Miesto zraniteľnosti SARS-CoV-2 Spike indukuje široko ochrannú protilátku proti antigénne odlišným omikrónovým subvariantom

Rýchly vývoj variantov koronavírusu 2 (SARS-CoV-2) koronavírusu 2 (SARS-CoV{2}}) zdôraznil potrebu identifikácie protilátok so širokými neutralizačnými schopnosťami, ktoré by poskytli informácie o budúcich monoklonálnych terapiách a stratégiách očkovania. Tu sme identifikovali S728-1157, široko neutralizujúcu protilátku (bnAb) zacielenú na receptor viažuce miesto (RBS), ktorá bola odvodená od jedinca predtým infikovaného WT SARS-CoV-2 pred rozšírením varianty obáv (VOC). S728-1157 preukázal širokú krížovú neutralizáciu všetkých dominantných variantov vrátane D614G, Beta, Delta, Kappa, Mu a Omicron (BA.1/BA.2/BA.2.75/BA.4/BA.5/ BL.1/XBB). Okrem toho S728-1157 chránila škrečky pred in vivo napadnutiami vírusmi WT, Delta a BA.1. Štrukturálna analýza ukázala, že táto protilátka sa zameriava na epitop triedy 1/RBS-A v doméne viažucej receptor prostredníctvom viacerých hydrofóbnych a polárnych interakcií s jej oblasťou 3 určujúcou komplementaritu ťažkého reťazca (CDR-H3), okrem bežných motívov v CDR-H1/ CDR-H2 triedy 1/RBS-A protilátky. Dôležité je, že tento epitop bol ľahšie dostupný v otvorenom a prefúznom stave alebo v konštruktoch hrotov stabilizovaných hexaprolínom (6P) v porovnaní s konštruktmi diprolínu (2P). Celkovo S728-1157 demonštruje široký terapeutický potenciál a môže poskytnúť informácie o návrhoch cieľových vakcín proti budúcim variantom SARS-CoV-2.

cistanche tubulosa - zlepšenie imunitného systému

Úvod

Od začiatku pandémie v decembri 2019 viedol vírus ťažkého akútneho respiračného syndrómu koronavírus 2 (SARS-CoV-2) k viac ako 660 miliónom prípadov koronavírusovej choroby 2019 (COVID{6}}) a viac ako 6.5. miliónov úmrtí na celom svete. Hoci rýchly vývoj a distribúcia vakcín a terapeutík do značnej miery obmedzili účinok COVID-19, výskyt cirkulujúcich variantov vyvolávajúcich obavy (VOC) naďalej predstavuje veľkú hrozbu z dôvodu potenciálu ďalšieho úniku imunity a zvýšená patogenita. Variant D614G bol najskorším variantom, ktorý sa objavil a potom sa stal všeobecne rozšíreným. V porovnaní s WT variant D614G vykazoval skôr zvýšenú prenosnosť ako zvýšenú patogenitu, a preto je nepravdepodobné, že by znížil účinnosť vakcín v klinických štúdiách (1). Od objavenia sa D614G do októbra 2021 sa na celom svete vyvinuli 4 ďalšie významné VOC, vrátane Alpha, Beta, Gamma a Delta. Spomedzi týchto variantov sa Delta stala vážnou globálnou hrozbou pre svoju prenosnosť, zvýšenú závažnosť ochorenia a čiastočný imunitný únik, čo dokazuje znížená schopnosť polyklonálneho séra a mAb neutralizovať tento kmeň (2–6). Krátko nato, v novembri 2021, bol variant Omicron identifikovaný a ohlásený ako nový VOC. Tento variant mal doteraz najväčší počet mutácií a zdalo sa, že sa šíri rýchlejšie ako predchádzajúce kmene (7, 8). V súčasnosti existuje široká škála podlínií Omicron, ktoré vedú k novým prípadom COVID{21}}, pričom BQ.1, BQ.1.1 a XBB.1.5 sa stávajú dominantnými nad BA.5 a v tom čase predstavujú väčšinu nových prípadov na celom svete písania. Varianty Omicron môžu v rôznom rozsahu uniknúť rozpoznaniu imunity spojenej s vakcínou COVID{28}}, čím sa výrazne zníži neutralizačná schopnosť sérových protilátok od rekonvalescentných jedincov, ktorí sú plne očkovaní mRNA, a jedincov posilnených novou bivalentnou WT/BA.5 mRNA vakcína (9, 10). Podobne boli varianty Omicron schopné uniknúť väzbe niekoľkých terapeutických mAb na núdzové použitie (EUA), aj keď sa predtým ukázalo, že sú účinné proti skorším VOC (10–12). Vzhľadom na zníženú neutralizáciu proti Omicron a pokračujúcu hrozbu budúcich prchavých organických zlúčenín existuje naliehavá potreba identifikovať široké a silné neutralizačné protilátky, ktoré môžu chrániť pred rôznymi, vyvíjajúcimi sa líniami SARS-CoV-2. V tejto štúdii sme identifikovali silnú receptor viažucu doménu-reaktívnu (RBD-reaktívnu) mAb z periférnej krvi SARS-CoV-2-konvalescentného jedinca, ktorý účinne neutralizoval alfa, beta, kappa, delta, mu, a Omicron varianty (BA.1, BA.2, BA.2.75, BA.4, BA.5, BL.1 a XBB). Táto mAb, S728-1157, významne znížila BA.1 Omicron, Delta a WT vírusovú záťaž v pľúcach a nosovej sliznici po in vivo stimulácii u škrečkov. S728-1157 viaže receptor viažuce miesto (RBS), ktoré je úplne exponované, keď je RBD na hrote v konformácii nahor. mAb využíva motívy nachádzajúce sa v CDR-H1 a CDR-H2, ktoré sú spoločné pre protilátky IGHV3-53/3-66 triedy 1/RBS-A (13, 14), ale aj prostredníctvom rozsiahlych jedinečných kontaktov s CDR -H3 na obídenie mutácií vo vrcholoch VOCs. To naznačuje, že racionálny návrh budúcich zosilnení vakcíny pokrývajúcich varianty Omicron by sa mal upraviť tak, aby predstavoval stabilizovaný hrot v konfigurácii väčšinou hore, aby sa optimálne indukovali mAb triedy 1/RBS-A, ktoré majú podobné vlastnosti CDR-H3.

cistanche benefity-posilňujú imunitný systém

Výsledky

Izolácia RBD-reaktívnych mAb, ktoré vykazujú rôzne vzorce neutralizácie a účinnosti. Pred rozšírením línií Omicron sme predtým charakterizovali 43 mAb zacielených na odlišné epitopy na spike proteíne, vrátane N-terminálnej domény (NTD), RBD a podjednotky 2 (S2). Žiadna z týchto protilátok nebola schopná neutralizovať varianty SARS-CoV-2, ktoré v tom čase cirkulovali (15). V tejto štúdii bol exprimovaný ďalší panel RBD-reaktívnych mAb od 3 jedincov s vysokou odpoveďou, ktorí mali silné anti-spike IgG odpovede, ako bolo definované vyššie (16) (doplnkové tabuľky 1 a 3; doplnkový materiál dostupný online s týmto článkom; https://doi.org/10.1172/JCI166844DS1). Hoci podiel B-buniek viažucich sa na vrchol RBD bol podobný u vysoko odpovedajúcich osôb v porovnaní so strednými a nízko reagujúcimi (obrázok 1, A–C), miera somatickej hypermutácie ťažkého reťazca bola významne vyššia v skupine s vysokou odpovedou (obrázok 1 , D a E), čo naznačuje, že títo jedinci môžu mať najvyšší potenciál vytvárať silné skrížene reaktívne mAb (16). Tieto protilátky boli ďalej skúmané proti mutantom RBD, aby sa identifikovali ich klasifikácie epitopov (17). Medzi 14 RBD-reaktívnymi mAb sme identifikovali 4 mAb triedy 2, 2 mAb triedy 3 a 8 neklasifikovaných mAb, ktoré vykazovali malé alebo žiadne zníženie väzby proti akýmkoľvek kľúčovým testovaným mutantom RBD (obrázok 1F). Treba poznamenať, že protilátky triedy 2, triedy 3 a triedy 4 približne zodpovedajú epitopom RBS BD, S309 a CR3022 definovaným v predchádzajúcich štúdiách (13, 18). mAb triedy 2 a 3 RBD nerozpoznali multivariantný mutant RBD obsahujúci substitúcie K417N/E484K/L452R/N501Y, umelo navrhnutý RBD tak, aby zahŕňal kľúčové mutácie na únik vírusu (17, 18), ani nepreukázali žiadnu krížovú reaktivitu s RBD SARS-CoV-1 a blízkovýchodný respiračný syndróm (MERS)-CoV (obrázok 1F). Funkčne mAb triedy 2 a 3 RBD silne neutralizovali varianty D614G a Delta, ale neutralizačná aktivita bola obmedzenejšia proti Beta, Kappa a Mu (obrázok 1G). Žiadna z testovaných protilátok triedy 2 alebo 3 neneutralizovala žiadny testovaný variant Omicron.

