Účinok faktora nervového rastu na podporu priestorovej pamäte závisí od hipokampálnej cholinergnej inervácie

Pre viac informácií:ali.ma@wecistanche.com

Abstraktné

Génová terapia nervovým rastovým faktorom (NGF) bola použitá v klinických štúdiách Alzheimerovej choroby. Pochopenie základného mechanizmu vplyvu NGFPamäťmôže pomôcť pri vývoji nových stratégií liečby. NGF aj cholinergný systém hrajú dôležitú úlohu pri učení aPamäť. NGF je nevyhnutný na udržanie cholinergnej inervácie hipokampu, ale závisí od toho, či podporný účinok NGF na učenie aPamäťje špecificky závislá od intaktnej hipokampálnej cholinergnej inervácie. Tu charakterizujeme správanie a hipokampálne merania objemu, neurogenézy, dlhodobej potenciácie a cholinergnej inervácie u myší s deficitom Ngf špecifických pre mozog. Naše výsledky ukazujú, že knockoutované myši vykazujú zvýšenú úzkosť, zhoršené priestorové učenie a pamäť, znížený objem hipokampu u dospelých, neurogenézu, krátkodobú potenciáciu a cholinergnú inerváciu. Nadmerná expresia Ngf v hipokampe knockoutovaných myší s génom Ngf bola zachránená priestorovoPamäťa čiastočne obnovené cholinergné inervácie, ale nie úzkosť. Selektívna deplécia hipokampálnej cholinergnej inervácie viedla k narušeniu priestorového stavuPamäť. Nadmerná expresia Ngf v hipokampe však nedokázala zachrániť priestorPamäťu myší s hipokampálnou selektívnou depléciou cholinergných vlákien, Na záver sme demonštrovali vplyv nedostatku Ngf v mozgu a poskytli dôkazy, že účinok NGF na priestorovéPamäťje závislý na intaktných cholinergných inerváciách v hipokampe. Výsledky naznačujú, že adekvátne cholinergné zacielenie môže byť kritickou požiadavkou pre úspešné použitie NGF génovej terapie Alzheimerovej choroby.

Wei Zheng Eu1, Yu-Ju Chen1, Wei-Ting Chen1, Kuan-Yu Wu1, Cheng-Yu Tsai1, Sin-Jhong Cheng2,

Roderick N. Carter3 a Guo-Jen Huang 1,4,5

Úvod

Nervový rastový faktor (NGF), neurotrofický rastový faktor prvýkrát identifikovaný v 50. rokoch 20. storočia, podporuje rast neuritov a stimuluje diferenciáciu nervových buniek v kultivačných experimentoch1–3. V mozgu sa najvyššia expresia Ngf mRNA nachádza v hipokampe4. NGF aktivuje dva receptory: receptor NGF s nízkou afinitou (spoločný neurotrofický receptor, p75) a receptor NGF s vysokou afinitou (TrkA), ktoré sú oba exprimované v bazálnych cholinergných neurónoch predného mozgu5,6 a je známe, že inervujú hipokampálnu štruktúru7. Dôkazy naznačujú, že NGF sa uvoľňuje z cieľových buniek a spúšťa signálne dráhy retrográdne pozdĺž axónu8. Existuje silné spojenie medzi NGF a cholinergným systémom v hipokampe. Injekcia NGF do laterálnych komôr zvyšuje aktivitu cholínacetyltransferázy (ChAT) v hipokampe9. Okrem toho sa ukázalo, že NGF chráni bazálne cholinergné neuróny predného mozgu po axonálnom poškodení hipokampálnych vyčnievajúcich vlákien10.

Kliknutím zobrazíte výhody a vedľajšie účinky Cistanche tubulosa pre pamäť

Pre príčinu Alzheimerovej choroby bolo navrhnutých niekoľko hypotéz. Jednou z nich je hypotéza NGF11. Od začiatku 80-tych rokov minulého storočia viaceré správy ukázali, že významná cholinergná dysfunkcia sa vyskytuje u dementných starších ľudí a že cholinergná neuronálna degenerácia je spojená s kognitívnymi deficitmi pri Alzheimerovej chorobe1.

Nová pozitrónová emisná tomografia (PET) rádioindikátor 18F-fluóretoxybenzén bodkočiarka poskytla novší dôkaz, že u pacientov s Alzheimerovou chorobou existuje väčšia kortikálna cholinergná terminálna strata13. Štúdie na zvieratách tiež poskytujú dôkaz, že hustota cholinergných inervácií klesá u starých potkanov a transgénnych myší podobných Alzheimerovej chorobe14,15. Okrem toho staré anti-NGF myši vykazujú fenotypy podobné Alzheimerovej chorobe, ako je strata neurónov, cholinergné deficity a poruchy priestorovej pamäte16. Nedávna štúdia naznačuje, že metabolická dráha NGF je narušená u pacientov s Alzheimerovou chorobou, pričom sa zistilo, že molekulárny mechanizmus pre dozrievanie proNGF je znížený, zatiaľ čo molekulárny mechanizmus pre dozrievanie proNGF je zvýšený17.

Centrálny cholinergný systém sa podieľa na učení18,19 a zdá sa, že NGF zohráva dôležitú úlohu pri podpore tohto procesu. Intraventrikulárna infúzia NGF môže zachrániť miernu cholinergnú depléciu v hipokampe a pamäťové deficity u heterozygotných Ngf plus / - mutantných myší20. Dôkazy tiež ukazujú, že NGF moduluje silu cholinergných projekcií do hipokampu a ovplyvňuje plasticitu neurónov a zachovanie správania v oblasti priestorového učenia21. Zostáva však neznáme, či účinky NGF na učenie závisia od týchto cholinergných projekcií do hipokampu. Objasnenie tohto môže poskytnúť lepšie pochopenie pre vývoj liečby Alzheimerovej choroby. V tejto štúdii sme sa touto otázkou zaoberali použitím myší s podmieneným knockoutom Ngf (cKO) špecifických pre mozog, aby sme odhalili dôležitosť NGF pri úzkosti a priestorovej pamäti. Ďalej sme zistili, že účinok NGF na priestorovú pamäť, ale nie úzkosť, vyžaduje cholinergnú projekciu do hipokampu.

Materiály a metódy

Zvieratá

Experimenty sa uskutočňovali na pohlavne vyvážených kohortách 12-týždňových myší Ngf cKO a myší divokého typu (WT). Ngf floxované myši z National Laboratory Animal Center, Taiwan, (RMRC 13175) a myši Sox1::Cre (Ac. No. CDB0525K)22 sa použili na generovanie Ngf flox/flox; Myši Sox1::Cre v tejto štúdii. Ngf flox/flox; Myši Sox1::Cre (cKO) a Ngf flox/flox (WT) použité v tejto štúdii boli súrodenci vytvorené krížením Ngf flox/flox; Myši Sox1::Cre s homozygotnými myšami Ngf flox/flox. Dvanásťtýždňoví samci myší C57BL/6Narl sa použili na hipokampálnu cholinergickú denerváciu. Myši sa množili v špecifických podmienkach bez patogénov certifikovaných AAALAC. Boli umiestnené v cykle svetlo-tma 12:12 hodín pri teplote 22 stupňov a vlhkosti 60-70 percent. Zvieratá mali ad libitum prístup k potrave a vode. Všetky postupy sa uskutočňovali v súlade s miestnymi predpismi a boli schválené Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť o zvieratá a ich používanie na univerzite Chang Gung (číslo povolenia: CGU105-033).

