Synergické protizápalové účinky extraktu Laminaria Japonica Fucoidan a Cistanche Tubulosa

Ako imunitnú odpoveď proti cudzím antigénom uvoľňujú makrofágy prozápalové cytokíny, ako je tumor nekrotizujúci faktor- (TNF- ), interleukín-1 (IL- 1), IL-6 a ďalšie. Takéto cytokíny vyvolávajú chemotaktický prílev granulocytov, monocytov, lymfocytov a žírnych buniek do poškodeného tkaniva, čo podporuje odstránenie antigénu a obnovu tkaniva. Avšak nadmerná infiltrácia a aktivácia buniek zhoršuje poranenia tkaniva, čo vedie k edému (vaskulárnemu exsudácii) a bolesti, čo sú dobre známe javy zápalu.

TNF- je dôležitým faktorom pre indukciu expresie génu syntázy oxidu dusnatého (iNOS) v niekoľkých bunkových líniách. Aktivácia iNOS vedie k produkcii oxidu dusnatého (NO), ktorý nielen moduluje niekoľko fyziologických funkcií, ako je baktericídna a vazodilatácia, ale tiež spôsobuje zápal. Po poškodení tkaniva degradáciou fosfolipáz fosfolipidov bunkovej membrány vzniká kyselina arachidónová. Kyselina arachidónová sa ďalej rozkladá cyklooxygenázou (COX) na prostaglandíny (PG). Nadmerné množstvo PGE2 vytvoreného COX-II indukuje niekoľko cytokínov pre zápal. Keďže NO aj PGE2 pôsobia ako hlavné faktory zápalu a indukcie bolesti, dráhy TNF-–NO a COX-II–PGE2 sú hlavnými prúdmi zápalového procesu, ktoré sú inhibované kortikosteroidmi a nesteroidnýmiprotizápalové lieky(NSAID), resp.

Aj keď existuje niekoľko steroidov a NSAID preterapiu zápalových ochorenítieto lieky môžu spôsobiť nežiaduce účinky na imunitný systém, gastrointestinálny trakt, obličky, pečeň, centrálny nervový systém, krvný tlak a kardiovaskulárny systém. Preto je potrebné minimalizovať nepriaznivé účinky chemických terapeutík ich nahradením alebo používaním v kombinácii s prírodnými produktmi.

Fucoidan, sulfátový polysacharidový komplex z morských rias, ako je Laminaria japonica a Cladosiphon okamuranus široko rozšírený v mnohých krajinách, sa už dlhú dobu používa ako liečivo v orientálnej medicíne. V predchádzajúcich štúdiách sa preukázalo, že fukoidan má antioxidačné, antikoagulačné, protirakovinové aprotizápalové aktivity. V súlade s tým priťahujú pozornosť výskumníkov priaznivé účinky fukoidanu na zápalové ochorenia, ischémiu, imunitnú dysfunkciu a nádory. na druhej straneCistanche tubulosa(CT) sa tiež široko používa ako tradičný liek v Číne. Bolo publikované, že CT extrakty znižujú produkciu TNF-a a IL- 4, ktoré sú hlavnými faktormi produkcie NO v zápalových dráhach [19].

Takéto predchádzajúce zistenia nás viedli k skúmaniu kombinovanej účinnosti fukoidánu a CT extraktu na 2 hlavné dráhy zápalu. Na objasnenie mechanizmu účinku sme analyzovali NO a PGE2 v exsudátoch zo zápalu vzduchových vačkov vyvolaného karagénanom.

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA PRE PREVENCIUZÁPALOVÉ AKTIVITYPHGS75 % ECH 30 % ACT 12 %

Materiály a metódy

Materiály

Polopurifikovaný fukoidán a vodný extrakt CT boli získané od Misuba RTech Co., Ltd. (Asan, Kórea). Fucoidan a CT extrakt boli udržiavané pri 4 stupňoch, zmiešané (1:3) rozpustené v purifikovanej vode pred použitím a orálne podávané v objeme 5 ml/kg.

Bunková kultúra a kvantifikácia NO

Bunková línia myšieho makrofágu RAW 264.7 bola zakúpená od American Type Culture Collection (Manassas, USA) a kultivovaná v Dulbeccovom modifikovanom Eagleovom médiu (Sigma, St. Louis, USA) obsahujúcom 10 % fetálneho hovädzieho séra a antibiotiká [100 U/ml penicilín (Sigma) a 100 ug/ml streptomycínu (Sigma)]. Bunky sa inkubovali vo zvlhčenej atmosfére 5 % CO2 pri 37 stupňoch.

