Vekovo citlivá účinnosť obmedzenia kalórií na mitochondriálnu biogenézu a poškodenie MtDNA v pečeni potkana 2

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPre viac informácií

2.4.Vplyv veku a CR na obsah a poškodenie mtDNA

Keďže mitochondriálna dynamika úzko súvisí s udržiavaním mtDNA [16,18], stanovili sme obsah mtDNA u všetkých potkanov pomocou kvantitatívnej polymerázovej reťazovej reakcie (qPCR) (obrázok 8).

Zníženie obsahu mtDNA súvisiace s vekom bolo zistené u AL-28(-27 percent) a AL-32 potkanov (-23 percent) v porovnaní s AL{{ 5}} zvierat, zatiaľ čo medzi skupinami AL-28 a AL-32 nebol prítomný žiadny štatistický rozdiel. CR bola veľmi účinná pri predchádzaní poklesu obsahu mtDNA súvisiacemu s vekom iba po 28 mesiacoch, čo viedlo k zvýšeniu (plus 19 percent) hodnoty v skupine CR-28 v porovnaní s náprotivkom s vekom kŕmeným AL. Okrem toho nebol medzi hodnotou AL{14}} a hodnotou skupiny CR{15}} žiadny štatistický rozdiel. Ako je vidieť pri iných markeroch v tejto práci, CR nebola taká účinná po 32 mesiacoch, pretože nebol žiadny rozdiel medzi hodnotou AL-32 a hodnotou CR-32 náprotivku. Aby sme prehĺbili analýzu na úrovni poškodenia mtDNA, zmerali sme relatívny obsah 4,8 Kb "bežnej delécie" pomocou qPCR (obrázok 9).

Vo všetkých testovaných skupinách neboli zistené žiadne významné zmeny s vekom ani s CR v relatívnom obsahu 4,8 Kb delécie.

Nakoniec sme skrínovali tri špecifické oblasti mtDNA na výskyt oxidovaných purínov, najmä 8-oxo-deoxyguanozínu (8-oxidu), pomocou enzýmu formamidopyrimidín DNA glykozylázy (Fpg) citlivého na oxidované puríny. Tieto tri oblasti zahŕňali vytesňovaciu slučku (D-slučka), počiatok replikácie ľahkého vlákna (Ori-L) a časti oboch NADH dehydrogenázových (ND) podjednotiek 1 a 2 (ND1/ND2)( Obrázok 10).

Ak chcete vedieť viac, kliknite sem

Ako je znázornené na obrázku 10, percento výskytu 8-oxidov bolo medzi skupinami potkanov v každej analyzovanej oblasti významne odlišné, hoci s podobným vzorom. Postdoc test odhalil význam zníženej prítomnosti 8-oxidu u CR-28 potkanov v porovnaní s AL-18 aj AL-28 skupinami ({{7} } percent CR-28 vs. AL-18 a-43 percent CR-28 vs.AL-28 v D-slučke;-48 percent CR -28 vs. AL-18a-49 percentá CR-28vs.Cistanche Extract Anti RadiationAL-28 na Ori-L; -54 percent CR-28 vs. AL-18 a -56 percent CR-28 vs. AL{{ 7}} pri ND1/ND2. potkanov. Oxidované puríny boli detegované už u AL-18 potkanov bez toho, aby vykazovali vekom súvisiace zvýšenie počtu AL{15}} zvierat. Porovnanie medzi skupinou AL-32 a skupinou CR-32 neukázalo významný rozdiel. Vzhľadom na hodnoty konkrétnej oblasti je zaujímavé zdôrazniť, že výskyt D-slučky bol najvyšší spomedzi hodnôt z testovaných oblastí v každej skupine, čo podporuje predchádzajúce zistenia naznačujúce túto oblasť ako hotspot pre oxidačné poškodenie [17, {{ 20}}].

