Trvalá lokálna inhibícia trombínu zachováva mikroarchitektúru a funkciu obličiek po nástupe akútneho poškodenia obličiek

Kontakt: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Ian Vargas a kol

Abstraktné

Akútne poškodenie obličiekManažment (AKI) zostáva hlavne podporný, pretože v klinických štúdiách neuspeli žiadne špecifické terapeutické činidlá zamerané na jednotlivé signálne dráhy. Tu uvádzame, že inhibícia trombínom riadenej zrážanlivosti a zápalovej signalizácie s použitím lokálne pôsobiacich nanočastíc perfluórovaného uhľovodíka (PFC NP) zacielených na trombín chráni renálnu vaskulatúru a široko moduluje rôzne zápalové procesy, ktoré spôsobujú renálne ischemicko-reperfúzne poškodenie. Každý PFC NP bol komplexovaný s ~ 13 650 kópiami priameho inhibítora trombínu, PPACK (prolín-fenylalanín-arginín-chlórmetyl-ketón). Myši liečené po nástupe AKI pomocou PPACK PFC NP vykazovali zníženú reguláciu infiltrátov VCAM-1, ICAM-1, PGD2 prostanoidov, M-CSF, IL-6 a mastocytov. Mikrovaskulárna architektúra, tubulárne bazálne membrány a komponenty kefového lemu boli lepšie zachované. Nereperfúzia bola znížená, čo naznačovalo znížené zachytávanie červených krviniek a nehémové železo.Obličkyfunkcia a tubulárna nekróza sa zlepšili po 24 hodinách v porovnaní s neliečenou kontrolnou skupinou, čo naznačuje prínos pre duálnu inhibíciu trombózy a zápalu pomocou PPACK PFC NP.

Kľúčové slová: Akútne poškodenie obličiek; trombóza; zápal; perfluorokarbónové nanočastice; Poškodenie plavidla

Cistanche tubulosa zabraňuje ochoreniu obličiek, kliknite sem a získajte vzorku

Akútne poškodenie obličiek(AKI) je častým klinickým problémom u mladých aj starých ľudí so zvyšujúcou sa incidenciou a neprijateľne vysokou mierou úmrtnosti, ktorá sa v posledných desaťročiach podstatne nezlepšila.1,2 Syndróm sa zvyčajne vyvíja po náhlom prechodnom poklese celkového alebo regionálneho prietoku krvi do aobličkyako dôsledok množstva inzultov vrátane hypotenzie, sepsy, toxínov atď.3 AKI vyvoláva komplexnú škálu patofyziologických molekulárnych hráčov a signalizačných udalostí v chorobnom procese, ktorý sa časom vyvíja v štádiách.3–6 Selektívna a špecifická molekulárne cielená medikácia terapie pre AKI zatiaľ neexistujú, napriek naliehavej lekárskej potrebe7. Po rokoch predklinického a klinického výskumného úsilia zostávajú súčasné liečby v podstate podporné.

Tu predpokladáme, že terapeutické zásahy na báze nanočastíc zamerané na trombín, ktoré môžu zachovať mikrovaskulárnu integritu a bariérovú funkciu a súčasne znížiť zápalovú signalizáciu, budú prínosom pre výsledky AKI. Trombín je hlavná aterogénna molekula a molekula na hojenie rán, ktorá poháňa mnoho ďalších zápalových molekúl, ktoré sa podieľajú na aktivácii endotelu po poranení, ako je NF-KB,8 NADPH oxidáza,⁹

a ďalšie prostredníctvom proteázou aktivovaných receptorov (PAR-1) na endoteli aj makrofágoch.10,11 Všetky typy buniek vobličkyzaznamenali zmeny vzoru génovej expresie, ktoré zahŕňajú zvýšenú expresiu markerov poranenia a vývojových génov, ako ukázali Rudman-Melnick et al v časovom priebehu štúdie sekvenovania jednej bunky na jednostrannej ischémii-reperfúziiobličkyOkrem toho štúdia sekvenovania jednojadrovej RNA na hlodavcoch pri bilaterálnom ischemicko-reperfúznom poškodení obličiek13 identifikovala špecifickú bunkovú populáciu proximálneho tubulu nadmerne exprimujúcu gény prozápalu a profibrotické po ischemicko-reperfúznom poškodení. Tieto výsledky naznačujú, že zápal by mal predstavovať užitočný terapeutický cieľ. Aj keď sa tvorba pevných intravaskulárnych zrazenín v AKI javí ako nezvyčajná, ďalej sme predpokladali, že zmiernenie mikrovaskulárnej prokoagulačnej aktivity prostredníctvom lokálne pôsobiacich silných antagonistov antitrombínových nanočastíc14–17 môže zlepšiť prietok krvi, znížiť „nepretekanie“ a zmierniť zápalovú signalizáciu na zachovanie. funkcie obličiek.