Behaviorálne testy

Pre behaviorálne testy sa pohyb zvierat zaznamenával a sledoval pomocou video záznamového systému. Myši na vykonanie behaviorálnej analýzy boli náhodne rozdelené do samostatnej klietky na testovanie s podstielkou, potravou a vodou a potom boli premiestnené späť do domácej klietky. Všetky bludiská sú vyrobené z akrylu; počas testu nie je v bludisku žiadna podstielka. Všetky údaje o správaní boli zaznamenané a získané automaticky softvérom Ethovision.

Otvorené pole

Myši boli umiestnené do okrúhleho otvoreného poľa s polomerom =45 cm a vnútorným kruhom s polomerom =30 cm. Nechali sa voľne pohybovať 5 minút a boli sledované softvérom Ethovision.

Zvýšené plus-bludisko

Prístroj použitý na test zvýšeného plusového bludiska (EPM) pozostával z dvoch otvorených ramien (30 x 5 cm) a dvoch uzavretých ramien rovnakej veľkosti so stenami vysokými 15 cm. Bludisko bolo vyvýšené 38 cm nad podlahou. Myši sa umiestnili do EPM na 5 minút so slabým svetlom a meral sa čas strávený v otvorenom ramene.

Morrisovo vodné bludisko

Toto sa uskutočnilo v okrúhlej nádrži s vodným bludiskom (priemer 110 cm, hĺbka 50 cm) umiestnenej vo svetlej miestnosti. Bazén bol naplnený do hĺbky 15 cm vodou, ktorá bola nepriehľadná pridaním bielej, netoxickej farby. Štvorcová úniková plošina (9 × 9 cm) bola ponorená 0,5 m pod hladinou vody, v pevnej polohe v jednom z kvadrantov. Myši boli trénované počas 4 dní. V každý tréningový deň dostali myši štyri tréningové pokusy. Interval medzi pokusmi bol 15 minút. V každom pokuse boli myši umiestnené do bazéna na jednom zo štyroch východiskových miest. Myšiam bolo umožnené plávať/hľadať maximálne 90 s alebo kým nenašli plošinu a nechali sa na plošine zostať 30 s. Ak myš v danej skúške nenašla platformu, bola navedená na platformu. Osem dní po poslednej skúške bola platforma na test pamäte odstránená z fondu a myš ju mohla hľadať v 90-tych rokoch. Zber údajov a analýza sa uskutočňovali automaticky, vrátane dĺžky plávanej dráhy tréningových pokusov a percentuálneho času stráveného v cieľovom kvadrante pre test pamäte.

Nové rozpoznávanie objektov

Myšiam sa umožnilo zoznámiť sa s dvoma identickými bielymi akrylovými valcami (výška=9cm, priemer= 5 cm) počas 15 minút denne, počas 2 dní. Predmety boli na pevnom mieste v bielej komore. Počas testovacej fázy na tretí deň bol jeden z exponovaných predmetov nahradený sivým brokovnicovým sklom (výška=8 0,7 cm, priemer=5 cm) upevneným obrátene v komore a druhý predmet bol nahradený novým, ale identickým bielym akrylovým valcom. Čas strávený skúmaním každého z objektov bol zhromaždený a analyzovaný softvérom Ethovision.

Objemová analýza hipokampu

Všetky skenovania magnetickou rezonanciou (MRI) sa uskutočnili pomocou ClinScan 70/30 USR (Bruker BioSpin, Ettlingen, Nemecko) s fázovanou cievkou prispôsobenou pre hlavu myši. Trojrozmerná (3D) sekvencia gradientu a ozveny bola zvolená na získanie viacrezových obrázkov mozgu s nasledujúcimi parametrami: čas opakovania=30 ms;čas ozveny=15 ms; uhol preklopenia=20";počet priemerov=5; hrúbka rezu =0,2 mm; rozlíšenie v rovine=256×256; veľkosť voxelu=59×59 ×200 μm². Celkový čas akvizície bol približne 15 minút s 1-2 percentami izofluranu ako anestetika. Objem hipokampu sa meral pomocou PMOD 3.2 (PMOD Technologies. Švajčiarsko). objem každého rezu sa získal vynásobením vyznačenej plochy hrúbkou rezu (0,2 mm). Celkový objem mozgu sa meral pomocou manuálne načrtnutých oblastí cez 19 sagitálnych rezov na zviera, pričom sa vyznačená plocha znásobila na hrúbku rezu (0,2 Obrázky sa analyzovali za rovnakých podmienok slepým spôsobom.

kvantifikácia mRNA

Hipokampálne tkanivo bolo odobraté z WT a cKO myší, potom homogenizované v Trizole, po čom nasledovala fenol-chloroformová extrakcia celkovej RNA. cDNA sa potom pripravila pomocou reverznej transkriptázy SuperScript III (Invitrogen). Experimenty sa uskutočňovali duplicitne. Hladiny génovej expresie sa potom vypočítali metódou △ACt a normalizovali sa oproti kontrole Gapdh. Ng-Forward: 5'-TTCTA TACTG GCCGC AGTGA-3; Ngf-Reverse 5-TTAGT CCAGT GGGCT TCAGG-3'

Test kortikosterónu

Vzorky krvi sa odoberali medzi 7:30 a 20:00 popoludní punkciou tvárovej žily a odoberali sa do skúmaviek Microvette" CB300 LH. Plazma sa oddelila od plnej krvi centrifugáciou a skladovala sa v centrifugačných skúmavkách pri {{5} „C až do analýzy. Na analýzu sa vzorky zriedili v pufri (1/40), potom sa analyzovali pomocou súpravy Corticosterone EIA (Enzo Life Sciences) podľa pokynov výrobcu, ako bolo opísané vyššie.

Príprava vírusového vektora a intrahipokampálne injekcie

Pre experiment nadmernej expresie Ngf sa použili fragmenty DNA, ktoré kódovali Ngf (RefSeq NM 013609) alebo zosilnené. Zelené fluorescenčné proteíny (eGFP) boli vytvorené pomocou PCR a subklonované do miesta Note konštruktu vírusu AAV9. Rekombinantné vektory AAV9 boli produkované štandardnou metódou transfekcie s tromi plazmidmi a boli purifikované dvoma kolami centrifugácie Csd. Fyzikálne vektorové titre AAV boli kvantifikované meraním počtu zbalených vektorových genómov pomocou metódy PCR v reálnom čase.

