Selektívna cytotoxicita akteozidu rastlinnej látky proti nádorovým bunkám a jej mechanické poznatky

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Christina Cheimonidi a kol

ABSTRAKT

Prírodné produkty sa vyznačujú extrémnou štrukturálnou diverzitou, a preto ponúkajú jedinečný zdroj na identifikáciu nových protinádorových látok. Tu uvádzame, že rastlinná látkaakteozidizolovaný pokročilými fytochemickými metódami z listov Lippia citriodora vykazoval zvýšenú cytotoxicitu proti metastatickým nádorovým bunkám; pôsobil v synergii s rôznymi cytotoxickými činidlami a senzibilizoval chemorezistentné rakovinové bunky.akteozidnebol toxický vo fyziologickom bunkovom kontexte, zatiaľ čo zvyšoval oxidačnú záťaž, ovplyvňoval aktivitu proteostatických modulov a potláčal matricové metaloproteinázy v nádorových bunkových líniách. Intraperitoneálne alebo orálne (prostredníctvom pitnej vody) podávanie akteozidu v modeli myší s melanómom zvýšilo antioxidačné reakcie v nádoroch; avšak iba intraperitoneálne podanie potlačilo rast nádoru a vyvolalo protinádorovo-reaktívne imunitné reakcie. Identifikačné/kvantifikačné analýzy hmotnostnou spektrometriou odhalili, že intraperitoneálne podanieakteozidviedlo k významne vyššej koncentrácii zlúčeniny v plazme a nádoroch liečených myší v porovnaní s perorálnym podávaním, čo naznačuje, že jej protinádorový účinok in vivo závisí od spôsobu podávania a dosiahnutej koncentrácie v nádore. Nakoniec to ukázali štúdie molekulového modelovania a testy enzymatickej aktivityakteozidinhibuje proteínkinázu C. Presvedčivo je akteozid sľubný ako chemický skelet pre vývoj nových protinádorových činidiel.

Kľúčové slová:akteozid, Rakovina, Prírodná zlúčenina, Oxidačný stres, Proteostáza, Imunomodulácia

cistanche akteozid

1. Úvod

Karcinogenéza je charakterizovaná dereguláciou niekoľkých bunkových signálnych dráh a je spojená so zvýšeným bunkovým oxidačným, replikačným, metabolickým, genotoxickým a proteotoxickým stresom [1]. Aby sa prispôsobili a prekonali tieto stresové fenotypy, malígne bunky upregulujú (okrem onkogénov) niekoľko neonkogénnych dráh, ktorých cieľom je buď potlačiť alebo (aspoň) zmierniť prebiehajúci stres. Medzi rôznymi neonkogénnymi dráhami, o ktorých sa zistilo, že sú často upregulované počas tumorigenézy, sú moduly siete proteostázy (PN) spolu s bunkovými antioxidačnými odpoveďami [2,3].

Kľúčovými zložkami PN sú dva hlavné degradačné mechanizmy, a to autofágovo-lyzozómová dráha (ALP) a ubikvitín-proteazómová dráha (UPP), spolu so sieťou bunkových molekulárnych chaperónov. ALP sa podieľa najmä na degradácii proteínových agregátov a poškodených organel [4], zatiaľ čo UPP degraduje normálne proteíny s krátkou životnosťou a neopraviteľné chybne poskladané alebo neposkladané proteíny [5–8]. 26Seukaryotický proteazóm sa skladá z 19S regulačných častíc (RP) a 20 Score častice (CP); posledný sa skladá zo štyroch na seba naložených heptamérnych kruhov (dva typu obklopujú dva typu), ktoré tvoria sudovitú štruktúru. Aktivita proteazómovej peptidázy chymotrypsínu (CT-L), trypsínu podobná (TL) a kaspáza podobná (CL) sa nachádza na 5, 2 a 1 proteazomálnych podjednotkách [6]. Preukázaná klinická účinnosť inhibítorov proteazómu Bortezomib (Velcade®; tiež nazývaná PS-341) a Carfifilzomib proti rôznym hematologickým malignitám [9] poskytla „dôkaz koncepcie“ zamerania sa na UPP ako sľubnú stratégiu pre liečbe rakoviny. Komplexná sieť bunkových antioxidačných obranných dráh, ktorá je často upregulovaná počas karcinogenézy [3,10], zahŕňa antioxidačné enzýmy, ako aj niekoľko transkripčných faktorov, ktoré mobilizujú cytoprotektívne genómové odpovede; medzi ne patrí vidlicový box O (Foxo) a jadrový faktor erytroidný 2-faktor súvisiaci s jadrom (Nrf-2). Nrf-2 je ústredným prvkom ochrany buniek pred oxidačným a/alebo xenobiotickým poškodením, pretože stimuluje expresiu antioxidačných génov a génov fázy II [11-13].