Medzi kritické problémy, ktoré svedčia proti aplikácii priamych inhibítorov trombínu na prevenciu renálneho ischemicko-reperfúzneho poškodenia (IRI), patria ich potenciálne toxické vedľajšie účinky a riziko systémového krvácania. Pokiaľ ide o trombózu, konvenčné antikoagulačné terapeutiká neboli obzvlášť úspešné, aj keď solubilný trombomodulín môže mať renoprotektívne účinky18,19 ako môže aktivovať proteín C20,21 a antitrombín III,22 aj keď s potenciálnymi komplikáciami nadmerného krvácania.21 Okrem toho warfarín aj dabigatranu boli spojené s renálnou toxicitou.^23,24Skutočnosť, že tieto antikoagulačné prístupy zatiaľ klinicky neuspeli, však neznižuje potenciálnu hodnotu trombínu ako cieľa v dôsledku jeho dvojitej funkcie pri koagulácii aj zápale. Hoci neexistuje žiadna klinická štúdia týkajúca sa liečby VEGF pre AKI, predklinická štúdia preukázala, že VEGF je dôležitým mediátorom pri renoprotekcii počas AKI, 25 čo ďalej podporuje náš navrhovaný hypotetický terapeutický mechanizmus zachovania renálnych ciev pri ochrane funkcie obličiek počas AKI.

Vyvinuli sme stabilnú, biokompatibilnú a nefrotoxickú platformu perfluorokarbónových nanočastíc (PFC NP), ktorá inhibuje aktivitu trombínu proteázy bez toho, aby spôsobovala krvácavú diatézu.14,15 Natívne PFC NP sú schválené FDA ako krvné náhrady26 a obsahujú tekutý perfluorokarbón jadro a vonkajší obal fosfolipid-surfaktant s priemerom od ~160-250 nm. V nedávnych predbežných štúdiách AKI sme podávali antitrombín PFC NP ako predbežnú liečbu, aby sme potvrdili, že trombín je cenným cieľom na urýchlenie obnovy funkcie obličiek čiastočne zachovaním mikrovaskulárnej integrity a znížením nereperfúzie pri IRI, keď sa podáva pred ischémiou-reperfúziou. poranenia.16 Antitrombínový PFC NPS tiež chráni obličkové aloštepy pred IRI a vykazuje výrazné zníženie percenta parenchymálnej tubulárnej nekrózy spojenej so zvýšenou životnosťou obličiek po transplantácii.27 Nie je však jasné, či je táto antitrombózna nanočastica stále účinná po nástupe AKI, čo predstavuje úplne iný súbor populácií pacientov.

V tejto práci sme sa preto snažili rozšíriť použitie tohto prístupu na zavedený AKI po IRI, aby sme objasnili jeho potenciál pre klinickú transláciu. Na dôkaz konceptu používame PPACK (Phe[D]-Pro-Arg-chlórmetylketón) ako antitrombínovú skupinu na konjugáciu s PFC NP, o ktorej sme ukázali, že predchádza trombínovej signalizácii a mikrovaskulárnej trombóze na modeloch aterosklerózy a akútneho poškodenia obličiek ( AKI).14–17 Samotný PPACK je dobre známy priamy a ireverzibilný inhibítor trombínu, ktorý sa vo voľnej forme vylučuje obličkami príliš rýchlo na to, aby bol hodnotný ako terapeutické činidlo.14,15 Tu objasňujeme skoré patofyziologické reakcie na Terapia PPACK PFC NP, ktorá obmedzuje zápalové signalizačné udalosti v obličkách aj systémovo, zachováva mikroarchitektúru obličiek a zmierňuje poškodenie ciev. Tieto údaje naznačujú, že tento terapeutický prístup k prebiehajúcej AKI založený na nanočasticiach by mohol pripraviť pôdu pre klinický vývoj antitrombínového činidla, ktoré má lokálne obmedzené pleiotropné účinky a môže sa bezpečne podávať v skorých fázach AKI.

Metódy

Formulácia nanočastíc

Nanočastice perfluórovaných uhľovodíkov boli formulované tak, ako bolo opísané vyššie.14 Stručne povedané, lipidová zmes 98,5 mol percent vaječného L- - fosfatidylcholínu a 1,5 mol percent 1,2-distearoyl snglycero- 3-fosfoetanolamín-N-[ karboxy(polyetylénglykol)-2000] (sodná soľ) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) sa pripravil v zmesi chloroform:metanol (3:1) pred vysušením za vzniku lipidového filmu vo vákuu. Lipidový film (2 percentá (hmotn./obj.)) sa potom spojil s PFOB (20 percent (objem/objem)) (Exfluor Research Corp.) (glycerín 1,7 percenta (hmotn./obj.)) (Sigma, St. Louis, MO ) a vodou MilliQ, pred emulgáciou (Microfluidics Inc) na ľade počas 4 minút pri 20,000 psi. Na funkcionalizáciu nanočastíc pomocou konjugácie PPACK sme použili metódu kopulácie amín-karboxyl. Nanočastice (1 ml) sa najskôr 1 hodinu zmiešali s 2 mg EDCI 1-[3-(dimetylamino)propyl]-3-etylkarbodiimidmetiodid (Sigma, St. Louis, MO). pred pridaním 12,5 mg PPACK (BACHEM, Torrance, CA) na orbitálnu trepačku pri teplote miestnosti cez noc. Dialýza s limitom molekulovej hmotnosti 3000-5000 g/mol (Fisher Scientific, Waltham, MA) sa uskutočnila na odstránenie nadbytku EDCI a PPACK. Podrobný spôsob formulácie bol zahrnutý v doplnkových materiáloch.

