Aktuálny stav neuroprotekcie pri vrodenej srdcovej chorobe, časť 2

Mikroskopické obrazy sa potom podrobili výpočtu obrazu pomocou softvéru ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Signál Hsp60 bol vynásobený "x".

Hsp60 je dôležitá proteínová molekula, ktorá hrá dôležitú biologickú úlohu v ľudskom tele. Výskum v posledných rokoch ukázal, že prítomnosť Hsp60 úzko súvisí s ľudskou pamäťou.

Hsp60 je molekulárny chaperónový proteín, ktorý sa podieľa hlavne na skladaní, rozbaľovaní, stabilizácii a degradácii proteínov. Tieto procesy sú veľmi dôležité pre normálny metabolizmus a bunkovú funkciu ľudského tela. Zároveň má Hsp60 aj antioxidačné, protizápalové a imunomodulačné účinky a zohráva veľkú úlohu pri udržiavaní ľudského zdravia a rovnováhy imunitného systému.

Výskum zistil, že Hsp60 hrá kľúčovú úlohu pri tvorbe a udržiavaní pamäte. Počas procesu učenia a pamäte produkujú mozgové bunky veľké množstvo molekúl Hsp60. Tieto molekuly môžu chrániť bunky pred rušením a poškodením z vonkajšieho prostredia, aby zabezpečili hladký priebeh učenia a pamäte. Okrem toho môže Hsp60 ovplyvňovať aj ľudské myslenie a správanie zmenou signálnej transdukcie mozgových buniek a vývoja neurónov a má pozitívny vplyv na kogníciu a odolnosť voči stresu.

Hoci úloha Hsp60 preukázala pozitívne účinky na ľudský organizmus, ľudia si tiež musia uvedomiť, že nadbytok aj nedostatok Hsp60 môže mať negatívne účinky na ľudské zdravie. Preto by sme mali aktívne skúmať a študovať mechanizmus Hsp60 v rôznych fyziologických a patologických stavoch ľudského tela, aby sme lepšie pochopili postavenie a úlohu Hsp60 v ľudskom zdraví. Je vidieť, že potrebujeme zlepšiť pamäť a Cistanche deserticola môže výrazne zlepšiť pamäť, pretože Cistanche deserticola má antioxidačné, protizápalové účinky a účinky proti starnutiu, čo môže pomôcť znížiť oxidačné a zápalové reakcie v mozgu, a tým chrániť zdravie nervového systému. Okrem toho môže Cistanche deserticola tiež podporovať rast a opravu nervových buniek, čím zvyšuje konektivitu a funkciu neurónových sietí. Tieto účinky môžu pomôcť zlepšiť pamäť, schopnosť učenia a rýchlosť myslenia a môžu tiež zabrániť rozvoju kognitívnej dysfunkcie a neurodegeneratívnych ochorení.

Kliknite na Know, aby ste zlepšili krátkodobú pamäť

Hodnota "x" bola stanovená nasledovne: odpočítaním "x"-zloženého signálu Hsp60 od signálu mitochondriálnej DNA v kontrolnej skupine bola hodnota mitochondriálnej DNA menšia alebo rovná nule. Signál histónu H2B bol vynásobený "y".

Hodnota "y" sa určila nasledovne: odpočítaním signálu "y" zloženého histónu-H2B od signálu jadrovej DNA v kontrolnej skupine bola hodnota jadrovej DNA menšia alebo rovná nule. Ak sa signál pozadia v dôsledku násobenia zvýši, kontrast znásobeného obrazu možno upraviť pre rovnaké podmienky vo všetkých vzorkách.

Na následnú analýzu sa použil obraz farbenia dsDNA mínus upravený obraz znásobeného Hsp60 a histónu H2B. Pomocou funkcie "Adjust-Threshold" boli tieto obrázky binarizované. Vybrali sme bodky dsDNA s veľkosťou od 2 do 2 0 µm2 (kruhovitosť 0,1–1,0) a spočítali sme ich pomocou funkcie „Analyze-Analyze Particles“.

2.3. Elektrónová mikroskopia

Jeden deň pred transfekciou boli HeLa bunky nanesené v hustote 600 buniek/µl. Expresia požadovaných génov bola umlčaná v HeLa bunkách pomocou Stealth RNAi siRNA (Thermo Fisher Scientific) v Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent (ThermoFisher Scientific) podľa podľa pokynov výrobcu (s konečnou koncentráciou RNA 10 nM).

Štyri dni po knockdown siRNA sa bunky podrobili fixácii. Vzorky bunkovej kultúry sa fixovali s 2 % PFA a 2 % glutaraldehydom v 0.1 M fosfátovom pufri, pH 7,4, pri 37 °C, potom sa umiestnili do 4 ◦C chladnička na 30 min. Vzorky boli fixované v 2 % glutaraldehyde v 0,1 M fosfátovom pufri cez noc pri 4 °C. Vzorky boli trikrát premyté 0,1 M fosfátovým pufrom počas 30 minút a následne fixované 2% oxidom osmičelým v 0,1 M fosfátovom pufri pri 4 °C počas 1 hodiny.

Vzorky boli dehydratované roztoky ingradovaného etanolu, prenesené na živicu (Quetol{0}}, Nisshin EM Co., Tokio, Japonsko) a polymerizované pri 60 °C počas 48 hodín. Polymerizované živice sa narezali na ultratenké 70-emrezy diamantovým nožom s použitím ultramikrotómu (Ultracut UCT, Leica Microsystems, Wetzlar, Nemecko) a potom sa namontovali na medené mriežky.

Rezy boli zafarbené 2% uranylacetátom pri teplote miestnosti počas 15 minút a premyté destilovanou vodou, po čom nasledovalo sekundárne farbenie roztokom na farbenie olova (Sigma-Aldrich, Tokio, Japonsko) pri teplote miestnosti počas 3 minút.

