UW roztok doplnený tiosíranom sodným chráni obličkové štepy pred predĺženým chladným ischemicko-reperfúznym poranením v myšom modeli syngénnej transplantácie obličky

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Max Y. Zhang a kol

Cistanche tubulosa zabraňujeobličkychoroba, kliknite sem a získajteproduktov a Cistanche Nz

ABSTRAKT

Úvod:Studené ischemicko-reperfúzne poškodenie (IRI) je nevyhnutnou udalosťou, ktorá zvyšuje potransplantačné komplikácie. Už sme predtým demonštrovali, že suplementácia roztoku University of Wisconsin (UW) donorovými molekulami sírovodíka (H2S) neschválenými FDA minimalizuje studené IRI a zlepšuje funkciu obličkového štepu po transplantácii. Táto štúdia skúma, či donorová molekula H2S schválená FDA, tiosíran sodný (STS), bude mať rovnaký alebo lepší účinok v klinicky relevantnom potkanom modeli syngénneho ortotopického systému.obličkytransplantácia.

metóda:Tridsať potkanov Lewis podstúpilo bilaterálnu nefrektómiu, po ktorej nasledovala syngénna ortotopická transplantácia ľavej stranyobličkypo 24-hodinovej konzervácii v roztoku UW alebo UW plus STS pri 4 ◦C. Potkany sa monitorovali do 14. dňa po transplantácii a usmrtili sa na posúdenie funkcie obličiek (výdaj moču, sérový kreatinín a dusík močoviny v krvi).Obličkyrezy boli zafarbené H&E, TUNEL, CD68 a myeloperoxidázou (MPO) na detekciu akútnej tubulárnej nekrózy (ATN), apoptózy, infiltrácie makrofágmi a infiltrácie neutrofilov.

výsledok:Štepy UW plus STS vykazovali signifikantne zlepšenú funkciu štepu bezprostredne po transplantácii so zlepšeným prežívaním príjemcu v porovnaní so štepmi UW (p < {{0}},05).="" histopatologické="" vyšetrenie="" odhalilo="" významne="" zníženú="" infiltráciu="" atn,="" apoptózu,="" makrofágy="" a="" neutrofily="" a="" downreguláciu="" prozápalových="" a="" proapoptotických="" génov="" v="" uw="" plus="" sts="" štepoch="" v="" porovnaní="" s="" uw="" štepmi="" (p=""><>

Záver:Prvýkrát sme ukázali, že konzervácia obličkových štepov v roztoku UW doplnenom STS chráni pred predĺženým studeným IRI potlačením apoptotických a zápalových dráh, a tým zlepšuje funkciu štepu a predlžuje prežitie príjemcu. To by mohlo predstavovať novú klinicky použiteľnú terapeutickú stratégiu na minimalizáciu škodlivého klinického výsledku predĺženej studenej IRIobličkytransplantácia.

Kľúčové slová:Tiosíran sodný (STS) Ischemicko-reperfúzne poškodenie (IRI) Statické chladenie (SCS)Obličkytransplantácia Prežitie štepu a príjemcu

1. Úvod

ObličkyTransplantácia je optimálnou liečbou v konečnom štádiuobličkyobličkovéchoroba (ESRD). V porovnaní s dialýzouobličkytransplantácia je lepšia, pretože poskytuje lepšiu kvalitu života a poskytuje významnú výhodu v prežití spolu s jej nákladovou efektívnosťou [1–3]. Odoberanie darcovských obličiek je však neodmysliteľne spojené s ischemicko-reperfúznym poškodením (IRI), čo je nevyhnutný dôsledok zastavenia a následného obnovenia prietoku krvi počas transplantácie [4]. Súčasnou stratégiou na zmiernenie IRI vyvolanej transplantáciou je statické chladenie (SCS) obličkových štepov v štandardných konzervačných roztokoch, ako je roztok University of Wisconsin (UW) na ľade pri 4 °C počas predtransplantačného obdobia [5]. Ukázalo sa však, že predĺžený SCS je spojený so zvýšenou bunkovou smrťou, zápalom a inými škodlivými bunkovými a molekulárnymi udalosťami, ktoré v konečnom dôsledku vedú k zvýšenému výskytu oneskorenej funkcie štepu (DGF), akútnej tubulárnej nekrózy (ATN) a zníženého počtu štepu. prežitie [6–10]. Okrem toho, v snahe držať krok s celosvetovo rastúcim výskytom ESRD a neustále sa zvyšujúcim počtom pacientov na čakacích listinách na transplantáciu, mnohé transplantačné centrá akceptujú obličkové štepy s predĺženými studenými ischemickými obdobiami, čo ďalej prispieva k celkovému poškodeniu tkaniva. Po SCS nasleduje reperfúzia, keď sa teplá okysličená krv obnoví do studeného ischemického štepu. Reperfúzia, ktorá je efektorovou fázou ischemického poškodenia, je charakterizovaná zvýšeným poškodením tkaniva [11–13].