Model akútneho poškodenia obličiek

Dospelé myši C57BL/6 (n=22) podstúpili bilaterálnu renálnu teplú ischemickú reperfúziu na vyvolanie akútneho poškodenia obličiek. Zvieratá sa anestetizovali koktailom ketamínu (85 mg/kg) a xylazínu (13 mg/kg) pred podstúpením laparotómie, aby sa vyvolala 17 minútová teplá ischémia. Bola zavedená stredná brušná incízia na odhalenie renálnej artérie aj žily. Renálna ischémia bola vyvolaná okluzívnymi svorkami na tepne aj žile, aby sa obmedzil prietok krvi do obličiek. Úspešné zastavenie prietoku krvi obličkami bolo potvrdené vizuálne zmenou farby obličiek z ružovej na tmavofialovú. Telesná teplota myší sa udržiavala na 37 stupňoch pomocou systému ohrevu malých zvierat. Svorky sa uvoľnili po 17 minútach, aby sa umožnilo obnovenie prietoku krvi obličkami, čo sa potvrdilo zmenou farby obličiek na ružovú. Chirurgická rana sa potom po vrstvách uzavrela a zvieratá sa monitorovali a po voľnom pohybe sa vrátili do klietky. Po reperfúzii počas 2 hodín jedna dávka PPACK

PFC NP ({{0}},5 ml/kg PFC NP; 0,05 mg/kg PPACK) alebo obyčajný (kontrolný) PFC NP sa podával intravenózne injekciou do chvostovej žily. Keďže naša predchádzajúca štúdia preukázala, že jedna preventívna dávka PPACK PFC NP vykazovala renálne ochranné účinky,16 tu sme aplikovali jednorazovú liečbu po nástupe AKI, aby sme vyhodnotili jej renálny ochranný účinok. Postupy a protokoly boli schválené Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť o zvieratá a ich používanie na University of South Florida.

Odber a konzervácia tkaniva 24 hodín po podaní nanočastíc sa myši usmrtili a obličky sa extrahovali na analýzu. Pred odstránením obličky na histologické a molekulárne vyhodnotenie bola odobratá krv srdcovou punkciou na následnú analýzu séra a potom bola každá myš systémovo perfundovaná normálnym fyziologickým roztokom (kat. č.: 23-535435, Fisher Scientific, Waltham, MA) až do reziduálneho krv bola vyplavená z obličiek. Na odber séra sa celá krv zrážala pri teplote miestnosti počas 30 minút a potom sa centrifugovala pri 2000 x g počas 10 minút pri 4 stupňoch. Odobraté sérum sa skladovalo pri -80 stupňoch pred hodnotením dusíka močoviny v krvi a cytokínov. Na histologickú analýzu boli vyrezané obličky fixované v 10 percentnom formalíne pred spracovaním tkaniva, zaliatím do parafínu a narezaním na rezy. Na vyhodnotenie eikosanoidov sa vyrezané obličky ďalej rozrezali, aby sa oddelila kôra a dreň, predtým, ako sa rýchlo zmrazili v tekutom dusíku a uskladnili pri -80 stupňoch na analýzu.

Histológia

Podrobné histologické farbenie a metódy analýzy údajov boli zahrnuté v doplnkových materiáloch. Sklíčka boli zbavené parafínu a rehydratované pred farbením hematoxylínom a eozínom, farbením Periodic Acid Schiff (PAS) (kat. č.: ab150680, Abcam, Cambridge, MA), farbením Prussian Blue Iron, imunohistochemickým farbením na vizualizáciu CD31, VCAM-1, a expresia ICAM-1 a farbenie žírnych buniek-eozinofilov (kat. č.: 150665, Abcam, Cambridge, MA). Údaje o kontrolnom zafarbení izotypu králičieho IgG sú uvedené na doplnkových obrázkoch 2 a 3, aby sa demonštrovala špecifickosť výsledkov imunohistochemického farbenia. Všetky mikroskopické snímky boli získané pri rovnakých nastaveniach výkonu a parametroch digitalizácie. Mikroskopické hodnotenia sa uskutočňovali mikroskopom Olympus s jasným poľom vybaveným digitálnym fotoaparátom DP27 na zaznamenávanie snímok patologických rezov pri 20-násobnom alebo 40-násobnom zväčšení. Na všetkých snímkach sa uskutočnila dvojito zaslepená analýza údajov.

Dusík močoviny v krvi (BUN)

Merania BUN sa uskutočnili s Urea Nitrogen (BUN) kolorimetrickou detekčnou súpravou (kat. č.: K024-H5, Arbor Assays, Ann Arbor, MI) podľa pokynov výrobcu.

Príprava a analýza eikosanoidov

Eikosanoidy sa extrahovali pomocou modifikovaného extrakčného procesu a analyzovali sa pomocou UPLC ESI-MS/MS, ako už bolo opísané.28 Podrobné metódy použité pre túto štúdiu boli zahrnuté v doplnkových materiáloch.

Hodnotenie sérových cytokínov

Upravený súbor cytokínov bol zakúpený od R&D Systems (Minneapolis, MN) a vyhodnotený pomocou Luminex 200 (Northbrook, IL) podľa pokynov v používateľskej príručke.

Štatistiky

Výsledky sú vyjadrené ako priemer ± štandardná chyba priemeru (SEM). Štatistická analýza pre každý experiment je zhrnutá v doplnkovej tabuľke 1. Použilo sa obojstranné t testovanie alebo jednosmerná ANOVA so Scheffeho testom. Na výpočet Pearsonovej hodnoty r sa vykonali korelačné analýzy pre vybrané páry metrík. Štatistická významnosť rozdielov bola pripísaná na P <>

Výsledky

Liečba PPACK PFC NP zlepšuje funkciu obličiek po nástupeakútne poškodenie obličiek.