Na posúdenie účinkov fukoidánu a CT extraktu na sekréciu NO sa bunky RAW 264.7 (1×106 buniek/ml) inkubovali s fukoidanom alebo CT extraktom (1–320 µg/ml) počas 5 minút a potom interferón- (IFN-, 10 U/ml) a lipopolysacharid (LPS, 10 ug/ml) počas 24 hodín. V našich predbežných štúdiách sa potvrdilo, že ošetrenie pomocou IFN- plus LPS na aktiváciu buniek RAW 264.7 neovplyvnilo životaschopnosť buniek do 24 hodín a že fukoidan a CT extrakt neboli cytotoxické do 1 mg/ml. Ako indikátor NO bola meraná koncentrácia dusitanov (NO2 – ), oxidovaného produktu NO. Kultivačné médium sa zmiešalo s rovnakým objemom Griessovho činidla (1 % sulfanilamid, 0,1 % naftyletyléndiamín v 2,5 % kyseline fosforečnej) [21] a inkubovalo sa pri teplote miestnosti 10 minút. Koncentrácia dusitanov sa analyzovala pri 540 nm, kde sa na vytvorenie štandardnej krivky použil NaN02.

Zvieratá a liečba

Samce myší ICR (vo veku 7 týždňov) boli zakúpené od Daehan Biolink (Eumseong, Kórea) a umiestnené v miestnosti s konštantnými podmienkami prostredia (22 ± 2ºC; 40-70 % relatívna vlhkosť; 12-hodina svetla -tmavý cyklus; 150-300 lux jas). Krmivo pre pelety a čistená voda boli dostupné ad libitum. Všetky pokusy na zvieratách boli schválené Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť o zvieratá a ich používanie (IACUC) Národnej univerzity Chungbuk (CBNU), Kórea, a boli vykonané podľa štandardných operačných postupov (SOP) Centra pre výskum laboratórnych zvierat, CBNU.

Myši (n{0}}/skupina) boli perorálne liečené fukoidanom (18 alebo 54 mg/kg), CT extraktom (54 alebo 162 mg/kg) alebo ich zmesou (18+54, {{6 }} alebo 90+270 mg/kg) raz denne počas 7 dní. Nízke dávky fukoidánu (18 mg/kg) a CT extraktu (54 mg/kg) pochádzali z odhadovaných dávok u ľudí 100 mg/telo (70 kg) a 300 mg/telo po prenesení povrchovej plochy telesnej hmotnosti (Km{14 }} pre človeka/Km=3 pre myš). Vysoké dávky fukoidánu a CT extraktu boli nastavené na 3-násobok, samostatne alebo v zmesi, a zmes s najvyššou dávkou bola fixovaná na 5-násobok, aby sa vyhodnotili maximálne synergické účinky.

V 1. deň liečby fukoidanom a CT extraktom sa myšiam subkutánne injikovalo 10 ml sterilného vzduchu do zadnej strany, aby sa vytvorilo vrecko [22,23]. Po 2 a 5 dňoch sa do vrecka znova vstreklo 5 ml vzduchu. Jednu hodinu po konečnom ošetrení sa do vrecka vstrekol 1 ml karagénanu (1 % vo fyziologickom roztoku; Sigma) alebo jeho vehikula (fyziologický roztok).

Analýza exsudátov

Vzduchový vak sa premyl 1 ml studeného fyziologického roztoku 6 hodín po injekcii karagénanu a zaznamenal sa čistý objem výplachovej tekutiny. Celkový počet zápalových buniek, neutrofilov, monocytov a lymfocytov sa určil pomocou coulter counter. Koncentrácie NO a PGE2 boli stanovené pomocou Griessovho činidla (Sigma) a enzýmového imunotestu (EIA) s použitím súpravy Correlate-EIA (Assay Designs, Ann Arbor, Ann ArboUSA).

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA BLOKOVANIE ÚČINKU NA ZÁPALOVÉ BUNIEK CHEMOTAXIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Histopatologické vyšetrenie

Tkanivo s výstelkou vrecka sa odstránilo a fixovalo v neutrálnom formalínovom roztoku. Tkanivové sklíčka zaliate v parafíne sa zafarbili hematoxylínom-eozínom a skúmali sa pod svetelným mikroskopom na zápalové lézie.

Štatistická analýza

Výsledky sú prezentované ako priemer ± SE. Porovnania experimentálnych skupín sa uskutočnili jednosmernou analýzou rozptylu, po ktorej nasledovala korekcia Tukeyho testu. Hodnota AP<0.05 was considered statistically significant.

