Účinnosť a bezpečnosť pinokembrínu v ovčom modeli pľúcnej fibrózy vyvolanej bleomycínom

Kontakt:tina.xiang@wecistanche.com

Abstraktné

PrimárnyflavonoidPredpokladá sa, že pinocembrín má rôzne medicínske využitie, ktoré súvisí s jeho hláseným antioxidantom,protizápalové, antimikrobiálne a protirakovinové vlastnosti. Niektoré štúdie uvádzajú, že tento flavonoid má antifibrotické účinky. V tejto štúdii sme skúmali, či by pinocembrín bránil fibróze, tlmil zápal a zlepšilpľúcafunkciu vo veľkom zvieracom modeli pľúcnej fibrózy. Fibróza bola indukovaná v dvoch lokalizovaných pľúcnych segmentoch u každej z 10 oviec zúčastnených na štúdii. To sa dosiahlo pomocou dvoch infúzií bleomycínu podávaných bronchoskopicky v dvojtýždňových intervaloch. Ďalší pľúcny segment u tej istej ovce bol ponechaný neošetrený a bol použitý ako zdravá kontrola. Zvieratá boli držané o niečo viac ako 5 týždňov po poslednej infúzii bleomycínu. Pino-cembrín, izolovaný z listov eukalyptu, bol podávaný do jedného z dvoch bleomycínom poškodených pľúcnych segmentov v dávke 7 mg. Táto dávka sa podávala raz týždenne počas 4- týždňov, počínajúc jeden týždeň po poslednej infúzii bleomycínu. Kompliancia pľúc (ako miera tuhosti) sa významne zlepšila po štyroch týždenných podávaniach pinocembrínu do segmentov pľúc poškodených bleomycínom. V bronchoalveolárnej laváži segmentov pľúc s infúziou bleomycínu, ktoré boli liečené pinocembrínom, boli výrazne nižšie počty neutrofilov a zápalových buniek. V porovnaní s pľúcnymi segmentmi poškodenými bleomycínom bez medikamentóznej liečby bolo podávanie pinokembrínu spojené s významne nižším počtom imunopozitívnych CD8t a CD4 plus T buniek v pľúcnom parenchýme. Údaje z histopatologického skóre ukázali, že liečba pinocembrínom bola spojená s významným zlepšením zápalu a celkového skóre patológie. Hydroxyprolínová analýza ukázala, že podávanie pinocembrínu neznížilo zvýšený obsah kolagénu, ktorý bol v tomto modeli indukovaný bleomycínom. Analýzy rezov zafarbených Massonovým trichrómom ukázali, že liečba pinocembrínom významne znížila obsah spojivového tkaniva v pľúcnych segmentoch vystavených bleomycínu v porovnaní s pľúcami s infúziou bleomycínu, ktoré nedostali pinocembrín. Nápadné protizápalové a mierne antifibrotické remodelačné účinky podávania pinocembrínu boli pravdepodobne spojené so schopnosťou zlúčeniny zlepšiť pľúcnu patológiu a funkčnú komplianciu v tomto zvieracom modeli pľúcnej fibrózy.

Kliknutím získate ďalšie informácie

Úvod

Primárnyflavonoid, pinocembrín, bol identifikovaný a izolovaný z mnohých rastlinných druhov. Predpokladá sa, že táto bioaktívna molekula má rôzne medicínske využitie, ktoré súvisí s jej hláseným antioxidantom,protizápalové, antimikrobiálne a protirakovinové vlastnosti [1-7]. Dôležité je, že pinocembrín má antifibrotické vlastnosti na mnohých rôznych zvieracích modeloch ochorenia. Napríklad pinocembrín znižuje ventrikulárnu fibrózu [8] na potkanom modeli depresie a znižuje atriálnu fibrózu na potkanom modeli infarktu myokardu [9]. Podobne v experimentálnom modeli fibrózy pečene vyvolanej chloroformom na potkanoch perorálne podávanie pinocembrínu znížilo expresiu kolagénu a alfa-SMA (používaného ako marker diferenciácie myofibroblastov) ako miery fibrózy [10]. Nedávna štúdia preukázala

Pinocembrín zmierňuje bleomycínom indukovanú kožnú fibrózu u myší a potláča proliferáciu, migráciu a inváziu keloidných fibroblastov a myších primárnych dermálnych fibroblastov in vitro [11]. Pinocembrín indukoval tieto antifibrotické účinky prostredníctvom downregulácie signálnych dráh NF-x a TGF- 1/Smad [10,11].

