Štúdia o neuroendokrinno-imunitnej funkcii Cistanche Deserticola a jej produktov na pare z ryžového vína na modeli potkanov indukovaných glukokortikoidmi-Ⅰ

1. Úvod

Cistanche púšť, ktorý sa nazýva „púštny ženšen“, je tradičná čínska medicína, ktorá sa po stáročia používa ako bylina jang-tonikumpovzbudenie obličiek a posilnenie jangu[1]. Osem druhov a jedna variáciaCistanche Herba boli zaznamenané iba v ČíneCistanche deserticolaYC Ma aCistanche tubulosa(Schenk) Wight sú zaznamenané v Čínskom liekopise [2]. Farmakologické štúdie to dokázaliCistanches Herbavykazuje neuroprotektívne [3], imunomodulačné [4], kardioprotektívne [5], protiúnavové [6], protizápalové [7], hepatoprotektívne [8], antioxidačné [9], antibakteriálne [10], laxatívne [11] a protinádorové účinky [12]. Široké spektrum uvádzaných biologických aktivít tohto rodu sa pripisuje jeho zložitému a rôznorodému fytochemickému zloženiu.Cistanche deserticolaobsahuje fenyletanolové glykozidy, iridoidy, polysacharidy [13] atď. Obsah fenyletanoidových glykozidov je najvyšší v pôvodných liečivých materiáloch [14].

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA OBŽIVENIE OBLIČIEK PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Spracovanie čínskej Materia Medica (CMM) je tradičná farmaceutická technika na splnenie rôznych požiadaviek na liečbu, dávkovanie a výrobu prípravkov podľa teórie tradičnej čínskej medicíny. Tieto spracované produkty sa nazývajú odvarové kúsky, ktoré sa používajú na klinikách. Cieľom spracovania je zvýšiť účinnosť pri znižovaní toxicity surových liečiv. Čínsky liekopis z roku 2015 zaznamenal, že hrubé plátky Cistanche (CD) a Cistanche dusené v ryžovom víne (WCD) by sa mohli na klinike použiť ako kúsky odvaru. Naša výskumná skupina ukázala, že laxatívny účinok sa uvoľnil a účinky proti starnutiu a povzbudzujúce účinky na obličky a jang sa zvýšili po tom, čo bol Cistanche naparený s ryžovým vínom [15].

Funkcia osi hypotalamus-hypofýza-nadobličky-týmus (HPAT) je pri syndróme obličkovo-jangovej deficiencie narušená [16]. Pacienti s deficitom jangu a obličiek majú tiež rozsiahlu imunitnú dysfunkciu. Dysfunkcia osi HPA úzko súvisí s imunodeficienciou. Teória neuroendokrinno-imunitnej siete (NEI) ukazuje, že imunitný a neuroendokrinný systém zdieľajú mnohé ligandy a receptory [17] a hypotalamus sa považuje za kľúčový prvok spojenia neuroendokrinného systému s imunitným systémom.

V tejto štúdii sme replikovali deficit obličky-yang u modelových potkanov s exogénnou injekciou kortikosteroidov a skúmali mechanizmus deficitu obličky-yang v reakcii na rôzne spracované produkty Cistanche deserticola z hľadiska endokrinno-imunitnej funkcie.

2. Materiály a metódy

2.1. Materiály a činidlá

Cistanche deserticola bola zozbieraná od Alashana Neimenggu v roku 2019.5 a identifikovaná ako sušené mäsité stonky Cistanche deserticola YC Ma profesorom Yanjunom Zhaiom (Farmaceutická škola, Liaoning University of Tradičná čínska medicína, Čína). Vzorky poukážok sa zachovali v Technologickom centre spracovania Liaoning.