Na rozdiel od toho sa väčšina neklasifikovaných mAb viazala na multivariant RBD a skrížene reagovala na SARS-CoV-1 RBD (obrázok 1F). Spomedzi nich sme identifikovali 3 mAb, S451-1140, S626-161 a S{7}}, ktoré vykazovali vysokú neutralizačnú účinnosť proti D614G a krížovo neutralizované beta, delta, kappa, mu a Omicron BA.1 s 99 % inhibičnou koncentráciou (IC99) v rozsahu 20–2 500 ng/ml (obrázok 1G). Vzhľadom na širokú neutralizačnú silu týchto 3 mAb sme okrem platformy na testovanie plakov vykonali aj neutralizačnú aktivitu proti autentickým BA.2.75, BL.1 (BA.2.75+R346T), BA.4, BA.5 a XBB vírusy s použitím neutralizačného testu redukcie ohniska (FRNT) (obrázok 1G). Z nich S728-1157 vykazoval vysoké neutralizačné aktivity proti panelu variantov Omicron vrátane BA.1, BA.2, BA.4 a BA.5, s IC99 až do 100 ng/ml, merané pomocou plakový test. Podobný scenár bol pozorovaný pri použití FRNT, kde si S728-1157 zachoval svoju vysokú neutralizačnú aktivitu voči BA.2.75, BL.1, BA.4, BA.5 a XBB s IC50 v rozsahu 8–300 ng /ml (obrázok 1G). S451-1140 neutralizoval BA.1, BA.2, BA.2.75 a BL.1 silne, ale nie BA.4 a BA.5, ako bolo pozorované na oboch platformách neutralizačných testov. Na druhej strane, S626-161 nepreukázal neutralizačnú aktivitu proti variantom Omicron za variantom BA.1 (obrázok 1G). Hoci S626-161 mal nižšiu neutralizačnú účinnosť voči testovaným VOC ako ostatné 2 protilátky, bola to jediná mAb, ktorá vykazovala skríženú reaktivitu nielen voči SARS CoV-1 RBD, ale bola schopná neutralizovať aj netopiere koronavírusy WIV-1 a RsSHC014 (obrázok 1, F a G). Tieto údaje naznačujú, že S626-161 rozpoznáva konzervovaný epitop, ktorý je zdieľaný medzi týmito arbovírusovými líniami, ale chýba v kmeňoch BA.2 a neskorších. Okrem toho má S728-1157 a S{65}} v porovnaní s S728-1157 a S{65}} dlhšiu CDR-H3, ktorá by mohla poskytnúť vylepšenú schopnosť rozpoznať vysoko konzervovanú záplatu zvyškov zdieľaných medzi arbovírusmi, ako je opísané v predchádzajúcej štúdii (19) (doplnkový obrázok 1). Pri porovnaní variabilných génov imunoglobulínového ťažkého (IGHV) a ľahkého reťazca (IGLV alebo IGKV) týchto 3 mAb s dostupnou databázou SARS-CoV-2 neutralizujúcich mAb (13, 15, 20–27) sme zistili, že ťažký reťazec variabilné gény používané S728-1157 (IGHV3-66), S451-1140 (IGHV3-23) a S626-161 (IGHV4-39) majú už bolo hlásené, že kóduje niekoľko silne neutralizujúcich protilátok SARS-CoV-2 zameraných na RBD (21, 22, 28, 29). Avšak iba S728-1157 mal jedinečné páry variabilných génov ťažkého a ľahkého reťazca, ktoré neboli uvedené v databáze (doplnková tabuľka 3), čo naznačuje, že nejde o verejný klonotyp.

Obrázok 1. Charakterizácia RBD-reaktívnych mAb izolovaných z COVID-19 – rekonvalescentných jedincov

Tieto 3 mAb (S451-1140, S{2}} a S728-1157) boli ďalej charakterizované, aby sa určila ich šírka väzby voči SARSCoV-2 VOC (obrázok 2, A a B) . Predfúzne stabilizovaný hrot obsahujúci 2-prolínové substitúcie v podjednotke S2 ​​(2P; diprolín) sa ukázal ako lepší imunogén v porovnaní s hrotom WT a je základom niekoľkých súčasných SARS-CoV-2 vakcíny, vrátane vakcín na báze mRNA (30, 31). Nedávno sa uvádza, že spike proteín stabilizovaný 6 prolínmi (6P; hexaprolín) zvyšuje expresiu a je dokonca stabilnejší ako pôvodný diprolínový konštrukt; v dôsledku toho bola navrhnutá na použitie v ďalšej generácii vakcín COVID{17}} (32, 33). Na určenie, či existujú rozdiely v antigénnosti medzi konštruktmi s hrotmi diprolínu a hexaprolínu, boli do nášho testovacieho panelu zahrnuté oba imunogény. Pri meraní pomocou ELISA sme zistili, že 3 mAb viazali 6P-WT spike antigén vo väčšej miere v porovnaní s WT-2P spike (obrázok 2, A a B). Všetky 3 mAb vykazovali porovnateľnú väzbu s vrcholmi vírusov Alpha, Beta, Gamma a Delta v porovnaní s väzbami WT-2P (obrázok 2, A a B). Avšak väzbové reaktivity týchto 3 mAb boli podstatne znížené proti panelu antigénov rodiny Omicron (obrázok 2, B a C). S451-1140 väzba bola citlivá na mutácie nájdené v BA.1 a BA.2, čo viedlo k veľkému zníženiu väzby a 31-násobnému zníženiu neutralizácie proti týmto variantom v porovnaní s WT-2 P antigén a vírus D614G, v danom poradí (obrázok 2B). Krížovo neutralizujúca mAb sarbekovírusu, S626-161, tiež vykazovala 1.2- až 3.5-násobne zníženú väzbu na hrot BA.1 antigénu, čo môže byť príčinou {{45} }-násobné zníženie neutralizačnej aktivity proti BA.1 (obrázok 1G a obrázok 2, B a C). V prípade najsilnejšej široko neutralizujúcej protilátky (bnAb), S728-1157, bola väzba na antigény Omicron znížená v menšom rozsahu (v rozsahu od 1.1- do 44-násobne) v porovnaní s WT-2P stúpol a neutralizačná aktivita nebola ovplyvnená (obrázok 1G a obrázok 2, B a C). Podstatný pokles vo väzbe mAb neutralizujúcej Omicron na vrchol BA.1 môže byť spôsobený zmenami v jeho mobilite a súvisí s tesným zabalením Omicron 3-štruktúry znižujúcej RBD a preferenciou pre 1- up RBD, ktoré pomáhajú pri vyhýbaní sa protilátkam, ako uvádza predchádzajúca štúdia (34). Stabilizačné mutácie 2P a 6P majú tiež rozdielne účinky vo variantoch Omicron, kde všetky 3 mAb vykazovali viac ako 2.{67}}násobne zvýšenú väzbu na hrot BA.{68}}P v porovnaní s BA.1-2P verzia, ale len okrajovo zvýšená väzba na spike BA.2 a BA.4/5 6P verzie v porovnaní s ich 2P verziami 1,2 × až 1,4 ×, čo naznačuje o niečo lepšiu dostupnosť mAb neutralizujúcich Omicron k hexapólovým verziám, najmä pre konštrukt spike BA.1. Okrem ELISA sa na kvantifikáciu rýchlosti viazania a rovnovážnych konštánt (kon, koff a KD) týchto 3 mAb na panel spikových antigénov (doplnkový obrázok 2) použila biovrstvová interferometria (BLI). Koncové miery rozpoznávania fragmentu väzby antigénu (Fab) na hroty hexaprolínu boli 1.5- až 3.{85}}krát rýchlejšie v porovnaní s hrotmi diprolínu (doplnkový obrázok 2, B a C), čo ukazuje, že protilátky sa viazali na 6P konštrukt rýchlejšie ako na 2P konštrukt. To by sa dalo očakávať, keby boli epitopy prístupnejšie na RBD v otvorenom stave na hexaprolínovom hrote. Okrem S626- 161 sa Fab oddeľovali od hexaprolínovej špičky pomalšie (mali nižší koff) ako diprolínovej špičky, takže celková KD ukázala, že S728-1157 a S451-1140 sa viazali na hexaprolínový hrot s väčšou afinitou (doplnkový obrázok 2, B a C). Zvýšenie väzby na hexaprolínovú špičku bolo ešte výraznejšie pre intaktný IgG pomocou modelu interakcie 1:2, ako ukazujú S728-1157 a S{96}} mAb, čo je v súlade s expozíciou viacerých epitopov s 6P stabilizáciou umožňujúcou zlepšená avidita (doplnkový obrázok 2, A a C). Celkovo tieto výsledky naznačujú, že cielené epitopy môžu byť porovnateľne dostupnejšie na 6P-stabilizovanom hrote, keď je RBD v otvorenom stave. Ďalej sa uskutočnili štrukturálne analýzy na overenie tejto domnienky.