Vzhľadom na známe antifibrotické účinky pinocembrínu sme sa zamerali na zistenie, či by pinocembrín bránil fibróze a zlepšovalfunkcie pľúcna veľkom zvieracom modeli pľúcnej fibrózy. Fyziologicky a farmakologicky relevantný model pľúcnej fibrózy bol vyvinutý ako prostriedok na skúmanie základného mechanizmu (mechanizmov) ochorenia pre idiopatickú pľúcnu fibrózu (IPF) [12,13]. Bol tiež užitočný na testovanie nových spôsobov liečby pľúcnej fibrózy [14-16].

Idiopatická pľúcna fibróza (IPF) je devastujúce chronické ochorenie pľúc charakterizované progresívnym zjazvením pľúc v dôsledku bujnej akumulácie extracelulárnej matrice (ECM) v pľúcnom parenchýme [17]. Prognóza IPF je veľmi zlá, iba 3-5 rokov mediánu prežívania pacientov po diagnóze [18]. Súčasné dostupné farmakologické liečby sú obmedzené na pirfenidón a nintedanib, lieky, u ktorých sa preukázalo, že len spomaľujú progresiu ochorenia bez toho, aby ho zastavili. Okrem toho existujú významné nepriaznivé vedľajšie účinky spojené s týmito dvoma liekmi. Preto existuje neuspokojená potreba nových účinných spôsobov liečby tohto stavu.

Cieľom tejto štúdie bolo zhodnotiť terapeutickú účinnosť a bezpečnosť pinocembínu na ovčom modeli pľúcnej fibrózy vyvolanej bleomycínom vyvinutom v našom laboratóriu(12). Konkrétne sa uskutočnila štúdia, aby sa zistilo, či lokálne podanie pinocembínu do pľúc významne zmiernilo fibrózu, zápal a histopatológiu v špecifických pľúcnych segmentoch po indukcii fibrózy bleomycínom. Dôležité je, že sme určili, či lokálne podávanie pinocembrínu významne zlepšilo fyziologickú funkciu špecifických pľúcnych segmentov s fibrózou vyvolanou bleomycínom.

Materiály a metódy

Indukcia fibrózy v segmentoch ovčích pľúc

V tejto štúdii sme použili celkovo 10 oviec. Fibrózu sme indukovali v dvoch pľúcnych segmentoch každej ovce podobným spôsobom ako v našich predchádzajúcich štúdiách [12,13]. Použitím tohto zavedeného postupu (pozri podrobnosti nižšie) bola fibróza obmedzená na malé, izolované oblasti v pľúcach, pričom zostávajúcich 90-95 percent zdravých nepostihnutých pľúc vykonávalo normálnu respiračnú funkciu.

Všetky ovce v štúdii boli vystavené 2 jednotlivým dávkam bleomycínu (3 jednotky) na pľúcny segment s odstupom 2 týždňov a zvieratá boli držané niečo viac ako 5 týždňov po poslednej dávke bleomycínu. Postup podávania zahŕňal vloženie bronchoskopu do pľúcnych segmentov v pravých a ľavých pľúcach a potom pomaly infúziou cez port na biopsiu bronchoskopu bleomycín do dvoch segmentov, ako je znázornené na obr.

Načasovanie infúzií bleomycínu, odber vzoriek krvi, odber vzoriek bronchoalveolárnej laváže a testovanie funkcie pľúc a aplikácia pinocembrínu sú podrobne uvedené v Eig2. Všetky experimentálne postupy na zvieratách boli schválené Etickou komisiou pre zvieratá Univerzity v Melbourne (ID číslo schválenia pre etiku zvierat: 2015209.1). Tieto experimentálne postupy a časové harmonogramy spojené s prácou na zvieratách boli navrhnuté tak, aby zmiernili a minimalizovali utrpenie oviec použitých v štúdii. Najmä počet bronchoskopických výkonov bol znížený na nevyhnutné minimum, čo by umožnilo úspešnú interpretáciu údajov.