Štandardné zlúčeniny ajugolu boli zakúpené od Chengdu Pure Chem-Standard Co., Ltd. (Chengdu, Čína); cistanozid F,echinakozid, cistanozid A a izoakteozidboli zakúpené od spoločnosti Must Company (Sichuan China); akteozid bol zakúpený od Dalian Meilun Bio. Co., Ltd. (Dalian, Čína). Acetonitril a metanol akosti MS boli zakúpené od Merck KGaA (Darmstadt, Nemecko). Kyselina mravčia HPLC bola zakúpená od Merck KGaA (Darmstadt, Nemecko). Ryžové víno bolo zakúpené od Zhejiang Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, Čína).

Kortikosterón (CAS: 50-22-6, čistota > 98 %, TCI Shanghai Development Ltd. Co.), pilulky chinkuei shin chewan (Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd.), potkaní ACTH, CRH, T, IL{{ 2}}, IFN-c, TNF-, IL-2 a IL{6}} ELISA detekčné súpravy boli zakúpené od Nanjing Jiancheng Co., Ltd. Súpravu potkanieho kortizolu ELISA poskytla spoločnosť BOSK Co., potkania CD4 protilátka, CD8a protilátka (č. 561833 a 559976), RBC lyzát (Solarbio, R1010), tlmivý roztok PBS (Solarbio, P1020-500), TRIzol (MAN0001271), CaM a -aktín upstream a downstream primery boli poskytnuté Guangzhou Invitrogen Co. Reverse Transscription Kit (č. RR037A) a cDNA Synthesis Kit (č. 10000068167) boli poskytnuté spoločnosťou Bole Life Medicine Products (Shanghai) Co., Ltd. Chloroform, izopropanol, 75 % etanol a uretán roztoky boli všetky analyticky čisté a vyrábané spoločnosťou Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Ultračistá voda bola vyrobená systémom Milli-Q (18,2 MQ, Millipore, MA, USA).

2.2. Experimentálne nástroje

Enzýmový marker (Thermo, model 3530911931), automatická umývačka platní (model HBS- 4009), digitálny displej push-pull merač sily (model VICTOR- 50N), vysokorýchlostná mraziaca odstredivka (model Sigma 3k15 ), ultramikro spektrofotometer (model B-50Q), génový zosilňovač (model L96G), fluorescenčná kvantitatívna PCR v reálnom čase (model StepOne), prietokový cytometer (model AC66051710132), parafínový mikrotóm (model Laika), mikroskop (Olympus , model BS-53) a prístroj na čistú vodu (model F7JA36507).

2.3. Príprava vzoriek pre UPLC-Q-TOF-MS a farmakologické experimenty

WCD bolo spracované z rovnakej šaržeCistanche púšťv našom laboratóriu. Na prípravu WCD sa suché kúsky CD (hrúbka 5 mm) (100 g) naplnili ryžovým vínom (30 ml), naparili sa pri vysokom tlaku (1,25 kPa) počas 4 hodín a potom sa sušili pri 55 stupňoch.

Hrubé prášky CD a WCD boli namočené v 10-krát 95% etanole počas 0,5 hodiny, extrahované pod spätným chladičom 3-krát zakaždým počas 1 hodiny a filtrované a filtráty boli 3-krát spojené. Etanol sa izoloval pri zníženom tlaku a extrakt sa získal na podávanie. Extrakt (1 ml) sa pridal do 50 % metanolu, čím sa celkový objem upravil na 20 ml, a skladoval sa pri 4 stupňoch na analýzu obsahu.

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA ZLEPŠENIE SEXUÁLNEJ FUNKCIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.4. Podmienky UPLC-QqQ-MS pre analýzu CD a WCD extraktov

2.4.1. Analytické podmienky LCThMS

Na zber a spracovanie dát bol použitý systém UPLC-MSThMS so softvérom MassLynx 4.1 Analyst. Analytická kolóna bola Acquity UPLC BEH C18 (1{{10}}}0 mm × 2,1 mm, 1,7 μm) pri teplote 40 stupňa C. Mobilná fáza bol 0,1 % vodný roztok kyseliny mravčej (A) a acetonitril obsahujúci 0,1 % kyseliny mravčej (B). Elučný gradient bol 0.{15}}–1.{17}} min s 3 % B, 1,01 – 2.{22}} min s 3 % – 11,5 % B, 2,01 – 3.{29 }} min s 12 % B, 3,01 – 4.{34}} min s 15 % B, 4,01 – 5.00 min s 20 % B, 5,01 – 6.00 min s 22 % B, 6,01–8.00 min s 25 % B a 8,01–9.00 min s 10 % B. Prietok bol 0,3 mLTh min a objem vstreku bol 1,0 μl.