V prípade injekcií vírusového vektora sa chirurgický zákrok uskutočnil v anestézii (zmes Zoletil-Rompun). Myši dostali bilaterálne injekcie vírusových vektorov do hipokampu v objeme 1,5 ul pod stereotaxickým vedením. Celkovo boli štyri miesta vpichu (pre dorzálny hipokampus, predno-zadný (AP)-22 mm. Mediálne-laterálny (ML)±2.0 mm od bregmy a dorzálno-ventrálny ( DV)-1.8 mm od dura; pre ventrálny hroší kampus, AP-3.0mm, ML ±3.0 a DV-3 0,3 mm). Konečná koncentrácia injikovaného AAV vektora bola 3,1 x10 12vg/ml.

Imunohistochémia/in situ hybridizácia a kvantifikácia

Všetky rezy na označenie Ki67, Doublecortin (DCX,5-Bróm-2'-deoxyuridín (BrdU)/NeuN a ChAT boli narezané na hrúbku 40μm na posuvnom mikrotóme Rezy boli pripevnené na sklíčka SuperFrost a sušené cez noc. Následne boli sklíčka inkubované v 0,01 mol/l citrónovom pufri počas 20 minút pri 90 x C, 3 percentá HaO, počas 10 minút, opláchnuté vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS) a inkubované cez noc pri izbovej teplote s králičou anti-Ki67 protilátkou (1:3000, Abcam), králičou anti-DCX protilátkou (1:4000, Abcam) a anti-ChAT protilátkou (1:200, Abcam). Použil sa štandardný postup súpravy králičieho IgG ABC (Vector Lab) a sklíčka reagovali 5-10 min s tabletou Sigma DAB. Rezy sa potom prekryli s DPX.

Na dvojité značenie BrdU/NeuN sa rezy inkubovali v 2N HCl počas 15 minút pri 37 °C, neutralizovali sa v boritanu sodnom (Sigma) počas 10min (pH 8,5) a pred inkubáciou s potkanom sa trikrát premyli v PBS anti-BrdU (1:1500, Abcam) a myšacia anti-NeuN (1:1000, Millipore).Po troch premytiach v PBS (každé 5 minút) sa rezy inkubovali s fluorescenčnou sekundárnou protilátkou (1:250, Alex Fluor 488 a Texas Red, Invitrogen) počas 2 hodín v 0,3 percentách Triton/PBS s 2 percentami kozieho séra.

Na hybridizáciu Ngf in situ sa použila sonda Ngf (katalógové číslo 565131) a RNAscope 2.5 HD Brown Reagent Kit (Advanced Cell Diagnostics, USA) a farbenie sa uskutočnilo podľa návodu k produktu. Stručne, sklíčka sa inkubovali v 1 x vyhľadávacom pufri počas 5 minút pri 100 stupňoch C, 3 percentá H, O, počas 10 minút a opláchli sa v 1 x premývacom pufri. Sklíčka sa potom inkubovali v proteáze počas 20 minút a následne v cieľovej sonde počas 2 hodín pri 40 °C. Po sérii amplifikácií sa na vizualizáciu RNA použila DAB.

Bunky DCX, Ki{0}} a dvojito označené BrdU/NeuN sa spočítali na každom ôsmom reze cez celý rostrokaudálny rozsah vrstvy granulových buniek (šesť rezov na zviera). Počet spočítaných buniek sa potom vynásobil 16, aby sa získal odhad celkového počtu DCX, Ki67 a BrdU-pozitívnych buniek v gyrus dentatus. Všetky sklíčka boli randomizované a kódované pred kvantitatívnou analýzou. Bunkové somáty označené ChAT boli spočítané na každom druhom reze cez rostrokaudálny rozsah jadra vertikálneho ramena diagonálneho pásu (VDB) a mediálneho septa (MS) (štyri rezy na zviera). Pre reprezentatívny obraz dvojitého značenia BrdU/NeuN sa najprv získal obrázok z-stack (sedem rezov v zásobníku) pod objektívom x40, po ktorom nasledovala 3D dekonvolúcia s rýchlym iteračným režimom pomocou softvéru Axiovision Microimaging (Carl Zeiss).

Cholinergné vlákna sa vizualizovali pri farbení ChAT a skúmali sa v tmavom poli pod objektívom × 10 (Axio Imager 2, zachytený Nikon D5100). Hustota vlákna sa kvantifikovala ako stredná intenzita (stredná hodnota šedej) prahového signálu pod oblasťou hipokampu s obrazom 142g (NIH), hustota cholinergných vlákien hipokampu sa kvantifikovala jednostranne na každom ôsmom úseku cez celý rostrokaudálny rozsah celého hipokampu.

Elektrofyziológia v hipokampálnych rezoch

Rezy hipokampu (hrúbka 45 0 um) sa priečne narezali pomocou vibračného rezača tkaniva (DSK Microslicer DTK-1000; Dosaka EM, Kyoto, Japonsko). Rezy sa nechali zotaviť aspoň 120 minút a preniesli sa do záznamovej komory ponorného typu namontovanej na zvislom mikroskope (BX51Wl; Olympus Optical, Kyoto, Japonsko) vybavenom mikroskopickým videom s infračerveným diferenciálnym interferenčným kontrastom. Okysličená umelá cerebrospinálna tekutina (5 percent CO,/95 percent O) obsahujúca 0,1 mM pikrotoxínu bola perfundovaná do záznamovej komory rýchlosťou 1-2 ml/min. Bipolárna stimulačná elektróda z nehrdzavejúcej ocele (Frederick Haer Company, Bowdoinham, ME) (impedancia 10 Meg-ohm) a sklenená pipeta naplnená 3 M NaCl sa umiestnili do stratum radiatum CA1 na vyvolanie a zaznamenanie excitačných postsynaptických potenciálov poľa (fEPSPs). )činnosť, resp. Facilitácia párových impulzov (PPF) bola skúmaná v rôznych interstimulačných intervaloch a každý interstimulačný interval aplikoval dva krátkodobé prúdové impulzy （40 μs） každých 20 s najmenej štyrikrát. Na analýzu údajov sa merali pomery počiatočných sklonov z druhej odozvy fEPSP/prvej odozvy fPSP. Pre dlhodobé experimenty s potenciáciou (LTP) bola stabilná základná aktivita fPSP vyvolaná každých 20 sekúnd počas najmenej 20 minút, potom bola indukovaná vysokofrekvenčná stimulácia (HFS)-LTP pomocou 5 sledov 100 impulzov pri 100 Hz s intervalom medzi kmeňmi z 20. rokov. Elektrofyziologické stopy boli amplifikované zosilňovačom (Multiclamp 700 B; Axon Instruments, Union City, CA). Všetky signály boli filtrované v dolnej priepusti pri 1 kHz a digitalizované pri 10 kHz pomocou rozhrania CED Micro 1401 MKII (Cambridge Electronic Design). Údaje sa zbierali pomocou softvéru Signal (Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK). Synaptické odpovede boli normalizované na priemer základnej línie. Hodnoty krátkodobej potenciácie (STP) a LTP boli stanovené spriemerovaním 5 minút normalizovaných hodnôt sklonu pri 10-15 min a 55-60 min po HFS. Experimentátori, ktorí viedli elektrofyziológiu, boli voči skupine myší zaslepení.