Výsledky

In vitro kultivácia buniek RAW 264.7, ošetrenie IFN- a LPS výrazne zvýšili produkciu NO (obrázok 1). Predošetrenie fukoidanom (1–320 µg/ml) neovplyvnilo uvoľňovanie NO z makrofágovej bunkovej línie (obrázok 1A). Na porovnanie, extrakt CT (32–320 µg/ml) významne potlačil produkciu NO, čo svedčí o protizápalovej aktivite (obrázok 1B).

Injekcia karagénanu do vzduchového vrecka myši výrazne zvýšila objem exsudátu vo vrecku (obrázok 2). Takáto zvýšená exsudácia bola zoslabená liečbou fukoidanom (18 mg/kg) a CT extraktom (54 a 162 mg/kg). Je pozoruhodné, že kombinovaná liečba fukoidanom a CT extraktom ďalej znížila objem exsudátov v porovnaní s individuálnymi účinkami, hoci kombinácie vyšších dávok (54+162 mg/kg a 90+270 mg/kg) nevykazovali dodatočnú účinnosť na najnižšiu kombináciu dávok (18+54 mg/kg) (obrázok 2A). Obsah N stupňa vo vrecku sa tiež drasticky zvýšil po injekcii karagénanu (obrázok 2B). V porovnaní s miernym účinkom fukoidanu CT extrakt výrazne znížil koncentráciu N. Kombinovaná liečba fukoidanom a CT extraktom ďalej znižovala hladinu NO v závislosti od dávky. Podobne bol zvýšený obsah PGE2 synergicky potlačený kombinovanou terapiou fukoidanom a CT extraktom (obrázok 2C).

Paralelne so zápalovými mediátormi vo vrecku sa počet zápalových buniek drasticky zvýšil injekciou karagénanu: 37,8-násobok, 4,8-násobok a 24,1-násobok kontrolných hladín pre neutrofily, monocyty a lymfocyty (tabuľka 1). Fucoidan a CT extrakt však významne znížili infiltráciu zápalových buniek, v ktorej bol fukoidan o niečo lepší ako CT extrakt. Neočakávane sa spoločným podávaním fukoidánu a CT extraktu nedosiahol žiadny synergický účinok pri infiltrácii zápalových buniek.

Ako vyplýva z infiltrácie zápalových buniek v exsudátoch, podkožné tkanivo obklopujúce vzduchové vaky vykazovalo závažné zápalové lézie (obrázok 3). Pozorovalo sa enormne veľa buniek v zhrubnutom podkožnom tkanive vystavenom karagénanu (obrázok 3B), v porovnaní s takmer normálnymi znakmi u kontrolných zvierat (obrázok 3A). Takéto zápalové lézie boli pozoruhodne oslabené liečbou fukoidanom (obrázky 3C a 3D) alebo CT extraktom (obrázky 3E a 3F).

Najmä vyššie protizápalové účinky sa dosiahli kombinovanou terapiou s fukoidanom a CT extraktom (obrázky 3G-3I).

Diskusia

Použitím modelu zápalu vzduchových vačkov vyvolaného aragénanom stupňa in viv, injekcia vzduchu do chrbta hlodavcov indukuje proliferáciu buniek, ktoré sa stratifikujú na povrchu dutiny, aby vytvorili štruktúru podobnú synovii. V tomto modeli injekcia karagénanom indukovanej infiltrácie zápalových buniek zvýšila exsudát, čo svedčí o vaskulárnom presakovaní. Vzduchový vak slúži ako zásobník zápalových buniek a mediátorov, ktoré možno ľahko merať v tekutine, ktorá sa hromadí lokálne.

Spomedzi rôznych zápalových mediátorov, ktoré môžu indukovať vaskulárnu permeabilitu, je dobre známe, že NO a PGE2 sú hlavnými faktormi zapojenými do patogenézy mnohých zápalových ochorení. Sú tiež známe ako mediátory indukcie a vnímania bolesti. iNOS, ktorý je exprimovaný a aktivovaný v rôznych typoch buniek stimuláciou TNF- a/alebo LPS počas zápalu, produkuje vysoké trvalé koncentrácie NO. NO je dôležitá regulačná molekula v rôznych fyziologických funkciách, ako je vazodilatácia vedúca k vaskulárnemu presakovaniu. PGE2, ktorý sa vytvára z kyseliny arachidónovej prostredníctvom COX, prispieva k rozvoju mnohých zápalových ochorení a nadprodukcia PGE2 v reakcii na rôzne zápalové stimulácie je spojená s upreguláciou hladín COX-II a progresiou zápalu. Preto sa dráhy TNF- - NO a COX-II-PGE2 považovali za dva hlavné prúdy zápalových procesov, ktoré sú blokované inhibítormi iNOS (kortikosteroidy) a COX (NSAID).