Obrázok 10. Výskyt poškodenia oxidovaných purínov v oblasti D-slučky, Ori-L a ND1/ND2 mtDNA v pečeni z AL-18, AL-28, CR-28, AL -32 a CR-32-mesačné potkany. (A). Stĺpce predstavujú údaje získané z dvoch nezávislých experimentov uskutočnených v troch vyhotoveniach a analyzovaných pomocou jednocestného testu ANOVA a Tukeyho viacnásobného porovnávacieho testu. V grafickom znázornení boli údaje normalizované voči hodnote AL-18 potkanov, fixované ako 1 a zobrazené ako priemerná hodnota a SD.*p<0.05 versus=""><0.05versus al-28="" rats.n:="" number="" of="" analyzed="" animals.="" (a)d-loop;(b)ori-l;(c)="" nd1/nd2.(b).representative="" gel="" of="" formamidopyrimidine="" dna="" glycosylase="" (fpg)-treated="" and="" untreated="" total="" dna="" from="" one="" cr-28="" and="" one="" al-28="" rat;="" 5="" ng="" total="" dna="" were="" amplified="" using="" the="" d-loop="" primers.="">cistanche herbaAlikvotná časť každej PCR amplifikácie bola nanesená na agarózový gél farbený etídiumbromidom a analyzovaná na intenzitu pásov.

Všetky zistenia o účinnosti CR vo vekových skupinách boli zhrnuté v tabuľke 1.

3. Diskusia

V dlhotrvajúcom hľadaní prístupov schopných pôsobiť proti progresívnemu poklesu starnutia, CR nadobudla prvoradý význam vďaka svojim pozitívnym účinkom, hláseným v širokej sérii organizmov od kvasiniek až po človeka [22]. Ukázalo sa, že CR ovplyvňuje veľký počet molekulárnych dráh. Niektoré z nich sú obzvlášť účinné pri modulácii mitochondriálnej biogenézy a aktivity, ako napríklad tie, ktoré snímajú hladiny živín a/alebo energie, ako je AMP-dependentná kináza (AMPK) a sirtuíny, v ktorých všetky spolupracujú s CR-indukovaným preprogramovaním mitochondrií. metabolizmus [23]. Zlepšením oxidačného metabolizmu CR znižuje mitochondriálnu produkciu ROS a molekulárne poškodenia vyvolané nárastom týchto reaktívnych druhov súvisiacim s vekom [8-10]. Hoci niekoľko štúdií skúmalo účinky CR na mitochondriálnej úrovni [3,13-15,24], komplexná práca o účinkoch tohto nutričného zásahu na organely stále chýba. Preto sa táto štúdia snažila otestovať existenciu hraníc účinnosti CR vo veľkom súbore mitochondriálnych markerov. Zamerali sme sa najmä na porovnanie medzi účinkami vyvolanými týmto diétnym režimom u starých (28-mesačných) a extrémne starých (32-mesačných) potkanov, aby sme overili, či medzi CR existuje súhra a postup starnutia. Analýza výsledkov odhalila komplexný obraz účinnosti CR na mitochondriálnu biogenézu a poškodenie mtDNA, ktorý je zhrnutý v tabuľke 1.