Hippokampálna cholinergná denervácia

Myšia p{0}}protilátka so saporínom konjugovaná (mu p75-SAP) (ATS Bio, San Diego) sa použila pri cholinergnej denervácii. Potom sa na jedno miesto podalo 0,2 ug mup75-SAP a miesta injekcie boli podobné miestam injekcie vírusového vektora (štyri miesta injekcie na zviera).

Štatistická analýza

Pre každú skupinu bol stanovený priemer ± SEM. Štatistická analýza sa uskutočnila pomocou softvéru Graphpad Prism. Dáta sa analyzovali pomocou analýzy rozptylu alebo t-testu podľa potreby. V prípade potreby sa použila Bonferroniho metóda. Rozdiely sa považovali za významné, keď p bolo<>

Výsledky

Znížená hipokampálna neurogenéza, hustota cholinergných vlákien a objem u myší Ngf KO špecifických pre nervový systém

Hlavnou výzvou pre štúdium funkcií NGF u dospelých myší je to, že konvenčné modely KO zomierajú predčasne. Doteraz väčšina správ používala blokátory NGF, ako sú malé interferujúce RNA alebo protilátky, na vyhodnotenie účinku NGF52. Aby sme študovali úlohu NGF v mozgu, skrížili sme myši Ngf floxed s myšami Sox: Cre, ktoré exprimujú Cre v celej nervovej trubici z E1127. Tieto tkanivovo špecifické cKO myši nám umožňujú skúmať funkcie Ngf v mozgu (obr. 1A). Najprv sa merala hipokampálna expresia Mgf mRNA pomocou kvantitatívnej PCR. Výsledky ukazujú výrazné zníženie expresie Ngf u myší cKO (str<0.0001, tuo="8.24)(Fig.1B)." to="" further="" confirm="" the="" specificity="" of="" this="" brain="" cko,="" we="" measured="" ngf="" mrna="" levels="" in="" the="" whole="" brain,="" liver,="" and="" musde="" from="" wt="" and="" cko="" mice,="" and="" our="" results="" confirm="" the="" specificity="" of="" ko="" (supplementary="" fig.="">

Infúzia NGF do laterálnych komôr zvyšuje tak prežitie novonarodených neurónov, ako aj cholinergnú aktivitu v hipokampe8. Preto sme sa pýtali, či myši s deficitom Ngf majú nižšie hladiny hipokampálnej neurogenézy dospelých a cholinergnej inervácie. Na zistenie neurogenézy dospelých sme injikovali BrdU (200 mg/kg, jedna injekcia, intraperitoneálne) dospelým myšiam WT a Ngf cKO (vo veku približne 13 týždňov). Myši boli usmrtené 34 dní po tejto injekcii BrdU na vyhodnotenie prežitia neurónov. Mozgové tkanivo sme farbili na Ki67 (marker bunkovej proliferácie), DCX (marker pre nezrelé neuróny) a dvojité farbenie na BrdU a NeuN (neurónový marker). Na posúdenie hustoty cholinergných vlákien sme zafarbili ChAT, enzým zodpovedný za syntézu acetylcholínu. V gyrus dentate gyrus hipokampu u myší Ngf cKO v porovnaní s myšami WT. Pokiaľ ide o dvojité značenie BrdU a NeuN, myši Ngf cKO tiež vykazovali trend nižšej úrovne počtu buniek BrdU plus /NeuN plus (p=0,054, t(14)=2,09) (obr. 1C). Spoločne tieto údaje ukazujú, že deficit NGF v mozgu vedie k zníženiu hipokampálnej neurogenézy dospelých. Plazmatický kortikosterón je hlavným faktorom pri kontrole neurogenézy dospelých29, a preto, aby sme určili, či je znížená neurogenéza u myší Ngf cKO spôsobená zvýšeným plazmatickým kortikosterónom, zmerali sme bazálnu hladinu plazmatického kortikosterónu u myší WT a cKO. Nezistil sa žiadny významný rozdiel v bazálnom plazmatickom kortikosteróne (p=0.24, t(9)=1.25), čo naznačuje, že účinok Ngf na neurogenézu nie je spôsobený rozdielom v plazmatickom kortikosteróne ( Doplnkový obrázok S1b).

Predchádzajúca práca ukázala, že cholinergné projekcie do hipokampu pochádzajú z bazálneho predného mozgu30. Hodnotili sme teda, či existujú nejaké zmeny v cholinergných septohippokampálnych projekciách u myší Ngf cKO. Naše výsledky z farbenia ChAT ukazujú, že hustota cholinergných vlákien je dramaticky znížená v hipokampe myší Ngf cKO (približne o 76 percent znížená, p < 0,0001,="" t(8)="9,56)" (obr.="" 1d),="" ale="" nie="" iné="" kortikálne="" oblasti,="" ako="" je="" mediálny="" prefrontálny="" kortex="" (p="0.12," t(8)="1.73)" a="" temporálny="" asociačný="" kortex="" (p="0.2," t(16="" )="1.31)" (doplnkový="" obrázok="" s2a,="" b).="" tieto="" údaje="" spolu="" naznačujú,="" že="" ngf="" je="" potrebný="" na="" podporu="" cholinergných="" projekcií="" do="" hipokampu,="" ale="" nie="" do="" kôry.="" ďalej="" sme="" analyzovali="" počet="" cholinergných="" neurónových="" buniek="" vo="" vdb="" broca="" a="" ms,="" odkiaľ="" premieta="" cholinergné="" vlákna="" do="" hipokampu31,="" 32.="" myši="" ngf="" cko="" vykazujú="" malý="" pokles="" (približne="" o="" 20="" percent="" znížený)="" v="" počte="" buniek="" chat="" v="" ms="" a="" vdb="" (p="0,022," t="" (16)="2,52)" (doplnkový="" obrázok="" s2c)="">

Počas delenia mozgového tkaniva sme zistili, že hipokampus cKO myší sa zdal byť malý. Aby sme to potvrdili, vykonali sme sken MRI a naše výsledky potvrdzujú, že Ngf cKO má menšie hipokampy ako WT (p < 0.0001,="" t(12)="12)." aby="" sme="" to="" ďalej="" overili,="" vypreparovali="" sme="" hipokampus="" a="" zmerali="" sme="" hmotnosť="" a="" zistili="" sme,="" že="" hipokampy="" cko="" myší="" majú="" nižšiu="" hmotnosť="" v="" porovnaní="" s="" myšami="" wt="" (p="0,01," t(23)="2." 79)="" (obr.="">

Znížená reakcia na úzkosť a priestorové učenie u myší Ngf cKO

Blokáda endogénneho NGF zhoršuje retenciu priestorovej pamäte21 a narúša cholinergnú signalizáciu, zatiaľ čo delécia cholinergného systému predného mozgu ovplyvňuje úzkosť a priestorové učenie18,33. Aby sme lepšie pochopili účinky Ngf cKO na úzkosť a učenie, podrobili sme myši otvorenému poľu, EPM, testovaniu vo vodnom bludisku a novému rozpoznávaniu objektov.