V režime záporných iónov sa použil Watersov trojitý štvornásobný hmotnostný spektrometer (Xevo TQD, Waters Corp., Milford, MA, USA) vybavený zdrojom elektrosprejovej ionizácie (ESI). Desolvatačným plynom bol dusík s prietokovou rýchlosťou 500 LThh pri teplote 250 stupňov. Všetky detekované zlúčeniny boli merané v režime monitorovania viacerých reakcií (MRM); V tabuľke 1 sú uvedené energetické parametre a v tabuľke 2 sú uvedené kalibračné krivky pre analyzované zložky.

2.4.2. Príprava referenčných látok

Tubulozid A (3.02 mg), echinakozid (3.00 mg), 2′-acetylakteozid (2,34 mg), akteozid (2,45 mg), izoakteozid (0,61 mg), cistanozid F ( 2,14 mg), salidrozid (3,39 mg), kyselina geniposidová (2,84 mg), ajugol (1,58 mg) a katalpol (2,39 mg) sa rozpustili v metanole, aby sa pripravil zásobný roztok. Zásobný roztok sa zriedil metanolom, aby sa získali vhodné koncentrácie pre pracovné štandardné roztoky. Všetky pripravené roztoky boli pred použitím skladované pri 4 stupňoch.

2.5. Príprava a zoskupovanie zvieracích modelov

Samce potkanov SD (180–220 g) boli zakúpené od spoločnosti Liaoning Changsheng Biotechnological Co., číslo povolenia pre zvieratá: SCXK (Liao) 2015–0001. Všetky potkany boli udržiavané s voľným prístupom k potrave a vode pri teplote 25 stupňov a relatívnej vlhkosti 30–50 %. Zvieratá boli chované 7 dní pred experimentmi.

Sto potkanov bolo náhodne rozdelených do 10 skupín: slepá kontrolná skupina (BC), modelová kontrolná skupina (MC), pozitívna kontrolná skupina (PC), kontrolná skupina s ryžovým vínom (WC), CD s vysokou dávkou (CD -HD) skupina, CD skupina so strednou dávkou (CD-MD), skupina CD s nízkou dávkou (CD-LD), skupina s vysokou dávkou WCD (WCD-HD), skupina so strednou dávkou WCD (WCD-MD) a WCD skupina s nízkou dávkou (WCD-LD). Dávky CD-HDThWCD-HD, CD-MDTh WCD-MD a CD-LDThWCD-LD boli 5,48 gTh (kg ∙ d), 2,74 gTh (kg ∙ d) a 1,37 gTh (kg ∙ d). Dávka pre skupinu PC bola 1,646 gTh (kg ∙ d) a pre skupinu WC 1 mLTh100 g počas 40 dní. Na 6. deň po podaní bola potkanom subkutánne injikovaná vodná suspenzia kortikosterónu (kortikosterón + 0.1% dimetylsulfoxid + 0.1% Tween-80 + 0.9% chlorid sodný) okrem pre skupinu BC [18]. Koncentrácia kortikosterónu bola 5 gThL a dávka bola 0,1 mLTh100 g. Potkanom v skupine BC bol podávaný normálny fyziologický roztok + 0,1 % dimetylsulfoxid + 0,1 % Tween- 80 + 0,9 % chlorid sodný injekčne v rovnakej dávke.