Obrázok 2. Väzbová šírka Omikrón-neutralizujúcich mAb

Štrukturálna analýza široko neutralizujúcich mAb. Ako prvá aproximácia viazaných epitopov sa použil kompetičný test ELISA, aby sa určilo, či tieto 3 široko neutralizujúce mAb zdieľajú nejaké prekrytie s naším súčasným panelom mAb, súborom mAb so známymi epitopovými špecificitami z predchádzajúcich štúdií (15, 25, 35) a 2 ďalšie mAb, ktoré sa v súčasnosti klinicky používajú, LY-CoV555 (Eli Lilly) (36) a REGN10933 (Regeneron) (37). Väzbové miesta S451-1140 a S{11}} sa čiastočne prekrývali s CC12.3 (23, 25), neutralizačnou protilátkou triedy 1, a väčšinou protilátok triedy 2 vrátane LY-CoV555 a REGN10933, ale nie s protilátkami triedy 3 a triedy 4 (obrázok 3A). S626-161 zdieľal pozoruhodné prekrytie vo väzbovej oblasti s triedou 1 CC12.3, niekoľkými protilátkami triedy 4 vrátane CR3022 a ďalšími neklasifikovanými protilátkami, pričom sa čiastočne prekrýval s niekoľkými protilátkami triedy 2 a jednou protilátkou triedy 3 (obrázok 3A). Analogicky, konkurenčný test BLI odhalil, že S451-1140 a S728-1157 navzájom silne súťažili o väzbu na vrchol WT-6P, zatiaľ čo S626-161 nie (doplnkový obrázok 3). Celkovo tieto údaje naznačujú, že S451-1140 a S{39}} rozpoznávajú podobné epitopy, ktoré sa líšia od S626-161.

Obrázok 3. Mechanizmus širokej neutralizácie S728-1157

Protilátka S728-1157 bola kódovaná IGHV3-66 a mala krátku oblasť 3 určujúcu komplementaritu (CDR-H3). Najmä mAb, ktoré viažu RBS vo väzbovom režime 1 (tj miesto RBS-A alebo triedy 1), typizované CC12.1, CC12.3, B38 a C105 (13, 18, 23, 29, 38, 39), majú tendenciu používať IGHV3-53 alebo 3-66 a sú citlivé na mutácie VOC (40). Avšak oblasť CDR-H3 S728-1157 je veľmi odlišná od iných protilátok tejto triedy, čo potenciálne zodpovedá za jej širšiu aktivitu. Aby sme pochopili štrukturálny základ širokej neutralizácie pomocou S728-1157 v tomto epitope, vyriešili sme štruktúru kryoelektrónovej mikroskopie (kryo-EM) (obrázok 3B) IgG S728-1157 v komplexe s hrotom WT{ {31}}P-Mut7, verzia hrotového WT-6P, ktorá má interprotomérnu disulfidovú väzbu na C705 a C883, v globálnom rozlíšení približne 3,3 Á (doplnkový obrázok 4E). Pomocou expanzie symetrie, zameranej klasifikácie a metód spresnenia sme dosiahli lokálne rozlíšenie na rozhraní RBD-Fv približne na 4 Á (doplnkový obrázok 4E a doplnková tabuľka 8). Kryštalická štruktúra S728-1157 Fab sa určila s rozlíšením 3,1 Á a použila sa na zostavenie atómového modelu na rozhraní RBD-Fv. Naše štruktúry potvrdzujú, že S728-1157 sa viaže na epitop RBS-A (alebo triedy 1) v konformácii RBD-up (obrázok 3B a doplnkový obrázok 4E), podobne ako iné IGHV3-53/{{55} } protilátky (obrázok 3C). Stérická blokáda väzbového miesta angiotenzín-konvertujúceho enzýmu 2 (ACE2) pomocou S728-1157 vysvetľuje jeho vysokú neutralizačnú účinnosť proti SARS-CoV-2. Motív 32NY33 a motív 53SGGS56 (23) v S728-1157 CDR-H1 a -H2 interagujú s RBD takmer rovnakým spôsobom ako CC12.3 (doplnkový obrázok 4, B a C). V porovnaní s VH 98DF99 v CC12.3 však VH 98DY99 v S728-1157 CDR-H3 vytvára rozsiahlejšie interakcie, vrátane hydrofóbnych aj polárnych interakcií, s RBD, čo môže zodpovedať za širokú neutralizáciu proti VOC (obrázok 3D a doplnkové tabuľky 6 a 7). Diglycín VH 100GG101 v S728- 1157 CDR-H3 môže tiež uľahčiť rozsiahlejšiu väzbu v porovnaní s VH Y100 v CC12.3, pravdepodobne vďaka flexibilite glycínových zvyškov, ktorá vedie k odlišnej konformácii špičky CDR -H3 slučka a relatívny posun zvyškov na 98DY99.

cistanche tubulosa - zlepšenie imunitného systému

Kliknite sem pre zobrazenie produktov Cistanche Enhance Immunity

【Požiadať o viac】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Hoci Omicron VOC majú rozsiahle mutácie v RBD, väčšina týchto zvyškov neinteraguje s S728-1157, pretože väzba je stále pozorovaná (doplnkový obrázok 4A). Z nášho špičkového modelu WT-6P-Mut7 + Fab S728-1157 sa predpokladá, že Y505 až VL Q31 a E484 až VH Y99 vytvoria vodíkové väzby (doplnkový obrázok 4D a doplnková tabuľka 6 ), ktoré majú potenciál byť narušené omikrónovými mutáciami Y505H a E484A. Mutácia Y505H by však stále umožňovala vodíkovú väzbu s VL Q31 a mutácia E484A by pridala ďalší hydrofóbny bočný reťazec blízko hydrofóbnych zvyškov VL Y99, F456 a Y489. Tieto kontakty môžu čiastočne vysvetliť mechanizmus, ktorý umožňuje S728-1157 zachovať si neutralizačnú aktivitu, aj keď zníženú, proti hrotovému antigénu BA.1 (obrázok 1G a obrázok 2B). Antigén BA.1 zase možno súvisí s mutáciami Omicron, ktoré menia konformačnú krajinu spike proteínu (34). Avšak niekoľko somaticky mutovaných zvyškov, tj VH L27, L28, R31, F58 a VL V28 a Q31, v S728-1157 sa podieľa na interakcii so SARS-CoV-2 RBD (doplnkový obrázok 1 a Doplnková tabuľka 7), čo môže tiež prispieť k jeho širokej reaktivite v porovnaní s CC12.3. Celkovo naše štrukturálne štúdie odhalili základ širokej neutralizácie S728-1157, ktorá dokáže pojať väčšinu mutácií vo VOC SARS-CoV{41}}.

Obrázok 4. Ochranná účinnosť bnAb proti infekcii SARS-CoV-2 u škrečkov.

S728-1157 znižuje replikáciu SARS-CoV-2 BA.1 Omicron, Delta a WT SARS-CoV-2 u sýrskych škrečkov. Na vyhodnotenie ochrannej účinnosti našich široko neutralizujúcich mAb sme použili zlatý model infekcie sýrskeho škrečka, ktorý sa široko používa pri SARS-CoV-2. Škrečky dostali 5 mg/kg našich testovaných mAb alebo izotypovú kontrolu zameranú na irelevantný antigén (glykoproteín ebolavírusu) intraperitoneálnou injekciou 1 deň po infekcii vírusmi SARS CoV{10}}. Pľúcne a nazálne tkanivá sa odobrali 4 dni po infekcii (obrázok 4A). Terapeutické podávanie S728-1157 malo za následok znížené titre variantov WT, BA.1 Omicron a Delta v nosových mušľách a pľúcach infikovaných škrečkov (obrázok 4, B–D). Je zaujímavé, že účinok S728-1157 v pľúcach bol dramatický, pričom sa znížila vírusová záťaž WT a BA.1 Omicron približne o 104 PFU, pričom vírusové titre variantu BA.1 Omicron boli úplne zrušené (obrázok 4C). Na rozdiel od neutralizácie in vitro (obrázok 1G), S451-1140 neznížil replikáciu BA.1 Omikrónového vírusu v pľúcnych a nosných mušľách, čo naznačuje nesúlad medzi neutralizáciou in vitro a ochranou in vivo pre tento klon (obrázok 4E) . Na porovnanie, podávanie S626-161 viedlo k marginálne významnému zníženiu titrov pľúcnych vírusov po stimulácii WT a BA.1 (obrázok 4, F a G). Tieto údaje podčiarkujú, že na presnú definíciu všeobecne ochranných mAb je potrebné vyhodnotenie účinnosti ochrany súbežne s neutralizačnou aktivitou. V budúcnosti bude zaujímavé preskúmať, do akej miery je ochranná kapacita S728-1157 závislá od Fc. Celkovo S728-1157 predstavuje sľubnú mAb so širokou neutralizačnou účinnosťou proti variantom SARS CoV{31}}, ktoré sú schopné dramaticky znížiť replikáciu WT, Delta a BA.1 in vivo.

