Abstraktný
Na skúmanie synergických inhibičných účinkovPúšť cistanchefenyletanoidové glykozidy (PHGS) a glabridín (GLA) na kožnej pigmentácii, optimálny pomer hmotnosti PHGS k GLA sa predbežne preveril cezin vitrotyrosinase activity inhibition assays, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging, and 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS⁺) radical scavenging experiments. Ďalšie hodnotenia sa uskutočňovali s použitím troch bunkových modelov:

Model melanogenézy B16F10 indukovaného UVB na vyhodnotenie inhibície syntézy melanínu prostredníctvom aktivity tyrozinázy a obsahu melanínu;

Zápalový model HACAT vyvolaný lipopolysacharidom (LPS) na vyhodnotenie protizápalových účinkov meraním interleukínu -6 (IL -6) a potlačenie nekroózy nádoru (TNF-);

AAPH (2,2'-azobis (2- amidinopropán) dihydrochloridom indukovaný model HACAT oxidatívneho stresu na stanovenie antioxidačnej aktivity prostredníctvom superoxidovej dismutázy (SOD) a katalázy (CAT).

Optimálny pomer hmotnosti PHGS/GLA bol identifikovaný prostredníctvom týchto modelov. Výsledky ukázali, že roztoky PHGS/GLA (pripravené v fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátom, PBS, pH 6,8) v hmotnostných pomeroch 1: 1, 5: 1 a 10: 1 vykazovali významnú inhibíciu tyrozinázy a synergické antioxidačné účinky. Miera inhibície tyrozinázy bola 94,37%, 92,93%a 88,06%; Miera zachytávania radikálov DPPH dosiahla 89,44%, 88,72%a 88,10%; Miera upratovania ABTS bola 100,13%, 100,01%a 99,87%. Pri 25 ug/ml v DMEM, PHGS/GLA (1: 1, 5: 1, 10: 1) nevykazovali žiadnu cytotoxicitu voči bunkám B16F10 alebo HACAT. PHGS/GLA (1: 1) zobrazené riešenie DMEMinhibícia vynikajúcej tyrozinázy(23,80% zvyšková aktivita), výrazneznížený obsah melanínu(30,90%) a prekonali ďalšie pomery a monoterapie pri potláčaní IL -6/TNF- uvoľňovanie a zvýšenie aktivity SOD/CAT. Synergická kombinácia PHG a GLA účinne zmiernila Shyperpigmentácia príbuznej inhibíciou melanogenézyzníženie zápalu aZvyšovanie antioxidačnej kapacity.

Kľúčové slová
Cistanchepúšť fenyletanoidové glykozidy; glabridín; synergický efekt; anti-melanogenéza; antioxidant; protizápalové; farmaceutické suroviny

 

 

 

Cistanchepúšť extrahovaťNa vysokej úrovnifenyletanoidové glykozidy na bielenie kože

WhatsApp nás pre viac podrobností

 

Experimentálna časť

1.1 Materiály, činidlá a nástroje

Myšacie melanómové bunkyB16F10 (katalógové č.: STCC20013G -1), Wuhan ServiceBio Technology Co., Ltd.

Ľudské imortalizované keratinocytyHACAT (katalóg č.

Cistanche fenyletanoidové glykozidy (PHGS)aglabridín (GLA), Shaanxi Tianxingjian Biological Chemical Technology Co., Ltd.

Tyrozináza, Hefei Basf Biotechnology Co., Ltd.

Arbutin (ARB)aL-tyrosín, Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Šanghaj, Čína.

1, 1- diphenyl -2- picrylhydrazyl (dpph), Tokio Chemical Industry Co., Japonsko.

2,2'-azino-bis (3- etylbenzothiazoline -6- kyselina sulfónová) Diammonium Salt (ABTS), Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd.

Kyselina askorbová (VC), Továreň Tianjin Damao Chemical Reagent Factory.

Persulfát draslíkaabezvodý etanol, Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd.

Hydroxid sodný, Chengdu Huayi Pharmaceutical Excipient Manufacturing Co., Ltd.

Fosforečnan, Shanghai Sanpu Chemical Co., Ltd.

L-dopa, Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd.