Izolácia a štrukturálne potvrdenie pinocembrínu

Pinocembrín bol purifikovaný z metanolových extraktov listov zozbieraných z trojročného Eucalyptus pressiana subsp. Sadenice pressiana boli pestované na experimentálnom pozemku v kampuse University of Melbourne Dookie (36° 23'3"S, 145° 42'52"E). Semená zakúpené od Nindethana Seed Company (King River, Austrália) boli zozbierané z Woodenellup, Západná Austrália a sadenice boli vypestované a presadené na pozemok, ako je opísané v [19]. Vzorky listov sa sušili v sušiarni pri 5{{40}} stupňoch počas 48 hodín a potom sa rozomleli na jemný prášok pomocou mlynčeka IKA MF10 vybaveného sitom 1 mm. Rozomleté ​​tkanivo (100 g) sa umiestnilo do celulózových náprstok Kinesis XK (Antylia Scientific, Chicago, USA) a podrobilo sa Soxhletovej extrakcii so 100 percentným MeOH (200 ml) počas 8 hodín. MeOH extrakty sa potom skoncentrovali na približne 50 ml použitím rotačnej odparky. Alikvóty koncentrovaných extraktov (2 ml) sa podrobili bleskovej chromatografii na systéme Revelers X2 (Buchi AG, Flawil, Švajčiarsko) vybavenom 12g patrónou FlashPure C18 RP-WP (Buchi). Použitým rozpúšťadlovým systémom bol gradient acetonitrilu (MeCN) a vody z 30-100 percent MeCN počas 5 minút s ekvilibračným časom 1 minúta (obr. S1). Frakcia obsahujúca pinocembrín bola detegovaná pri 283 nm a zozbieraná. Frakcie z viacerých Flash cyklov sa spojili, MeCN sa odstránil rotačným odparovaním a pinocembrín sa vysušil lyofilizáciou. Štruktúra pinocembrínu bola potvrdená pomocou ESI-LCMS a NMR spektroskopie, ako je opísané v [19] s porovnaním s komerčným štandardom (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA). Pinocembrín: Svetložlté kryštály z MeCN/H, O.UVXmax MeCN（nm）∶ pás-1325 nm, pás-II289 nm. 'H NMR）600 MHz,CDCI）∶55,36（1H,dd,J13,0,3,0 Hz,H-2）,52,76）(1H,dd,J17,1,3,1Hz,H{ {51}}a）,δ3,02（1H,dd,J17,1,13,1 Hz,H-3b）,δ5,92（1H,d,2,2Hz,H-6）, δ5,94（1H,d,2,2Hz,H-8）.ESI-MS（fragmentor 150V,Skimmer 65V)m/z(rel. int. percentá):255,0673([MH],100),213,0565 ([M-42-H],19), 151,0037([M-104-H],16), 257,0811([M plus H],100), 153,0167([M-104 plus H],2). Čistota izolovaného pinocembrínu založená na hmotnosti bola kvantifikovaná na minimálne 96 percent pomocou HPLC-PDA v porovnaní s komerčným štandardom (obr. S2A a S2B).

Podávanie pinocembrínu do segmentov ovčích pľúc

Každý týždeň dávkovacieho režimu bolo 7 mg pinocembrínu podaných infúziou do jedného kaudálneho pľúcneho segmentu u každej ovce podstupujúcej test (obr. 1). Táto hmotnosť dávky pinocembínu bola založená na predtým publikovanej štúdii, ktorá ukázala, že 50 mg pinocembrínu na kg telesnej hmotnosti bola najúčinnejšia dávka na zlepšenie symptómov ochorenia v tomto zvieracom modeli [20]. Dávka 7 mg pinocembrínu umožnila skutočnosť, že len približne 150 g pľúcneho segmentu na ovcu sa ošetrilo pri ~ 50 mg/kg. Bioaktívna látka bola rozpustená v 10 percentách DMSO a podávaná raz týždenne počas štvortýždňového obdobia, ako je znázornené na obr. 2. Na účely kontroly sa použil pľúcny segment v protiľahlých pľúcach ako bleomycín-pozitívny, bez liečiva, kontrola 1. Bioaktívne molekuly vo vehikule boli dodávané ako 5 ml infúzie cez bioptický port bronchoskopu. Všimnite si, že na vynulovanie akýchkoľvek malých rozdielov (napr. fyziologických alebo anatomických atď.) medzi ľavými a pravými pľúcami boli infúzie pinocembínu náhodne rozdelené medzi ľavý a pravý kaudálny segment pľúc. Polovica zvierat (n=5 oviec) dostala pinocembrín do pravých chvostových segmentov pľúc, zatiaľ čo druhá (n=5 oviec) dostala pinocembrín do ľavých chvostových segmentov pľúc. Pravý stredný pľúcny segment bol ponechaný neošetrený a použitý pre zdravé pľúcne kontrolné tkanivo, z ktorého sa odobrali vzorky pri pitve (obr. 1).