My a iní sme nedávno navrhli, že zacielenie na tieto nádorové závislosti (tj proteostatické moduly a/alebo dráhy antioxidačnej odozvy) alebo zvýšenie bunkových hladín ROS v kontexte transformovaného genotypu ponúka potenciálne terapeutické okno pre selektívne zabíjanie nádorových buniek [3 ,14]; na podporu bolo publikované selektívne zabíjanie rakovinových buniek malou molekulou, ktorá upregulovala bunkové hladiny ROS [2]. Očakáva sa, že kombinačné prístupy zahŕňajúce aj aktiváciu protinádorovo-reaktívnych imunitných odpovedí [15] pravdepodobne maximalizujú terapeutické okno, ktoré ponúka inhibícia PN a antioxidačných odpovedí a/alebo zvýšením hladín bunkových ROS.

Prírodné produkty (extrakty alebo čisté zlúčeniny) (NP) z rôznych zdrojov (rastliny, morské organizmy, mikroorganizmy atď.) sú testované na ich schopnosť pôsobiť ako protinádorové látky v dôsledku ich extrémnej štrukturálnej rozmanitosti a chemickej zložitosti, ako aj preto, pôsobia pleiotropne modulujúco viaceré bunkové signálne dráhy [16]. Údajne NP aktivujú protizápalové, protinádorové a/alebo antimetastatické reakcie [16,17] a tiež sa vyhýbajú rezistencii voči viacerým liekom [18,19]. Spomedzi nich fenolové zlúčeniny (vrátane fenyletanoidových glykozidov) pritiahli značný záujem kvôli ich uvádzanej úlohe pri prevencii a/alebo liečbe rôznych ľudských chorôb.

Akteozid, tiež nazývaný užitie alebo verbaskozid [20], je fenyletanoidový glykozid izolovaný z mnohých dvojklíčnolistových rastlín. Údajne akteozid vykazuje niektoré zaujímavé biologické aktivity vrátane antioxidačných, protizápalových vlastností a vlastností regulujúcich bunkovú apoptózu [21,22]. Napriek tomu sa jeho potenciálna protinádorová aktivita neriešila. Uvádzame tu, že akteozid vykazoval zvýšenú cytotoxicitu proti rakovinovým bunkám cicavcov bez zjavných toxických účinkov vo fyziologických bunkových kontextoch. Okrem toho akteozid potláčal rast melanómového nádoru na myšom modeli Vivo (okrem iného) aktiváciou protinádorových reaktívnych imunitných reakcií.

účinkycistanche akteozid

2. Materiály a metódy

2.1. Rastlinný materiál a extrakcia

sušené listy Lippia citriodora (Lamiaceae) (4,5 kg) boli zakúpené z miestneho trhu v Aténach, Grécko. Listy boli rozdrvené a extrahované mechanickým miešaním počas 12 hodín s metanolom (2 x 20 1). Metanolický extrakt sa odparil do sucha a premyl sa zmesou CH2CI2/MeOH 98/2 (15 1). Nerozpustný zvyšok sa oddelil a vysušil, čím sa získal zeleno-žltý prášok (450 g).