Mikroskopické vyšetrenie celkového vzhľadu obličiek 24 hodín po postreperfúznej liečbe antitrombínom (PPACK) PFC NP indikovalo zlepšenie poškodenia v zavedenej AKI (obrázok 1, AB). Poranenie po 24 hodinách bolo lokalizované prevažne v kortikomedulárnom spojení obličky a prednostne boli poškodené proximálne tubuly. Vzorom poranenia bola nekróza koagulačného typu. V 24-hodinovom časovom bode bol malý zápalový infiltrát. Kvantifikácia tubulárneho poškodenia v rezoch zafarbených H&E (obrázok 1, C) odhalila, že myši liečené PPACK PFC NP vykazovali celkové zníženie akútnej tubulárnej nekrózy (ATN) o 33,95 percent oproti kontrolným myšiam liečeným NP (24,44 ± 1,76 percenta oproti 37). 16}} ± 4,96 percent v tomto poradí; P=0,035). Obrázok 1, D ukazuje, že myši, ktoré dostávali liečbu, vykazovali 44,03 percentné zníženie BUN za 24 hodín (110,96 ± 6,21 mg/dl oproti 62,10 ± 8,71 mg/dl pre kontrolný NP oproti PPACK PFC NP; P=0,0002) . Tieto skoré priaznivé výsledky odzrkadľujú ochranu, ktorú sme predtým pozorovali pri antitrombínových režimoch pred liečbou po 24 hodinách,16 čo naznačuje, že trombín naďalej zohráva rozhodujúcu úlohu vo vývoji AKI po počiatočnom ischemickom urážke.

Obrázok 2 ilustruje regionálne odozvy štruktúr bazálnej membrány a kefového lemu na liečbu antitrombínom na základe semikvantifikácie farbenia PAS. Obrázok 2, AC ukazuje, že liečba zvýšila percento glomerulov s intaktnými bazálnymi membránami z 51,43 percent ± 2,61 percent na 70.{10}} percent ± 3,09 percent (P=0.00033). Obrázok 2, DF ilustruje hlbšie poškodenie, ktoré utrpeli rúrkové kefové lemy, kde len menšina zachovala úplne neporušené kefové lemy po 24 hodinách. Ošetrenie však zlepšilo integritu kefového okraja o 50,79 percent (P=0,015). Liečba znížila celkový rozsah proteínových agregátov o 54,09 percent (P=0,032) (obrázok 2, GI), čo by mohlo zabrániť tubulárnej kongescii na udržanie funkcie obličiek.

Liečba PPACK PFC NP zachovala vaskulárnu integritu po nástupe IRI

Na kvantifikáciu potenciálu PPACK PFC NP chrániť cievne elementy sa rezy obličiek zafarbili na CD31.

Obrázok 3 ilustruje väčšiu prevalenciu farbenia CD31 po 24 hodinách v kôre a dreni myší liečených PPACK NP oproti kontrolnému NP (obrázok 3, A a D oproti B a E). V kortikálnych oblastiach zafarbenie CD31 tvorilo 4,28 percent ± 0,62 percent liečených zvierat oproti 1,75 percenta ± 0,34 percent u kontrolných zvierat (P=0.0{{ 25}}18), alebo relatívny nárast o 144,57 percent (obrázok 3, C). V medulárnych oblastiach zafarbenie CD31 zahŕňalo 3,24 percenta ± 0,38 percenta pre zvieratá liečené PPACK NP oproti 1,91 percenta ± 0,29 percenta pre kontrolné zvieratá liečené NP (P=0,0073), alebo relatívne 88,81 percentné zvýšenie (obrázok 3, F) . Mikroskopické hodnotenie vaskulárnej integrity neodhalilo žiadnu výraznú arteriolárnu nekrózu v 24-hodinovom časovom bode.

Vzhľad červených krviniek (RBC) na mikroskopických snímkach sa líšil medzi myšami liečenými PPACK NP a kontrolnými myšami liečenými NP po 24 hodinách (obrázok 4). Pretože myši boli systémovo perfundované, aby sa vymyla krv v perfúzovateľných obličkových oblastiach, prítomnosť červených krviniek indikovala buď agregáciu v slabo perfundovaných mikrovaskulárnych kanálikoch alebo intersticiálnu extravazáciu, prípadne oboje. V glomeruloch (obrázok 4, AB) boli červené krvinky pozorované vo vaskulárnych chumáčoch, ale zriedkavo v Bowmanovej kapsule po 24 hodinách. Liečba znížila prevalenciu glomerulárnych červených krviniek o 40,78 percent (P=0,007) (obrázok 3, C). V dreni (obrázok 4, DE) nebolo možné priradiť definitívne umiestnenie červených krviniek na základe škvŕn H&E, ale liečba znížila celkovú prevalenciu červených krviniek o 34,92 percent (P=0,049) (obrázok 4, F) .

Na ďalšie vymedzenie dôsledkov ukladania a zachytávania RBC sa uskutočnilo farbenie nehémovým železom s pruskou modrou. Škvrny od železa boli pozitívne v glomerulárnych aj tubulárnych bunkových štruktúrach. Liečba znížila prevalenciu železa v kôre (44,23 percentné zníženie; P=0,022) (obrázok 5, AC) a dreni (50,50 percentné zníženie; P=0,006) (obrázok 5, DF ) po 24 hodinách, čo je v súlade s účinkom liečby antitrombínom na zachytávanie červených krviniek.