Postupy odberu vzoriek bronchoalveolárnej laváže

Pre každý z bronchoalveolárnych (BAL) odberov vzoriek v časových bodoch uvedených na obrázku 2 bol endoskop manipulovaný do špecifického segmentu pľúc na odber vzoriek, zvyčajne prechádzajúceho cez približne 3 až 4 vetvy dýchacích ciest. Pri odbere vzoriek BAL sa 10 ml sterilného fyziologického roztoku podávalo infúziou cez bioptický port endoskopu do špecifického pľúcneho segmentu a potom sa odoberalo do injekčnej striekačky cez ten istý port. Týmto postupom sa získalo 3 až 5 ml tekutiny BAL. Metóda odberu vzoriek odoberala bunky na analýzy z malých dýchacích ciest a alveolárnych lúmenov špecifického segmentu pľúc, kam bol navigovaný bronchoskop. Bunky BAL z každého segmentu boli centrifugované na sklenených podložných sklíčkach a zafarbené na diferenciálne počítanie zápalových buniek pomocou Hem-Quik, ako už bolo opísané [13].

Testovanie a analýzy funkcie pľúc

Pľúcna funkcia bola meraná v opísaných pľúcnych segmentoch v časových bodoch uvedených na Obr. 2. Pľúcna funkcia bola hodnotená vo všetkých testovaných pľúcnych segmentoch (ľavý a pravý chvostový lalok a stredný lalok u každej ovce). Funkčná kapacita pľúcnych segmentov bola meraná pomocou endoskopu publikovaným postupom [12,13]. Parameter funkcie pľúc hodnotený v tejto štúdii sa označoval ako poddajnosť v pľúcnom segmente (skrátene Cseg). Vo všeobecnosti je poddajnosť meradlom toho, aké ľahké je nafúknuť pľúca. Zle poddajné pľúca sa označujú ako stuhnuté pľúca, ktoré sa zvyčajne ťažšie nafukujú.

Odber krvi

Plná krv sa odobrala na začiatku pred indukciou fibrózy a na konci experimentu pred eutanáziou experimentálnych zvierat, ako je znázornené na obr. 2, odberom krvi z jugulárnej žily do skúmavky obsahujúcej heparín. Krv bola spracovaná na analýzu krvného obrazu.

Izolácia a analýza pľúcneho tkaniva

Ovce boli usmrtené o niečo viac ako 5 týždňov po poslednej dávke bleomycínu (začiatok týždňa 12), ako je uvedené na obr. Eutanázia bola vyvolaná predávkovaním barbiturátmi podanými IV v ml na 2 kg telesnej hmotnosti podľa odporúčania výrobcu (Lethabarb, Virbac Animal Health Pty Ltd. Po eutanázii sa vybrali pľúca a identifikovali sa cielené segmenty pľúc a opatrne sa vyrezali z okolitého prostredia Jednotlivé segmenty sa potom nafúkli zmesou 1:1 OCT (Optimal Cutting Temperature, Tissue-Tek) a sterilného roztoku PBS pod tlakom približne 20 cm/H, O[13]. Niekoľko sériových priečnych rezov nafúknutý segment bol fixovaný v 10 percentnom neutrálnom pufrovanom formalíne a spracovaný v parafíne na histopatologické hodnotenie.Zostávajúce pľúcne rezy boli vložené do OCT a zmrazené v kryo-formách na hliníkových člnoch plávajúcich na tekutom dusíku.

Rezy tkaniva zaliateho parafínom （5 μm） boli zafarbené hematoxylínom a eozínom Y (H&E) na všeobecnú histológiu a farbením Massonovým trichrómom na identifikáciu zmien obsahu kolagénu v pľúcnom parenchýme.