Delécia Ngf zvýšila správanie podobné úzkosti a znížilo priestorové učenie a pamäť bez ovplyvnenia rozpoznávania nového objektu. V teste open-fifield strávili myši cKO menej v strednej zóne (p=0,04, t(40)=2,09), bez rozdielu v celkovej prejdenej vzdialenosti (p {{7 }}.31, t(40)=1.01) (obr. 2A). V EPM myši cKO strávili viac času v otvorenom ramene (p=0,001, t(40)=3,43), ale nevykazovali významný rozdiel v celkovej vzdialenosti (p {{ 18}}.25, t(40)=1.15) (obr. 2B). V teste vo vodnom bludisku mali myši Ngf cKO horšie výsledky v tréningovej časti (p=0,001, F(1,16)=15,65). O týždeň neskôr sme vykonali test pamäti. Myši boli umiestnené do vodného bludiska, ale s odstránenou platformou. Ngf cKO myši strávili menej času v cieľovom kvadrante (p=0,01, t(16)=2,79) (obr. 2C). Pre nové rozpoznávanie objektov nie je rozdiel v DI (p=0.41, t(20)=0.82). Tieto údaje spolu naznačujú, že NGF hrá úlohu pri sprostredkovaní úzkosti a priestorového učenia/pamäte.

Hippokampálny LTP bol široko považovaný za synaptický model pamäte34 a priame intraseptálne infúzie NGF uľahčujú indukciu LTP21. Aby sme preskúmali účinok NGF na synaptickú plasticitu, merali sme LTP prostredníctvom ex vivo elektrofyziologického záznamu v hipokampálnej dráhe kolaterálov CA1 Schaffer mozgových rezov u myší WT a Ngf cKO. Naše výsledky ukázali, že HFS produkoval trvalé zvýšenie sklonu fEPSP v CA1 neurónoch myší WT a Ngf cKO, ale žiadny rozdiel v LTP (obr. 2D). Po piatich cykloch tetanizačného stimulu HFS sa však STP významne znížil v skupine Ngf cKO (10–15 minút po HFS, p=0,006, t(10)=3,39) ( Obr. 2E). Aby sme ďalej potvrdili účinok na presynaptický prenos, skúmali sme krátkodobú synaptickú plasticitu pomocou PPF. Pomery párových impulzov (PPR) boli podobné medzi myšami Ngf cKO a WT. Pozorujeme však trend zvýšenej PPR zo vzoriek Ngf cKO pomocou 50 ms interstimulačného intervalu (p=0,094, t(18)=1,76) (obr. 2F), čo naznačuje, že presynaptický prenos sa mohol u myší Ngf cKO zmeniť.

Nadmerná expresia Ngf v hipokampe cKO myší zachraňuje priestorovú pamäť, ale nie úzkosť

Aby sme určili, či behaviorálne fenotypy, ktoré sme pozorovali u myší Ngf cKO, možno zvrátiť nadmernou expresiou Ngf v hipokampe, vstrekli sme vírusový vektor AAV-CB (kurací aktín)-Ngf (nadmerná expresia) alebo vírusový vektor AAV-CB-eGFP ( kontrola) do hipokampu myší Ngf cKO. Štrnásť dní po operácii sme všetky myši podrobili behaviorálnemu testovaniu. Výsledky neukazujú žiadny významný rozdiel v teste v otvorenom poli (čas v strednej zóne, p=0,59, t(37)=0,54) a EPM (čas v otvorenom ramene, p {{12} }.76, t(37)=0.29) (obr. 3A, B). V prípade vodného bludiska sa v tréningovej časti nezistil žiadny rozdiel (p=0.54, F(1,15)=0.39). Avšak myši cKO s nadmernou expresiou Ngf strávili viac času v cieľovej zóne v porovnaní s kontrolnou skupinou (p=0,008, t(15)=3,01) (obr. 3C, D). Po zbere mozgového tkaniva sme potvrdili nadmernú expresiu Ngf in situ hybridizáciou a real-time PCR (obr. 3E, F). Zistili sme tiež výrazne vyššiu hladinu cholinergných vlákien v hipokampe myší s nadmernou expresiou Ngf (p=0 0,001, t(10)=4 0,19) (obr. 3G, H). Tieto výsledky naznačujú, že myši Ngf cKO s hipokampálnou nadmernou expresiou Ngf môžu obnoviť cholinergné inervácie a priestorovú pamäť, ale nie úzkosť.

Zhoršená priestorová pamäť u myší s cholinergnou denerváciou v hipokampe

Myši Ngf cKO vykazovali výrazne zníženú inerváciu hipokampálnych cholinergných vlákien, ktorá bola obnovená nadmernou expresiou hipokampálneho Ngf. To korelovalo s obnovením výkonu priestorovej pamäte (bez zlepšenia úzkosti). Preto sme sa zaoberali tým, či vyčerpanie cholinergných vlákien selektívne v hipokampe ovplyvňuje úzkosť alebo priestorovú pamäť vo vodnom bludisku.

Predchádzajúca správa ukázala, že anti-p75NTRSaporín je špecifický cholinergný imunotoxín u myší35. Za týmto účelom sme injikovali anti-p75NTRSaporín (alebo PBS vehikulum ako kontrolu) do hipokampu myší C57. Štrnásť dní po operácii sme tieto dve skupiny myší podrobili behaviorálnemu testovaniu. Nenašli sme žiadny významný rozdiel v teste v otvorenom poli (čas v centrálnej zóne, p=0,5, t(15) {{10}} 0,68) a EPM (čas v otvorenom náručí , p=0,51, t(14)=0,66) (obr. 4A, B). Pre vodné bludisko sa v tréningovej časti nezistil žiadny rozdiel (p=0.49, F(1,14)=0.49); avšak myši s injekciou anti-p75NTRSaporínu do hipokampu strávili menej času v cieľovej zóne v porovnaní s PBS kontrolou (p=0,035, t(14)=2,33) (obr. 4C, D). Po odbere mozgového tkaniva sme pomocou ChAT farbenia potvrdili, že v hipokampe došlo k cholinergnej denervácii (p < 0,0001,="" t(10)="11,85)," čo="" tiež="" ukazuje,="" že="" cholinergné="" vlákna="" v="" kortexe="" boli="" ušetrené="" (p="" {="" {37}}.184,="" t(14)="1.39)" (obr.="" 4e).="" tieto="" výsledky="" ukazujú,="" že="" hipokampálny="" cholinergný="" systém="" je="" potrebný="" na="" udržanie="" funkcie="" priestorovej="" pamäte="" bez="" toho,="" aby="" to="" malo="" vplyv="" na="">

