Aby sme určili, že ISL potláča zápal v AKI prostredníctvom inhibície FPR2 v makrofágu, použili sme plazmid s nadmernou expresiou FPR2 na zvýšenie expresie FPR2 v zápalových BMDM bunkách ošetrených ISL. Ako je znázornené na obr. 6, hladina proteínu a mRNA FPR2 bola významne zvýšená v pcDNA3.1- Skupina transfekovaná FPR2 (obr. 6A, B, G) a nadmerná expresia FPR2 účinne zrušila inhibičný účinok 40 mM ISL na aktiváciu p65 a hladiny proteínu IL-1b, IL-6 a TNF-a v LPS-indukovaných BMDM bunkách (obr. 6CeF). Podobne zvýšená regulácia FPR2 odstránila supresívny účinok 40 mM ISL na expresiu a sekréciu zápalových cytokínov v bunkách BMDM indukovaných LPS, ako sú IL-1b, IL-6 a TNF-a (Obr. 6HeM), čo naznačuje, že ISL znižuje zápal v LPS-indukovaných BMDM bunkách inhibíciou FPR2.

4. Diskusia

Akútne poškodenie obličiek patrí medzi bežné klinické ochorenia. Zvyčajne v krátkom čase vedie k oslabeniu imunitnej funkcie pacientov. V prípadoch traumy straty krvi, poškodenia orgánov, šoku sú obličky najcitlivejším orgánom a sú náchylné na rozvoj akútneho poranenia.18e20 Početné štúdie potvrdili, že zápal hrá kľúčovú úlohu vo vývoji AKI, o ktorej sa uvažovalo ako potenciálny intervenčný cieľ pre liečbu AKI. V posledných rokoch dosiahli čínske lieky obrovský pokrok v boji proti zápalu, vrátane kurkumínu, kvercetínu, naringenínu a iných monomérov. Izo-liquiritigenín je flavonoidná zlúčenina, ktorá má mnoho biologických aktivít, ako sú protizápalové účinky, účinky proti voľným radikálom, protinádorové a iné účinky.21 Predchádzajúce štúdie zistili, že ISL inhibuje apoptózu, zápal a produkciu extracelulárnej matrice v angiotenzíne. II-indukované HK-2 bunky.22 Štúdie od Wu Yangpinga ukázali, že ISL môže down-regulovať IL-6 a IL-8 inhibíciou aktivity NF-kB v modeli psoriázy, čo naznačuje ISL môže byť kandidátom na liečbu psoriázy a iných autoimunitných zápalových ochorení.23 Na druhej strane nedávna štúdia preukázala, že ISL by mohla zmierniť septické AKI potlačením translokácie NF-kB p65 a inhibíciou zápalových reakcií.24 V tejto štúdii sme zistili, že ISL môže účinne zlepšiť funkciu obličiek u myší s AKI indukovanou cisplatinou, znížiť poškodenie obličiek a inhibovať zápal obličiek. Presný mechanizmus inhibície zápalu ISL však nie je jasný.

FPR2 patrí do rodiny chemotaktických receptorov a je to receptor spojený s G proteínom so 7-krát transmembránovým. Predchádzajúce štúdie zistili, že FPR2 sa podieľa na rôznych fyziologických a patologických procesoch, vrátane obranných reakcií, zápalu, neurodegeneratívnych ochorení, nádorov, porúch súvisiacich s metabolizmom glukózy a lipidov.25,26 FPR2 môže byť upregulovaný lipopolysacharidmi, rôznymi zápalovými faktormi, a prostaglandín E2 v zápalovom procese, ktorý môže hrať protizápalovú a prozápalovú úlohu.27,28 Rôzne účinky FPR2 na zápal závisia od prostredia a ligandov, ktoré aktivujú rôzne signálne dráhy.29 V tejto štúdii sme zistili, že FPR2 sa exprimuje hlavne v makrofágoch v renálnom interstíciu a je vysoko exprimovaný v obličkách AKI myší indukovaných cisplatinou, čo naznačuje, že FPR2 v makrofágoch sa môže podieľať na zápalovej odpovedi makrofágov v obličkách AKI. Čoraz viac dôkazov potvrdilo, že veľké množstvo makrofágov infiltrovalo do obličiek v priebehu niekoľkých hodín po výskyte AKI a zhoršilo poškodenie obličiek reakciou na zápal. byť dôležitým smerom na zlepšenie AKI a či je FPR2 zapojený do tohto procesu, nie je známe.