Infekcia SARS-CoV-2 zriedkavo vyvoláva silné skrížene neutralizujúce mAbs podobné S728-1157. Vzhľadom na krížovú neutralizáciu a profylaktický potenciál S728-1157 sme sa snažili vyhodnotiť, či sú protilátky podobné S728–1157 bežne indukované medzi polyklonálnymi odpoveďami u pacientov so SARS-CoV-2. Aby sme to vyhodnotili, vykonali sme kompetičné ELISA s použitím rekonvalescentného séra na detekciu titrov protilátok anti-RBD, ktoré by mohli súťažiť o väzbu s S728-1157 (obrázok 5A). Subjekty boli rozdelené do 3 skupín na základe veľkosti protilátkových reakcií, ako bolo definované vyššie (15, 16). Hoci osoby s vysokou a strednou odpoveďou mali vyššie titre S728-1157-konkurenčných sérových protilátok v porovnaní s osobami s nízkou odpoveďou (obrázok 5B), titre boli vo všetkých skupinách dosť nízke, čo naznačuje, že je nezvyčajné získať vysoké hladiny S{{ 18}-podobné protilátky v polyklonálnom sére po infekcii WT SARS-CoV-2. Okrem S728-1157 sme testovali konkurenciu rekonvalescentného séra s inými mAb vrátane S451- 1140, S626-161, LY-CoV555, REGN10933, CR3022 a CC12.3. Podobne ako v prípade S728-1157 sme pozorovali relatívne nízke titre protilátok konkurujúcich S451-1140, S626-161, LY-CoV555, REGN10933 a CC12.3 v polyklonálnom sére od väčšiny rekonvalescentov jedincov (obrázok 5, C–F a H). Napriek tomu pacienti s vysokou odpoveďou mali tendenciu mať výrazne vyššie titre proti tým, ktoré neutralizovali mAb, ako osoby s nízkou odpoveďou (obrázok 5, B–F a H). Naopak, protilátky zacielené na miesto epitopu CR3022 boli výraznejšie u pacientov v rekonvalescencii, čo naznačuje obohatenie RBD protilátok triedy 4 v polyklonálnom sére (obrázok 5G). Pozoruhodné je, že medzi 3 skupinami respondentov nebol žiadny významný rozdiel v titroch CR3022, čo naznačuje, že protilátky v mieste CR3022-boli konzistentne indukované počas infekcie WT SARS-CoV-2 u väčšiny jedincov. Je zaujímavé, že v porovnaní s CC12.3 bol S728-1157 detegovaný v 4-krát nižších hladinách v sére pacientov s vysokou odpoveďou. Takže napriek tomu, že protilátky triedy 1 sú často indukované prirodzenou infekciou a očkovaním (14, 20, 28, 29, 41–43), naše údaje naznačujú, že protilátky podobné S728–1157, ktoré predstavujú podskupinu tejto triedy, sú pomerne zriedkavé.

Okrem toho sme skúmali rozdiel v reaktivite na 2P oproti 6P-stabilizovaným hrotom v našich sérach zotavujúcej sa kohorty (obrázok 5, I–K). Zistili sme, že všetky 3 skupiny respondentov nasadili anti-spike reaktívne protilátky proti 6P-stabilizovaným spike WT vo väčšej miere ako 2P-stabilizovaným spike WT, 6- až 11-násobne (obrázok 5J), čo naznačuje, že hlavné antigénne epitopy boli lepšie vystavené alebo stabilizované na 6P-stabilizovanom antigéne. Pri použití tých istých vzoriek mali pacienti s vysokou a strednou odozvou tiež nižšie titre anti-spike protilátok proti BA.{17}}P ako BA.{18}}P, 4- až 5-krát (obrázok 5K). Je potrebné poznamenať, že respondenti s nízkou odpoveďou mali menšiu násobnú zmenu vo väzbovej reaktivite proti špičke BA.1 Omicron-2P a 6P (2-násobné zníženie) v porovnaní s vrcholom WT-2P a 6P ({ {28}}násobné zníženie) (obrázok 5, J a K), čo naznačuje, že sérová protilátka proti BA.1 omikrón-reaktívnym epitopom môže byť obmedzenejšia u jedincov s nízkou odpoveďou. Celkovo tieto údaje naznačujú, že existuje zlepšená polyklonálna väzba indukovaná prirodzenou infekciou na 6P-stabilizovaný hrot, a to pre vírusy WT aj Omicron.

Protilátky podobné S728–1157 sú optimálne indukované v kontexte hybridnej imunity. Primárna infekcia SARS-CoV-2 bez očkovania sa v súčasnom globálnom prostredí stala zriedkavou a niekoľko štúdií uvádza, že imunita voči SARS-CoV-2 sa medzi jednotlivcami so špecifickou históriou očkovania/infekcie líši. V dôsledku toho sme sa ďalej snažili zistiť, ktoré bežné expozície, okrem infekcie WT samotným predkovým SARS-CoV-2, by účinne indukovali protilátky podobné S728–1157 v plazme od očkovaných jedincov na báze monovalentnej mRNA s predchádzajúcimi alebo bez nich. infekcia. Potrebnú biovzorku sme získali od kohorty štúdie Protection Associated with Rapid Imunity to SARS-CoV-2 (PARIS), ktorá dlhodobo sledovala zdravotníckych pracovníkov od začiatku pandémie (44). Vybrali sme vzorky plazmy od plne imunizovaných (2 × očkovaných) účastníkov štúdie s infekciou a bez nej, ako aj od posilnených účastníkov (3 × očkovaných) s infekciou a bez nej. Okrem toho sme zahrnuli aj vzorky od účastníkov štúdie, ktorí dostali bivalentnú mRNA vakcínu (predkov WA1/2020 plus Omicron BA.5) (obrázok 6A a doplnková tabuľka 2). K prelomovým infekciám u účastníkov, ktorí dostali posilňovacie očkovanie, došlo v čase, keď línie Omicron vytlačili všetky ostatné línie SARS-CoV-2 v metropolitnej oblasti New Yorku. Zistili sme, že dvojito očkovaní jedinci mali najnižšie titre S728-1157 kompetitívnych sérových protilátok spomedzi 5 testovaných skupín vzoriek (obrázok 6B). Je pozoruhodné, že tieto hladiny boli podobné hladinám pozorovaným v našej kohorte bez očkovania v rekonvalescencii (všetci respondenti; obrázok 5B). Na porovnanie, jedinci s prirodzenou infekciou v anamnéze, vrátane jedincov v rekonvalescencii s 2 z 3 dávok vakcíny, a jedincov, ktorí prekonali prelomovú infekciu a dostali bivalentnú posilňovaciu dávku, vykazovali významne vyššie úrovne elicitácie S{31}} v porovnaní s neinfikovanými ale očkovaných jedincov (obrázok 6B). Hoci neinfikovaná 3-dávková skupina vykazovala iba nevýznamný nárast v porovnaní s 2-dávkovou skupinou, párové rozdelenie podľa typu vakcíny naznačovalo, že homológne tretie dávky BNT162b2 a mRNA-1273 významne zvýšili S{{ 38}} ako titre neutralizačných protilátok 2,72 x a 2,85 x, v danom poradí (obrázok 6, C a D). Treba poznamenať, že medzi účastníkmi s 3 celkovými kontaktmi s prudkým nárastom akýmkoľvek spôsobom boli titre protilátok podobných S728-1157-3-krát vyššie u rekonvalescentných dvojitých vakcín v porovnaní s trojnásobnými vakcínami bez predchádzajúcej infekcie, čo naznačuje, že SARS-CoV{{ 51}} infekcia optimálnejšie indukuje tento klonotyp. Medzi skupinami s hybridnou imunitou sme zaznamenali, že väčšina jedincov s posilňovacou dávkou s prelomom, ktorí dostali dávku bivalentnej posilňovacej vakcíny, mala len nepatrne vyšší titer protilátok S728-1157 v porovnaní so skupinami s predomikrónovým rekonvalescentným očkovaním, čo naznačuje, že S{{53} }} titer sa pravdepodobne blížil k plató po 3 expozíciách. Skúmali sme tiež titre polyklonálnych protilátok, ktoré súťažili s CC12.3 a CR3022 okrem S728-1157. Všetci jedinci vykazovali relatívne vysoké titre CC12.3- a protilátok podobných CR{61}}, nezávisle od počtu a typu expozícií (doplnkový obrázok 5), na rozdiel od toho, čo sme pozorovali pre S728-1157- ako protilátky. Celkovo tieto údaje naznačujú, že infekcia SARS-CoV{65}} a očkovanie mRNA prispievajú k indukcii protilátok podobným S{66}}, pričom infekcia hrá dominantnejšiu úlohu u očkovaných jedincov.

cistanche tubulosa - zlepšenie imunitného systému

Nakoniec, pri porovnávaní odpovedí proti 2P- verzus 6P-stabilizovanému hrotu v mRNA-vakcinačnej kohorte sme zistili, že väčšina skupín vyvolala podobné hladiny protilátok proti obom konštruktom. Výnimkou bola neinfikovaná trojnásobne očkovaná skupina, ktorá vykazovala štatisticky vyššiu, aj keď len mierne zvýšenú, reaktivitu na 2P v porovnaní s 6P-stabilizovaným hrotom (obrázok 6E). Tieto údaje naznačujú, že na rozdiel od prirodzenej infekcie (obrázok 5, J a K) samotná vakcinácia vytvára polyklonálnu odpoveď, ktorá je viac obmedzená na epitopy v konštrukte Spike{11}}P, v súlade s konštruktom Spike{12 }}P formulácia súčasných vakcín. Tieto zistenia v konečnom dôsledku podporujú myšlienku, že 6P-stabilizácia budúcich vakcín proti SARS-CoV-2 by mohla byť veľkým prínosom pri indukcii široko ochranných klonotypov protilátok, ako je S{17}}.