Potenciálna terapeutická stratégia na obmedzenie studenej IRI počasobličkytransplantácia zahŕňa doplnenie štandardného konzervačného roztoku sírovodíkom (H2S), endogénne produkovaným plynotransmiterom, ktorý hrá dôležitú fyziologickú úlohu pri vazodilatácii a bunkovej signalizácii [14–16]. Už sme predtým ukázali, že predĺžená SCS v roztoku UW doplnenom H2S redukuje transplantáciou indukovanú chladnú IRI a zlepšuje prežitie štepu na myšacích modeloch syngénnej a alogénnej transplantácie obličiek [17–19,41, 42]. Avšak donorové molekuly H2S použité v týchto štúdiách nie sú klinicky životaschopné. To viedlo k úvahe o použití tiosíranu sodného (STS), donorového lieku H2S, ktorý je schválený Food and Drug Administration (FDA) na liečbu kalcifylaxie u pacientov s ESRD, toxicity vyvolanej cisplatinou pri liečbe rakoviny a ako protijed proti otrava kyanidom [20–23]. Nedávne štúdie ukázali, že STS vykazuje ochranné účinky na zvieracích modeloch IRI [24–26]. Jeho účinok na chladné IRI obličiek vyvolané transplantáciou však nie je známy. Preto táto štúdia skúma renoprotektívne účinky STS na in vitro modeli renálnej IRI a potkanom modeli syngénnej ortotopickej transplantácie obličky.

2. Materiály a metódy

2.1. Experimentálny protokol in vitro

Na posúdenie ochranných účinkov STS počas IRI obličiek sa použil in vitro model studenej hypoxie a teplého reoxygenačného poškodenia, ktorý napodobňuje bunkové podmienky počas in vivo studenej IRI. V experimentoch in vitro sa použili epitelové bunky potkaních obličiek (NRK{0}}bunková línia E; ATCC, USA), pretože tieto bunky sú citlivé na ischemické poškodenie [27] a ich použitie je v súlade s potkanmi model transplantácie použitý pre druhý cieľ tejto štúdie. Bunky sa kultivovali v Dulbeccovom modifikovanom Eaglovom médiu (DMEM) obsahujúcom 10 percent fetálneho bovinného séra (FBS) inaktivovaného teplom pri 60 °C počas 20 minút a 1 percento penicilínu/streptomycínu (P/S). Bunky boli inkubované pri normálnych rastových podmienkach 37 °C, 21 percent O2 a 5 percent CO2. Kontrolné bunky boli v podmienkach identických s podmienkami pre predexperimentálne bunky. Experimentálne bunky boli ošetrené buď médiom bez séra (SF), SF plus 200 nM AP39 alebo SF s rôznymi koncentráciami (50 uM, 150 uM, 500 uM, 1 mM) pentahydrátu tiosíranu sodného (STS), ktoré boli získané z 250 mg/ml injekčný roztok STS (Seacalphyx® [Seaford Pharmaceuticals Inc, Mississauga, ON, Kanada]). Použila sa koncentrácia 200 nM AP39, pretože sme predtým ukázali, že AP39 v tejto koncentrácii je cytoprotektívny proti rovnakej bunkovej línii v podobnom modeli studenej IRI [20]. Bunky sa potom inkubovali pri 10 °C počas 24 hodín v hypoxických podmienkach (5 percent CO2, 0,5 percent O2, 95 percent N2) v hypoxickej komore HypOxystation H85 (HYPO2YGEN, USA), aby sa vyvolalo studené ischemické poškodenie. Použila sa podchladená teplota 10 ◦C, pretože to bola najnižšia teplota, ktorú bolo možné technologicky dosiahnuť pri zachovaní 0,5-percentnej hladiny O2 hypoxie. Po hypoxii sa médium obsahujúce experimentálne bunky nahradilo kontrolným médiom a bunky sa reoxygenovali inkubáciou za normálnych rastových podmienok (37 °C, 21 percent O2 a 5 percent CO2) počas 24 hodín, aby sa simulovala reperfúzia a s ňou spojené poškodenie. Po 24-hodinovej reoxygenácii sa bunková životaschopnosť hodnotila farbením buniek s FITC-konjugovaným annexinom-V (FITC-Annexin-V; BioLegend, USA) a 7-aminoaktinomycínom D (7-AAD; BioLegend, USA ), ktorý meria bunkovú apoptózu a nekrózu. Bunky sa analyzovali prietokovou cytometriou s použitím CytoFLEX S (Beckman Coulter, USA). FlowJo verzia 11 (FlowJo LLC, USA) sa použila na vhodné hradenie údajov na štatistickú analýzu.

2.2. Pokusné zvieratá

Tridsať samcov potkanov Lewis s hmotnosťou 275–300 g zakúpených od Charles River (St. Constant, QC, Kanada) bolo umiestnených v zariadení starostlivosti o zvieratá a veterinárnych služieb na Western University (Londýn, ON) za štandardných podmienok. Štúdie na zvieratách boli schválené Radou západnej univerzity pre starostlivosť o zvieratá a používanie zvierat s protokolom ID 2018–155.