Účinok NGF na priestorovú pamäť závisí od hipokampálneho cholinergného systému

Ďalej sme sa zaoberali tým, či prínos priestorovej pamäte získaný nadmernou expresiou Ngf v hipokampe myší Ngf cKO závisí od intaktnej hipokampálnej cholinergnej inervácie. Do hipokampu myší Ngf cKO sme injikovali anti-p75NTRSaporín a AAV-Ngf vírusové vektory. V kontrolnej skupine sme injikovali vírusové vektory anti-p75NTRSaporín a AAV-eGFP. Štrnásť dní po operácii sme hodnotili úzkosť aj priestorovú pamäť. Výsledky nepreukázali žiadny rozdiel medzi AAV-Ngf a AAV-eGFP v teste na otvorenom poli (čas v stredovej zóne, p=0,6, t(33)=0,51) a EPM (čas v otvorené ramená, p=0,92, t(33)=0,09) (obr. 5A, B). Pokiaľ ide o priestorové učenie a pamäť, neboli medzi skupinami žiadne rozdiely ani v tréningovej časti (p=0,94, F(1,36)=0,004), ani v teste pamäte (p {{ 26}}.44, t(36)=0.77) (obr. 5C, D). Po zbere mozgového tkaniva sme hodnotili hustotu hipokampálnych cholinergných vlákien farbením ChAT a obe skupiny vykazovali vážnu depléciu hipokampálnych cholinergných vlákien, hoci u myší AAV-Ngf bola zistená mierne vyššia úroveň hustoty vlákien v porovnaní s myšami AAV-eGFP (p=0.01, t(12)=2.83) (obr. 5E, F). PCR v reálnom čase potvrdila, že skupina AAV-Ngf dramaticky zvýšila expresiu Ngf v porovnaní s kontrolnou skupinou (p=0,0004, t(12)=4,89) (obr. 5G). Tieto údaje naznačujú, že priaznivý účinok NGF na priestorovú pamäť vyžaduje intaktnú hipokampálnu cholinergnú inerváciu.

Diskusia

V tejto štúdii sme sa rozhodli preskúmať úlohy hipokampálneho NGF a cholinergného systému na úzkosť, učenie a pamäť. Ukázali sme, že myši s deléciou Ngf špecifickou pre mozog (Mgf ckO) vykazujú zvýšenú úzkosť a deficit priestorového učenia. Myši Ngf cKO tiež vykazovali nižšie úrovne neurogenézy dospelých, menší objem hipokampu, zhoršenú STP a dramatickú depléciu cholinergných inervácií v hipokampe. Nadmerná expresia Ngf v hipokampe KO myší s génom Ngf zachránila priestorovú pamäť, ale nezvýšila úzkosť. Je zaujímavé, že sme tiež pozorovali čiastočnú obnovu cholinergnej inervácie v hipokampe po nadmernej expresii Ngf v tejto štruktúre. Aby sme zistili, či účinok NGF na priestorovú pamäť závisí od týchto cholinergných inervácií, najprv sme vyčerpali hipokampálne cholinergné vlákna u myší WT C57 injekciou cholinergného imunotoxínu do hipokampu a potvrdili sme, že hipokampálne cholinergné vlákna podporujú priestorovú pamäť. Ďalej sme na myšiach s pozadím Ngf cKO vyčerpali hipokampálne cholinergné vlákna, ale súčasne sme zvýšili expresiu Ngf pomocou AAV-Ngf, ktoré boli porovnané s podobnými myšami s depléciou cholinergných buniek, ale injikované kontrolou AAV-eGFP. Výsledok ukázal, že opätovná expresia vysokých hladín Ngf v hipokampe nezlepšila priestorovú pamäť. Ukazujeme teda, že obnovujúci účinok NGF v Ngf cKO je závislý od intaktných hipokampálnych cholinergných inervácií a nie od iného mechanizmu.

Ukázalo sa, že exogénne poskytnutý NGF zvyšuje prežitie novonarodených neurónov28 a priestorové učenie36 u hlodavcov, zatiaľ čo blokáda NGF protilátkami zhoršuje priestorovú pamäť21. V súlade s podpornou úlohou NGF v týchto parametroch sme ukázali, že delécia Ngf špecifická pre centrálny nervový systém vykazuje zníženie bunkovej proliferácie a neurogenézy. V testoch správania sme tiež pozorovali zhoršenie úzkosti a priestorového učenia/pamäť.

Predchádzajúca štúdia Ngf KO poskytla dôkazy o tom, že NGF je nevyhnutný pre učenie a pamäť37. Autori však nevykonali test sondy (pamäťová časť) a namiesto toho sa vykonalo spätné učenie. Okrem toho 60 percent hipokampálnych cholinergných vlákien v tejto štúdii stále zostalo u myší Ngff/f–Nes::Cre. V našom modeli myší zisťujeme iba 20 percent cholinergných vlákien, ktoré zostali u myší Ngff/f–Sox1::Cre. Tento nesúlad môže vysvetliť rozdiel v správaní, ktoré sme pozorovali, pretože náš experiment poskytuje dôkaz, že na účinok NGF na priestorovú pamäť sú potrebné hipokampálne cholinergné inervácie. Fenotyp úzkosti, ktorý sme pozorovali u myší Ngf cKO, nemožno zvrátiť nadmernou expresiou hipokampálneho Ngf. Jednou z možností je, že fenotyp úzkosti, ktorý sme pozorovali u myší Ngf cKO, bol dôsledkom inaktivácie Ngf v počiatočnom štádiu. Alternatívne môže NGF pôsobiť mimo hipokampu na moduláciu úzkosti. Pozorujeme však regeneráciu cholinergných vlákien a zlepšenie zachovania priestorovej pamäte u hipokampálnych myší s nadmernou expresiou Ngf a tento výsledok je v súlade s predchádzajúcou štúdiou u starých potkanov38.

Zistili sme, že cholinergná lézia hipokampu neovplyvnila úzkosť, ale zhoršenú priestorovú pamäť. Naše výsledky sú v rozpore s predchádzajúcimi správami, ktoré ukázali mikroinfúziu inhibítora acetylcholínesterázy alebo antagonistov muskarínových M1 a M2 receptorov do hipokampu modulujúceho úzkosť39, 40. Naše výsledky sú však v súlade so správou, ktorá nezistila žiadny účinok na úzkosť po znížení hipokampálnej cholinergnej inervácie, ktorá sa dosiahla injekciou imunotoxínu v MS a VDB Broca41. Pokiaľ ide o priestorové učenie a pamäť, niekoľko štúdií naznačuje, že aktivita ChAT je spojená s priestorovým učením18, 35, 42, 43, ale iné práce nepreukázali žiadny vplyv na priestorové učenie a pamäť po lézii imunotoxínov44, 45. V našom experimente sme zistili, že vyčerpanie hipokampálnej cholinergnej inervácie zhoršuje priestorovú pamäť bez ovplyvnenia akvizície. Tieto nezrovnalosti medzi štúdiami by mohli byť spôsobené rôznymi protokolmi správania, vekom, kmeňom a metódami na inhibíciu cholinergného systému v hipokampe.