Cistanche môže proti starnutiu

3.1. Mitochondriálne markery u 28-mesačných potkanov

Veľký počet mitochondriálnych markerov bol pozitívne ovplyvnený CR u 28-mesačných potkanov. Konkrétne boli hlásené zníženia aktivity citrátsyntázy súvisiace s vekom, v množstvách proteínov TFAM, MFN2 a DRP1 a v obsahu mtDNA v porovnaní s kontrolnou skupinou AL-18 s AL-28 skupinou. . Všetkým takýmto zmenám zabránila CR u 28-mesačných potkanov (CR-28). Tieto výsledky podporujú účinok proti starnutiu CR až do tohto veku v pečeni potkanov. Podobne tento názor ďalej posilňuje pokles výskytu oxidovaných purínov vo všetkých troch testovaných oblastiach mtDNA, indukovaný CR. Je potrebné poznamenať, že toto oxidačné poškodenie sa už vyskytovalo u zvierat AL{11}} bez zvýšenia súvisiaceho s vekom u potkanov AL{13}}, čo naznačuje, že jeho vzhľad možno identifikovať ako skorý marker starnutia. Osobitnú pozornosť je potrebné venovať piatim mitochondriálnym markerom, ktoré neboli ovplyvnené CR u 28-mesačných potkanov, konkrétne množstvu proteínu LonP1. Cvt c, OGGl a APE1 a obsah vymazania 4,8 Kb. V skutočnosti, ako v prípade LonP1 a Cyt c, CR nezabránila poklesu súvisiacemu s vekom zistenému u AL-28 zvierat, zatiaľ čo množstvá proteínov OGG1 a APE1, ako aj obsah delécie 4,8 kb, neboli ovplyvnené vekom ani CR. LonP1 je zodpovedný za degradáciu vyčerpaného TFAM [25-27] a bol hlásený jeho pokles s vekom [28] v pečeni potkanov [29] až do veku 27 mesiacov. Predtým sme navrhli, že takáto starnutím znížená expresia LonP1 [16] môže súvisieť s jeho aktivitou pri odstraňovaní TFAM neviazaného na mtDNA [26]. Ako možné vysvetlenie neúčinnosti CR na zabránenie poklesu expresie LonP1 súvisiaceho s vekom, napriek obnovenej expresii TFAM a väzbe TFAM na oblasti špecifické pre mtDNA (súčasné údaje a Picca et al. [15]), je CR -sprostredkovaná aktivácia Sirt3 [30], ktorá mohla ovplyvniť aj množstvo proteínu LonP1 prostredníctvom indukovanej deacetylácie. Na vysvetlenie neúčinnosti CR na prevenciu poklesu množstva Cyt c súvisiaceho s vekom možno navrhnúť inú hypotézu. Tento proteín je hlavným spúšťačom mitochondriálnej apoptotickej dráhy prostredníctvom jeho uvoľňovania do cytosólu, takže jeho znížené intramitochondriálne množstvo u potkanov AL-28 v porovnaní s hodnotou AL-18 naznačuje zvýšenie vnútorný apoptotický proces so starnutím [16,31]. Okrem toho, pokiaľ ide o LonP1, množstvo Cyt c u potkanov CR-28 bolo stále výrazne nižšie ako hodnota u zvierat AL-18, čo naznačuje, že CR podstatne neovplyvnila konečnú reguláciu expresie Cytc /uvoľňovanie do cytosolu a pravdepodobne ani vekom podmienené zvýšenie mitochondriálnej apoptotickej dráhy. To je v súlade s predtým uvádzanou podporou apoptózy sprostredkovanej CR [23].rast penisu cistancheKeďže apoptotická dráha môže byť spustená aj akumuláciou poškodenia DNA [32,33], stanovili sme proteínovú expresiu dvoch hlavných mitochondriálnych enzýmov BER, a