2.2. Purifikácia akteozidu a UPLC-HRMS analýza

Časť (10} g) vyššie uvedeného zvyšku sa podrobila protiprúdovej chromatografii s použitím zariadenia na rýchlu odstredivú deliacu chromatografiu (FCPC) (Kromaton, Francúzsko); ako dvojfázový rozpúšťadlový systém sa použila zmes EtOAc/EtOH/H20 v pomere 5/0,5/4,5. Zozbierané frakcie sa podrobili tenkovrstvovej chromatografii; potom sa chromatogramy pozorovali pod UV lampou (254 a 365 nm) a vizualizovali sa postrekom s metanolom a vanilín sulfátom s následným zahrievaním počas dvoch minút. Vyššie uvedeným spôsobom sa izolovalo celkovo 2,1 g akteozidu (čistota väčšia alebo rovná 90 percentám). Identifikácia akteozidu sa uskutočnila pomocou nukleárnej magnetickej rezonancie (NMR) a hmotnostnej spektrometrie (MS), pričom jeho čistota sa stanovila pomocou UPLC-MS a NMR analýzy; podrobnosti pozri Dod. Materiály a metódy.

2.3. Bunkové línie

Ľudské pľúcne embryonálne fibroblasty (bunky IMR90) spolu s myšacími bunkovými líniami B16.F1, B16.F10, YAC-1 a WEHI-164 boli získané z American Tissue Culture Collection (ATCC). Bunkové línie ľudského osteosarkómu U2 OS a Sa OS láskavo daroval prof. V. Gorgoulis (School of Medicine, National and Kapodistrian University of Athens, Grécko), zatiaľ čo bunky osteosarkómu KH OS a bunkové línie chemorezistentného osteosarkómu [23] boli dar Dr. E. Gonosa (Národná nadácia pre helénsky výskum, Grécko). Myšie rakovinové bunkové línie C5N a A5 patria do viacstupňového modelu karcinogenézy myšacej kože [24,25] a boli darované prof. A. Balmainom (Comprehensive Cancer Center, University of California, USA). Podmienky kultivácie použitých bunkových línií sú uvedené v Suppl. Materiály a metódy.

prospech zcistanche akteozid

2.4. Mužský model myši s melanómom

Myši C57BL/6 (hmotnosť 25–3{27}} g, vek 6–8 týždňov) boli získané z Hellenic Pasteur Institute a umiestnené pod kontrolovanou teplotou (22 stupňov) a fotoperiódou (12 hodín svetlo: 12 hodín tma ) s voľným prístupom k vode a jedlu. Myši boli subkutánne naočkované 105 B16.F1 melanómovými bunkami (v 100 ul PBS) a boli náhodne rozdelené do 3 skupín (n=5/skupina). Keď sa nádory stali hmatateľnými (deň 11), myši dostali akteozid dvoma spôsobmi; buď intraperitoneálne (IP) (1 mg/myš zriedený v 200 μl PBS; celkovo 6 dávok podávaných každý druhý deň) alebo perorálne v pitnej vode (OR) (2,5 mg/myš; celkovo 13 dávok počas 13 po sebe nasledujúcich dní). Kontrolným myšiam sa podával PBS. Rast nádoru sa zaznamenával každé 2 dni meraním hlavnej a vedľajšej osi vytvorených nádorov digitálnym posuvným meradlom. Merania boli transformované na objem nádoru pomocou vzorca: objem nádoru (cm3)=hlavná os x vedľajšia os 2 x 0,5. V deň 28 sa zvieratá usmrtili cervikálnou dislokáciou a asepticky sa odobrali sleziny. Experiment sa opakoval trikrát s podobnými zisteniami.

Splenocyty boli izolované z individuálne homogenizovaných slezín a okamžite testované na ich cytotoxicitu v porovnaní s B16.F1, YAC-1 a WEHI-164 bunkovými cieľmi. Cytotoxicita bola hodnotená na základe detekcie expozície CD107 na bunkovom povrchu v dôsledku degranulácie efektorových buniek. Splenocyty (105 buniek/jamka) sa spoločne kultivovali s cieľmi v 96-jamkových mikroplatniach s dnom U v pomere efektor k cieľu (E:T) 100:1, pri 37 stupňoch v 5 percentách CO2. Do každej jamky sa pridali FITC-konjugované anti-CD107a a anti-CD107b monoklonálne protilátky (25 ul/ml) a monenzín (6 ul/ml; všetky od BD Biosciences). Bunky boli zozbierané o 6 hodín neskôr a analyzované pomocou prietokového cytometra FACSCanto II. Paralelne boli nádory vyrezané a spracované pre následné testy, ako je opísané v Suppl. Materiály a metódy.

cistanche akteozid