Interakcia medzi NGF a cholinergným systémom bola dlho študovaná. Strata TrkA, ako aj delécia Ngf, znižuje cholinergné neuróny v MS a cholinergné inervácie v kortikálnych oblastiach a hip pocampus37, 46. Podobné výsledky boli pozorované v našom modeli s deficitom Ngf, pričom približne 76 percent hipokampálnych cholinergných vlákien bolo denervovaných. Aby sme vedeli, či tieto cholinergné vlákna prispeli k účinku NGF v priestorovom učení, zvýšili sme expresiu Ngf a medzitým sme vyčerpali cholinergné inervácie u myší Ngf cKO prostredníctvom intrahipokampálnej injekcie so zmiešaným AAV-Ngf (alebo AAV-eGFP pre kontrolnú skupinu) a anti-p75NTRSaporín. Výsledky ukazujú, že sme dramaticky zvýšili expresiu Ngf a tiež úspešne vyčerpali tieto cholinergné inervácie. Hoci hustota cholinergných vlákien v skupine AAV-Ngf plus anti-p75NTRSaporín bola o niečo vyššia ako v skupine AAV-eGFP plus anti-p75NTRSaporín, obe skupiny dosiahli 90 percent deplécie cholinergných vlákien v hipokampe v porovnaní s neliečenými WT myšami. Medzi týmito skupinami nebol pozorovaný žiadny rozdiel v priestorovej pamäti, čo naznačuje, že jednoduché zvýšenie expresie Ngf bez cholinergnej inervácie hipokampu nestačí na obnovenie priestorovej pamäte.

Tu používame mozgovo špecifické Ngf podmienené KO myši, aby sme odhalili dôležitosť NGF pri regulácii objemu hipokampu, správania, synaptickej plasticity, neurogenézy a cholinergnej inervácie. Ďalej demonštrujeme, že účinok hipokampálneho NGF na priestorovú pamäť závisí od intaktného cholinergného systému. Génová terapia Ngf bola testovaná u pacientov s Alzheimerovou chorobou, ale v poslednej fáze 2 klinickej štúdie neboli zistené žiadne účinky47. Nedávne údaje z predchádzajúcej klinickej štúdie fázy 1 s identickým chirurgickým postupom, analyzujúcim post-mortem tkanivo, však zistili, že injikovaný AAV-Ngf priamo nezapájal cieľové cholinergné neuróny48. Naše údaje poskytujú dôkaz, že AAV-Ngf môže byť neúčinný bez cholinergnej reinervácie. Naša štúdia v kombinácii s týmto nedávnym post-mortem pozorovaním naznačuje, že je ešte príliš skoro na to, aby sme dospeli k záveru, že terapia NGF je pri Alzheimerovej chorobe neúčinná.

Referencie

1 Levi-Montalcini, R. & Hamburger, V. Selektívne účinky myšieho sarkómu stimulujúce rast na senzorický a sympatický nervový systém kuracieho embrya. J. Exp. Zool. 116, 321-361 (1951).

2. Levi-Montalcini, R. Účinky transplantácie myšieho nádoru na nervový systém. Ann. NY Acad. Sci. 55, 330-344 (1952).

3. Cohen, S., Levi-Montalcini, R. & Hamburger, V. Faktor stimulujúci nervový rast izolovaný zo sarkómov 37 a 180. Proc. Natl Acad. Sci. USA 40, 1014–1018 (1954).

4. Shelton, DL & Reichardt, LF Štúdie o expresii génu beta nervového rastového faktora (NGF) v centrálnom nervovom systéme: úroveň a regionálna distribúcia mRNA NGF naznačujú, že NGF funguje ako trofický faktor pre niekoľko odlišných populácií neurónov . Proc. Natl Acad. Sci. USA 83, 2714 – 2718 (1986).

5. Lee, TH a kol. Lokalizácia nervového rastového faktora, imunoreaktivity trkA a P75 v hipokampálnej formácii a bazálnom prednom mozgu dospelých potkanov. Neuroscience 83, 335-349 (1998).

6. Sobreviela, T. a kol. TrkA-imunoreaktívne profily v centrálnom nervovom systéme: kolokalizácia s neurónmi obsahujúcimi receptor nervového rastového faktora p75, cholínacetyltransferázu a serotonín. J. Comp. Neurol. 350, 587-611 (1994).

7. Mesulam, MM, Mufson, EJ, Wainer, BH & Levey, AI Centrálne cholinergné dráhy u potkana: prehľad založený na alternatívnej nomenklatúre (Ch1- Ch6). Neuroscience 10, 1185 – 1201 (1983).

8. Ehlers, MD, Kaplan, DR, Price, DL & Koliatsos, VE NGF-stimulovaný retrográdny transport trkA v nervovom systéme cicavcov. J. Cell. Biol. 130, 149-156 (1995).

9. Vantini, G. a kol. Nervový rastový faktor indukuje od dávky závislé a dlhotrvajúce zvýšenie aktivity cholínacetyltransferázy v oblasti septa a hipokampu u nezranených potkanov. Acta Neurobiol. Exp. (Vojny.) 50, 323–331 (1990). 10. Hefti, F. Nervový rastový faktor podporuje prežitie septálnych cholinergných neurónov po fimbriálnych transekciách. J. Neurosci. 6, 2155-2162 (1986).

11. Iulia, MF & Cuello, metabolická dysfunkcia rastového faktora AC pri Alzheimerovej chorobe a Downovom syndróme. Trends Pharmacol. Sci. 35, 338 – 348 (2014).

12. Bartus, RT, Dean, RL3rd., Beer, B. & Lippa, AS Cholinergická hypotéza geriatrickej dysfunkcie pamäte. Science 217, 408-414 (1982).

13. Aghourian, M. a kol. Kvantifikácia mozgovej cholinergnej denervácie pri Alzheimerovej chorobe pomocou PET zobrazovania s [(18)F]-FEOBV. Mol. Psychiatria 22, 1531–1538 (2017).

14. Hu, L., Wong, TP, Cote, SL, Bell, KF & Cuello, AC Vplyv Abeta plakov na kortikálne cholinergné a necholinergné presynaptické boutony u transgénnych myší podobných Alzheimerovej chorobe. Neuroscience 121, 421-432 (2003).

15. Case, MA, Wong, TP, De Koninck, Y., Ribeiro-da-Silva, A. & Cuello, AC Starnutie spôsobuje preferenčnú stratu cholinergnej inervácie charakterizovaných neokortikálnych pyramídových neurónov. Cereb. Cortex 12, 329-337 (2002).

16. Capponi, S. a kol. Alzheimerova neurodegenerácia u starých transgénnych myší s antinervovým rastovým faktorom. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 6826 – 6831 (2000).

17. Pentz, R., Iulia, MF, Ducatenzeiler, A., Bennett, DA & Cuello, AC Metabolická dráha NGF ľudského mozgu je narušená v predklinickom a klinickom kontinuu Alzheimerovej choroby. Mol. Psychiatria, 0797-2 (2020).

18. Nilsson, OG a kol. Poruchy priestorového učenia u potkanov so selektívnou imunoléziou cholinergného systému predného mozgu. Neuroreport 3, 1005-1008 (1992).

19. Gage, FH & Bjorklund, A. Cholinergné septálne štepy do hipokampálnej formácie zlepšujú priestorové učenie a pamäť u starých potkanov mechanizmom citlivým na atropín. J. Neurosci. 6, 2837-2847 (1986).

20. Chen, KS a kol. Porušenie jedinej alely génu pre nervový rastový faktor má za následok atrofiu bazálnych cholinergných neurónov predného mozgu a poruchy pamäti. J. Neurosci. 17, 7288-7296 (1997).