to OGG1 a APE1. Množstvo bielkovín oboch nebolo ovplyvnené starnutím a CR, ktoré prešli od 18. do 28. mesiaca veku. Možným vysvetlením je, že expresia dvoch enzýmov BER už bola zvýšená a dostatočná u potkanov AL-18, aby pôsobila proti zvýšenému poškodeniu mtDNA súvisiacemu s vekom. V skutočnosti bolo hlásené zvýšenie aktivity mitochondriálneho OGG1 [34,35] a mitochondriálneho APE1[36] súvisiace s vekom v pečeni hlodavcov prechádzajúcich z 3-6-mesačných zvierat do 20-23-mesiaca -staré, pravdepodobne indukované tak, aby účinne pôsobili proti nárastu poškodenia mtDNA súvisiacemu s vekom. To všetko ďalej podporuje našu hypotézu, že poškodenia mtDNA, opravené pomocou OGG1 a APE1, sa objavili veľmi skoro v živote hlodavcov (boli už prítomné u potkanov AL-18) a indukovali prostredníctvom retrográdnej komunikácie mitochondrie-jadro, skoré zvýšenie expresie enzýmov BER. Pokiaľ ide o neprítomnosť účinku CR na OGG1 a APE1, navrhujeme, aby CR-redukovaná prítomnosť ROS a súvisiace oxidačné poškodenia bola účinne potlačená expresiou oboch enzýmov, ktoré sa nelíšili od expresie AL zvierat rovnakého veku. Pokiaľ ide o 4,8 kb vymazaný obsah, nedošlo k žiadnemu nárastu súvisiacemu s vekom z AL-18 zvierat na AL-28, ako keby sa aj toto poškodenie mtDNA objavilo pomerne skoro v živote potkanov a ich veku -súvisiace zvýšenie bolo možné overiť iba v porovnaní s mladými zvieratami, ako sa uvádza v iných štúdiách [19,37-39]. Neúčinnosť CR výrazne znížiť obsah delécie 4,8 kb u CR-28 potkanov v porovnaní s AL-28 a AL-18 zvieratami ďalej naznačuje, že dlhodobá CR vyvolala výrazné zníženie prítomnosti ROS v pečeni. To mohlo viesť k určitej ustálenej úrovni delécie 4,8 Kb, ktorá sa nelíši od úrovne AL-18 náprotivku a je kompatibilná s príslušným obsahom mtDNA. Hoci oprava mtDNA nebola znížená starnutím, pokles obsahu mtDNA súvisiaci s vekom bol stále prítomný pri prechode z AL-18 potkanov na AL-28, ako už bolo opísané v rôznych tkanivách staré hlodavce [3,15,19,39-42]. To možno vysvetliť zvýšenou väzbou TFAM súvisiacou s vekom v špecifických oblastiach mtDNA, ktoré boli tiež poškodenými hotspotmi [19]. Táto hypotéza by teda zosúladila stratu mtDNA súvisiacu s vekom s nezmenenou expresiou a aktivitou opravných enzýmov. Ďalšou podporou tejto hypotézy je absencia straty mtDNA u potkanov CR-28. V skutočnosti sme už predtým preukázali, že CR zabránila vekom súvisiacemu zvýšeniu väzby TFAM v špecifických oblastiach mtDNA [15]. Preto podľa súčasných a našich predchádzajúcich údajov môže byť modulácia väzby TFAM medzi molekulárnymi mechanizmami zapojenými do regulácie mitochondriálnej biogenézy sprostredkovanej starnutím a CR. Ukázalo sa tiež, že táto regulácia starnutím a CR sa sleduje prostredníctvom rovnováhy mitochondriálnej dynamiky, ktorá je ovplyvnená starnutím [43] a vedie k prevahe fúzie nad štiepením [44,45]. Preto sme vypočítali fúzny index (FI) u všetkých testovaných