2.6. Stanovenie funkcií osi HPA

2.6.1. Test hmotnosti, teploty a prídržnej sily

Každé 3 dni sa robil test hmotnosti a každých 6 dní sa merala teplota. počas experimentu. Na 39. deň bola meracím prístrojom zmeraná maximálna sila zadnej končatiny. Potkany boli umiestnené na hladké plošiny, pričom ich zadná končatina chytila ​​palicu. Potkany inštinktívne chytia akýkoľvek predmet, aby zabránili pohybu dozadu, keď sa ťahá za chvost, kým sila ťahu nepresiahne zovretie. Keď potkan stratil priľnavosť, predzosilňovač mohol automaticky zaznamenať maximálnu silu uchopenia.

2.6.2. Stanovenie hladiny T, CRH, ACTH, CORT a kortizolu v sére

Jednu hodinu po poslednom podaní sa potkany anestetizovali intraperitoneálnou injekciou uretánového roztoku (20 gTh100 ml). Potom sa odobrali vzorky krvi, centrifugovali sa pri 3500 r počas 15 minút, aby sa získalo sérum, a skladovali sa pri -20 stupňoch. Koncentrácie T, CRH, ACTH, CORT a kortizolu sa merali pomocou súprav ELISA pre potkany podľa pokynov výrobcu.

2.6.3. Mikroskopické pozorovania

Morfologická štruktúra tkaniva nadobličiek sa pozorovala farbením HE. Tkanivo nadobličiek bolo fixované v 10% paraformaldehyde, dehydratované v etanole, priehľadné roztokom xylénu, vložené konvenčnými metódami, narezané na plátky s hrúbkou 4 μm, zbavené vosku roztokom xylénu, hydratované gradientom etanolu a potom zafarbené hematoxylínom a eozínom farbiaci roztok. Po spriehľadnení xylénom sa platňa utesnila neutrálnou gumou a pozorovala sa pod mikroskopom.

2.6.4. Imunohistochemické farbenie expresie proteínov Bax, Bcl-2, kaspázy-3, Fas a FasL v nadobličkách

Rezy nadobličiek potkanov fixované vo formalíne a zaliate do parafínu boli zbavené parafínu a rehydratované po narezaní na hrúbku 4 um. Na blokovanie aktivity endogénnej peroxidázy boli rezy predinkubované v bloku peroxidu vodíka počas 10 min. Rezy sa ponorili do 0,01 M citrátu (pH 6,0) a zahriali sa do varu. Postup sa opakuje po 5-10 minútach. Po ochladení boli rezy premyté PBS (pH 7,2-7,6) 1-2 krát, ponechané pri izbovej teplote približne 5 minút a premyté PBS (pH 7,2-7,6) 2-3 krát. Pri teplote miestnosti sa pridal blokovací roztok 5 % BSA a prebytočná kvapalina na reze sa vytrepala o 20 minút neskôr. Pridali sa zriedené primárne protilátky špecifické pre FasTh FasL, Bcl-2ThBax a kaspázu{26}} (1:100 zriedené PBS) a inkubovali sa pri 37 stupňoch 1 hodinu alebo 4 stupne cez noc. Rezy sa premyli 2-3 krát PBS (pH 7,2-7,6). Potom sa pridal biotinylovaný kozí anti-myší IgG a rezy sa sušili pri 20–37 stupňoch počas 20 minút a premyli sa PBS (pH 7,2–7,6) 4-krát počas 5 minút. Po dôkladnom premytí v PBS boli rezy inkubované so zmesou činidiel A a B počas 30 minút, inkubované s PBS počas 45 minút a nakoniec vyvolané s DAB substrátom (DAKO) počas 30 minút predtým, ako boli mierne kontrastne zafarbené hematoxylínom, dehydratované, a namontované.