Imunohistochémia

Imunohistochemická lokalizácia CD4* a CD8 T lymfocytov bola vykonaná na zmrazených rezoch. Rezy pľúcneho tkaniva （5 μm） boli fixované ľadovo studeným etanolom; endogénne peroxidy boli blokované pomocou H, O, roztoku a rezy boli potom inkubované s primárnymi protilátkami (monoklonálna myšacia anti CD4 (čistá) a monoklonálna myšacia anti CD8 (čistá)) vo vlhkej komore počas 2 hodín pri teplote miestnosti. Po inkubácii s primárnymi protilátkami

rezy sa potom trikrát premyli PBS a inkubovali sa so sekundárnou protilátkou (králičia antimyšia IgG(HRP)(ab6728)) (1:100; Abcam, Melbourne, Austrália) počas 1 hodiny pri teplote miestnosti. Na kontrolu špecifickosti boli počas IHCrun zahrnuté izotypové kontroly s použitím biologicky irelevantnej protilátky SBU-3 rovnakého izotypu. Rezy boli kontrastne zafarbené Mayerovým hematoxylínovým roztokom počas 20 sekúnd. Komplex antigén-protilátka sa vizualizoval 3,3'-diaminobenzidínom. Nakoniec boli rezy dehydratované etanolom, vyčistené v xyléne a pripevnené do DPX.

Histopatologické skóre

Histopatológia pľúcneho parenchýmu bola hodnotená pomocou semikvantitatívneho skórovacieho systému, ako už bolo opísané [12,13]. Stručne, histologické sklíčka boli všetky zaslepené, takže posudzovateľ nepoznal liečené skupiny. Pre každý rez zafarbený H&E sa klasifikovalo 10 po sebe idúcich, neprekrývajúcich sa polí pri 200-násobnom zväčšení na základe hodnotiacich kritérií pre fibrózu, zápal a celkové skóre patológie, ako už bolo uvedené [12,13]. Oblasti boli vybrané mimo veľkých dýchacích ciest a veľkých krvných ciev. Skóre zo všetkých desiatich polí sa potom spriemerovalo, aby sa získali reprezentatívne skóre pre parametre hodnotené v segmente pľúc.

Analýza koncentrácie kolagénového proteínu pomocou hydroxyprolínového testu sa použila na extrapoláciu obsahu kolagénu a koncentrácie každého segmentu, ako už bolo opísané (4, 5). Stručne, zmrazené pľúcne tkanivá z každého segmentu boli lyofilizované na suchú hmotnosť, hydrolyzované v 6M HCl a hodnotený na obsah hydroxyprolínu meraním absorbancie rekonštituovaných vzoriek (v 0,1M HCl) pri 558 nm pomocou Beckmanovho prístroja. DU-64 spektrofotometer (Beckman Coulter Inc, Brea, CA). Obsah hydroxyprolínu bol stanovený zo štandardnej krivky trans-L-hydroxy-L-prolínu (Sigma-Aldrich). Obsah kolagénu sa extrapoloval vynásobením meraní hydroxyprolínu číslom 6,94 (na základe hydroxyprolínu, ktorý predstavuje ~14,4 percenta aminokyselinového zloženia kolagénu vo väčšine tkanív [21]) a potom sa vyjadril ako podiel suchej hmotnosti tkaniva, čím sa získala koncentrácia kolagénu (ktorá bola vyjadrená v percentách).

Analýza obsahu spojivového tkaniva na posúdenie stupňa fibrózy bola kvantifikovaná hodnotením zmien v celkovom obsahu spojivového tkaniva v parenchýmovom tkanive s použitím skôr opísanej metódy [13]. Na uskutočnenie tejto analýzy sa parafínové rezy ovčích pľúcnych tkanív zafarbili pomocou Massonovho trichrómového farbenia, ktoré farbí spojivové tkanivo na modro. Následne sa pomocou digitálnej kamery spojenej s mikroskopom a počítačom zachytili obrázky Massonovej trichrómom zafarbenej časti pľúc. Náhodne bolo zachytených desať polí pri 400-násobnom zväčšení s výnimkou veľkých krvných ciev a priedušiek. Snímky sa potom analyzovali pomocou Image-Pro Plus (verzia 6.3 pre Windows, Media Cybernetics, Bethesda, Maryland, USA) s použitím nástroja na výber farieb na meranie plochy modro sfarbených tkanív (kolagén a iné spojivové tkanivá) v každom poli. z pohľadu. Hodnoty pre každý z desiatich obrázkov sa potom spriemerovali pre každú snímku. Frakcia modro sfarbenej plochy tkaniva bola vyjadrená ako percento na celkovú plochu poľa (percento modro sfarbenej plochy tkaniva na celkovú plochu poľa). Zachytenie obrazu a analýza sa uskutočňovali zaslepeným spôsobom na kódovaných sklíčkach.