zvierat (obrázok 6) a našli sme hodnoty, ktoré potvrdili a rozšírili naše predchádzajúce výsledky [16].výhody cistanche salsaTáto štúdia môže zhromaždiť niekoľko nových indikácií, konkrétne u potkanov AL-18pokryli hodnoty FI malý rozsah, zatiaľ čo u potkanov AL-28 bol rozsah FI oveľa väčší, s výrazným vekom podmienené zvýšenie jednotlivých hodnôt, u potkanov CR-28 malý rozsah hodnôt indikoval pozitívny vplyv CR na indukciu štiepenia, so všeobecným zvýšením individuálnych množstiev DRP1 v porovnaní s hodnotami z AL-28 skupina. Zatiaľ čo efektívne štiepenie môže odstrániť poškodené organely, podobná fúzia entít by mohla zabezpečiť difúziu poškodených makromolekúl v mitochondriálnej sieti, čím by sa riedili ich negatívne účinky [46]. Preto CR-sprostredkovaná obnova jemne vyladenej rovnováhy mitochondriálnej dynamiky môže vyvolať pozitívne dôsledky na moduláciu mitochondriálnej biogenézy, pričom pôsobí synergicky s retrográdnou komunikáciou poškodenia mtDNA. To je v súlade s existujúcou literatúrou, ktorá uvádza, že stav živín a metabolické zmeny môžu modulovať rovnováhu mitochondriálnej dynamiky [47], a tak ovplyvniť aj biogenézu organel. Najmä regulácia mitochondriálnej biogenézy citlivá na ROS môže čeliť iba obmedzenému zvýšeniu ROS prostredníctvom zvýšenia počtu organel [48] a prítomnosť ROS so zníženou CR [15] môže zabrániť prekonaniu prahovej úrovne, ktorá by mohla viesť k strate mitochondrií. Účinnosť CR pri znižovaní prítomnosti ROS bola v tejto štúdii preukázaná zníženou akumuláciou oxidovaných purínov v oblastiach analyzovaných mtDNA u potkanov CR-28, čo podporuje celkové zlepšenie mitochondriálneho metabolizmu, schopné pôsobiť proti veku. -súvisiaci pokles. Skutočne, CR-redukovaná prítomnosť ROS bola široko preukázaná aj na úrovni mitochondriálnych proteínov a lipidov. Konkrétne sa ukázalo, že CR znižuje oxidačné modifikácie mitochondriálnych proteínov v srdciach potkanov |49] a modifikuje index saturácie/nenasýtenosti v mitochondriálnych membránach, čím zabraňuje oxidačnému poškodeniu a udržuje fluiditu membrány [8]. Okrem toho sa preukázalo, že CR znižuje produkciu ROS mitochondriálnymi respiračnými komplexmi v myšacom kostrovom svale aj pečeni [8]. Medzi priaznivé účinky CR na úrovni ROS patrí aj zlepšená neutralizácia ROS a zvýšená oprava molekúl poškodených ROS [10]. Okrem tohto účinku sú zmeny v mitochondriálnej funkčnosti modulované aktiváciou AMPK citlivých na CR a sirtuínov, ktoré regulujú aktivitu transkripčných faktorov receptora gama koaktivátora aktivovaného peroxizómovým proliferátorom 1-alfa (PGC-1) ) a forkhead box (FoxO), pričom druhý sa podieľa na biogenéze, oxidačnom metabolizme a obrate mitochondrií [23]. Pozitívny vplyv na mitochondriálny metabolizmus sprostredkovaný CR by teda mal interagovať s inými dráhami, aby moduloval konečný spúšťač mitochondriálnej biogenézy, podľa modelu retrográdnej komunikácie s jadrom [50].