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA ZVÝŠENIE SEXUÁLNEHO VNÍMANIA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.7. Stanovenie imunitných funkcií

2.7.1. Výpočet indexu imunitného orgánu

Jednu hodinu po poslednom podaní sa potkany anestetizovali intraperitoneálnou injekciou uretánového roztoku (20 gTh100 ml) a potom sa slezina a týmus odstránili a okamžite sa zvážili v sterilnej kukle. Hmotnostné koeficienty sleziny alebo týmusu (%) � hmotnosť sleziny alebo týmusu (mg) Telesná hmotnosť (g).

2.7.2. Detekcia podskupín T lymfocytov v periférnej krvi

Splenocyty a hemocyty sa inkubovali s monoklonálnymi protilátkami anti-CD4 (PE) a anti-CD8 (FITC) počas 30 minút v tme. Pridali sa 2 ml erytrocytového lyzátu a roztok sa premiešal vortexovaním. Roztok bol ponechaný v tme počas 10 minút a centrifugovaný počas 5 minút. Supernatant sa odstránil a potom sa roztok premyl 3-krát ľadovo studeným PBS a resuspendoval sa v permeabilizačnom roztoku PBS. Najmenej 10000 buniek sa analyzovalo prietokovou cytometriou do 1 hodiny od každého farbenia Mab.

2.7.3. Stanovenie hladiny IL-10, IL-6, IL-2, TNF- a IFN-c v sére

Jednu hodinu po poslednom podaní sa potkany anestetizovali intraperitoneálnou injekciou uretánového roztoku (20 gTh100 ml) a krv sa odobrala z brušnej aorty. Krv sa centrifugovala pri 3500 r počas 15 minút, aby sa získalo sérum, a skladovala sa pri -20 stupňoch. Koncentrácie IL-10, IL-6, IL-2, TNF- a IFN-c sa detegovali pomocou súprav ELISA pre potkany podľa pokynov výrobcu.

2.8. Expresia CaM v tkanivách hypotalamu a hypofýzy

Celková RNA bola extrahovaná z hypotalamu a tkanív hypofýzy pomocou TRIzolu. Reverzná transkripcia sa uskutočnila na 10 ul celkovej RNA podľa pokynov výrobcu. Rovnaké množstvá cDNA sa analyzovali pomocou qPCR v prítomnosti farbiva viažuceho dsDNA (Promega, USA) a systému CFX 96 Real-time PCR System (Bio-Rad, USA), aby sa pozreli na rôzne gény za podmienok počiatočnej aktivácie na 95 stupňov počas 10 minút, 40 cyklov denaturácie pri 95 stupňoch počas 15 s a predĺženie žíhania pri 60 stupňoch počas 1 minúty.

Priméry pre CaM a -aktín sú uvedené v tabuľke 1 a -aktín sa použil ako vnútorná kontrola. Každá vzorka sa normalizovala použitím rozdielu v kritických prahoch (Ct) medzi cieľovým génom a -aktínom. Na opis výsledku bola použitá nasledujúca rovnica: ΔΔCt � (Ct cieľový gén – Ct-aktínový gén) experimentálna skupina – (Ct cieľový gén – Ct-aktínový gén) kontrolná skupina. Hladiny mRNA každej vzorky sa potom porovnali s použitím cieľového génu expresie 2- ΔACt. Výsledky každej skupiny boli spriemerované (tabuľka 3).

2.9. Štatistická analýza

Všetky údaje boli analyzované pomocou softvéru SPSS (verzia 19.0, SPSS Institute Inc., Chicago, IL). Rozdiely medzi skupinami sa analyzovali jednosmernou analýzou rozptylu s opakovanými meraniami (ANOVA). Výsledky boli vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka (SD) pomocou softvéru GraphPad Prism (verzia 6.0, San Diego, CA, USA). Rozdiely s hodnotou P menšou ako 0,05 sa považovali za štatisticky významné.

3. Experimentálne výsledky

3.1. UPLC-QqQ-MSA analýza

Na dosiahnutie najlepšej separácie, tvaru piku a krátkeho času analýzy sa v našom predbežnom experimente študovali chromatografické podmienky vrátane kolóny, mobilnej fázy a gradientového programu. Typické chromatogramy s režimom MRM sú uvedené na obrázku 1.