Liečba PPACK PFC NP znížila lokálny a systémový zápal po nástupe AKI

Aby sme objasnili úlohu trombínu pri udržiavaní aktivácie endotelu a lokálneho zápalu v obličkách, kvantifikovali sme ICAM-1 aj VCAM-1. Expresia VCAM-1 v kortexe sa liečbou PPACK nezmenila (obrázok 6, AC). Avšak expresia VCAM- 1 v dreni bola po liečbe podstatne znížená o 65,25 percent (P=0.011) (obrázok 6, DF). Zvýšená expresia endotelového ICAM-1 bola pozorovaná v kôre aj dreni u kontrolných myší liečených NP (obrázok 7, B a E). ICAM-1 bola znížená liečbou o 36,89 percent (P=0,0083) v kôre (obrázok 7, AC) a o 31,17 percent (P=0,030) v dreni (obrázok 7 , DF).

Aby sme vymedzili úlohu trombínu pri regulácii zápalových bioaktívnych lipidov v ranom vývoji AKI, vykonali sme lipidomické testy na tkanivách extrahovaných oddelene od kôry a drene po 24 hodinách. Doplnkové tabuľky 2 a 3 uvádzajú špecifické molekulárne testy, oblasť obličiek a typy subjektov (liečená AKI, neliečená AKI alebo normálna bez AKI). Doplnková tabuľka 4 uvádza priemernú percentuálnu zmenu od zdravých normálnych východiskových hodnôt pre každý lipid v kôre a dreni. Vo všeobecnosti kortikálne aj medulárne oblasti vykazovali odchýlku expresie takmer všetkých bioaktívnych lipidov hodnotených v porovnaní s normálnymi obličkami (doplnkové tabuľky 2 a 3) a takmer všetky signalizačné lipidy sa po antitrombínovej terapii trendovo posúvali smerom k normálnym hladinám. Ako zjednodušená metrika pre regionálny zápal (doplnková tabuľka 4) bola priemerná percentuálna zmena pre všetky lipidy 65,13 percent a 38,60 percent pre kôru a 136,42 percent a 90,76 percent pre dreň v kontrolných skupinách NP a PPACK NP, čo naznačuje, že zápal v dreň podľa lipidomických testov prevýšila kortex.

Hoci po liečbe boli u takmer všetkých druhov lipidov zjavné trendy rozlíšenia, väčšina nespĺňala štatistickú významnosť. Pozoruhodná v týchto testoch však bola významná odpoveď PDG2, ktorá sa znížila o 47,62 percent v kôre (obrázok 8, A) (P=0.012) a o 50,21 percent v dreni (obrázok 8, B) ( P=0.0249), resp. Na základe tohto pozorovania sme kvantifikovali prevalenciu infiltrujúcich žírnych buniek, ktoré sú známym významným zdrojom zápalového PGD2. Obrázok 8, CE ukazuje, že liečba antitrombínom znížila obsah žírnych buniek v celej obličkovej časti o 54,27 percent (P=0,002) po 24 hodinách. To sa zhoduje s pozorovaným znížením VCAM-1 a ICAM-1 (obrázky 6 a 7) ako aktivovaných žírnych buniek exprimujúcich LFA-1 (antigén 1 spojený s funkciou lymfocytov) a VLA (veľmi neskoro antigén) ligujú tkanivovo špecifické adhézne molekuly na transmigráciu do zapálených tkanív.29,30 Navyše chemokíny/cytokíny spojené so žírnymi bunkami, ako sú M-CSF a IL-6, boli súčasne downregulované antitrombínovými nanočasticami. Po liečbe PPACK NP sa sérový M-CSF a IL-6 znížili o 36,60 percent (P=0,0448) a 27,44 percent (P=0,0454), v tomto poradí v porovnaní s neošetrenej kontrolnej skupine (obrázok 8, F).

Zo súboru údajov súvisiacich s infiltráciou žírnych buniek, vaskulárnym poškodením a funkciou obličiek sa objavilo niekoľko zaujímavých korelácií pre celkové kombinované skupiny liečených a neliečených zvierat v oblastiach kôry aj drene. Nepriamy vzťah sa týkal BUN a CD31 (r=0 0,75, P=0 0,000009), čo naznačuje, že zhoršenie zlyhania obličiek bolo spojené s väčším vaskulárnym kompromisom (doplnkový obrázok 1, A). Medzi počtom žírnych buniek a BUN existovala priama súvislosť (r=0.71, P=0.004), čo naznačuje progresívne znižovanie

renálnej funkcie v spojení s infiltráciou žírnych buniek (doplnkový obrázok 1, B). Bol pozorovaný nepriamy vzťah medzi počtom žírnych buniek a CD31 (r=0 0,59, P=0 0,002), čo naznačuje, že vaskulárne poškodenie sa zhoršilo so zvýšenou infiltráciou žírnych buniek (doplnkový obrázok 1, C). Nakoniec sa pozoroval priamy vzťah medzi počtom žírnych buniek a globálnou expresiou ICAM-1 (r=0.54, P=0.008), čo je v súlade s očakávaním, že upregulované vaskulárne adhézne molekuly by podporovať navádzanie žírnych buniek do poškodených tkanív (doplnkový obrázok 1, D). Ešte tesnejší priamy vzťah sa týkal medulárnej expresie VCAM a počtu žírnych buniek (r=0 0,69, P=0 0,009; údaje nie sú uvedené).