3.2. Mitochondriálne markery u 32-mesačných potkanov

Pokiaľ ide o porovnanie medzi potkanmi AL-32 a CR{1}}, naše údaje ukazujú všeobecnú absenciu významných rozdielov. To môže naznačovať vekové obmedzenie účinnosti CR v boji proti poklesu súvisiacemu s vekom pri prechode z 28 na 32 mesiacov. Pokiaľ ide o vplyv veku, v závislosti od analyzovaného markera možno vyvodiť rôzne závery. V skutočnosti v oboch 32-mesačných skupinách sa vekom podmienený pokles aktivity citrátsyntázy, množstva TFAM, LonP1, OGG1, APE1, obsahu mtDNA a delécie 4,8 Kb udržal na úrovni ktorý bol podobný tomu, ktorý bol pozorovaný u AL-28 potkanov, alebo mu bolo čiastočne/úplne zabránené, ako pri množstvách Cyt c, MFN2, DRP1 a výskyte oxidovaných purínov v špecifických oblastiach mtDNA. Toto odlišné správanie môže byť pravdepodobne spôsobené súhrou rôznych dráh zahŕňajúcich analyzované markery. Ďalší záver možno zdôrazniť porovnaním 32-mesiacov starých skupín s AL-18 a AL-28 pre sumy MFN2 a DRP1. V skutočnosti pokles súvisiaci s vekom nebol prítomný pri prechode zo skupiny AL-18 do skupín AL-32 a CR-32 pre dva dynamické proteíny. Vzhľadom na to, že v porovnaní medzi skupinou AL-18 a oboma 32-mesačnými skupinami, ako aj v prípade ostatných markerov, došlo k poklesu súvisiacemu s vekom, ktorý je podobný alebo menší ako medzi AL{{ 30}} a AL{31}} skupiny, môžeme vyvodiť určité dôsledky. To môže naznačovať, že zmeny markerov súvisiace s vekom mohli začať alebo už boli prítomné vo veku 18 mesiacov a potom dosiahli najnižšiu/najvyššiu hodnotu u starých,28-mesačných zvierat s „tempom“, ktoré je typické pre proces starnutia. Naopak, u extrémne starých zvierat (32-mesiacov) sa zdá, že „tempo“ procesu sa spomalilo, pretože hodnoty boli nižšie alebo rovnaké ako hodnoty AL-18 náprotivkov, ale nie nižšie /vyššie ako tie z AL-28, boli nájdené, napriek dlhšiemu uplynutému časovému rozpätiu. Hypotéza dvoch rôznych temp v procese starnutia [16] naznačuje, že poškodenia spôsobené rôznymi príčinami začínajú ovplyvňovať fyzické a metabolické aktivity počas dospelosti u každého potkana. Proti takýmto poškodeniam sa účinne bojuje kompenzačnými mechanizmami a škody sa neprejavujú otvorene, čo sa zhoduje so stabilným „stredným“ vekom charakterizovaným úspešnou homeostázou. V tejto štúdii sme identifikovali ako „rýchlo“ starnúce potkany, u ktorých sa rovnováha medzi intervenčnými poškodeniami a kompenzačnými mechanizmami začína strácať neskôr v živote.cistanche tubulosa dávkovanie redditU týchto zvierat, ktoré tvoria väčšiu časť skupiny AL-28, škody presahujú prah kompatibilný s bežnými aktivitami a dochádza k zmenenému stavu. Naopak, zvyšná, menšia časť skúmanej starnúcej populácie si udržuje homeostatickú rovnováhu medzi poškodením a nápravou dlhší čas a tvorí skupinu zvierat starnúcich „pomaly“, vrátane AL-32 aj CR{{2} } potkanov. Podobná hypotéza o rôznych rýchlostiach starnutia bola nedávno navrhnutá aj pre ľudí [51]. Celkovo tieto výsledky naznačujú, že extrémne staré zvieratá mohli dosiahnuť dlhovekosť bez toho, aby boli významne ovplyvnené CR a pravdepodobne kvôli genetickej predispozícii lepšie sa vyrovnať s mitochondriálnou dysfunkciou súvisiacou s vekom, ale takáto hypotéza si vyžaduje budúci výskum. Tieto nové zistenia môžu dať odpoveď na pôvodnú a zásadnú otázku o existencii limitov účinnosti CR, ktorú nastolili Ingram a de Cabo vo svojej veľmi hlbokej štúdii o tejto problematike l52l, ktorá umožňuje identifikovať tieto limity s vekom 28 mesiacov pre pečeň potkanov. Záver, že CR alebo akákoľvek diéta nevyvolávajú priaznivé následky u potkanov prirodzene predisponovaných k dlhovekosti, by však nemal ovplyvniť celkovú dôveru v účinnosť tohto nutričného zásahu. V skutočnosti CR stále dokázala sprostredkovať priaznivé účinky, pretože dokázala zabrániť väčšine vekom podmienených zmien mitochondriálnej biogenézy a poškodenia mtDNA v pečeni 28-mesačných potkanov. To ďalej potvrdzuje CR ako dobre podloženú stratégiu na účinné pôsobenie proti poklesu starnutia vo všeobecnej populácii.

