Štúdia účinkov kalcitriolu proti starnutiu na ľudské prirodzené zabíjačské bunky in vitro

ABSTRAKT

O vitamíne D sa všeobecne predpokladá, že má regulačný účinok na imunitný systém. Niektoré klinické výskumy ukázali, že dopyt povitamín D sa zvyšuje s vekom. Kalcitriol je biologicky aktívna formavitamín D. Jeho účinok na ľudské prirodzené zabíjačské (NK) bunky však zostáva nejasný. Preto sme v tejto štúdii skúmali účinky kalcitriolu proti starnutiu a imunomodulačné účinky na NK bunky pomocou série imunologických metód, aby sme preskúmali jeho dôležitú úlohu vo vrodenej imunite. Zistili sme, že kalcitriol zvrátil expresiu biomarkerov súvisiacich so starnutím v NK bunkách a inhiboval ich expanziu udržiavaním týchto buniek vo fáze G1 bez akejkoľvek apoptózy a vyčerpania. Kalcitriol potláčal uvoľňovanie cytokínov súvisiacich so zápalom, ako sú interleukín-5 (IL-5), interleukín-13 (IL-13), interferón-gama (IFN- ), a tumor nekrotizujúci faktor alfa (TNF-). Degranulácia NK buniek bola znížená kalcitriolom, keď boli tieto bunky kultivované spoločne s nádorovými bunkami K562. Zistili sme tiež, že kalcitriol upreguloval dráhu endoplazmatickej retikulum kinázy (SIRT1/pERK) súvisiacu so starnutím súvisiacu so sirtuín 1- a expresiu SIRT1-deltaExon8 (SIRT1-∆Exon8) aktiváciou receptora vitamínu D (VDR). Okrem toho by kalcitriol mohol byť potenciálnym negatívnym regulátorom NK buniekapoptózaamitochondriálna inaktiváciaktorý je spôsobený týmoxidačný stres. Tak sa prejavuje kalcitriolúčinky proti starnutiuna ľudských NK bunkách in vitro aktiváciou osi SIRT1-PERK aodolnosť proti oxidatívnej starnutiu.

Kliknite sem a získajte doplnky proti starnutiu Cistanche

1. Úvod

Mnohé štúdie zistili, že starnutie má priamy vplyv na niekoľko chorôb, ako sú infekčné choroby, kardiovaskulárne choroby, neurodegeneratívne choroby, autoimunitné poruchy a rakovina. Starnutie organizmu je sprevádzané imunosenescenciou. K spoločným znakom starnutia patrí najmä zápalové starnutie s chronickým nízkym zápalom [1], nestabilita genómu, nerovnováha expresie proteínov, mitochondriálna inaktivácia, starnutie buniek a zmeny v medzibunkovej komunikácii [2]. Ako hlavná zložka vrodenej imunity zohrávajú NK bunky dôležitú úlohu v protiinfekčnom a protinádorovom účinku ako aj v regulácii imunitného systému [3]. NK bunky môžu eliminovať cieľové bunky priamo alebo prostredníctvom bunkovej cytotoxicity závislej od protilátok (ADCC), namiesto toho, aby vykazovali akékoľvek antigénne alebo protilátkovo špecifické reakcie [4]. NK bunky sú tiež spojené s hypersenzitívnymi reakciami a autoimunitnými ochoreniami [5]. Keď imunitný systém starne, dochádza k expresii povrchových aktivačných receptorov, ako je prirodzený zabijak skupiny 2 člen D (NKG2D) [6], zabíjačský imunoglobulínový receptor (KIR), klaster povrchových markerov diferenciácie 57 (CD57) [7] , zhluk diferenciácie 16 (CD16) [8] sa zvýšil. Táto molekula by mohla aktivovať zabíjaciu funkciu NK buniek, čo môže viesť k bunkovej nerovnováhe a zápalu u starších ľudí. Medzitým sa znížili inhibičné molekuly NK buniek, ako je prirodzený zabíjač člen A skupiny 2 (NKG2A), prirodzený zabíjačský člen skupiny 2 C (NKG2C) a prirodzené receptory cytotoxicity (NCR) [6]. Ďalšie markery NK buniek súvisiace so starnutím sú T bunkový imunoglobulín a proteín 3 obsahujúci mucínovú doménu (TIM3) a zvýšená programovaná bunková smrť-1 (PD{30}}). Upregulácia PD-1 a TIM3 počas imunosenescencie môže inhibovať funkcie NK buniek a viesť k deplécii NK buniek [9].