2.3. Model transplantácie obličky

Syngeneic kidney transplantation in Lewis rats was performed to eliminate any confounding effects of immunosuppression. Rats were randomized into treatment groups of UW solution alone (UW) or UW+STS, anesthetized with ketamine (30 mg/kg) via intraperitoneal administration, and maintained under anesthesia with isoflurane during surgery. The left donor kidneys were procured under aseptic condition and flushed with 10 mL of either cold (4 ◦C) UW solution (UW group, n = 8) in a 28-G Angiocath Becton-Dickinson, or cold UW solution supplemented with sodium thiosulfate pentahydrate (150 µM Seacalphyx® [Seaford Pharmaceuticals Inc, Mississauga, ON, Canada]; UW+STS group, n = 6) until venous effluent was clear. Grafts were then subjected to SCS in UW solution at 4◦C with or without STS for 24 h to mimic prolonged cold ischemic time as previously described [13]. Following 24 h of SCS and bilateral nephrectomy in recipients, renal grafts were transplanted orthotopically into the left renal fossa of syngeneic recipient rats using 11–0 Prolene sutures as we previously described [22]. Sham-operated rats (mid-line incision only; n = 5), were used to establish a baseline for survival, histological analysis, BUN, and serum creatinine. Additionally, another subset of rats in the UW+STS group had grafts removed pre-emptively on a postoperative day (POD) 3 (n = 5) for histological comparison with UW grafts of recipients that were sacrificed at this time point. All surgeries were performed by the same microsurgeon with the length of surgery for the recipient being approximately 2–3 h for both UW and UW+STS groups. Graft failure was presumed in animals that required premature sacrifice (severe visible distress and/or >20-percentný úbytok hmotnosti) alebo smrť. Humánne koncové body sa kontrolovali dvakrát denne a všetky potkany sa usmrtili vystavením CO2 v komore pri prietoku 40 percent. V čase eutanázie sa nevyskytli žiadne chirurgické komplikácie, ktoré by mohli mať za následok odchýlky vo výsledkoch.

2.4. Analýza funkcie obličiek

Po transplantácii obličky sa potkany monitorovali v metabolických klietkach počas 14 dní a potom sa usmrtili. Vzorky krvi a moču sa odobrali v POD 3, 5, 7, 10 a 14 na stanovenie parametrov funkcie obličiek (sérový kreatinín, dusík močoviny v krvi [BUN], osmolalita moču a výdaj moču). BUN a sérový kreatinín boli od príjemcov transplantovanej obličky a falošne operované potkany boli merané pomocou prístroja IDEXX Catalyst One Chemistry Analyzer (Markham, ON). Hladiny osmolality moču sa stanovili osmometriou bodu tuhnutia s použitím prístroja 3320 Osmometer (Advanced Instruments, Norwood, MA) a porovnali sa so štandardmi poskytnutými spoločnosťou.

2.5. Histopatologická a morfometrická analýza

Tkanivá obličiek zaliate v parafíne boli narezané na rezy s hrúbkou 4 um a pripevnené na mikroskopické sklíčka na histológiu. Rezy boli zafarbené hematoxylínom a eozínom (H&E), značenie koncovej deoxynukleotidyltransferázy dUTP (TUNEL), aby sa určil stupeň ATN a apoptózy. Sekciám H&E pridelil zaslepený renálny patológ skóre pre ATN podľa nasledujúcej schémy: 1 =<11%, 2="11–24%," 3="25–45%," 4="46–75%," 5="">75 percent štepu ATN. Rezy obličiek boli tiež zafarbené nasledujúcimi primárnymi protilátkami: marker poškodenia obličiek (KIM-1), makrofágový povrchový marker CD68 a neutrofil-špecifický enzým myeloperoxidáza (MPO; Abcam®, Toronto, Kanada) a vizualizované sekundárnymi protilátkami a Substrátový chromogén DAB s použitím systému Dako Envision System (Dako, Glostrup, Dánsko) podľa protokolu výrobcu a následne analyzovaný pod digitálnym svetelným mikroskopom Eclipse 90i (Nikon® Instruments, New York) pri 10-násobnom zväčšení a kvantifikovaný softvérom ImageJ v. 1.8 (National Inštitúty zdravia, Bethesda, MD).

2.6. Kvantitatívna PCR analýza

Celková RNA bola izolovaná z tkanív obličkového štepu získaných v POD 3 pomocou súpravy RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Toronto, Kanada) a reverzne transkribovaná do cDNA pomocou súpravy na syntézu cDNA OneScript® Plus (ABM, Kanada) v spojení s oligo(dT)12– 18 primerov podľa protokolu výrobcu. Izolovaná RNA a cDNA sa pred použitím analyzovali pomocou nanokvapky (DeNovix DS-11 Spectrophotometer, Kanada), s hodnotením A260/280 konzistentne > 1,95 a > 1,8. Reakčná zmes každej vzorky qPCR mala objem 20 ul a bola vyrobená podľa protokolu Blastaq® Green 2X qPCR Master Mix (ABM, Kanada) a analyzovaná pomocou prístroja CFX Connect Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Kanada). . Sekvencie primérov boli navrhnuté pomocou softvéru Primer-BLAST (NCBI) proti beta-aktínu, poly (ADP-ribóza) polymeráze (PARP), interferónu-gama (IFN-), tumor nekrotizujúceho faktoru alfa (TNF-), interleukínu 6 (IL -6), B-bunkový lymfóm 2 (Bcl-2), proteín X spojený s Bcl{26}} (BAX), kaspáza 3, agonista smrti interagujúcej domény BH3 (BID), c-Jun N-terminálna kináza 1/2 (JNK1/2), Pparg koaktivátor 1 alfa (PGC-1 ), mitochondriálny komplex I (NDUFB8), mitochondriový komplex II (SDHB), mitogénom aktivovaná proteínkináza 1/2 (ERK1 /2), gény neutrofilnej gelatinázy lipokalín (NGAL) a molekuly poranenia obličiek-1 (KIM{45}}). Všetky požadované gény boli normalizované voči beta-aktínu. Násobné zmeny génovej expresie sa porovnali s falošne operovanými potkanmi a vypočítali sa s použitím metódy ACt.