4. Materiály a metódy

4.1.Zvieratá

Štúdiu schválil Inštitucionálny výbor pre starostlivosť o zvieratá a ich používanie na Floridskej univerzite. Všetky postupy boli vykonané v súlade s usmerneniami Národného inštitútu zdravia (NIH) pre starostlivosť a používanie laboratórnych zvierat. Vzorky pečene boli od samcov potkanov Fischer 344× Brown Norway (F344BNF1) získaných z kolónie National Institute of Aging Colony (Indianapolis, IN, USA) a chovaných individuálne pri teplote (20 plus /-2 stupňov) a svetle. kontrolované prostredie (12-h cyklus svetlo/tma) s pravidelnou potravou pre potkany a vodou dostupnými ad libitum na Oddelení starnutia a geriatrického výskumu, Divízia biológie starnutia, College of Medicine, University of Florida, Gainesville, FL( USA). Obmedzenie kalórií sa začalo vo veku 3,5 mesiaca (10 percentné obmedzenie), zvýšilo sa na 25 percent v 3,75 mesiaci a udržiavalo sa na 40 percentnom obmedzení od 4 mesiacov do konca života každého zvieraťa, čo je 28 mesiacov (CR{ {17}}) alebo 32 mesiacov (CR-32) veku. Zvieratá s obmedzeným príjmom kalórií boli kŕmené NIH31-NIA obohatenou stravou, aby sa zabezpečilo, že nebudú podvyživené, zatiaľ čo zvieratám kŕmeným ad libitum sa podávala NIH31 potkania strava. Zvieratá pozostávali z nasledujúcich skupín: 18-mesačné kŕmené ad libitum (AL-18, n=6),28-mesačné kŕmené ad libitum (AL -28, n=6),28-mesačná reklama s obmedzeným príjmom kalórií (CR-28, n=6), 32-mesačná reklama libitum kŕmených (AL-32, n=6) a 32-mesačných potkanov s obmedzeným príjmom kalórií (CR-32, n =6). Zvieratá sa pred usmrtením anestetizovali a vzorky pečene sa okamžite odobrali, rýchlo sa zmrazili v izopentáne ochladenom tekutým dusíkom a skladovali v tekutom dusíku až do ďalšej analýzy.

4.2. Stanovenie aktivity citrátsyntázy

Stanovenie aktivity citrátsyntázy sa uskutočnilo ako v [17]. Stručne, 80 ug celkových proteínov purifikovaných zo vzoriek pečene sa inkubovalo v reakčnom pufri (0,31 mM acetyl-CoA, 100 mM Tris pufor ( pH 8,1), 0,25 percenta Tritonu X-100, 0,1 mM kyseliny 550-ditiol-bis-2-nitrobenzoovej a 0,5 mM oxaloacetátu (1 ml) pri 30 stupňoch.

Aktivita citrátsyntázy (umol x min-1 x g tkaniva-) bola stanovená spektrofotometricky meraním rýchlosti produkcie kyseliny tionitrobenzoovej (TNB) pri 412 nm.

4.3. Western Imunoblotting

Mitochondrie pečene boli izolované v médiu obsahujúcom 220 mM manitol, 70 mM sacharózu, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA a 5 mM EGTA, pH 7,4, pri 4 stupňoch podľa 【16】. Okrem toho sa na analýzu Western immunoblotting použilo 10 ug mitochondriálnych proteínov. Anti-TFAM (1:50,000), anti-VDAC (1:50,000, Abcam, Cambridge, Spojené kráľovstvo), anti-OGG1 (1:2500, Abcam, Cambridge, Spojené kráľovstvo) , anti-APE1 (1:5000, Abcam, Cambridge, Spojené kráľovstvo), anti-MFN2 (1:5000, Abnova, Taipei, Taiwan), anti-DRP1 (1:2500, Abnova, Taipei, Taiwan) anti-Cyt c(1:500, Pharmingen, San Diego, CA, USA) a anti-Lon proteáza (1:10 000) sa použili ako primárne protilátky. Protilátky proti TFAM a Lon boli vyrobené na mieru a láskavo darované Dr. H. Hinagaki (oddelenie chémie, Národný inštitút priemyselného výskumu v Nagoji, Nagoya-shi, Aichi, Japonsko) a Dr. C. Suzuki (oddelenie z biochémie a molekulárnej biológie, New Jersey Medical School, University of Medicine and Dentistry of New Jersey, Newark, NJ, USA). Proteíny sa detegovali pomocou chemiluminiscencie a imunoreaktívne pásy sa kvantifikovali pomocou softvéru Image Lab Software (BioRad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA) a normalizovali sa voči expresii VDAC.