Ďalším faktorom vedúcim k imunosenescencii je imunitný zápal [10]. Uvádza sa, že vysoké hladiny zápalových cytokínov uvoľňovaných NK bunkami spôsobujú poškodenie DNA, oxidačný stres a starnutie buniek. Okrem toho môže bunková nerovnováha NK buniek a stav zápalu viesť k autoimunitnému ochoreniu [11]. Hladiny interleukínu-1 (IL-1), interleukínu-4 (IL-4), interleukínu-6 (IL-6), interleukínu -10 (IL-10) a tumor nekrotizujúci faktor alfa (TNF- ) sú vyššie u starších ľudí [12]. Hoci počet celkových imunitných buniek so starnutím klesal, populácia NK buniek sa výrazne zvýšila, čo môže byť spôsobené infiltráciou zápalových buniek [13].

Vitamín D existuje v ľudskom tele v dvoch aktívnych formách ako vitamín D2 (ergokalciferol) a vitamín D3 (kalcitriol). Hlavnou funkciou vitamínu D je podporovať vstrebávanie vápnika a fosforu. Vitamín D tiež reguluje imunitné funkcie [14]. Hoci sa mnohé správy zamerali na jeho protiinfekčné a protinádorové funkcie [15], kalcitriol vykazuje aj protizápalové účinky [16]. Receptor vitamínu D (VDR) je exprimovaný na rôznych imunitných bunkách [17]. Zníženie produkcie zápalových cytokínov prispieva k zníženiu zápalových reakcií. Je známe, že kalcitriol potláča produkciu TNF-, interleukínu-1 (IL-1), interleukínu-2 (IL-2), interferónu-gama (IFN-) a iné zápalové cytokíny v B a T bunkách. Môže tiež uvoľňovať protizápalové cytokíny ako IL-4 a IL-10 [18] a regulovať autofágiu proti infiltrácii zápalových buniek [19].

Antioxidačné vlastnosti kalcitriolu boli opísané pri depresii, stukovatení pečene [20], kardiovaskulárnych ochoreniach a iných ochoreniach súvisiacich so zápalom. Voľné radikály a reaktívne formy kyslíka (ROS) sa tiež hromadia v bunkách a tkanivách počas starnutia. Publikované údaje ukázali, že oxidačný stres ovplyvňuje rôzne signálne dráhy v bunkách [21], vrátane dráh SIRT1, mitogénom aktivovanej proteínkinázy (MAPK) a nukleárneho faktora-κB (NF-κB). Gén SIRT1 sa považuje za gén dlhovekosti a supresia tohto génu má za následok poruchy súvisiace s expresiou proteínov, bunkovým cyklom a metabolizmom [22]. SIRT1-ΔExon8 je nová izoforma SIRT1, ktorá existovala u cicavcov alternatívnym zostrihom. SIRT1-ΔExon8 bol tiež považovaný za koregulačný faktor SIRT1 plnej dĺžky [23].

Zatiaľ len veľmi málo štúdií sa zameriava na účinky starnutia a oxidačnej starnutia na NK bunky. Účinky kalcitriolu na SIRT1-ΔExon8 tiež neboli hlásené. Preto sa táto štúdia zamerala na skúmanie účinkov kalcitriolu na starnutie a oxidačné starnutie NK buniek, keďže tieto bunky zaujímajú ústrednú pozíciu v ľudskom vrodenom imunitnom systéme.

2. Materiály a metódy

2.1 Bunková kultúra a činidlá

Tri vzorky ľudskej periférnej krvi boli získané od darcov, ktorí nemali žiadne aktívne autoimunitné ochorenie, akútne alebo chronické zápalové ochorenie, rakovinu alebo iné ochorenia súvisiace s imunitou. Vek darcov sa pohyboval od 48 do 65 rokov. Mononukleárne bunky periférnej krvi (PBMC) boli izolované pomocou Lymphoprep Ficoll. NK bunky boli expandované a udržiavané s použitím súpravy NK Cell Culture Kit (MoreCell, Shenzhen, Čína) pri 37 stupňoch / 5 percent CO2.

2.2 Analýza prietokovou cytometriou

Po ošetrení kalcitriolom počas 72 hodín boli NK bunky zafarbené anti-humánnym FITC-CD3, PerCp-CD56, APC-CD16, PE-NKG2A, PE-TIM3, PE-PD1 a PE-KIR (BioLegend, Kalifornia, USA). Všetky testy FACS sa uskutočnili pomocou prietokového cytometra DxFLEX (Beckman, Kalifornia, USA).

2.3 Meranie bunkovej expanzie, uvoľňovanie cytokínov a test bunkového cyklu

Bunková expanzia bola stanovená pomocou súpravy Cell Counting Kit-8 [24] (CCK8; Beyotime, Shanghai, Čína). NK bunky boli ošetrené kalcitriolom počas 48 hodín a supernatant bol zozbieraný na test uvoľňovania cytokínov. Hladiny cytokínov sa skúmali pomocou LEGEND Plex Human Inflammation Panel (BioLegend, California, USA). Najprv sa guľôčky zachytávajúce cytokíny inkubovali so štandardmi alebo vzorkami a potom sa ďalej inkubovali s biotinylovanými detekčnými protilátkami. Následne sa pridal roztok viažuci biotinylovanú detekčnú protilátku, streptavidín (SA)-PE, aby poskytol fluorescenčný signál [25]. Tieto signály sa potom analyzovali pomocou testu FACS.