Diskusia

Napriek desaťročiam úsilia pri hľadaní efektívneho riadeniaakútne poškodenie obličiek, current treatments remain essentially supportive. Failure of single agents tested in numerous AKI clinical trials now prompts a renewed search for agents that might exert more pleiotropic or broad-spectrum therapeutic actions for preserving renal function.3–7 The present data indicate that targeting thrombin with locally acting nanoparticle agents represents one such approach to accelerating functional recovery, preserving vascular and tubular integrity, and modulating inflammation. The exceptional local potency of PPACK PFC NP against thrombin with normal bleeding times and clotting parameters by 30-60 min after injection14,15 is due to the fact that each nanoparticle situates >104 antitrombínových skupín v miestach mikrovaskulárnej trombózy a aktivácie PAR-1 (ďalší popis v doplnkových materiáloch), stratégia amplifikácie, ktorú nemožno dosiahnuť stechiometriou 1:1 konvenčných voľných činidiel, ktoré inhibujú trombín, vrátane PPACK.

Súčasný súbor údajov ukazuje, že akútne renálne ischemicko-reperfúzne poškodenie nie je dokončené do 2 hodín po reperfúzii a trombín zostáva po reperfúzii vysoko hodnotným cieľom v poškodených tkanivách. Predchádzajúce úsilie Molitorisových spolupracovníkov a iných podporuje pokračujúce úsilie navrhnúť bezpečné metódy na priamu inhibíciu trombínu v AKI.^18,31–33Z našej predchádzajúcej práce na predbežnom ošetrení AKI pomocou PPACK PFC NP vieme, že antitrombínové nanočastice poskytujú trvalý dohľad proti lokálne aktivovanému trombínu, ktorý zachováva vaskulárnu integritu, výrazne zmierňuje fenomén no-reflow o ~ 50 percent a rýchlo zvráti renálnu dysfunkciu o 24 hod.16 Spolu so súčasnými údajmi je jasné, že antitrombínové nanočastice pokračujú v získavaní prístupu k poškodeným, ale životaschopným obličkovým tkanivám aj po reperfúzii, aby sa predišlo ďalšiemu vaskulárnemu a tubulárnemu poškodeniu. Predchádzajúce správy, že PAR-1 knockout myši trpia zníženým renálnym ischemicko-reperfúznym poškodením, sú tiež v súlade s našou stratégiou silnej a pretrvávajúcej farmakologickej inhibície aktivácie PAR-1 v AKI prostredníctvom inhibície trombínu.³⁴

Ochrana renálnych vaskulárnych štruktúr (obrázok 3), kefového lemu a bazálnej membrány (obrázok 2) poskytovaná antitrombínom PFC NP v súlade s našimi predchádzajúcimi údajmi, ktoré ukazujú, že antitrombínová terapia vyvoláva 2-násobné zlepšenie perfúzie v kortikomedulárnych oblastiach AKI,16 potvrdzuje vznikajúci prínos zlepšenia renálnej mikroangiopatie. Hoci presná povaha poškodenia peritubulárnych kapilár a venúl nebola v týchto skorých časových bodoch po reperfúzii úplne objasnená, je opísaná zvýšená priepustnosť ciev a aktivácia endotelovej proapoptickej kaspázy-3, ako aj zníženie signálu pre CD31 (PECAM),35 ktorý reguluje integritu endotelového spojenia.36 Syntéza a expresia CD31 v bunkových spojeniach sú downregulované zápalovými cytokínmi, ktoré sú exprimované aktivovanými mastocytmi (TNF- a IFN-), ktoré zvyšujú vaskulárnu permeabilitu.^37,38Okrem toho indukcia tkanivového faktora trombínom prostredníctvom aktivácie PAR{0}} je regulovaná CD31 a myši s knockoutovaným CD31 vykazujú zvýšenú tubulárnu epitelovú a endoteliálnu apoptózu, zvýšené ukladanie fibrínu a expresiu tkanivového faktora.³⁹V súlade s tým môže byť schopnosť PPACK PFC NP zachovať expresiu CD31 životne dôležitá na obmedzenie prebiehajúcej aktivácie zrážacej kaskády a na udržanie integrity endotelu.

Medzi zápalom a koaguláciou v rozšírenej fáze AKI existuje lokálny súvis, ktorý obmedzuje vonkajšiu medulárnu kapilárnu perfúziu spôsobujúcu predĺženú regionálnu ischémiu/hypoxiu, ktorá potom zhoršuje opravu a regeneráciu tubulárnych buniek.4 Trvalý pokles počtu mikrociev vo vnútornom pruhu vonkajšej medully v AKI naznačuje, že poškodenie ciev pokračuje a signalizácia VEGF je potlačená.^40–42Okrem toho existuje množstvo dôkazov, že vaskulárna zriedkavosť vyvoláva chronickú hypoxiu vedúcu k progresívnej tubulointersticiálnej fibróze.⁴³V modeli akútnej ischémie/poranenia potkana sú proximálne tubuly obzvlášť citlivé na hypoxiu, ktorá sa prejavuje odlupovaním buniek tubulov a dokonca ich úplným rozpadom, čo spôsobuje nadmernú mortalitu. chronické ochorenie obličiek.⁴⁶

Naše údaje tiež potvrdzujú, že vaskulárne poškodenie podporuje zachytávanie červených krviniek a nehemové ukladanie (obrázky 4 a 5), ​​čo môže zhoršiť chronické ochorenie obličiek,⁴⁷ale ktorý je prístupný antitrombínovej terapii. Zdroj tkanivového železa v glomerulárnych aj tubulárnych bunkách (obrázok 5) nepochybne pochádza z rozpadu červených krviniek v týchto oblastiach v dôsledku krvácania a / alebo mikrovaskulárnej trombózy, čo je v súlade s obrazom vaskulárneho kompromisu, ktorý je zmiernený antitrombínovou terapiou. V súlade s tým môžu prístupy, ktoré zachovávajú vaskulárnu integritu, predstavovať kritický prvý krok smerom k udržaniu zásobovacích liniek pre výživné substráty, ktoré uľahčujú rýchlejšie hojenie poškodených tubulárnych štruktúr.