Mriežky boli pozorované pod transmisným elektrónovým mikroskopom (JEM{0}}Plus, JEOL Ltd., Tokio, Japonsko) pri akceleračnom napätí 80 kV (mozog zebričky) alebo 100 kV (bunka) a snímky boli zaznamenané pomocou kamery so zariadením s nábojovou väzbou (CCD) (EM-14830RUBY2,JEOL Ltd.) .

2.4. Imunoelektrónová mikroskopia

Vzorky na zlatých diskoch boli zmrazené v tekutom propáne pri -175 ◦C. Potom, čo boli vzorky zmrazené, boli zmrazené nahradené 1% kyselinou trieslovou v etanole a 2% destilovanej vody pri -80 °C počas 24 hodín.

Vzorky sa potom udržiavali pri teplote -20 °C počas 4 hodín, po čom nasledovala inkubácia pri teplote 4 °C počas 1 hodiny. Potom boli vzorky trikrát dehydratované v bezvodom etanole počas 30 minút. zakaždým, nasledovaná infiltráciou zmesou etanolu a živice v pomere 50:50 (LR biela: London Resin Co. Ltd., Berkshire, UK) pri 4 °C počas 1 hodiny. Vzorky boli prenesené do čerstvej 100% živice a inkubované pri 4 °C počas 30 minút a tento proces sa opakoval trikrát.

Vzorky sa preniesli do čerstvej 100% živice a polymerizovali sa pri 50 °C CO/N. Polymerizované živice boli narezané na ultratenké rezy pri 90 nm diamantovým nožom s použitím ultramikrotómu (Ultracut UCT; Leica) a rezy boli umiestnené na niklové mriežky. Mriežky sa inkubovali s anti-dsDNA protilátkou (35I9 DNA) (1/800, Abcam, kat. č. ab27156, RRID: AB_470907) v 1 % BSA/PBS pri 4 °C CO/N, po čom nasledovali tri premytia s 1% BSA/PBS vždy 1 min.

Následne boli inkubované so sekundárnou protilátkou konjugovanou s {{0}}}nm časticami zlata (kozia anti-myšia IgG polyklonálna protilátka) počas 2 hodín pri teplote miestnosti. Po opláchnutí PBS sa mriežky umiestnili do 2% glutaraldehydového 0,1 M kakodylátového pufra.

Potom sa mriežky vysušili a potom farbili 2 % octanom uranylu počas 15 minút a roztokom farbiva olova (Sigma-Aldrich) pri teplote miestnosti počas 3 minút. Mriežky sa pozorovali transmisným elektrónovým mikroskopom (JEM{4}} plus JEOLLtd.) pri akceleračnom napätí 100 kV. Digitálne snímky boli získané pomocou CCD kamery (EM-14830RUBY2, JEOL Ltd.).

3. Výsledky

3.1. Znížený TFAM alebo GBA indukuje zvýšenie ektopickej mitochondriálnej DNA

Najprv sme ukázali príklad detekcie cytoplazmatickej DNA odvodenej z mitochondrií v HeLa bunkách, v ktorých bol proteín TFAM zrazený siRNA (obrázok 1A). TFAM je kľúčový mitochondriálny transkripčný faktor a funguje aj pri replikácii a oprave mitochondriálnej DNA [20]. .

Uvádza sa, že sekvenčné polymorfizmy v tomto géne súvisia s Parkinsonovou chorobou [21,22]. Po 3 dňoch knockdownu proteínu TFAM sa v cytoplazme buniek HeLa detegovalo veľa bodiek dvojvláknovej DNA.

Históny sú pozitívne markery pre DNA jadrového pôvodu v cytoplazme a negatívne markery pre mitochondriálnu DNA a DNA mitochondriálneho pôvodu v cytoplazme [23]. Tieto bodky sa nelokalizovali spolu s histónmi, čo naznačuje, že nejde o DNA odvodenú z jadra. Okrem toho sa niektoré z týchto cytoplazmatických ektopických bodov DNA nelokalizovali spolu s Hsp60, markerom pre mitochondriálnu matricu, čo naznačuje, že sa nachádzali mimo mitochondrií (obrázok 1B, C).

Elektrónová mikroskopia tiež ukázala, že ektopická DNA unikala z mitochondrií (obrázok 2A, B). Stručne povedané, zvýšenie ektopických DNA bodiek v cytoplazme knockdownom TFAM bolo spôsobené únikom mitochondriálnej DNA z mitochondrií. Po druhé, ukázali sme ďalší príklad detekcie cytoplazmatickej DNA odvodenej z mitochondrií v HeLa bunkách, v ktorých bol GBA proteín zrazený siRNA (Obrázok 1A).

GBA je kauzálny gén pre Gaucherovu chorobu, ale heterozygotná mutácia GBA je tiež rizikovým faktorom pre Parkinsonovu chorobu [24]. Po 3 dňoch odbúrania proteínu GBA sa v cytoplazme buniek HeLa detegovalo veľa bodiek dvojvláknovej DNA. Niektoré bodky DNA boli lokalizované spolu s histónmi, čo naznačuje, že ide o DNA odvodenú od jadra.

Iné DNA bodky neboli lokalizované spolu s histónmi, čo naznačuje, že nešlo o DNA odvodenú od jadra, ale o DNA odvodenú od mitochondrií (obrázok 1D). Stručne povedané, zvýšenie ektopických bodov DNA v cytoplazme knockdownom GBA bolo aspoň čiastočne spôsobené únikom mitochondriálnej DNA z mitochondrií.

For more information:1950477648nn@gmail.com