21. Conner, JM a kol. NGF je nevyhnutný pre plasticitu hipokampu a učenie. J. Neurosci. 29, 10883-10889 (2009).

22. Takashima, Y. a kol. Neuroepiteliálne bunky dodávajú počiatočnú prechodnú vlnu diferenciácie MSC. Cell 129, 1377-1388 (2007).

23. Tsai, CY, Tsai, CY, Arnold, SJ & Huang, GJ Ablácia hipokampálnej neurogenézy u myší zhoršuje reakciu na stres počas temného cyklu. Nat. komun. 6, 8373 (2015).

24. Crowley, C. a kol. Myši, ktorým chýba nervový rastový faktor, vykazujú perinatálnu stratu senzorických a sympatických neurónov, no vyvíjajú sa bazálne cholinergné neuróny predného mozgu. Cell 76, 1001-1011 (1994).

25. Kwon, EJ, Skalak, M., Lo Bu, R. & Bhatia, SN Neurónom zacielené nanočastice na dodávanie siRNA do traumatických poranení mozgu. ACS Nano. 10, 7926 – 7933 (2016).

26. da Silva, JT, Evangelista, BG, Veneto, RAG, Seminowicz, DA & Chacur, M. Liečba anti-NGF môže znížiť chronickú neuropatickú bolesť zmenou periférnych mediátorov a mozgovej aktivity u potkanov. Správaj sa. Pharmacol. 30, 79 – 88 (2019).

27. Huang, GJ a kol. Ektopická migrácia cerebelárnych buniek spôsobuje nesprávny vývoj Purkyňových buniek a abnormálne motorické správanie u myší bez Cxcr4. PLoS ONE 9, e86471 (2014).

28. Frielingsdorf, H., Simpson, DR, Thal, LJ & Pizzo, DP Nervový rastový faktor podporuje prežitie nových neurónov v dospelom hipokampe. Neurobiol. Dis. 26, 47-55 (2007).

29. Cameron, HA & Gould, E. Neurogenéza dospelých je regulovaná adrenálnymi steroidmi v gyrus dentatus. Neuroscience 61, 203-209 (1994).

30. Bloem, B. a kol. Topografické mapovanie medzi bazálnymi cholinergnými neurónmi predného mozgu a mediálnym prefrontálnym kortexom u myší. J. Neurosci. 34, 16234 – 16246 (2014).

31. Nyakas, C., Luiten, PG, Spencer, DG & Traber, J. Detailné projekčné vzory septálnych a diagonálnych pásových aferentov do hipokampu u potkana s dôrazom na inerváciu CA1 a gyrus dentatus. Brain Res. Bull. 18, 533-545 (1987).

32. Palacios, G., Garcia-Ladona, J. & Codina, M. Ultraštrukturálna štúdia cholinergných neurónov v strednom septálnom jadre a vertikálnej končatine diagonálneho pásu Broca v bazálnom prednom mozgu potkana. J. Chem. Neuroanat. 4, 205-221 (1991).

33. Martinovich, K. a kol. Úloha p75 (NTR), dlhodobá depresia a cholinergný prenos pri úzkosti a zvládaní akútneho stresu. Biol. Psychiatria 71, 75–83 (2012).

34. Bliss, TV & Collingridge, GL Synaptický model pamäte: dlhodobá potenciácia v hipokampe. Nature 361, 31-39 (1993).

35. Berger-Sweeney, J. a kol. Selektívne imunolézie cholinergných neurónov u myší: účinky na neuroanatómiu, neurochémiu a správanie. J. Neurosci. 21, 8164-8173 (2001).

36. Pelleymounter, MA, Cullen, MJ, Baker, MB, Gollub, M. & Wellman, C. Účinky intrahipokampálneho BDNF a NGF na priestorové učenie u starých potkanov Long Evans. Mol. Chem. Neuropathol. 29, 211-226 (1996).

37. Muller, M. a kol. Strata signalizácie NGF-TrkA z CNS nie je dostatočná na vyvolanie kognitívnych porúch u mladých dospelých myší alebo myší stredného veku. J. Neurosci. 32, 14885 – 14898 (2012).

38. Fischer, W. a kol. Zlepšenie atrofie cholinergných neurónov a poškodenia priestorovej pamäte u starých potkanov nervovým rastovým faktorom. Nature 329, 65-68 (1987).

39. Degroot, A. & Treit, D. Chrbtový a ventrálny hipokampálny cholinergný systém modulujú úzkosť v testoch plus-bludisko a šokových sondách. Brain Res. 949, 60-70 (2002).

40. File, SE, Gonzalez, LE & Andrews, N. Endogénny acetylcholín v dorzálnom hipokampe znižuje úzkosť prostredníctvom pôsobenia na nikotínové a muskarínové1 receptory. Správaj sa. Neurosci. 112, 352-359 (1998).

41. McHugh, SB a kol. Deplécia acetylcholínu v hipokampe nemá žiadny vplyv na úzkosť, preferenciu priestorovej novosti alebo rozdielnu odmenu za nízku mieru odpovede (DRL) u potkanov. Správaj sa. Neurosci. 129, 491 – 501 (2015).

42. Dunbar, GL, Rylett, RJ, Schmidt, BM, Sinclair, RC & Williams, LR Hipokampálna aktivita cholínacetyltransferázy koreluje s priestorovým učením u starých potkanov. Brain Res. 604, 266-272 (1993).

43. Gil-Bea, FJ a kol. Cholinergná hypofunkcia zhoršuje získavanie pamäte pravdepodobne prostredníctvom hipokampálneho oblúka a downregulácie BDNF. Hippocampus 21, 999–1009 (2011).

44. Fletcher, BR, Baxter, MG, Guzowski, JF, Shapiro, ML & Rapp, PR Selektívna cholinergná deplécia hipokampu šetrí tak behaviorálne indukovanú transkripciu Arc, ako aj priestorové učenie a pamäť. Hippocampus 17, 227–234 (2007).

45. Baxter, MG & Gallagher, M. Intaktné priestorové učenie u mladých aj starých potkanov po selektívnom odstránení hipokampálneho cholinergného vstupu. Správaj sa. Neurosci. 110, 460-467 (1996).

46. ​​Phillips, HS a kol. Záchrana myší s deficitom NGF II: bazálne cholinergné projekcie predného mozgu vyžadujú NGF pre cieľovú inerváciu, ale nie vedenie. Brain Res. Mol. Brain Res. 124, 1-11 (2004).

47. Rafifii, MS a kol. Adeno-asociovaný vírusový vektor (sérotyp 2)-nervový rastový faktor pre pacientov s Alzheimerovou chorobou: randomizovaná klinická štúdia. JAMA Neurol. 75, 834 – 841 (2018).

48. Castle, MJ a kol. Postmortálna analýza v klinickom skúšaní génovej terapie AAV2-NGF pre Alzheimerovu chorobu identifikuje potrebu zlepšeného prenosu vektorov. Hum. Gene Ther. 31, 415 – 422 (2020).