Súprava na počítanie buniek -8 (CCK8), Peking Sinoinvitrogén Biotechnology Co., Ltd.

Triton X -100, dimetylsulfoxid (DMSO), 2,2'-azobis (2- metylpropionamidín) dihydrochlorid (AAPH)alipopolysacharid (LPS), Peking Solarbio Science & Technology Co., Ltd.

DMEM s vysokým obsahom glukózy, Thermo Fisher Scientific (Čína).

Fetal hovädzie sérum (FBS), Sigma-Aldrich (Šanghaj) Trading Co., Ltd.

Roztok penicilínu-streptomycín, Shanghai Dashier Biotechnology Co., Ltd.

Human IL -6 súpravy ELISA, ľudská súprava TNF- ElisaaSúprava pre ľudskú mačku Elisa, Wuhan Fine Biotech Co., Ltd.

Celková testovacia súprava Superoxid Dismutázy (SOD), Nanjing Jiancheng BiooGineering Institute. Všetky činidlá boli analytického stupňa.

Použité nástroje:

Čítačka mikroplatík s plnou vlnovou dĺžkou FCaInkubátor Heracell 371 CO2, Thermo Fisher Scientific, USA.

KQ -200 vdb ultrazvukový čistič, Kunshan Ultrasonic Instruments Co., Ltd.

Dvkw-d -2 digitálny termostatický vodný kúpeľ, Peking Yongguangming Lekársky nástroj.

DHG -9246 Elektrické termostatické výbuchové sušenie rúry, Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.

KN4006B UVB ultrafialové ožarovanie(Intenzita ožarovania: 8 MW/cm²), Xuzhou Kenuo Medical Instrument Equipment Co., Ltd.

1.2 Metódy

Po prvé, PHGS a GLA boli rozpustené buď v soľnom roztoku pufrovanom fosfátom (PBS, pH =6. 8) alebo 50% etanolový roztok na prípravu roztokov s hmotnostnými koncentráciami z{{0}}. 0 0 1, {{}}.. Potom boli PHGS a GLA zmiešané v pomerochm (phgs): m (gla)=40: 1, 20: 1, 10: 1, 5: 1, 1: 1: 5, 1:10, 1:20 a 1:40na prípravu roztokov PHGS/GLA s celkovou hmotnostnou koncentráciou0.4 g/L, označené akoPHGS/GLA (40: 1) ~ PHGS/GLA (1:40), respektíve.

 

1.3 Biochemické experimenty

1.3.1 Testinhibícia aktivity tyrozinázy

V 96- doštičke,50 μl roztoku testovacej vzorky, 50 μl PBS (pH =6. 8)a50 μl roztoku L-tyrozínu (1 g/l)boli postupne pridané. Doska bola inkubovaná vo vodnom kúpeli 37 stupňov po dobu 10 minút. Potom5 0 μl roztoku tyrozinázy (0,4 g/l, ekvivalent 200 U/ml)bol pridaný a tanier sa opäť inkuboval vo vodnom kúpeli 37 stupňov ďalších 10 minút.

Arbutin (ARB)sa použil ako pozitívna kontrola aPBS (pH =6. 8)sa použil ako prázdne ovládanie.

Absorbancia roztoku pri490 nmbol meraný pomocou čítačky mikroplatov a inhibícia inhibície tyrozinázy in vitro sa vypočítala pomocou rovnice (1).

 

 

Vo vzorci:

A _ reakciaje absorbancia roztoku vzorky obsahujúceho roztok L-tyrozínu, PBS a roztok tyrozinázy.

A _ Ovládanie reakcieje absorbancia roztoku vzorky obsahujúceho roztok L-tyrozínu a PBS bez roztoku tyrozinázy.

A _ prázdneje absorbancia roztoku obsahujúceho roztok L-tyrozínu, PBS a roztok tyrozinázy bez vzorky.

A _ slepé ovládacie prvkyje absorbancia roztoku obsahujúceho roztok L-tyrozín a PBS bez roztoku vzorky a tyrozinázy.