Obrázok 5. Konvalescentná sérová protilátková súťaž so široko neutralizujúcimi RBD-reaktívnymi mAb a porovnanie sérovej protilátkovej odpovede proti 6P- verzus 2P-stabilizovaným hrotom

Obrázok 6. Kompetícia sérových protilátok očkovaných mRNA s S728-1157 neutralizujúcimi RBD-reaktívnymi mAb a porovnanie sérovej protilátkovej odpovede proti 6P- verzus 2P-stabilizovaným hrotom.

Diskusia

V tejto štúdii identifikujeme silný bnAb izolovaný z pamäťovej B bunky jednotlivca, ktorý sa zotavil z infekcie SARS-CoV-2 počas počiatočnej vlny pandémie COVID-19. Tento bnAb, S728- 1157, si zachoval podstatnú väzbovú reaktivitu a mal konzistentnú neutralizačnú aktivitu voči všetkým testovaným SARS-CoV-2 VOC, vrátane Omicron BA.1, BA.2, BA.2.75, BL.1 ( BA.2.75+R346T), BA.4, BA.5 a XBB a bol schopný podstatne znížiť infekčné vírusové titre po infekcii Delta a BA.1 u škrečkov.

Zistili sme, že rekonvalescentné sérum z našej kohorty obsahovalo nízke koncentrácie protilátok, ktoré konkurujú S728-1157 (protilátka triedy 1/ RBS-A) a epitopu mAb triedy 2. To naznačuje, že S728-1157 je trochu jedinečný v porovnaní s inými protilátkami, ktoré sa zameriavajú na epitopy triedy 1, a je zriedkavo indukovaný v RBD-špecifickej pamäťovej B bunkovej skupine. Namiesto toho sa zdá, že naša prirodzená infekčná kohorta indukuje protilátky zacielené na epitop CR3022 (trieda 4); protilátky tejto špecifickosti sú často skrížene reaktívne, ale menej silne neutralizujúce ako protilátky zacielené na RBS (14, 17). Tieto údaje dopĺňajú naše predchádzajúce zistenia, ktoré dokazujú, že množstvo protilátok triedy 3/S309 v rekonvalescentných sérach môže prispieť k neutralizačnej aktivite proti variantom Alfa a Gamma, zatiaľ čo nedostatok protilátok triedy 2 môže zodpovedať za zníženú neutralizačnú schopnosť proti Delta (15). . Napriek tomu sa uvádza, že šírka aktivity väčšiny týchto protilátok zacielených na RBS (RBS-A/trieda 1, RBS-B, C/trieda 2 a RBS-D, S309/trieda 3) proti variantom Omicron je veľmi obmedzená (11, 40, 45).

Kľúčovou výzvou vpred bude určiť, ako zlepšiť vyvolanie široko skrížene reaktívnych protilátok na konzervované epitopy RBS. V tejto súvislosti sme tu pozorovali, že jedinci s hybridnou imunitou mali výrazne vyššie titre protilátok podobných S728-1157- ako očkovaní jedinci bez predchádzajúcej infekcie. Dôležité je, že tento jav bol zaznamenaný aj vtedy, keď bol počet expozícií kontrolovaný (tj u rekonvalescentných dvojito zaočkovaných verzus neinfikovaných trojnásobne zaočkovaných), čo naznačuje, že nejaký prvok imunity spojenej s infekciou (alebo vakcínová formulácia, ktorá môže napodobňovať tento typ imunity) je dôležitý pre vyvolanie tohto klonotypu. To je v súlade s experimentálnymi dôkazmi, ktoré dokumentujú, že jedinci s hybridnou imunitou majú širšie profily protilátkovej reaktivity v porovnaní s tými, ktorí majú imunitné reakcie vyvolané iba očkovaním alebo primárnou infekciou (9).

Tu uvedené štruktúry ilustrovali, že S728-1157 viaže epitop RBS-A/trieda 1 v RBD s up-konformáciou. Zdá sa, že tento epitop je ľahšie dostupný na 6P-stabilizovaných hrotoch, o ktorých sa uvádza, že predstavujú 2 RBD v hornom štáte v porovnaní s 2P hrotmi, ktoré predstavujú iba 1 (30, 33, 46, 47), a ku ktorým naše protilátky špecifické pre vzostupnú konformáciu vykazujú zlepšenú väzbu. S728-1157 bol izolovaný po prirodzenej infekcii; v takýchto kontextoch je pravdepodobnosť indukcie klonov podobných S728-1157 pravdepodobne vyššia, keďže RBD musí byť schopné prijať konformáciu, dokonca prechodne, aby sa naviazala na ACE2, čím sa tento epitop odkryje. Na rozdiel od väčšiny protilátok IGHV3-53/3-66 RBS-A/triedy 1, S728-1157 dokáže prispôsobiť kľúčové mutácie vo vrcholoch VOC pomocou rozsiahlych interakcií medzi CDR-H3 a RBD (29, 48 – 50). S728-1157 tiež používa odlišný ľahký reťazec (IGLV3-9) v porovnaní s inými menej širokými protilátkami, ako je CC12.3 (IGKV3-20), čo môže ovplyvniť celkové väzbové interakcie; naša analýza však naznačuje, že medzi ľahkým reťazcom S728-1157 a RBD je menej vodíkových väzieb v porovnaní s CC12.3 (doplnková tabuľka 7). Hoci väčšina kontaktných zvyškov CDR-H3 kritických pre skríženú reaktivitu VOC v tejto interakcii je kódovaná zárodočnou líniou a nie je vnesená somatickými mutáciami, niekoľko somaticky mutovaných zvyškov v rámcových oblastiach alebo CDR-H1, CDR-H2 a CDR-L1 je zapojený do interakcie so SARS-CoV-2 RBD. Na jednej strane to naznačuje, že pamäťové B bunky kódujúce protilátky triedy IGHV3-53/66 by mohli získať podobný stupeň skríženej reaktivity ďalším afinitným dozrievaním. Na druhej strane to tiež naznačuje možnosť navrhnúť imunogény zacielené na zárodočnú líniu, ktoré sa zameriavajú na S728-1157-ako naivné B bunky. Hoci môže byť náročné navrhnúť vakcíny, ktoré dokážu špecificky vyvolať S728-1157-podobné protilátky s vybranými CDR-H3 schopnými prekonať mutácie VOC, je povzbudzujúce, že obmedzenie génu IGHV je pozorované aj u iných silných SARS-CoV{ {58}} neutralizačné štúdie mAb (13, 15, 20–27). Alternatívne to môže byť uskutočniteľné aj prostredníctvom iteratívnej imunizácie s optimalizovanými imunogénmi RBD, ako už bolo uvedené pre iné patogény (51–55).

Hoci sa v antigénnom mieste RBS-A/ triedy 1 (18) pozorovalo veľa mutácií, pokiaľ ide o S728-1157 epitop, 13 z 15 celkových kontaktných zvyškov RBD a 2 z 3 CDR-H{{9} }viazané kontaktné zvyšky RBD sú konzervované v rámci Omicron a všetkých ostatných VOC. To naznačuje, že oblasť RBD, kde sa nachádza epitop S{10}}, môže obsahovať zvyšky kritické pre jej dynamickú funkciu a vírusovú zdatnosť, a preto by bola menej tolerantná voči mutáciám a antigénnemu driftu ako okolité zvyšky miesta RBS-A/ triedy 1. Ak je to tak, tendencia k strate tohto konkrétneho epitopu pri vývoji vírusových variantov by sa mala znížiť, čím by sa charakterizácia S728-1157 a podobných protilátok a epitopov stala dôležitou pre vakcíny rezistentné voči variantom alebo terapeutický vývoj mAb. Stručne povedané, naša štúdia identifikuje bnAb, ktoré môžu informovať o dizajne imunogénov pre vakcíny proti koronavírusu novej generácie odolné voči variantom alebo slúžiť ako mAb terapeutiká, ktoré sú odolné voči evolúcii SARS CoV-2. Najmä z hľadiska kombinovanej účinnosti a šírky sa zdá, že S728-1157 je doposiaľ najlepšia izolovaná protilátka vo svojej triede. Vzhľadom na to, že táto protilátka sa ľahšie viaže s 6P-stabilizáciou, predpokladá sa, že bude prednostne indukovaná 6P-stabilizovanými rekombinantnými spike proteínmi alebo celým vírusom, čo naznačuje, že modifikácia hexaprolínu by mohla byť prínosom pre budúce vakcínové konštrukty s cieľom optimálne chrániť pred budúcim SARS-CoV. -2 variantov a iných arbovírusov.

cistanche tubulosa - zlepšenie imunitného systému

Metódy

Izolácia monoklonálnych protilátok. PBMC boli izolované z leukoredukčných filtrov a zmrazené, ako je opísané vyššie (24). B bunky boli obohatené z PBMC prostredníctvom FACS. Bunky boli zafarbené CD19, CD3 a antigénovými sondami konjugovanými s oligo-fluorofórom; bunky záujmu boli identifikované ako CD3– CD19+ antigén+. Všetky mAb boli generované z buniek s oligo-značenými antigénovými návnadami, ktoré boli identifikované pomocou jednobunkovej RNA-Seq, ako bolo opísané skôr (15, 24). Údaje o jednotlivých B bunkách generované v tejto štúdii boli uložené do Gene Expression Omnibus: GSE171703 a GSM5231088–GSM5231123.