2.7. Štatistická analýza

Všetky štatistické analýzy boli vykonané pomocou štatistického softvérového balíka GraphPad (La Jolla, CA) Prism, verzia 9.0. Údaje o prežití sa analyzovali pomocou Kaplan-Meierovej analýzy prežitia a log rank testu, zatiaľ čo údaje o expresii génu qPCR sa analyzovali pomocou nepárového jednosmerného t-testu. Všetky ostatné údaje sa analyzovali pomocou jednosmernej analýzy rozptylu (ANOVA), po ktorej nasledoval Tukeyho post-hoc test na určenie štatistických rozdielov medzi skupinami. Štatistická významnosť bola prijatá na str<0.05. values="" are="" presented="" as="" mean="" ±="" standard="" error="" of="" mean="">

3. Výsledky

3.1. Médium bez séra doplnené STS zlepšuje prežitie renálnych tubulárnych epiteliálnych buniek počas studenej hypoxie/reoxygenácie

Analýza prietokovou cytometriou po zafarbení na apoptózu a nekrózu ukázala, že bunky NRK{0}}E ošetrené SF počas in vitro studenej IRI vykazovali významne zníženú životaschopnosť buniek v porovnaní s kontrolnými (normoxickými) bunkami (obr. 1A; p < 0.05).="" zatiaľ="" čo="" všetky="" experimentálne="" vzorky="" vykazovali="" významne="" nižšiu="" životaschopnosť="" renálnych="" tubulárnych="" epiteliálnych="" buniek="" ako="" bunky="" pestované="" za="" normoxických="" podmienok="" (p="">< 0="" 0,05),="" bunky="" ošetrené="" sf="" doplneným="" 150="" um="" a="" 500="" um="" sts="" vykazovali="" významne="" vyššiu="" životaschopnosť="" ako="" bunky="" ošetrené="" so="" samotným="" sf="" médiom="" (obr.="" 1a;="" p="">< 0,05),="" čo="" zodpovedalo="" výrazne="" zníženej="" apoptóze="" v="" porovnaní="" s="" bunkami="" ošetrenými="" samotným="" sf="" médiom="" (obr.="" 1b;="" p="">< 0,05).="" okrem="" toho="" sa="" zdá,="" že="" zvýšenie="" životaschopnosti="" buniek="" a="" zníženie="" apoptózy="" dosahujú="" optimálne="" hladiny="" pri="" 150="" um="" a="" 500="" um="" sts,="" pretože="" vyššia="" dávka="" zvrátila="" tieto="" trendy="" (obr.="" 1a="" a="">

3.2. Doplnenie roztoku UW pomocou STS zlepšuje skoré prežitie a funkciu obličkového štepu

Zachovanie obličkových štepov v roztoku UW doplnenom STS významne zlepšilo prežitie príjemcu s 83 percentným prežitím do POD 14 (deň usmrtenia) v porovnaní s kontrolnou skupinou bez suplementácie STS, ktorá vykazovala 12,5 percentné prežitie, najmä v prvých 3 dňoch (obr. 2A; p < 0.05).="" okrem="" toho="" suplementácia="" sts="" výrazne="" zlepšila="" funkciu="" štepu="" počas="" skorého="" obdobia="" po="" transplantácii="" v="" porovnaní="" so="" samotnou="" liečbou="" uw.="" hladiny="" sérového="" kreatinínu="" a="" bun="" boli="" významne="" zvýšené="" v="" skupinách="" uw="" aj="" uw="" plus="" sts="" v="" pod="" 3,="" čo="" korelovalo="" so="" zníženou="" osmolalitou="" moču="" v="" porovnaní="" so="" simuláciou="" (obr.="" 2b,="" c="" a="" 3a;="" p="">< 0).{25="" }}5).="" hladiny="" sérového="" kreatinínu="" a="" bun="" v="" skupine="" uw="" plus="" sts="" však="" významne="" klesli="" v="" pod="" 3="" so="" zodpovedajúcim="" zvýšením="" osmolality="" moču="" v="" porovnaní="" so="" skupinou="" uw="" (obr.="" 2b,="" c="" a="" 3a;="" p="">< 0,05).="" je="" zaujímavé,="" že="" hladiny="" sérového="" kreatinínu="" a="" bun="" v="" skupine="" uw="" plus="" sts="" neustále="" klesali="" od="" pod="" 3="" do="" pod="" 14="" so="" zvýšenou="" osmolalitou="" moču="" a="" boli="" porovnateľné="" s="" hladinami="" u="" shama="" (obr.="" 2b,="" c="" a="" 3a).="" taktiež="" výstup="" moču="" v="" skupine="" uw="" plus="" sts="" bol="" signifikantne="" vyšší="" počas="" prvých="" štyroch="" pooperačných="" dní="" v="" porovnaní="" so="" skupinami="" uw="" a="" sham="" (obr.="" 3b;="" p="">< 0,05).="" stále="" však="" klesal="" smerom="" k="" základnej="" (sham)="" hodnote="" a="" bol="" porovnateľný="" s="" hodnotou="" sham="" v="" pod="" 14,="" zatiaľ="" čo="" produkcia="" moču="" u="" prežívajúceho="" potkana="" v="" skupine="" uw="" zostala="" vyššia="" ako="" východisková="" hodnota="" v="" pod="" 14="" (obr.="">