Naše experimentálne výsledky ukázali, že liečba nízkou a vysokou dávkou ISL u AKI myší indukovaných cisplatinou môže nielen zlepšiť štruktúru a funkciu obličiek, ale aj znížiť hladinu zápalových cytokínov. Okrem toho môže ISL účinne znižovať hladinu proteínu FPR2 a aktivitu p65. Pretože FPR2 je exprimovaný hlavne v makrofágoch, naznačuje to, že ISL môže zlepšiť zápal obličiek inhibíciou FPR2 v makrofágoch. Vzhľadom na dôležitú úlohu infiltrovaného makrofágu pri zápale obličiek sme potom extrahovali primárne makrofágy odvodené z kostnej drene na in vitro detekciu zlepšujúceho účinku ISL na zápal makrofágov a potenciálny mechanizmus. Naše výsledky ukázali, že ISL môže významne inhibovať LPS-indukovaný zápal makrofágov a down-regulovať expresiu a sekréciu zápalových faktorov IL-1b, IL-6 a TNF-a. Súčasne môže ISL tiež znížiť hladinu proteínov zápalových molekúl v makrofágoch a inhibovať expresiu mRNA a hladiny proteínov FPR2 stimulované LPS. Na overenie kľúčovej úlohy inhibície zápalu FPR2 pomocou ISL sme použili pcDNA3.{18}} Plazmid FPR2 na nadmernú expresiu FPR2 a zistili sme, že v zápalovom makrofágu liečenom ISL nadmerná expresia FPR2 neutralizuje inhibičný účinok ISL na zápal, čo naznačuje, že ISL down-regulovaný zápal makrofágov je hlavne prostredníctvom inhibície FPR2. Predovšetkým sme použili model AKI indukovaný cisplatinou in vivo a vybrali sme model zápalových buniek indukovaných LPS in vitro. Hoci indukčné činidlá týchto dvoch modelov nie sú konzistentné, v súčasnosti sa uznáva, že tieto dve metódy vytvárajú modely zápalu in vivo a in vitro, v danom poradí. Vzhľadom na to, že tento výskum sa zameriava na zápalové reakcie, je možné použiť tieto dve metódy v jednej štúdii.

Tieto údaje dokázali, že ISL môže účinne znížiť expresiu zápalových faktorov in vivo a in vitro a možno ho dosiahnuť inhibíciou expresie FPR2. ISL tak môže slúžiť ako potenciálne terapeutické liečivo pre AKI.

Poďakovanie

Táto práca bola podporená spoločným projektom Luzhou – Southwest MedicalUniversity (2017LZXNYD-P01 a 2018LZXNYD-PT03), Spoločným projektom nemocnice Southwest Medical University – Pridružená nemocnica tradičnej medicíny (2018XYLH-034), projektom výstavby kľúčového laboratória provincie Sichuan Medicine (2018#53), projekt vedy a techniky v Luzhou (2020-JYJ-56) a spoločný špeciálny grant Luzhou Municipal – Southwest Medical University na zavádzanie talentov na vysokej úrovni (tím Lan Hui-Yao ).

Referencie

1. Soares DB, Mambrini JVM, Botelho GR, Girundi FF, Botoni FA, Martins MAP. Lieková terapia a ďalšie faktory spojené s rozvojom akútneho poškodenia obličiek u kriticky chorých pacientov: prierezová štúdia.PeerJ. 2018;6:e5405. e-pub pred tlačou 22.08.2018.

2. Sato Y, Yanagita M. Imunitné bunky a zápal v AKI až CKD progresia.Am J Physiol Ren Physiol. 2018;315(6):F1501eF1512. e-pub pred tlačou 30. 8. 2018.

3. Ram P, Mezue K, Pressman G, Rangaswami J. Akútne poškodenie obličiek po transkatétrovej náhrade aortálnej chlopne.Clin Cardiol. 2017;40(12):1357e1362. e-pub pred tlačou 19. 12. 2017.

4. YH H, IJ C, YF L, YJ C, YH L, HW C. Laktoferín prispieva k renoprotektívnemu účinku pri akútnom poškodení obličiek a včasnej renálnej fibróze.Farmaceutika. 2020;12(5):434.

5. Bonavia A, Singbartl K. Prehľad úlohy imunitných buniek pri akútnom poškodení obličiek.Pediatr Nephrol. 2018;33(10):1629e1639. e-pub pred tlačou 2017/08/ 13.