Antigénovo špecifické B bunky sa vybrali na generovanie mAb na základe intenzity antigén-sondy analyzovanej pomocou JMP Pro 15. Gény ťažkého a ľahkého reťazca protilátky boli syntetizované spoločnosťou Integrated DNA Technologies (IDT) a klonované do ľudského IgG1 a ľudského ľahkého reťazca κ alebo λ expresné vektory zostavením Gibson, ako už bolo opísané (56). Ťažké a ľahké reťazce zodpovedajúcej mAb boli prechodne kotransfekované do buniek HEK293T (ATCC). Po transfekcii počas 18 hodín boli transfekované bunky doplnené supernatantom hybridómového média bez proteínov (PFHM-II, Gibco). Supernatant obsahujúci secernovanú mAb bol zozbieraný na 4. deň a purifikovaný s použitím proteínových A-agarózových guľôčok (Thermo Fisher Scientific), ako bolo podrobne opísané vyššie (56). Sekvencie ťažkých a ľahkých reťazcov dobre charakterizovaných protilátok boli odvodené z Protein Data Bank (PDB), LY-CoV555 (PDB ID: 7KMG), CR30}22 (PDB ID: 6W7Y) a REGN1{{ 125}}933 (PDB ID: 6XDG) a boli syntetizované tak, ako je opísané vyššie. CC12.3 mAb (PDB ID: 6XC4) poskytla Meng Yuan zo Scripps Research Institute (San Diego, Kalifornia, USA). Expresia rekombinantného vrcholového proteínu. Rekombinantný hrot D614G SARS-CoV-2 plnej dĺžky (FL), BA.{30}}P, BA.4/5-6P, BQ.1-6P, BQ. 1.1-6P, XBB-6P, WT RBD, jednotlivé mutanty RBD (R346S, K417N, K417T, G446V, L452R, S477N, F486A, F486Y, N487Q, Y489F, Q4933N, Q403N, Y505A a Y505F), kombinovaný mutant RBD (K417N/E484K/L452R/NN501Y), SARS-CoV-1 RBD a MERS-CoV RBD boli vytvorené interne. V stručnosti, rekombinantné antigény boli exprimované s použitím buniek Expi293F (Thermo Fisher Scientific). Požadovaný gén bol klonovaný do cicavčieho expresného vektora (interne modifikovaný AbVec) a transfekovaný pomocou súpravy ExpiFectamine 293 (Thermo Fisher Scientific) podľa protokolu výrobcu. Supernatant sa zozbieral na 4. deň po transfekcii a inkuboval sa s Ni-nitrilotrioctovou kyselinou (Ni-NTA) agarózou (Qiagen). Čistenie sa uskutočňovalo s použitím kolóny s gravitačným tokom a eluovalo sa pufrom obsahujúcim imidazol, ako už bolo opísané (57, 58). Eluát bol pufrovaný a vymenený za PBS pomocou odstredivej jednotky Amicon (Millipore). Rekombinantné FL hroty stabilizované 2P mutáciami variantov B.1.1.7 Alpha, B.1.351 Beta, P.1 Gamma, B.1.617.2 Delta, BA.1, BA.2 a BA.4 Omicron a boli vyrobené v laboratóriu Sather v Seattle Children's Research Institute. K417V, N439K a E484K RBD a rekombinantný FL hrot WT-2P a 6P boli vyrobené v laboratóriu Krammer na Icahn School of Medicine na Mount Sinai. SARS-CoV-2-6P-Mut7 a hrot BA.{91}}P boli navrhnuté a vyrobené tak, ako je opísané v predchádzajúcej štúdii (59). Proteínové sekvencie a zdroje pre každý antigén sú uvedené v doplnkovej tabuľke 4. ELISA. Rekombinantné SARS-CoV-2 spike/RBD proteíny boli nanesené na mikrotitračné doštičky s vysokou väzbou proteínov (Costar) v koncentrácii 2 ug/ml v PBS v množstve 50 μl/jamka a uchovávané cez noc pri 4 stupňoch . Doštičky boli premyté PBS obsahujúcim 0,05 % Tween 20 (PBS-T) a blokované 150 ul PBS obsahujúceho 20 % FBS počas 1 hodiny pri 37 stupňoch. Monoklonálne protilátky boli sériovo nariedené 3-násobne počínajúc od 10 ug/ml v PBS a inkubované v jamkách počas 1 hodiny pri 37 stupňoch. Doštičky sa potom premyli a inkubovali s HRP-konjugovanou kozou anti-ľudskou IgG protilátkou (Jackson ImmunoResearch; 109- 035-098), 1:1,000) počas 1 hodiny pri 37 stupňoch. Po premytí sa do každej jamky pridalo 100 ul substrátu Super AquaBlue ELISA (eBioscience). Absorbancia sa merala pri 405 nm na mikrodoštičkovom spektrofotometri (Bio-Rad). Testy sa štandardizovali s použitím kontrolnej protilátky S144-509 (15), so známymi väzbovými charakteristikami na každej platni, a platne sa vyvíjali, kým absorbancia kontroly nedosiahla OD 3,0. Všetky mAb sa testovali duplicitne a každý experiment sa uskutočnil dvakrát.

Sérová ELISA. Mikrotitračné doštičky s vysokou väzbou na proteíny boli potiahnuté rekombinantnými antigénmi SARS-CoV{1}} v koncentrácii 2 ug/ml v PBS cez noc pri 4 stupňoch. Platne boli premyté PBS 0.05 % Tween a blokované 200 μl PBS 0,1 % Tween + 3 % sušené odstredené mlieko počas 1 hodiny pri izbovej teplote (RT). Vzorky plazmy boli pred uskutočnením sérologického experimentu tepelne inaktivované počas 1 hodiny pri 56 stupňoch. Plazma bola sériovo nariedená 2--krát v PBS 0,1 % Tween + 1 % sušeného odstredeného mlieka. Doštičky sa inkubovali so sérovým riedením počas 2 hodín pri teplote miestnosti. Kozia anti-ľudská Ig sekundárna protilátka konjugovaná s HRP zriedená v pomere 1:3000 s PBS 0,1 % Tween + 1% sušeného odstredeného mlieka sa použila na detekciu väzby protilátok. Po 1 hodine inkubácie sa platne vyvíjali so 100 ul roztoku SigmaFast OPD (Sigma-Aldrich) počas 10 minút. Potom sa na zastavenie vývojovej reakcie použilo 50 ul 3M HCl. Absorbancia sa merala pri 490 nm na mikrodoštičkovom spektrofotometri (Bio-Rad). Koncové titre boli extrapolované zo sigmoidálnej 4PL (kde x je logaritmická koncentrácia) štandardnej krivky pre každú vzorku. Limit detekcie (LOD) je definovaný ako priemerná + 3 SD signálu OD zaznamenaného pomocou plazmy od jedincov pred SARS-CoV-2. Všetky výpočty boli uskutočnené v softvéri GraphPad Prism (verzia 9.0).

Súťažná ELISA. Na stanovenie klasifikácie cieľového epitopu RBD-reaktívnych mAb sa uskutočnili kompetičné ELISA s použitím iných mAb so známymi väzbovými charakteristikami epitopu ako kompetitívnych mAb. Kompetitívne mAb boli biotinylované pomocou EZ-Link sulfo-NHS-biotínu (Thermo Fisher Scientific) počas 2 hodín pri teplote miestnosti. Prebytok biotínu biotinylovaných mAb sa odstránil pomocou 7k medznej molekulovej hmotnosti (MWCO) Zeba spin odsoľovacích kolón (Thermo Fisher Scientific). Platne boli potiahnuté 2 ug/ml RBD antigénu cez noc pri 4 stupňoch. Platne boli blokované PBS-20% FBS počas 2 hodín pri teplote miestnosti a bolo pridané 2-násobné riedenie mAb neurčenej triedy alebo séra, počnúc 20 ug/ml mAb a riedenie séra 1:10. Po inkubácii protilátky počas 2 hodín pri teplote miestnosti sa pridala biotinylovaná kompetitívna mAb v koncentrácii dvojnásobku jej disociačnej konštanty (KD) a inkubovala sa ďalšie 2 hodiny pri teplote miestnosti spolu s mAb alebo sérom, ktoré sa pridalo predtým. Doštičky sa premyli a inkubovali so 100 ul HRP-konjugovaného streptavidínu (Southern Biotech) v riedení 1:1,000 počas 1 hodiny pri 37 stupňoch. Platne boli vyvinuté so substrátom Super AquaBlue ELISA (eBioscience). Na normalizáciu testov sa do jamky pridala kompetitívna biotinylovaná mAb bez akýchkoľvek kompetujúcich mAb alebo séra ako kontroly. Údaje sa zaznamenali, keď absorbancia kontrolnej jamky dosiahla OD 1,0–1,5. Percento kompetície medzi mAb sa potom vypočítalo vydelením OD pozorovanej vo vzorke OD dosiahnutej pozitívnou kontrolou, odčítaním tejto hodnoty od 1 a vynásobením 100. V prípade séra boli OD transformované log10 a analyzované nelineárnou regresiou, aby sa určilo 50 % inhibičnej koncentrácie (IC50) pomocou softvéru GraphPad Prism (verzia 9.0). Údaje boli transformované do Log1P a vynesené do grafu reprezentujúceho recipročné riedenie séra IC50 riedenia séra, ktoré môže dosiahnuť 50% kompetíciu s kompetitívnou mAb, ktorá je predmetom záujmu. Všetky mAb sa testovali duplicitne, každý experiment sa uskutočnil 2-krát nezávisle a hodnoty z 2 nezávislých experimentov sa spriemerovali.