3.3. Pridanie STS do roztoku UW zmierňuje smrť buniek vyvolanú transplantáciou po transplantácii obličky

Rezy obličiek získané v POD 3 a 14 boli zafarbené pomocou TUNEL ako miera apoptickej bunkovej smrti a hodnotené zaslepeným obličkovým patológom (obr. 4A). Renálne štepy zo skupiny UW vykazovali signifikantne vyššiu apoptotickú bunkovú smrť v POD 3, ako naznačuje vyššie skóre TUNNEL v porovnaní s obličkami zo skupín UW plus STS a Sham (obr. 5A a b; p < 0.{{11}="" }5).="" štepy="" zo="" skupiny="" uw="" plus="" sts="" sa="" významne="" nelíšili="" v="" porovnaní="" so="" štepmi="" sham="" v="" rovnakom="" časovom="" bode="" a="" v="" pod="" 14="" (obr.="" 4b).="" okrem="" toho,="" zatiaľ="" čo="" štepy="" zo="" skupín="" uw="" aj="" uw="" plus="" sts="" vykazovali="" významne="" zvýšené="" skóre="" atn="" v="" pod="" 3="" v="" porovnaní="" so="" skupinou="" sham="" (obr.="" 5;="" p="">< 0.05),="" štepy="" uw="" plus="" sts="" vykazovali="" znížené="" skóre="" atn="" v="" pod="" 3="" v="" porovnaní="" s="" uw="" (obr.="" 5;="" p="">< 0,05).="" zatiaľ="" čo="" príjemcovia="" uw="" štepov="" neprežili="" do="" pod="" 14,="" a="" teda="" ich="" skóre="" atn="" nebolo="" možné="" určiť="" v="" pod="" 14,="" tie="" zo="" štepov="" uw="" plus="" sts="" prežili="" do="" pod="" 14,="" ale="" vykazovali="" výrazne="" zvýšené="" skóre="" atn="" v="" porovnaní="" so="" skupinou="" sham="" (obr.="" 5;="" p=""><>

3.4. Renálne štepy konzervované v roztoku UW doplnenom STS vykazovali znížené markery poranenia a zápalový infiltrát po transplantácii obličky

Rezy obličiek získané v POD 3 a 14 boli zafarbené KIM-1 na detekciu poškodenia proximálnych tubulov, ako aj CD68 (marker makrofágov) a MPO (marker neutrofilov) a skórované zaslepeným renálnym patológom (obr. 6A, 7A, a C). Expresia KIM-1, CD68 a MPO v obličkovom tkanive bola významne vyššia v skupine UW v POD 3 v porovnaní s expresiou v skupinách UW plus STS a Sham (obr. 6B, 7B a D; p < {{11}="" }.05),="" zatiaľ="" čo="" expresia="" týchto="" markerov="" v="" uw="" plus="" sts="" štepoch="" nebola="" významne="" odlišná="" v="" porovnaní="" s="" sham="" v="" pod="" 14="" (obr.="" 6b,="" 7b="" a="" d;="" p=""> 0,05).

3.5. Doplnenie STS do roztoku UW potlačilo renálnu expresiu prozápalových, proapoptotických a mitochondriálnych génov

Génová expresia prozápalových, proapoptotických, mitochondrií zacielených markerov a markerov poškodenia obličiek bola stanovená pomocou qRT-PCR v transplantovaných obličkách získaných v POD 3. Expresia prozápalových génov IFN-, TNF- a IL{{8 }} boli výrazne zvýšené v UW štepoch v porovnaní s UW plus STS štepmi v POD 3 (obr. 8A; p < 0.05)="" a="" sledovali="" rovnaký="" vzorec="" s="" proapoptickými="" génmi="" parp,="" bax="" ,="" kaspázy-3,="" bid,="" jnk1="" a="" jnk2="" (obr.="" 8a;="" p="">< 0.05),="" zatiaľ="" čo="" expresia="" antiapoptotického="" bcl-2="" bola="" mierne="" zvýšená="" v="" uw="" plus="" skupina="" sts="" v="" porovnaní="" so="" skupinou="" uw,="" hoci="" tento="" nárast="" nedosiahol="" štatistickú="" významnosť="" (obr.="" 8a).="" okrem="" toho="" expresia="" mitochondriálnych="" génov="" pgc-1,="" ndufb8="" (komplex="" i)="" a="" sdhb="" (komplex="" ii)="" v="" uw="" štepoch="" bola="" významne="" znížená="" v="" porovnaní="" s="" uw="" plus="" sts="" štepmi="" (obr.="" 8b;="" p="">< 0="" .05),="" zatiaľ="" čo="" pri="" expresiách="" erk1="" a="" erk2="" bol="" pozorovaný="" opak="" (obr.="" 8b;="" p="">< 0,05).="" okrem="" toho="" sa="" expresia="" génu="" kim-1="" v="" uw="" štepoch="" významne="" zvýšila="" v="" porovnaní="" so="" štepmi="" uw="" plus="" sts="" (obr.="" 8c;="" p="">< 0,05),="" zatiaľ="" čo="" znížená="" expresia="" ngal="" v="" štepoch="" uw="" plus="" sts="" nedosiahla="" štatistickú="" významnosť="" v="" porovnaní="" s="" uw="" štepy="" (obr.="" 8c;="" p=""> 0,05).

4. Diskusia

Táto štúdia stanovuje suplementáciu štandardného konzervačného roztoku STS, klinicky životaschopného darcu H2S schváleného FDA, na zmiernenie IRI vyvolaného chladom obličiek, zlepšenie kvality štepu a predĺženie prežitia príjemcu. Pomocou in vitro modelu renálnej IRI a potkanieho modelu syngénnej ortotopickej transplantácie obličky prvýkrát demonštrujeme, že suplementácia UW roztoku s STS počas predĺženého SCS je pro- a orgánová ochrana.