1.3.2 Stanovenie aktivity voľného radikálu DPPH

Najprv {{0}}. 0197 g (0,05 mmol) DPPH sa presne odvážil a rozpustil v 250 ml bezvodého etanolu na prípravu pracovného roztoku DPPH s koncentráciou z koncentrácie z koncentrácie0. 2 mmol/l.

Potom sa PHGS a GLA rozpustili v 50% etanolu, aby sa pripravili etanolové roztoky PHGS a GLA s hmotnosťou koncentrácií{{0}}. 0 0 1, {{}}.. Etanolové roztoky VC boli pripravené rovnakým spôsobom.

Následne boli etanolové roztoky PHG a GLA zmiešané v pomerochm (roztok PHGS): M (GLA Solution)=40: 1, 20: 1, 10: 1, 5: 1, 1: 1: 5, 1:10, 1:20, 1:40na získanie 9 etanolových roztokov PHGS/GLA s rôznymi hmotnými pomermi, označenými akoPHGS/GLA (40: 1) ~ PHGS/GLA (1:40).

Nakoniec,100 μl každého roztoku vzorkya100 μl pracovného roztoku DPPHboli pridané do 96- doštičky, rovnomerne zmiešané a inkubované pri teplote miestnosti v tme po dobu 30 minút. Absorbancia pri517 nmbol meraný pomocou čítačky mikroplatín. VC sa použil ako pozitívna kontrola a každý experiment sa opakoval trikrát.

Rýchlosť vychytávania voľných radikálov DPPH (%) sa vypočítala pomocou rovnice (2).

 

Vo vzorci:

A1je absorbancia roztoku vzorky + pracovný roztok DPPH.

A2je absorbancia 50% pracovného roztoku etanol + DPPH.

A3je absorbancia roztoku vzorky + 50% etanol.

 

1.3.3 Stanovenie aktivity na čistenie voľných radikálov

Po prvé,1 g (1,82 mmol) ABTSbol rozpustený v deionizovanej vode na prípravu pracovného roztoku ABTS s konečnou koncentráciou7,4 mmol/l. 0. 5 g persulfátu draslíkabol rozpustený v deionizovanej vode, aby sa pripravil pracovný roztok persulfátu draslíka s konečnou koncentráciou2,6 mmol/l. Rovnaké objemy pracovného roztoku ABTS a pracovného roztoku persulfátu draslíka sa zmiešali a nechali sa reagovať v tme 12 hodín, aby sa pripravili pracovný roztok ABTS.

Potom etanolové roztoky PHGS, GLA a VC, ako aj roztoky PHGS/GLA Etanol s pomermiPHGS/GLA (40: 1) ~ PHGS/GLA (1:40), boli pripravené podľa metódy opísanej v oddiele 1.3.2.

Nakoniec,40 μl každého roztoku vzorkya160 μl pracovného roztoku ABTS⁺boli pridané do 96- doštičky, rovnomerne zmiešané a reagovali v tme pri teplote miestnosti počas 6 minút. Absorbancia roztoku pri734 nmbol meraný pomocou čítačky mikroplatín.

Rýchlosť vychytávania voľných radikálov ABTS⁺ (%) bola vypočítaná pomocou rovnice (3).

 

 

Vo vzorci:

A1je absorbancia roztoku vzorky + pracovné riešenie ABTS⁺.

A2je absorbancia deionizovanej vody + ABTS⁺ Pracovný roztok.

A3je absorbancia roztoku vzorky + deionizovaná voda.

1.4 experimenty buniek

1.4.1 Bunková kultúra

Po oživení buniek B16F10 a HACAT boli naočkované do média s vysokým obsahom glukózy DMEM (obsahujúce 10% fetálne hovädzie sérum a 1% penicilín-streptomycínový roztok) a kultivované v37 stupňov, 5% CO2a70% vlhkosťv inkubátore 24 hodín. Stav rastu buniek bol pozorovaný pod mikroskopom a stredné zmeny alebo paságovanie sa uskutočňovali podľa potreby na základe stavu rastu buniek.

1.4.2 Experimentálne zoskupenie

Bunky B16F10 a HACAT logaritmickej fázy sa naočkovali do 96- do platniek pri vhodnej hustote buniek a kultivovali sa 24 hodín, aby sa umožnila priľnavosť buniek. Roztoky vzoriek s rôznymi koncentráciami sa pripravili pomocou média DMEM.