Plakové testy. Plakové testy sa uskutočnili s variantmi vírusov SARS-CoV{1}} na bunkách Vero E6/TMPRSS2 (Japonská zbierka Research Bioresources (JCRB)) (doplnková tabuľka 5). Bunky sa kultivovali, aby sa dosiahla 90% konfluencia, predtým, ako sa trypsinizovali a naočkovali v hustote 3 x 104 bunky/jamku na 96-jamkové platne. Nasledujúci deň sa 102 PFU variantu SARS-CoV{11}} inkubovalo s 2-násobne zriedenými mAb počas 1 hodiny. Zmes protilátka-vírus sa inkubovala s bunkami Vero E6/TMPRSS2 3 dni pri 37 stupňoch. Doštičky boli fixované 20% metanolom a potom zafarbené roztokom kryštálovej violeti. Úplné inhibičné koncentrácie (IC99) sa vypočítali pomocou log (inhibítor) proti normalizovanej odozve (variabilná strmosť), uskutočnenej v GraphPad Prism (verzia 9.0). Všetky mAb sa testovali duplicitne a každý experiment sa uskutočnil dvakrát. Neutralizačný test redukcie zaostrenia. Neutralizačné testy redukcie zaostrenia (FRNT) sa použili na určenie neutralizačných aktivít ako ďalšia platforma okrem plakového testu. Sériové riedenia séra začínajúce pri konečnej koncentrácii 1:20 sa zmiešali so 103 fokusotvornými jednotkami vírusu na jamku a inkubovali sa 1 hodinu pri 37 stupňoch. Združená vzorka predpandemického séra slúžila ako kontrola. Zmes protilátka-vírus sa inokulovala na bunky Vero E6/TMPRSS2 (JCRB) v 96-jamkových doštičkách a inkubovala sa 1 hodinu pri 37 stupňoch. Do každej jamky sa pridal rovnaký objem roztoku metylcelulózy. Bunky sa inkubovali 16 hodín pri 37 stupňoch a potom sa fixovali formalínom. Po odstránení formalínu boli bunky imunofarbené myšou mAb proti SARS-CoV-1/2 nukleoproteínu [klon 1C7C7 (Sigma-Aldrich)] a následne kozím anti-myším imunoglobulínom značeným HRP (Sigma- Aldrich; A8924). Infikované bunky boli zafarbené TrueBlue Substrate (SeraCare Life Sciences) a potom premyté destilovanou vodou. Po vysušení sa čísla ohniska kvantifikovali pomocou analyzátora ImmunoSpot S6, softvéru ImmunoCapture a softvéru BioSpot (Cellular Technology). IC50 sa vypočítalo z interpolovanej hodnoty z log (inhibítor) oproti normalizovanej odozve s použitím nelineárnej regresie s premenlivým sklonom (4 parametre) vykonanej v GraphPad Prism (verzia 9.0).

Referencie

1. Hou YJ, a kol. Variant SARS-CoV-2 D614G vykazuje účinnú replikáciu ex vivo a prenos in vivo. Veda. 2020;370(6523):1464–1468.

2. Garcia-Beltran WF, a kol. Viaceré varianty SARS CoV-2 unikajú neutralizácii humorálnou imunitou vyvolanou vakcínou. Bunka. 2021; 184 (9): 2523.

3. Wall EC, a kol. Neutralizujúca protilátková aktivita proti SARS-CoV-2 VOC B.1.617.2 a B.1.351 očkovaním BNT162b2. Lancet. 2021;397(10292):2331–2333.

4. Edara VV a kol. Infekcia a očkovaním vyvolané reakcie neutralizačných protilátok na varianty SARS-CoV-2 B.1.617. N Engl J Med. 2021;385(7):664–666.

5. Zhou D, a kol. Dôkaz o úniku SARS-CoV-2 variant B.1.351 z prirodzeného a vakcínou indukovaného séra. Bunka. 2021;184(9):2348–2361.

6. Weisblum Y, a kol. Únik pred neutralizačnými protilátkami prostredníctvom variantov vrcholových proteínov SARS-CoV-2. Elife. 2020;9:e61312.

7. Graham F. Denný brífing: Variant Omicron koronavírusu uvádza vedcov do pohotovosti. Príroda. 2021;

8. Karim SSA, Karim QA. Variant Omicron SARS-CoV-2: nová kapitola pandémie COVID-19. Lancet. 2021;398(10317):2126–2128.

9. Carreño JM a kol. Aktivita rekonvalescentného a očkovacieho séra proti SARS-CoV-2 Omicron. Príroda. 2021;602(7898):682–688.

10. Wang Q, a kol. Alarmujúce vlastnosti úniku protilátok pri rastúcich subvariantoch SARS-CoV-2 BQ a XBB. Bunka. 2022;186(2):279–286.

11. VanBlargan LA, a kol. Infekčný SARS-CoV-2 B.1.1.529 Omicron vírus uniká neutralizácii terapeutickými monoklonálnymi protilátkami. Nat Med. 2022;28(3):490–495.

12. Takashita E, a kol. Účinnosť protilátok a antivírusových liekov proti Covid-19 Omicron Variant. N Engl J Med. 2022;386(10):995–998.

13. Yuan M, a kol. Rozpoznanie väzbovej domény SARS-CoV-2 receptora pomocou neutralizačných protilátok. Biochem Biophys Res Commun. 2021;538:192–203.

14. Barnes CO, a kol. Štruktúry neutralizujúcich protilátok proti SARS-CoV-2 informujú o terapeutických stratégiách. Príroda. 2020;588(7839):682–687.

15. Changrob S, a kol. Krížová neutralizácia vznikajúcich variantov SARS-CoV-2, ktoré vyvolávajú obavy, pomocou protilátok zameraných na odlišné epitopy na hrote. Mbio. 2021;12(6):e0297521.

16. Guthmiller JJ a kol. Závažnosť infekcie SARS-CoV-2 je spojená s vynikajúcou humorálnou imunitou proti hrotu. Mbio. 2021;12(1):e02940–20.

17. Greaney AJ, a kol. Mapovanie mutácií SARS-CoV-2 RBD, ktoré unikajú väzbe rôznych tried protilátok. Nat Commun. 2021;12(1):4196.

18. Liu H, Wilson IA. Ochranné neutralizačné epitopy pri SARS-CoV-2. Immunol Rev. 2022;310(1):76–92.

19. Jette CA, a kol. Široká skrížená reaktivita medzi arbovírusmi, ktorú prejavuje podskupina neutralizačných protilátok od darcu COVID-19. Cell Rep. 2021;36(13):109760.

20. Brouwer PJM, a kol. Silné neutralizačné protilátky od pacientov s COVID-19 definujú viacero cieľov zraniteľnosti. Veda. 2020;369(6504):643–650.

21. Pinto D, a kol. Krížová neutralizácia SARS CoV-2 ľudskou monoklonálnou protilátkou proti SARS-CoV. Príroda. 2020;583(7815):290–295.

22. Robbiani DF a kol. Konvergentné protilátkové odpovede na SARS-CoV-2 u pacientov v rekonvalescencii. Príroda. 2020;584(7821):437–442.

23. Yuan M, a kol. Štrukturálny základ zdieľanej protilátkovej odpovede na SARS-CoV-2. Veda. 2020;369(6507):1119–1123.

24. Dugan HL a kol. Profilovanie imunodominancie B buniek po infekcii SARS-CoV-2 odhaľuje vývoj protilátok proti neneutralizujúcim vírusovým cieľom. Imunita. 2021;54(6):1290–1303.

25. Rogers TF a kol. Izolácia silných neutralizačných protilátok SARS CoV-2 a ochrana pred ochorením na modeli malého zvieraťa. Veda. 2020;369(6506):956–963.

26. Schmitz AJ, a kol. Verejná protilátka vyvolaná vakcínou chráni pred SARS-CoV-2 a novými variantmi. Imunita. 2021;54(9):2159–2166.e6.

27. Shi R, a kol. Ľudská neutralizačná protilátka sa zameriava na receptor viažuce miesto SARS-CoV-2. Príroda. 2020;584(7819):120–124.

28. Cao Y, a kol. Silné neutralizačné protilátky proti SARS-CoV-2 identifikované vysokovýkonným jednobunkovým sekvenovaním B buniek rekonvalescentných pacientov. Bunka. 2020; 182 (1): 73–84.

29. Barnes CO, a kol. Štruktúry ľudských protilátok naviazaných na vrchol SARS-CoV-2 odhaľujú bežné epitopy a opakujúce sa znaky protilátok. Bunka. 2020;182(4):828–842.

30. Corbett KS a kol. Návrh mRNA vakcíny SARS-CoV-2 umožnila prototypová pripravenosť na patogén. Príroda. 2020;586(7830):567–571.