4.4. Určenie mtDNA a mtDNA 4,8 kb "Common Deletion" Content

Kvantitatívna polymerázová reťazová reakcia v reálnom čase (qPCR) sa použila na stanovenie relatívneho obsahu mtDNA a mtDNA 4,8 Kb "spoločná delécia". Reakcie sa uskutočnili pomocou SYBR Green chemistry s použitím 3 ng celkovej DNA ako templátu a nasledujúcich primerov: MtDNA pre 5-GGTTCTTACTTCAGGGCCATCA-3'(nt 15.785-15.806), mtDNA rev 5'-TGATTAGACCCGTTACCATCGA-3'(nt 15,868-15,847); -aktín pre 5'-CCCAGCCATGTACGTAGCCA-3'(nt 2181-2200), -actinrev5'-CGTCTCCGGAGTCCATC AC-3'(nt 2266-2248);4,8 del pre {{26} }AAGGACGAACCTGAGCCCTAATA-3'(nt8109-8131), 4.8 del rev 5'-CGAAGTAGATGATGCGTATACTGTA-3'(nt 13,020-12,996). Obsah mtDNA vo vzťahu k jadrovej Stanovil sa obsah DNA a 4,8 kb "spoločnej delécie" vzhľadom na mtDNA, ako je uvedené v [19].

4.5. Analýza oxidovaných purínov

Na detekciu oxidovaných purínov sa použilo štiepenie celkovej DNA formamidopyrimidínovou DNA glykozylázou (Fpg) (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) [53].

PCR amplifikácia oblastí D-slučky, Ori-L a ND1/ND2 mtDNA sa uskutočnila s použitím príslušného páru primérov:

D-loop For5'-TCTGGTCTTGTAAACCAAAAATGA-3'(nt 15,302-15,325),D-loop Rev 5'-TGGAATTTTCTGAGGGTAGGC-3'(nt 16,302-16, 282); Ori-L pre 5'-AACCAGACCCAA ACACGAAA-3' (nt 4414-4433),Ori-L Rev 5'-CTATTCCTGCTCAGGCTCCA-3'(nt 5407-5388);ND1 pre 5 '-AGGACCATTCGCCCTATTCT-3'(nt3390-3409),ND1 Rey 5'-CGCCAAC AAAGACTGATGAA3'(nt 4399-4380) na 5 ng celkovej DNA ošetrenej Fpg a neošetrenej. Podmienky cyklovania boli: Predinkubácia 10 minút pri 95 stupňoch, po ktorých nasledovalo 18 cyklov 15 až 95 stupňov, 15 s 58 stupňov C a 1 minúta 72 stupňov. Alikvotná časť každej PCR amplifikácie sa naniesla na 1,3 % agarózový gél. Intenzity pásov pásov zafarbených etídiumbromidom sa analyzovali pomocou softvéru Image Lab Software (BioRad Laboratories Inc., CA, USA). Aby sa zlepšila grafická vizualizácia, pomer medzi intenzitou pásov ošetrených Fpg a neošetrenými bol vyjadrený ako percento komplementu k 100.

4.6. štatistiky

Údaje sú vyjadrené ako priemer a štandardná odchýlka (SD). Použila sa jednocestná ANOVA s Tukeyho viacnásobným porovnávacím testom. Pre všetky testy bola štatistická významnosť nastavená na 5-percentnej úrovni. Analýzy sa uskutočňovali s použitím špecifického štatistického balíka (Stata Corp. 2005. Stata Statistical Software: Release. College Station, TX, USA).

Tento článok je prevzatý z Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 1665. https://doi.org/10.3390/ijms22041665 https://www.mdpi.com/journal/ijms