Štatistická analýza

Štatistická analýza sa uskutočnila s použitím GraphPad Prism pre Windows Verzia 5.01 (Graph-Pad Software Inc., La Jolla, CA, Spojené štáty americké). Parametre boli hodnotené pre Gaussovu hodnotu

distribúcia pomocou D'Agostinovho normality a Pearsonovho omnibusového testu. Pre parametrické údaje sa vykonali párové dvojstranné t-testy na porovnanie medzi segmentmi pľúc, ktorým bol podávaný bleomycín iba s kontrolnými segmentmi s infúziou fyziologického roztoku, a segmentmi pľúc, ktoré dostávali infúziu bleomycínu plus pinocembrín. Pre údaje, ktoré nespĺňali predpoklady pre Gaussovu distribúciu, sa použil Wilcoxonov test párov so znamienkom. Vo všetkých prípadoch bola p-hodnota menšia ako 0,05 definovaná ako významný rozdiel. Všetky hodnoty sú uvedené ako priemer (± SEM).

Výsledky

Zdravie zvierat a bezpečnosť podávania pinocembrínu

Zdravotné kontroly sa rutinne vykonávali počas liečebných období a skúšania až do eutanázie. Cieľom bolo uistiť sa, že liečba pinocembrínom nespôsobuje u oviec podstupujúcich test žiadne nežiaduce zdravotné problémy alebo nepriaznivé vedľajšie účinky. Všetky zvieratá zostali zdravé počas obdobia liečby pinocembrínom (týždeň 8 až týždeň 12, obr. 2). Počas tohto obdobia zvieratá naďalej priberali na váhe v očakávanom normálnom rozsahu pre tieto ovce, mali normálny počet bielych krviniek a nevyskytli sa žiadne iné nepriaznivé zdravotné účinky.

Podávanie pinocembrínu zlepšuje pokles funkcie pľúc spojený s rozvojom pľúcnej fibrózy vyvolanej bleomycínom

Obrázok 3 zobrazuje funkciu pľúc rôznych segmentov pľúc po liečbe pinocembrínom raz týždenne počas štyroch týždňov. Meraný parameter funkcie pľúc bola poddajnosť v lokálnych pľúcnych segmentoch a označuje sa ako segmentálna poddajnosť (Cseg). Vo všeobecnosti nižšie úrovne poddajnosti znamenajú horšiu funkciu v segmente pľúc (tj ťažšie sa nafúkne a pľúca sú tuhšie). Ako sa očakávalo, pľúcne segmenty, ktoré dostali poškodzujúcu látku bleomycín samotný, bez pinocembrínu, mali významne nižšiu priemernú segmentálnu poddajnosť ako neošetrené zdravé kontrolné pľúcne segmenty (obr. 3A). Pľúcne segmenty, ktoré dostali poškodzujúce činidlo bleomycín s podávaním pinocembrínu, mali vyššiu priemernú segmentálnu poddajnosť, ktorá sa významne nelíšila od neošetrených zdravých kontrolných pľúcnych segmentov (obr. 3A). Ďalším použitým hodnotením funkcie pľúc bola percentuálna zmena v súlade s východiskovou hodnotou (Eig 3C). Tým sa merala zmena v súlade od začiatku štúdie (pred terapiou bleomycínom a pinocembrínom) až po ukončenie konečnej liečby pinokembrínom. Hodnotenie ukázalo, že kompliancia v pľúcnych segmentoch liečených pinocembrínom sa významne zlepšila po podávaní pinocembínu raz týždenne počas 4-týždňového liečebného obdobia (obr. 3C).

Podávanie pinocembrínu znižuje akumuláciu zápalových buniek vyvolanú bleomycínom v tekutine BAL

Obrázok 4 ukazuje údaje o bunkách BAL po infúznom ošetrení pinocembrínom raz týždenne počas 4-týždňového liečebného obdobia. Bunky BAL sa odobrali z pľúcnych segmentov počas 12. týždňa pokusu, dva dni predtým, ako boli ovce vyradené. Počty buniek hodnotené v tekutine BAL boli samotné neutrofily a súčet hlavných zápalových buniek, ktoré zahŕňali neutrofily, eozinofily a lymfocyty. Ako sa očakávalo, zdravé kontrolné pľúcne segmenty, ktoré neboli liečené, mali relatívne nízky počet zápalových buniek v tekutine BAL (obr. 4).