Je zaujímavé, že PPACK PFC NP zrejme ponúka včasnú ochranu vaskulárnych štruktúr a zmierňuje rôzne markery zápalu (obrázky 6 a 7; doplnkové tabuľky 2-4) v kôre aj dreni. V tradičných experimentálnych štúdiách AKI sa predpokladá, že kôra je odolnejšia voči poškodeniu ako dreň v dôsledku nižšej metabolickej potreby, ale aktivácia endotelu a patofyziologický zápal sa javia ako rozšírené, ako dokazujú naše lipidomické a histochemické testy. Okrem toho široké ukladanie nehémového železa ako vedľajšieho produktu rozkladu zachytených červených krviniek v kôre aj dreni – a jeho zmiernenie antitrombínovými nanočasticami – je v súlade so všeobecným vzorom zápalu a poškodenia, aj keď sa kôra môže ukázať ako viac prechodne a mierne postihnuté ako dreň v priebehu ochorenia.

Prekvapivá skorá reakcia infiltrácie žírnych buniek do 24 hodín (obrázok 8) naznačuje dôležitú úlohu zápalových buniek iných ako tradičných hráčov, ako sú neutrofily a makrofágy. Žírne bunky sa zvyčajne považujú za mediátory alergických reakcií, existuje však množstvo literatúry týkajúcej sa ich patofyziologických dôsledkov pri akútnom a chronickom poškodení obličiek.^48–52 Aj keď neutrofily včas reagujú na poškodenie tkaniva, makrofágy vstupujú do obrazu až neskôr v zápalovom procese, čo naznačuje, že žírne bunky hrajú dôležitú úlohu v skorej fáze AKI. Danelli et al skutočne ukázali, že k degranulácii žírnych buniek dochádza skoro v AKI a že deplécia žírnych buniek v čase indukcie AKI, ale nie o 48 hodín neskôr, poskytuje dlhodobý priaznivý účinok na funkciu obličiek, atrofiu a fibrózu.⁵³K podobným záverom dospeli Tong et al v procedúrach žírnych buniek stabilizovaných kromolynom vykonaných pred reperfúziou.54 Summers ukázal, že myši s deficitom žírnych buniek (KitW-sh/W-sh) trpia menej ischemickým poranením ako divoké typy a že vyvolávajú znížené hladiny leukocytových chemoatraktantov.⁵⁵

Žírne bunky exprimujú proteázou aktivované receptory Žírne bunky exprimujú proteázou aktivované receptory (PAR), ktoré môžu byť aktivované trombínom na degranuláciu a uvoľnenie množstva vopred vytvorených chemokínov, cytokínov a bioaktívnych lipidov.56–58 Trombín tiež spôsobuje adhéziu žírnych buniek k matrici proteíny (napr. fibronektín) a expresiu interleukínu (napr. IL-6) prostredníctvom PAR- 1 interakcií.⁵⁹Po inhibícii trombínu sme pozorovali znížené hladiny PGD2, ktoré sú v súlade s relatívnou depléciou žírnych buniek, pretože PGD2 je hlavným bioaktívnym eikozanoidom vylučovaným žírnymi bunkami pri reakciách alergického typu.60 Okrem toho zníženie ICAM-1 a VCAM-1 po liečbe antitrombínovými nanočasticami je v súlade so zníženou infiltráciou žírnych buniek, pretože exprimujú LFA-1 a VLA a využívajú adhézne molekuly na získanie vstupu do tkaniva.^29,30

Špecifická patogénna úloha samotného PGD2 vo vývoji renálnej IRI nebola doteraz podľa našich vedomostí opísaná, ale slúži ako jasný biomarker pre aktiváciu žírnych buniek.⁵²Pri zápale pľúc sa ukázalo, že PDG2 zvyšuje expresiu prozápalových cytokínov makrofágov prostredníctvom svojich receptorov (DP1 a DP2), ktoré potom aktivujú prílev neutrofilov.61 Naše pozorovanie zvýšeného M-CSF a IL-6 (obrázok 8) v AKI ktoré sú downregulované PPACK PFC NP prostredníctvom supresie žírnych buniek, by bolo v súlade s takýmto predpokladaným mechanizmom. Keďže je však známe, že žírne bunky uvoľňujú množstvo faktorov potenciálne škodlivých pre funkciu obličiek, 51, 52 môže byť predmetom budúcej štúdie akýkoľvek počet zodpovedných determinantov na kontrolu pomocou inhibície trombínu alebo iných molekulárne cielených látok. V súlade s tým by zásahy, ktoré spomaľujú skorú príťažlivosť a degranuláciu žírnych buniek, mohli vysoko chrániť vaskulárnu integritu a funkciu obličiek, ako sa prejavuje lokálnou inhibíciou trombínu v predložených údajoch.