Primárnym zistením v našom in vitro modeli je, že suplementácia STS do bezsérového média chráni renálne epitelové bunky pred studenou hypoxiou a teplou reoxygenáciou indukovanou apoptózou a zvyšuje životaschopnosť, čo je v súlade s našou predchádzajúcou štúdiou, kde sme preukázali ochranné účinky mitochondrií. - zacielený donorový liek H2S, AP39, v in vitro modeli studenej obličkovej IRI [20]. Je zaujímavé, že vyššia koncentrácia STS 1 mM zvrátila priaznivé účinky, čo znamená, že STS vykazuje dvojfázový fenomén dávka-odozva označovaný ako horméza, v ktorom je nižšia koncentrácia cytoprotektívna, zatiaľ čo vyššia koncentrácia je cytotoxická. Mitochondriálne poškodenie je hlavným dôsledkom IRI obličiek, pretože mitochondriálna permeabilita môže inhibovať produkciu adenozíntrifosfátu (ATP) a zvýšiť tvorbu reaktívnych foriem kyslíka (ROS), deštruktívneho mediátora poškodenia tkaniva [13]. Nedávno bolo navrhnuté, že mitochondrie sú primárnym miestom aktivity STS. Nielenže je známe, že STS generuje H2S v mitochondriách prostredníctvom redukcie závislej od glutatiónu a naopak cestou oxidácie sulfidov, ale tiež zachováva mitochondriálnu syntézu ATP, znižuje produkciu ROS a zlepšuje komplexné enzýmové aktivity v reťazci transportu elektrónov (ETC) [24 ,28–30]. Nedávne štúdie navyše ukázali, že STS významne zvýšil expresiu PGC-1, pozitívneho regulátora mitochondriálnej biogenézy a produkcie ATP [26], čo je v súlade s naším pozorovaním in vivo. Tieto molekulárne mechanizmy by mohli zodpovedať za výrazne zvýšenú expresiu mitochondriálnych komplexov ETC I a II (NDUFB8 a SDHB) v našom modeli transplantácie obličky so zvýšeným prežitím a funkciou, ako sa pozorovalo u obličkových štepov konzervovaných v roztoku UW doplnenom STS.

Na základe našich výsledkov in vitro sme sa rozhodli preskúmať, či je ochranný účinok STS použiteľný in vivo pomocou transplantačného modelu, kde je studená IRI hlavným prispievateľom k dysfunkcii štepu a zvýšeným komplikáciám po transplantácii. Naše zistenia ukazujú, že predĺžená (24 h) SCS obličkových štepov v roztoku UW doplnenom STS výrazne zlepšuje kvalitu a funkciu štepu charakterizovanú zníženými hladinami sérového kreatinínu a BUN, vyšším výdajom moču a predĺženým prežitím príjemcu v porovnaní so štepmi konzervovanými v samotnom roztoku UW . Je dôležité poznamenať, že bezprostredný výstup moču aj po klinickej transplantácii obličky je kritickým výsledkom, ktorý určuje, či je potrebná dialýza na riešenie oneskorenej funkcie štepu (DGF). Preto naše pozorovanie, že STS zvyšuje produkciu moču ihneď po transplantácii a je porovnateľné so skupinou Sham v POD 14, je sľubným zistením. Pozorované zlepšenie funkcie obličiek po transplantácii štepov konzervovaných v roztoku UW doplnenom STS tiež poskytlo významnú výhodu v prežití. Kvantitatívne suplementácia STS predĺžila životnosť štepu tak, že 83 percent (5/6) potkanov, ktoré dostali UW plus STS štepy, prežilo do POD 14 (deň usmrtenia) v porovnaní s iba 12,5 percentami (1/8) potkanov príjemcov štepy konzervované v UW roztoku bez suplementácie STS. Toto zistenie z tejto štúdie sa tiež zhoduje s našou predchádzajúcou štúdiou, v ktorej sa iba 14 percent (1 zo 7) príjemcov štepov uchovalo v roztoku UW počas 24 hodín bez suplementácie H2S (GYY4137), prežilo do POD 14 [20]. .

Okrem zlepšenia parametrov funkcie obličiek suplementácia STS tiež inhibovala apoptózu a zápal obličkového štepu znížením tkanivovej expresie proapoptotických a prozápalových génov, pričom súčasne upregulovala antiapoptotické gény a znížila CD68-pozitívne makrofágy a MPO-pozitívne neutrofily, čo celkovo viedlo k zníženiu expresie KIM{5}} a ATN a nakoniec k zachovaniu morfológie obličiek. Je známe, že tieto zápalové cytokíny sú mediátormi bunkovej smrti počas studenej IRI [31] a ich redukcia v UW plus STS štepoch je pravdepodobne spôsobená dobre známymi charakteristikami STS, ktoré znižujú endotelovú permeabilitu vo vaskulárnej endotelovej monovrstve, tlmia produkciu cytokínov a vyvolávajú produkciu protizápalových cytokínov [32]. Naše zistenie, že suplementácia STS do roztoku UW znižuje expresiu prozápalových génov, sa zhoduje s predchádzajúcou štúdiou o protizápalovej aktivite STS znížením hladín TNF- a IL-6 pri neurologických ochoreniach [33 ,34]. Mechanicky STS inaktivuje kaspázu{16}} tým, že sa naviaže na jej aktívne miesto prostredníctvom silných vodíkových väzieb, čím zabráni prístupu prirodzeného substrátu k aktívnemu miestu, čím nakoniec zastaví apoptózu [35]. STS tiež blokuje aktiváciu JNK, proteínu, ktorý hrá rozhodujúcu úlohu v apoptickej signalizácii [35], čo podporuje naše zistenie o downregulačnom účinku STS na kaspázu3 a JNK. Nie sme však schopní určiť, či takéto mechanizmy fungujú v tejto štúdii, pretože sme nevykonali ďalšie experimenty na preskúmanie týchto molekulárnych mechanizmov.