6. Li J, Tang Y, Tang PMK a kol. Blokujúci inhibičný faktor migrácie makrofágov chráni pred akútnym poškodením obličiek u myší vyvolaným cisplatinou.Mol Ther. 2018;26(10):2523e2532. e-pub pred tlačou 2018/08/06.

7. Ferenbach DA, Sheldrake TA, Dhaliwal K, a kol. Deplécia makrofágov/monocytov klodronátom, ale nie difterický toxín, zlepšuje renálne ischemické/reperfúzne poškodenie u myší.Kidney Int. 2012;82(8):928e933. e-pub pred tlačou 2012/06/08.

8. JQ, JC, BM a kol. Isoliquiritigenín inhibuje aterosklerózu blokovaním expresie TRPC5 kanála.Kardiovaskulárne terapeutiká. 2020;2020:1926249.

9. YG, XL, HY, LP, X C. Isoliquiritigenín má antioxidačné a protizápalové účinky prostredníctvom aktivácie dráhy KEAP-1/Nrf2 a inhibície dráh NF-kB a NLRP3 pri zápale pohrudnice vyvolanej karagénanom.Jedlo& funkciu. 2020;11(3):2522e2534.

10. LS, XY, XY, YW, Q Z. Isoliquiritigenín indukuje apoptózu T24 buniek ľudského karcinómu močového mechúra prostredníctvom mechanizmu nezávislého od cyklín-dependentnej kinázy.Onkologické listy. 2017;14(1):241e249.

11. Wang JR, Luo YH, Piao XJ a kol. Mechanizmy, ktoré sú základom apoptózy indukovanej izoliquiritigenínom a zastavenia bunkového cyklu prostredníctvom dráh MAPK/STAT3/NF- kappaB sprostredkovaných ROS v bunkách ľudského hepatocelulárneho karcinómu.Drug DevRes. 2019;80(4):461e470. e-pub pred tlačou 31. 1. 2019.

12. AH, CS, YY, a kol. Hodnotenie estrogénnej aktivity druhov sladkého drievka v porovnaní s chmeľom používaným v rastlinách na symptómy menopauzy.PLoSJeden. 2013;8(7):e67947.

13. LL L, PM T, CJ L, a kol. Receptor na rozpoznávanie vzorov, Mincle, je nevyhnutný na udržanie fenotypu makrofágov M1 pri akútnom zápale obličiek.Kidney Int. 2017;91(3):587e602.

14. Schroder N, Schaffrath A, Welter JA, et al. Inhibícia receptorov formylpeptidu zlepšuje výsledok na myšom modeli Alzheimerovej choroby.JNeurozápal. 2020; 17 (1): 131. e-pub pred tlačou 26.04.2020.

15. Neymeyer H, Labels R, Reverte V, et al. Aktivácia signalizácie anexínu A1 v renálnych fibroblastoch má antifibrotické účinky.Acta Physiol. 2015;215(3):144e158. e-pub pred tlačou 2015/09/04.

16. FC, MP, RA. Odlišné signálne kaskády vyvolané rôznymi agonistami formylpeptidového receptora 2 (FPR2).Int J Mol Sci. 2013;14(4):7193e7230.

17. HW, XP, YG a kol. Zlúčenina odvodená od Ganodermy-A má inhibičný účinok prostredníctvom formylpeptidového receptora 2.Front Pharmacol. 2020;11:337.

18. Wang Y, Cai J, Tang C, Dong Z. Mitofágia pri akútnom poškodení obličiek a oprave obličiek.Bunky. 2020;9(2). e-pub pred tlačou 2020/02/07.

19. Sato Y, Takahashi M, Yanagita M. Patofyziológia AKI k progresii CKD.Semin Nephrol. 2020;40(2):206e215. e-pub pred tlačou 19.04.2020.

20. Ronco C, Bellomo R, Kellum JA. Akútne poškodenie obličiek.Lancet. 2019;394(10212): 1949e1964. e-pub pred tlačou 30. 11. 2019.

21. PZ, HM J, JW Z, et al. Ochranný účinok izoliquiritigenínu proti cerebrálnemu poškodeniu u septických myší prostredníctvom oslabenia NF-kB.Inflamofarmakológia. 2019;27(4): 809e816.

Obr.Biochem BiophysRes Commun. 2018;506(1):161e168.

23. YW, XC, XG a kol. Isoliquiritigenín zabraňuje progresii symptómov podobných psoriáze inhibíciou NF-kB a prozápalových cytokínov.J MolMed(Berl). 2016;94(2):195e206.