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA ZÁKAZ ZÁPALOVÝCH OCHORENÍ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

V tejto štúdii súčasné podávanie fukoidánu a CT extraktu znížilo objem exsudátu vo vrecku, čo naznačuje, že majú supresívnu aktivitu proti vaskulárnemu úniku (obrázok 2A). V porovnaní s individuálnymi účinkami každého fukoidánu a CT extraktu sa kombinovaná liečba ďalej zvýšila, čo znamená, že zlúčeniny 2. stupňa pôsobia synergicky. Takéto synergické účinky medzi fukoidanom a extraktom CT boli podporené ich aktivitami na úrovni NO a PGE2 v exsudátoch (obrázky 3B a 2C).

Je však zaujímavé, že sa potvrdilo, že fukoidan priamo neinhibuje aktiváciu makrofágov in vitro test (obrázok 1A). Podobne inhibičný potenciál fukoidánu na akumuláciu NO a PGE2 in vivo bol relatívne nižší ako u CT extraktu (obrázky 2B a 2C). Takýto mechanizmus účinku fukoidánu sa líši od priamej inaktivácie buniek extraktom CT (obrázok 1B). Na porovnanie, fukoidan vykazoval vysokú účinnosť pri inhibícii infiltrácie zápalových buniek vo vrecúškach (tabuľka 1). Fucoidan bol lepší ako CT extrakt v blokovaní migrácie neutrofilov, monocytov a lymfocytov do miest poškodenia tkaniva vyvolaného karagénanom. Je zaujímavé, že sa nepreukázal žiadny synergický antimigračný účinok, čo by svedčilo o rôznych mechanizmoch pôsobenia medzi fukoidanom a extraktom z CT: tj fukoidan blokuje infiltráciu zápalových buniek, zatiaľ čo extrakt CT inhibuje aktiváciu buniek.

Polymorfonukleárne bunky, najmä neutrofily, sú hlavnými bunkovými zložkami regrutovanými na akútne zápalové miesta vyvolané karagénanom. Okrem toho, následné zápalové bunky, ako sú makrofágy a lymfocyty, tiež hrajú ústrednú úlohu v zápalovom procese vylučovaním cytokínov. Pri predbežnom ošetrení fukoidanom alebo CT extraktom sa počet bielych krviniek, ktoré migrovali do vzduchových vačkov s injikovaným karagénanom, výrazne potlačil. Tento výsledok bol v súlade s účinkom, ktorý by sa dosiahol pri kortikosteroidoch, ako je dexametazón, ale nie pri NSAID vrátane indometacínu. Preto sa predpokladá, že fukoidan a CT extrakt majú čiastočne vlastnosť steroidov.

Okrem blokujúceho účinku na chemotaxiu zápalových buniek sa zdá, že CT extrakt potláča aktiváciu makrofágov. Potvrdili to jeho inhibičné účinky na NO in vitro a in vivo, čo je hlavný zápalový mediátor produkovaný makrofágmi. Účinok CT extraktu na makrofágy teda môže byť spôsobený potlačením expresie mRNA a/alebo priamou inhibíciou aktivity iNOS v týchto bunkách.

PGE2 je tiež jedným z hlavných zápalových mediátorov. Zvyšuje sa súbežne s edémom tkaniva, ktorý je potláčaný NSAID, inhibítormi COX. Karagénan môže zvýšiť produkciu PGE2 indukciou mRNA COX-II a proteínu COX-II v exsudáte vrecúška. V tomto modeli karagénan výrazne zvýšil množstvo PGE2 a výrazne ho potlačil CT extrakt. Je zaujímavé poznamenať, že tento výsledok bol konzistentný s účinkom, ktorý by sa dosiahol pri NSAID indometacínu. Z výsledkov sa preto usudzuje, že extrakt z CT má ďalšie vlastnosti NSAID. Celkovo sa predpokladá, že CT extrakt mal účinky ako kortikosteroidy, tak aj účinky podobné NSAID v modeli zápalu vyvolaného karagénanom a že fukoidan posilnilprotizápalové účinky CT extraktublokovaním infiltrácie zápalových buniek.

Hoci definovanie presného mechanizmu účinku si vyžaduje ďalšie štúdium, zmes fukoidánu a CT extraktu výrazne zmiernila zápalové príznaky blokovaním dráh TNF- –NO a COX-II – PGE2 pri zápale vzduchových vačkov vyvolanom karagénanom. Tieto zistenia poskytujú dôkaz, že kombinovaná liečba fukoidanom a CT extraktom môže byť sľubným kandidátom na zmiernenie rôznych typov zápalu, ktoré reagujú na kortikosteroidy alebo NSAID.

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA ZÁKAZ ZÁPALOVÝCH OCHORENÍ PHGS75% ECH 30% ACT 12%