Hlavným obmedzením nášho experimentu in vitro je naša technická výzva pri použití súčasnej štandardnej teploty uchovávania 4 ◦C [36], pretože nami použitých 10 ◦C bola najnižšia teplota, ktorú bolo možné technologicky dosiahnuť bez ohrozenia hypoxického prostredia. To je skutočný rozdiel, pokiaľ ide o bunkové fyziologické procesy a tiež v konzervačných technikách. Potenciálnym riešením je použiť chemicky vyvolanú hypoxiu v plastovom vrecku a umiestniť ho do chladničky s teplotou 4 ◦C, aby sa zohľadnili klinické nastavenia SCS. Tieto vaky na vytváranie anaeróbnej atmosféry však boli navrhnuté na použitie pri vysokých teplotách (21–37 ◦C), pretože chemické zlúčeniny, ktoré vyvolávajú hypoxické prostredie, fungujú za týchto podmienok. Budúce štúdie by sa mali zamerať na optimalizáciu teploty v hypoxickej komore, aby napodobnili klinické nastavenia SCS. Dosiahnutie konzistentnej teploty 4 ◦C bez ohrozenia hypoxického prostredia nám umožní určiť, či sú pozorované fenotypy v experimentálnom in vitro studenom modeli IRI konzistentne exprimované. Okrem experimentu in vitro nie je náš model transplantácie potkanov bez nevýhod. Uskutočnili sme syngénnu transplantáciu obličky (geneticky identickí darcovia a príjemcovia s imunologickou kompatibilitou), ktorá je pri klinickej transplantácii obličky použiteľná len pre jednovaječné dvojčatá, pričom väčšina klinických transplantácií obličiek je alogénna (geneticky odlišní darcovia a príjemcovia). Alogénna transplantácia núti príjemcov transplantátu podstúpiť pred transplantáciou imunologické testy na identifikáciu darcovských ľudských leukocytových antigénov (HLA; molekuly, ktoré indukujú a regulujú imunitnú odpoveď), stanovenie imunologickej kompatibility medzi darcami a príjemcami a zabránenie odmietnutiu orgánu [37,38]. Budúce štúdie využívajúce STS by mali zvážiť alogénnu transplantáciu. Ďalším limitujúcim modelom transplantácie obličky je skutočnosť, že sme sa zamerali na žijúcich darcov, suboptimálne štepy z darcovstva po srdcovej smrti (DCD) sú čoraz bežnejšie ako zdroj darcovských obličiek v mnohých transplantačných centrách na celom svete [39]. DCD vystavuje darcovské orgány rôznym obdobiam teplej ischémie okrem studených ischemických časov počas SCS a je spojená so zvýšenou mierou DGF a zníženým prežitím štepu v porovnaní so živými darcami [40]. Preto by budúce štúdie mali zvážiť model transplantácie obličky DCD na posúdenie účinku STS proti IRI v tomto modeli.

Na záver, naša štúdia demonštruje, že doplnenie štandardného konzervačného roztoku klinicky životaschopným donorovým liekom H2S počas predĺženého SCS obličkových štepov chráni pred studeným IRI obličiek vyvolaným transplantáciou, zlepšuje celkovú kvalitu štepu a funkciu štepu a predlžuje prežitie príjemcu transplantátu. Vzhľadom na to, že riziko DGF sa zvyšuje s predĺženým studeným ischemickým časom pri klinickej transplantácii obličky, čo vyvoláva veľké klinické obavy, pozorovanie, že STS chráni obličkové štepy počas predĺženého SCS a zabraňuje DGF po transplantácii, poskytuje veľký klinický prísľub, ktorý by mohol znížiť alebo zabrániť výskyt DGF pri klinickej transplantácii obličky v blízkej budúcnosti. Budúca výhoda pridania STS k riešeniam ochrany teda môže predstavovať potenciálne riešenie tohto pretrvávajúceho problému. Celkovo táto štúdia prispieva k rastúcemu počtu literatúry, ktorá podporuje cytoprotektívne účinky STS a iných darcov H2S proti orgánovej IRI, najmä zlepšenie výsledkov štepu pri studenej obličkovej IRI vyvolanej transplantáciou. Tieto stratégie by mohli uľahčiť použitie väčšieho počtu štepov vystavených predĺženej studenej ischemickej dobe, čo by mohlo zvýšiť zásobu transplantovateľných orgánov.

vyhlásenie o autorskom príspevku CRediT

Všetci autori súhlasili so zaslaním tohto rukopisu. Neexistuje žiadny konflikt záujmov.

Referencie

[1] RA Wolfe, VB Ashby, EL Milford a kol., Porovnanie mortality u všetkých dialyzovaných pacientov, dialyzovaných pacientov čakajúcich na transplantáciu a príjemcov prvej kadaveróznej transplantácie, New Engl. J. Med. 341 (23) (1999) 1725–1730.