Bunkový cyklus sa meral pomocou súpravy Cell Cycle Detection Kit (Beyotime, Shanghai, Čína). NK bunky boli ošetrené kalcitriolom počas 72 hodín. Tieto bunky boli fixované v 70% ľadovo studenom etanole a potom zafarbené ribonukleázou A (RNáza A) a propídiumjodidom (PI) (Beyotime, Shanghai, Čína) [26].

2.4 Test zabíjania NK buniek

Ľudské erytroleukemické bunky, bunky K562 (ATCC, Virginia, USA), sa inkubovali s 10 uM 3,3 -dioktadecyloxakarbocyanínu (DIOBeyotime, Shanghai, Čína) počas 15 minút a potom sa pridali k NK bunkám ošetreným kalcitriolom v rôznych pomeroch (E/T'=1:1, 5:1 a 10:1) počas 4 hodín (27).

2.5 Indukcia oxidačnej starnutia a analýza farbenia X-gal

Model starnutia NK buniek in vitro s použitím peroxidu vodíka (H2O2). Aby sa určil antioxidačný účinok kalcitriolu, NK bunky boli najskôr ošetrené kalcitriolom a potom vystavené 100 uM H2O2 počas 24 hodín. Aktivita -galaktozidázy sa merala pomocou farbenia 5-bróm-4-chlór-3-indolyl- -D-galaktopyranozidom (X-gal). Ošetrené bunky boli fixované v 4% paraformaldehyde a zafarbené roztokom na farbenie -galaktozidázou (Beyotime, Shanghai, China) cez noc pri 37 stupňoch [28]. Zafarbené bunky sa potom suspendovali v PBS a obrazy týchto buniek sa získali pomocou systému fluorescenčného inverzného mikroskopu Leica. Pre každú skupinu boli náhodne zozbierané tri mikroskopické obrázky z rôznych pozícií pri 40-násobnom zväčšení. Vypočítalo sa percento buniek zafarbených X-gal a použilo sa na posúdenie starnutia buniek pomocou softvéru ImageJ V.1.45S.

2.6 Farbenie a analýza potenciálu mitochondriálnej membrány

Na hodnotenie potenciálu mitochondriálnej membrány sa použili chlórmetyl-X-rosamín (CMXRos) a Hoechst (Beyotime, Shanghai, Čína). Bunkové jadrá (modré) boli lokalizované Hoechstovým farbením, zatiaľ čo mitochondriálny membránový potenciál bol určený mitochondriálnou špecificitou označujúcou fluorescenčné farbivo, CMXRos. Bunky Hoechst plus CMXRos (označené bielymi šípkami) vykazovali nízku aktivitu. Relatívna hladina fluorescencie sa vypočítala vydelením počtu Hoechst-pozitívnych buniek CMXRos-pozitívnymi bunkami [29]. Bunky sa inkubovali s 200 nM CMXRos a Hoechst (30 minút, 37 stupňov) a detegovali sa použitím invertovaného mikroskopu Leica pri excitačných vlnových dĺžkach 579 nm a 350 nm. Percento buniek Hoechst plus CMXRos plus sa vypočítalo tak, ako je opísané v časti 2.5.

2.7 Western blotting

Bunky boli lyzované pomocou lyzačného pufra pre rádioimunoprecipitačný test (RIPA) (Beyotime, Shanghai, Čína) s inhibítorom fosfatázy PhosSTOP (Roche, Bazilej, Švajčiarsko) a 1 uM fenylmetylsulfonylfluoridom (PMSF) (Beyotime, Shanghai, Čína). Celkový proteín sa kvantifikoval pomocou súpravy Bradford Protein Assay Kit (TAKARA, Tokio, Japonsko). Proteínové vzorky boli oddelené elektroforézou na dodecylsulfát-polyakrylamidovom géli sodnom (SDS-PAGE) a prenesené na 0.22 μm polyvinylidénfluoridové (PVDF) membrány (membrána Immobilon-P; Millipore, Massachusetts, USA). Po blokovaní boli membrány sondované primárnymi protilátkami a inkubované so sekundárnymi protilátkami [30]. Membrány boli detegované pomocou systému Odyssey (LI-COR, Nebraska, USA).

2.8 Štatistická analýza

Dáta boli analyzované jednosmernou analýzou rozptylu (ANOVA) s použitím GraphPad Prism a prezentované ako priemer ± štandardná odchýlka (SD). 6846 W. LI ET AL. Rozdiely sa považovali za štatisticky významné pri P < 0,05. Výsledky boli tiež analyzované pomocou softvéru GraphPad.

Požiadajte o viac:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950