Experimentálne skupiny boli nasledujúce:

Normálna skupina

Modelka

Skupina s nízkou dávkou PHGS(125 ug/ml)

PHGS stredná dávka(250 ug/ml)

Skupina vysokej dávky PHGS(500 ug/ml)

GLA nízka dávka(6,25 ug/ml)

GLA strednodávková skupina(12,5 ug/ml)

GLA vysoká dávka(25 ug/ml)

PHGS/GLA (1: 1) skupina(25 ug/ml)

Skupina PHGS/GLA (5: 1)

PHGS/GLA (10: 1) skupina

PreModel pigmentácie indukovaného UVB v bunkách B16F10, bunky skupiny modelov boli ošetrené30 μl PBS (pH =7. 4)a ožiarené pod ultrafialovým radiačným prístrojom UVB3 cm pod zariadenímpre110 sekúnd. Experimentálne skupiny boli vopred ošetrené100 μl rôznych roztokov vzoriek1 hodinu pred pridaním30 μl PBSa ožarovanie pod zariadením UVB na 110 sekúnd. Normálna skupina bola nepretržite ošetrená médiom DMEM s vysokým obsahom glukózy a prázdna skupina neobsahovala bunky, ale bola nahradená rovnakým množstvom média.

PreModel zápalu indukovaného LPS v bunkách HACAT, modelová skupina bola ošetrená20 ug/ml roztok PBS LPSpočas 24 hodín. Experimentálne skupiny boli vopred ošetrené100 μl rôznych roztokov vzoriek24 hodín pred pridaním20 ug/ml LPS roztokĎalších 24 hodín. Normálna skupina bola nepretržite ošetrená médiom DMEM s vysokým obsahom glukózy a prázdna skupina neobsahovala bunky, ale bola nahradená rovnakým množstvom média.

PreAAPH-indukovaný model oxidačného stresu v bunkách HACAT, modelová skupina bola ošetrenáRoztok 25 mmol/l AAPHpočas 24 hodín. Experimentálne skupiny boli vopred ošetrené100 μl rôznych roztokov vzoriek24 hodín pred pridanímRoztok 25 mmol/l AAPHĎalších 24 hodín. Normálna skupina bola nepretržite ošetrená médiom DMEM s vysokým obsahom glukózy a prázdna skupina neobsahovala bunky, ale bola nahradená rovnakým množstvom média.

Každá skupina bola zriadená3 replikujte studnea kultivované v37 stupňov, 5% CO2a70% vlhkosťv inkubátore.

1.4.3 Test cytotoxicity

Cytotoxicita sa merala pomocouMetóda CCK8. Bunky B16F10 a HACAT boli trávené pomocou logaritmických fáz0. 25% trypsinpočas 3 minút. Po zastavení trávenia sa médiom sa bunky opakovane pipetovali, aby sa pripravila suspenzia bunky s hustotou1 × 10⁴ bunky/ml. Bunky boli rovnomerne nasadené do 96- do platniek100 μl na jamkua PBS sa pridal do periférnych vrtov. Po adherencii buniek sa pridali rôzne koncentrácie roztokov vzoriek, s3 replikujte jamky na skupinua bunky sa kultivovali na37 stupňov, 5% CO2a70% vlhkosťpre24, 48 a 72 hodínPred vyradením média.

Pre všetky skupiny,100 ul média CCK8 DMEM s vysokým obsahom glukózy (obsahujúce 10% CCK8)bol pridaný a inkubovaný pre60 minút. Absorbancia roztoku pri450 nmbol meraný pomocou čítačky mikroplatín.

Životaschopnosť buniek (%) bola vypočítaná pomocou rovnice (4).

 

Vo vzorci:

A _ ošetrenéje absorbancia dobre obsahujúcich bunky, roztok CCK8 a roztok vzorky.

A _ prázdneje absorbancia dobre obsahujúceho médium a roztok CCK8, ale bez buniek.

A0je absorbancia dobre obsahujúcich bunky a roztok CCK8, ale bez roztoku vzorky.