Z tabuľky 4 môžeme vidieť, že obsah fenyletanoidných glykozidov v WCD sa zvýšil v porovnaní s CD, najmä pre echinakozid a akteozid, zatiaľ čo obsah iridoidov bol znížený v WCD.

3.2. Regulácia pre funkciu osi HPA

3.2.1. Test hmotnosti, teploty a prídržnej sily

Potkany zo skupiny MC a experimentálnych skupín vykazovali symptómy deficitu obličiek-yang postupne po podaní kortikosterónu. Symptómy, ako je strata hmotnosti, hypotermia, strata lesku vlasov, ovisnutý duch, oneskorenie v reakcii a významný pokles spotreby vody a aktivity, sa výrazne zlepšili v skupinách CD a WCD. Obrázok 2(a) ukazuje zmeny hmotnosti. Hmotnosť každej z liekových skupín sa zvýšila, najmä v skupinách CDHD a WCD-HD. Najnižší prírastok hmotnosti bol v skupine MC. Obrázok 2(b) ukazuje zmeny teploty, ktoré boli najnižšie v skupine MC a teplota sa zvýšila v skupinách WCD-HD, WCD-MD a WCD-LD.

Obrázok 2(c) ukazuje, že prídržná sila sa zvýšila pre skupinu BC a každú z experimentálnych skupín a skupina WCD-MD bola najvyššia, čo preukázalo, že príznaky slabosti vyvolané deficitom obličky-yang sa po podaní zlepšili.

3.2.2. Hladiny T, CRH, ACTH, CORT a kortizol

Obrázok 3 ukazuje, že v porovnaní s hladinami v skupine BC sa hladina T, CRH, ACTH a CORT v sére potkanov znížila (P < 0.01) a hladina kortizolu sa znížila (P < 0.05) v skupine MC. V porovnaní s hladinami v skupine MC sa zvýšila hladina T v skupinách WCD-HD a WCD-MD (P < 0.01), hladina CRH v skupine WCD-LD, Skupiny WCD-MD a WC sa zlepšili (P < 0,01), obsah ACTH sa zvýšil v skupinách CD-HD, WCD-MD a WCD-HD (P < 0,01), úroveň CORT sa zvýšila v Skupiny CD-MD, WCD-MD a WCD-HD (P < 0,01) a zvýšené v skupinách CDHD a WCD-LD (P < 0,05) a hladina kortizolu sa zvýšila v každej z liekových skupín.

3.2.3. Výsledky mikroskopického pozorovania

Tkanivo nadobličiek možno rozdeliť na kortikálnu vrstvu a vrstvu drene. Kortikálne vrstvy zahŕňajú globulárne, zväzkové a retikulárne vrstvy. Bunky obsahujú viac lipidov a vrstva drene pozostáva väčšinou z buniek feochromocytómu a malého množstva vláknitého tkaniva. Ako je znázornené na obrázku 4, zistili sme, že všetko bolo normálne v skupine BC, zatiaľ čo v skupine MC mala kôra nadobličiek zjavnú hyperpláziu, bunkovú atrofiu a zvyšujúcu sa hustotu. Cibuľovitý pás zhrubol a priesvitná fascikulárna zóna, úzka zona reticularis a menšie bunky vykazovali nerovnomerné sfarbenie a prekrvenie kapilár. V skupine PC boli viditeľné kortikálne a medulárne hranice. Bunky globulárnych a zväzkových pásov boli usporiadané rovnomerne a morfologická štruktúra bola obnovená. Rovnaká lepšia obnova bola pozorovaná v skupinách WCD a účinky v skupine WCD-MD boli lepšie ako v skupinách WCD-HD a WCD-LD. Morfológia nadobličiek v skupinách CD nebola taká dobrá ako v skupinách WCD.

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA ZLEPŠENIE SEXUÁLNEJ FUNKCIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%