[2] M. Tonelli, N. Wiebe, G. Knoll a kol., Systematický prehľad: transplantácia obličky v porovnaní s dialýzou v klinicky relevantných výsledkoch, Am. J. Transpl. 11 (10) (2011) 2093–2109.

[3] MC Cavallo, V. Sepe, F. Conte a kol., Nákladová efektívnosť transplantácie obličky z DCD v Taliansku, Transplantácia. Proc. 46 (10) (2014) 3289–3296.

[4] B. Dorweiler, D. Pruefer, TB Andrasi, SM Maksan, W. Schmiedt, A. Neufang, CF Vahl, Ischemia-reperfúzne poškodenie, Eur. J. Trauma Emerg. Surg. 33 (6) (2007) 600-612.

[5] EE Guibert, AY Petrenko, CL Balaban, AY Somov, JV Rodriguez, BJ Fuller, Organ preservation: súčasné koncepty a nové stratégie pre ďalšie desaťročie, Transfus. Med. Hemother. 38 (2) (2011) 125–142.

[6] AK Salahudeen, N. Haider, W. May, Studená ischémia a znížené dlhodobé prežívanie kadaveróznych obličkových aloštepov, Kidney Int. 65 (2) (2004) 713-718.

[7] I. Quiroga, P. McShane, DD Koo a kol., Hlavné účinky oneskorenej funkcie štepu a času studenej ischémie na prežitie obličkového aloštepu, Nephrol. Vytočiť. Transplantácia. 21 (6) (2006) 1689–1696.

[8] LK Kayler, J. Magliocca, I. Zendejas, TR Srinivas, JD Schold, Vplyv doby studenej ischémie na prežitie štepu u príjemcov transplantátu ECD: analýza párovej obličky, Am. J. Transplant. 11 (12) (2011) 2647–2656.

[9] MD Doshi, N. Garg, PP Reese, CR Parikh, Rizikové faktory príjemcu spojené s oneskorenou funkciou štepu: analýza párovej obličky, Transplantácia 91 (6) (2011) 666–671.

[10] A. Debout, Y. Foucher, K. Tr´ebern-Launay a kol., Každá ďalšia hodina studenej ischémie významne zvyšuje riziko zlyhania štepu a úmrtnosť po transplantácii obličky, Kidney Int. 87 (2) (2015) 343–349.

[11] A. Kezic, I. Spasojevic, V. Lezaic, M. Bajcetic, Antioxidanty zacielené na mitochondrie: budúce perspektívy pri ischemicko-reperfúznom poškodení obličiek, Oxid. Med. Cell Longev. 2016 (2016) 2950503.

[12] TI ​​Peng, MJ Jou, Oxidačný stres spôsobený mitochondriálnym preťažením vápnikom, Ann. NY Acad. Sci. 1201 (2010) 183–188.

[13] W. Jassem, SV Fuggle, M. Rela, DD Koo, ND Heaton, Úloha mitochondrií pri ischemickom/reperfúznom poškodení, Transplantácia 73 (4) (2002) 493–499.

[14] PM Snijder, E. van den Berg, M. Whiteman, SJ Bakker, HG Leuvenink, H. van Goor, Vznikajúca úloha gasotransmiterov pri transplantácii obličiek, Am. J. Transplant. 13 (12) (2013) 3067–3075.

[15] JT Hancock, M. Whiteman, Sirovodík a bunková signalizácia: tímový hráč alebo rozhodca? Plant Physiol. Biochem. 78 (2014) 37–42.

[16] W. Zhao, J. Zhang, Y. Lu, R. Wang, Vazorelaxačný účinok H(2)S ako nový endogénny plynný K(ATP) otvárač kanálov, EMBO J. 20 (21) (2001) 6008–6016.

[17] I. Lobb, M. Davison, D. Carter a kol., Liečba sírovodíkom zmierňuje ischemicko-reperfúzne poškodenie obličkového aloštepu počas skladovania v chlade a zlepšuje včasnú funkciu transplantovanej obličky a prežitie po alogénnej obličkovej transplantácii, J. Urol. 194 (6) (2015) 1806–1815.

[18] I. Lobb, A. Mok, Z. Lan, W. Liu, B. Garcia, A. Sener, Doplnkový sírovodík chráni funkciu transplantovanej obličky a predlžuje prežívanie príjemcu po dlhotrvajúcom ischemicko-reperfúznom poškodení chladom tým, že zmierňuje apoptózu obličkového štepu. a zápal, BJU Int. 110 (11 Pt C) (2012) E1187–E1195.

[19] I. Lobb, J. Jiang, D. Lian a kol., Sírovodík chráni obličkové štepy pred predĺženým studeným ischemicko-reperfúznym poškodením prostredníctvom špecifických mitochondriálnych účinkov, Am. J. Transplant. 17 (2) (2017) 341–352.

[20] C. Renard, SW Borron, C. Renaudeau, FJ Baud, tiosíran sodný na akútnu otravu kyanidom: štúdia na modeli potkanov, Ann. Pharm. Fr. 63 (2) (2005) 154-161. [21] N. Laplace, V. Kepenekian, A. Friggeri a kol., Tiosíran sodný chráni pred poškodením obličiek po hypertermickej intraperitoneálnej chemoterapii (HIPEC) s cisplatinou, Int. J. Hyperth. 37 (1) (2020) 897–902.