Obmedzenia

Tieto štúdie neboli navrhnuté tak, aby objasnili trvalé výhody inhibície trombínu, pretože model AKI je zameraný na včasnú ochranu proti IRI a súvisiacim mechanizmom. To, či dlhodobé prínosy jednej dávky antitrombínových nanočastíc môžu obmedziť progresiu na chronické ochorenie obličiek, presahuje rámec tejto správy a vyžadovalo by si to iný experimentálny model a hypotézu. Navyše časové okno príležitosti na dosiahnutie funkčného zotavenia inhibíciou trombínu v predlžovacej fáze AKI tu nie je riešené, ale je predmetom záujmu budúcich štúdií. Do akej miery sú hlavné priaznivé účinky lokálnej inhibície trombínu v AKI spôsobené potlačením aktivácie žírnych buniek, zostáva dohadné, ale bolo by možné otestovať v následných podrobných mechanistických štúdiách. Avšak aj keď významné lineárne korelácie medzi počtom žírnych buniek, CD31 a BUN nevyhnutne nestanovujú príčinu a účinok, ich zhoda podporuje silný vzťah medzi mastocytmi a vaskulárnym poškodením v skorých štádiách IRI obličiek. Napokon, použitie PPACK ako antitrombínovej skupiny je len jedným príkladom konjugovateľnej terapeutickej zložky, ktorá môže byť bezpečne a lokálne dodávaná na nanoštruktúre, aby sa potlačila trombínová signalizácia.

1. Benoit SW, Devarajan P. Akútne poškodenie obličiek: vznikajúce farmakoterapie v súčasných klinických štúdiách. Pediatr Nephrol 2018;33:779-87.

2. Chen H, Busse LW. Nové terapie akútneho poškodenia obličiek. Kidney Int Rep 2017;2:785-99.

3. Bonventre JV, Yang L. Bunková patofyziológia ischemického akútneho poškodenia obličiek. J Clin Invest 2011;121:4210-21.

4. Sharfuddin AA, Molitoris BA. Patofyziológia ischemického akútneho poškodenia obličiek. Nat Rev Nephrol 2011;7:189-200.

5. Bonventre JV. Patofyziológia AKI: zranenie a normálna a abnormálna oprava. Contrib Nephrol 2010;165:9-17.

6. Zuk A, Palevsky PM, Fried L, Harrell Jr FE, Khan S, McKay DB a kol. Prekonávanie translačných bariér pri akútnom poškodení obličiek: správa z dielne NIDDK. Clin J Am Soc Nephrol 2018;13:1113-23.

7. Zuk A, Bonventre JV. Nedávne pokroky v akútnom poškodení obličiek a jeho dôsledky a vplyv na chronické ochorenie obličiek. Curr Opin Nephrol Hypertens 2019;28:397-405.

8. Rahman A, Fazal F. Blokovanie NF-kappaB: zápalový problém. Proc Am Thorac Soc 2011;8:497-503.

9. Jagadeesha DK, Takapoo M, Banfi B, Bhalla RC, Miller Jr FJ. Nox1 transaktivácia receptora epidermálneho rastového faktora podporuje vylučovanie N-kadherínu a migráciu buniek hladkého svalstva. Cardiovasc Res 2012;93:406-13.

10. Lopez ML, Bruges G, Crespo G, Salazar V, Deglesne PA, Schneider H a kol. Trombín selektívne indukuje transkripciu génov v ľudských monocytoch zapojených do zápalu a hojenia rán. Thromb Haemost 2014;112:992-1001.

11. Borissoff JI, Spronk HM, Heeneman S, ten Cate H. Je trombín kľúčovým hráčom v bludisku „koagulačnej aterogenézy“? Cardiovasc Res 2009;82:392-403.

12. Rudman-Melnick V, Adam M, Potter A, Chokshi SM, Ma Q, Drake KA, et al. Jednobunkové profilovanie AKI na myšom modeli odhaľuje nové transkripčné podpisy, profibrotický fenotyp a presluchy medzi epitelom a stromom. Journal of the American Society of Nephrology: JASN 2020;31:2793-814.

13. Kirita Y, Wu H, Uchimura K, Wilson PC, Humphreys BD. Bunkové profilovanie akútneho poškodenia obličiek u myší odhaľuje konzervované bunkové reakcie na poškodenie. Proc Natl Acad Sci USA 2020;117:15874-83.

14. Myerson J, He L, Lanza G, Tollefsen D, Wickline S. Perfluorokarbónové nanočastice inhibujúce trombín poskytujú novú stratégiu liečby a zobrazovania akútnej trombózy magnetickou rezonanciou. Journal of thrombosis and hemostasis: JTH 2011;9:1292-300.

15. Myerson JW, He L, Allen JS, Williams T, Lanza G, Tollefsen D a kol. Nanočastice inhibujúce trombín rýchlo tvoria všestranné a detegovateľné povrchy proti zrážaniu krvi. Nanotechnológie 2014;25:395101.

16. Chen J, Vemuri C, Palekar RU, Gaut JP, Goette M, Hu L a kol. Antitrombínové nanočastice zlepšujú reperfúziu obličiek a chránia funkciu obličiek po ischemicko-reperfúznom poškodení. Am J Physiol Renal Physiol 2015;308:F765-73