31. Amanat F, a kol. Zavedenie dvoch prolínov a odstránenie miesta polybázického štiepenia viedlo k vyššej účinnosti rekombinantnej vakcíny proti SARS-CoV-2 na báze hrotov na myšom modeli. mBio. 2021;12(2):e02648–20.

32. Sun W, a kol. Vírus pseudomoru hydiny exprimujúci stabilizovaný vrcholový proteín SARS-CoV-2 indukuje ochranné imunitné reakcie. Nat Commun. 2021;12(1):6197.

33. Hsieh CL, a kol. Štruktúrny dizajn hrotov SARS-CoV-2 stabilizovaných pred fúziou. Veda. 2020;369(6510):1501–1505.

34. Gobeil SM a kol. Štrukturálna diverzita omikrónovej špičky SARS-CoV-2. Mol Cell. 2022;82(11):2050–2068.

35. Yuan M, a kol. Vysoko konzervovaný kryptický epitop v receptorových väzbových doménach SARS-CoV-2 a SARS-CoV. Veda. 2020;368(6491):630–633.

36. Starr TN, a kol. Kompletná mapa mutácií SARS-CoV-2 RBD, ktoré unikajú monoklonálnej protilátke LY-CoV555 a jej kokteilu s LY-CoV016. Cell Rep Med. 2021;2(4):100255.

37. Baum A, a kol. Protilátky REGN-COV2 zabraňujú a liečia infekciu SARS-CoV-2 u makakov rhesus a škrečkov. Veda. 2020;370(6520):1110–1115.

38. Wu NC, a kol. Alternatívny spôsob viazania protilátok IGHV3-53 k väzbovej doméne receptora SARS-CoV-2. Cell Rep. 2020;33(3):108274.

39. Wu Y, a kol. Nekonkurujúci pár ľudských neutralizačných protilátok blokuje väzbu vírusu COVID{2}} na jeho receptor ACE2. Veda. 2020;368(6496):1274–1278.

40. Yuan M, a kol. Štrukturálne a funkčné dôsledky antigénneho driftu v nedávnych variantoch SARS-CoV-2. Veda. 2021;373(6556):818–823.

41. Yan Q, a kol. Zárodočné IGHV 3-53-kódované neutralizačné protilátky zacielené na RBD sú bežne prítomné v repertoári protilátok pacientov s COVID-19. Objavujúce sa mikróby infikujú. 2021;10(1):1097–1111.

42. Zhang Q, a kol. Silné a ochranné IGHV3- 53/3-66 verejné protilátky a ich zdieľaný únikový mutant na vrchole SARS-CoV-2. Nat Commun. 2021; 12 (1): 4210.

43. Wang Z a kol. mRNA vakcínou vyvolané protilátky proti SARS-CoV-2 a cirkulujúce varianty. Príroda. 2021;592(7855):616–622.

44. Simon V, a kol. PARÍŽ a SPARTA: hľadanie Achillovej päty SARS-CoV-2. mSphere. 2022;7(3):e0017922.

45. Starr TN, a kol. Protilátky RBD proti SARS-CoV-2, ktoré maximalizujú šírku a odolnosť proti úniku. Príroda. 2021;597(7874):97–102.

46. ​​Walls AC, a kol. Štruktúra, funkcia a antigenicita vrcholového glykoproteínu SARS-CoV-2. Bunka. 2020;181(2):281–292.

47. Henderson R, a kol. Kontrola konformácie vrcholového glykoproteínu SARS-CoV-2. Nat Struct Mol Biol. 2020;27(10):925–933.

48. Shrestha LB a kol. Široko neutralizujúce protilátky proti novým variantom SARS-CoV-2. Front Immunol. 2021;12:752003.

49. Greaney AJ, a kol. Protilátky vyvolané vakcináciou mRNA-1273 sa viažu na väzbovú doménu receptora širšie ako protilátky z infekcie SARS-CoV-2. Sci Transl Med. 2021;13(600):eabi9915.

50. Reincke SM a kol. Infekcia SARS-CoV-2 Beta variantom vyvoláva silné líniovo špecifické a skrížene reaktívne protilátky. Veda. 2022;375(6582):782–787.

51. Wrammert J, a kol. V odpovedi ľudských B buniek proti pandemickej infekcii vírusom chrípky H1N1 z roku 2009 dominujú široko skrížene reaktívne protilátky. J Exp Med. 2011;208(1):181–193.

52. Guthmiller JJ a kol. Prvá expozícia široko neutralizujúcim protilátkam vyvolaným pandemickým vírusom H1N1 zameraným na epitopy hemaglutinínovej hlavy. Sci Transl Med. 2021;13(596):eabg4535.

53. Bajic G, a kol. Chrípkové antigénne inžinierstvo sa zameriava na imunitné odpovede na subdominantný, ale široko ochranný vírusový epitop. Bunkový hostiteľský mikrób. 2019;25(6):827–835.

54. Nachbagauer R, a kol. Prístup univerzálnej vakcíny proti vírusu chrípky na báze chimérického hemaglutinínu indukuje širokú a dlhotrvajúcu imunitu v randomizovanej, placebom kontrolovanej štúdii fázy I. Nat Med. 2021;27(1):106–114.

55. Angeletti D, a kol. Ohraničujúca imunodominanciu zameranú na subdominantné široko neutralizujúce epitopy. Proc Natl Acad Sci US A. 2019;116(27):13474–13479.

56. Guthmiller JJ a kol. Účinná metóda na generovanie monoklonálnych protilátok z ľudských B buniek. Metódy Mol Biol. 2019;1904:109–145.

57. Amanat F, a kol. Sérologický test na detekciu sérokonverzie SARS-CoV-2 u ľudí. Nat Med. 2020;26(7):1033–1036.

58. Stadlbauer D, a kol. Sérokonverzia SARS-CoV-2 u ľudí: podrobný protokol pre sérologický test, produkciu antigénu a nastavenie testu. Curr Protoc Microbiol. 2020;57(1):e100.

59. Torres JL a kol. Štrukturálne pohľady na vysoko účinnú pan-neutralizačnú ľudskú monoklonálnu protilátku SARS-CoV-2. Proc Natl Acad Sci USA. 2022;119(20):e2120976119.

60. Suloway C, a kol. Automatizovaná molekulárna mikroskopia: nový systém Leginon. J Struct Biol. 2005;151(1):41–60.

61. Lander GC a kol. Appion: integrované, databázou riadené potrubie na uľahčenie spracovania EM obrazu. J Struct Biol. 2009;166(1):95–102.

62. Voss NR, a kol. DoG Picker a TiltPicker: softvérové ​​nástroje na uľahčenie výberu častíc v jednočasticovej elektrónovej mikroskopii. J Struct Biol. 2009;166(2):205–213.

63. Pettersen EF, a kol. UCSF Chimera--vizualizačný systém na prieskumný výskum a analýzu. J Comput Chem. 2004;25(13):1605–1612.

64. Punjani A, et al. Nejednotné spresnenie: adaptívna regularizácia zlepšuje kryo-EM rekonštrukciu jednej častice. Metódy Nat. 2020;17(12):1214–1221.

65. Zhang K. Gctf: Stanovenie a korekcia CTF v reálnom čase. J Struct Biol. 2016;193(1):1–12.

66. Zivanov J, et al. Nové nástroje na automatické určovanie kryo-EM štruktúry s vysokým rozlíšením v RELION-3. Elife. 2018;7:e42166.

67. Casanal A, a kol. Aktuálny vývoj v oblasti lysky pre vytváranie makromolekulárnych modelov elektrónovej kryomikroskopie a kryštalografických údajov. Protein Sci. 2020;29(4):1069–1078.

68. Frenz B, a kol. Automatická oprava chýb v glykoproteínových štruktúrach pomocou rozety. Štruktúra. 2019;27(1):134–139.

69. Klaholz BP. Odvodenie a spresnenie atómových modelov v kryštalografii a kryo-EM: najnovšie nástroje Phenix na uľahčenie štruktúrnej analýzy. Acta Crystallogr D Struct Biol. 2019;75(pt 10):878–881.

70. Pettersen EF, a kol. UCSF ChimeraX: Vizualizácia štruktúry pre výskumníkov, pedagógov a vývojárov. Protein Sci. 2021;30(1):70–82.

71. Otwinowski Z, Minor W. Spracovanie údajov o röntgenovej difrakcii zozbieraných v oscilačnom režime. Metódy Enzymol. 1997;276:307–326.

72. McCoy AJ, a kol. Phaser kryštalografický softvér. J Appl Crystallogr. 2007;40(pt 4):658–674.

73. Qiang M, a kol. Neutralizačné protilátky proti SARS CoV-2 boli vybrané z knižnice ľudských protilátok skonštruovanej pred desiatkami rokov. Adv Sci (Weinh). 2022;9(1):e2102181.

74. Emsley P, Cowtan K. Coot: nástroje na vytváranie modelov pre molekulárnu grafiku. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2004;60 (pt 12 pt 1):2126–2132.

75. Adams PD, a kol. PHENIX: komplexný systém založený na Pythone pre riešenie makromolekulárnej štruktúry. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2010;66(pt 2):213–221.

76. Montiel-Garcia D, a kol. Epitop-Analyzer: Webový nástroj založený na štruktúre na analýzu široko neutralizujúcich epitopov. J Struct Biol. 2022;214(1):107839.