1,4.4 Tyrosinázový test

Metóda L-DOPA sa použila na meranie aktivity tyrozinázy. Po liečbe buniek pre48 hodínAko je opísané v oddiele 1.4.2, supernatant bol vyradený a jamky boli dvakrát premyté PBS (pH =7. 4). Potom50 μl 1% Triton X -100bol pridaný do každej jamky a okamžite sa umiestnil do mrazničky –80 stupňov pre30 minút. Bunky sa rozmrazili pri teplote miestnosti, aby sa vyvolala lýza.

Po predbežnom otepovaní o37 stupňovpre5 minút, 10 μl roztoku 10 mmol/l L-DOPAbol pridaný do každej jamky a inkuboval sa37 stupňov, 5% CO2 a 70% vlhkosťpre1 hodina. Absorbancia pri475 nmbol meraný pomocou čítačky mikroplatín. Každý experiment sa opakovaltrikráta aktivita tyrozinázy (%) bola vypočítaná pomocou rovnice (5).

Vo vzorci:

A _ experimentje absorbancia dobre obsahujúcich bunky a roztok vzorky pri ožiarení UVB.

A _ normálneje absorbancia dobre obsahujúcich bunky a roztok vzorky bez ožiarenia UVB.

A _ prázdneje absorbancia dobre obsahujúceho médium, ale bez buniek.

 

1.4.5 Meranie obsahu melanínu

Na meranie obsahu melanínu sa použila metóda Lysis NaOH. Po liečbe buniek pre72 hodínAko je opísané v oddiele 1.4.2, supernatant bol vyradený a jamky boli dvakrát premyté PBS.100 ul vodného roztoku NaOH obsahujúceho 10% DMSO (1 mol/l)bol pridaný do každej jamky a tanier bol umiestnený do a90 -stupňová rúrapre1 hodina. Absorbancia pri490 nmbol meraný pomocou čítačky mikroplatín. Každý experiment sa opakovaltrikráta obsah melanínu (%) sa vypočítal pomocou rovnice (5).

 

1.5 Meranie zápalových faktorov a ukazovateľov oxidačného stresu

Po liečbe buniek pre48 hodínako je opísané v oddiele 1.4.2,HACATZ každej skupiny sa zbierali pomocou bunkovej škrabky, centrifuged a supernatant sa zbieral. Koncentrácie IL -6 a TNF- sa merali podľa pokynov súprav ELISA.

Po liečbe buniek pre48 hodín, Bunky HACAT sa zbierali pomocou bunkovej škrabky, podrobené opakovaným cyklom zmrazenia a rozmrazenia, aby sa vyvolala lýza buniek, a centrifugované v12, 000 rpm počas 10 minút pri 4 stupni. Zhromaždil sa supernatant a aktivitySlieska koncentrácieMačkaboli merané pomocou pokynov na súpravu ELISA.

 

1,6 Meranie indexu kombinovaného indexu

TenMetóda kombinovaného indexu (CI)[20] sa použil na vyhodnotenie toho, či kombinácia PHGS a GLA pri rôznych hmotnostných pomeroch vykazovala synergické účinky pri inhibícii aktivity tyrozinázy a antioxidácii. Kombinovaný index sa vypočítal pomocou rovnice (6).

 

Vo vzorci:

D1aD2predstavujú príslušné koncentrácie (G/l) týchto dvoch liekov v kombinovanej liečbe potrebnej na dosiahnutiex% aktivita.

Dxpredstavuje koncentráciu (g/l) každej jednotlivej látky, keď sa používa samotná na dosiahnutiex% aktivita.

TenCompusyn Softwaresa použil na výpočty:

CI> 1označuje antagonistický účinok.

Ci=1označuje aditívny efekt.

CI <1označuje synergický účinok.

 

1.7 Analýza údajov

Všetky údaje boli vyjadrené ako„Priemer ± štandardná odchýlka (x̄ ± s)“a diskusie boli založené na stredných hodnotách.

Štatistická analýza sa uskutočňovala pomocouGraphPad Prism 9.5. 0. Jednosmerná ANOVA (analýza rozptylu) sa použila na porovnanie viacerých skupín. AP-hodnota <0. 05bol považovaný za štatisticky významný.