Na rozdiel od toho segmenty pľúc poškodené bleomycínom bez pinocembrínu mali významne vysoký počet neutrofilov a iných zápalových buniek v tekutine BAL v porovnaní so zdravými kontrolnými segmentmi (Eig 4). Pľúcne segmenty, ktoré dostávali poškodzujúce činidlo bleomycín a boli ošetrené pinocembrínom, vykazovali významne nižší počet neutrofilov a zápalových buniek v porovnaní s počtom buniek odobratých zo segmentov pľúc, ktoré dostávali samotný bleomycín bez pinocembrínu (obr. 4).

Účinok pinocembrínu na T bunky pľúcneho parenchýmu

Obr. 5 ukazuje údaje T buniek po štyroch infúznych ošetreniach pinocembrínom podávaným raz týždenne. T bunky sa hodnotili v parenchýme rozdielne ošetrených segmentov pľúc, z ktorých sa odobrali vzorky post mortem (12. týždeň). Ako sa očakávalo, zdravé kontrolné pľúcne segmenty, ktoré neboli liečené, mali relatívne nízke počty CD8t a CD4* T buniek v pľúcnom parenchýme (obr. 5).

Naopak, segmenty pľúc poškodené bleomycínom bez liečby pinocembrínom mali významne vyšší počet CD8 a CD4* T buniek v pľúcnom parenchýme v porovnaní so zdravými kontrolnými segmentmi (Eig 5). Pľúcne segmenty, ktoré dostali škodlivé činidlo bleomycín a ktoré boli ošetrené pinokembrínom, vykazovali výrazne nižšie počty CD8t a CD4 plus T buniek v pľúcnom parenchýme v porovnaní s počtom buniek odobratých z pľúcnych segmentov, ktoré dostávali samotný bleomycín bez pinocembrínu (Eig 5 ).

každý testovaný parameter (Eig⑥). Dôležité je, že segmenty pľúc, ktoré dostávali poškodzujúcu látku bleomycín a mali liečbu pinokembrínom, mali nižšie priemerné skóre pre každý hodnotený parameter (Eig ⑥). Liečba pinocembrínom významne znížila zápalové a celkové skóre patológie v porovnaní so segmentmi, ktoré dostávali iba infúziu bleomycínu (obr. 6). Zatiaľ čo segmenty pľúc, ktoré dostali infúziu bleomycínu a pinocembrínu, mali nižšie skóre fibrózy v porovnaní so segmentmi, ktoré dostali iba infúziu bleomycínu, rozdiel nebol štatisticky významný (obr. 6).

Účinky pinocembrínu na obsah spojivového tkaniva

Mikroskopické pozorovania Massonových rezov zafarbených trichrómom ukázali, že liečba pinocembrínom znížila množstvo spojivového tkaniva, ktoré bolo vyvolané infúziou bleomycínu (obr. 7A). EigZB ukazuje údaje pre percento plochy spojivového tkaniva zafarbenej Massonovou trichrómom po štyroch ošetreniach pinocembrínom raz týždenne. Dáta na obrázku 7B ukázali, že liečba pinocembrínom významne znížila percento modrého zafarbenia v pľúcnych segmentoch vystavených bleomycínu v porovnaní s pľúcami s infúziou bleomycínu, ktoré nedostali liečbu pinocembrínom (obr. 7B). Obr. ZC ukazuje údaje pre hydroxyprolínový test na obsah kolagénu po štyroch týždenných ošetreniach pinocembrínom. Údaje na obr. 7C boli zozbierané od všetkých 10 zvierat v teste a ukázali, že infúzia bleomycínu samotná (bez pinocembrínu) významne zvýšila koncentráciu kolagénového proteínu v porovnaní s príslušnými meraniami zo zdravých pľúcnych kontrolných segmentov, ktoré nedostali ani bleomycín, ani pinokembrín. Podávanie pinocembrínu však neznížilo zvýšenie koncentrácie kolagénu vyvolané bleomycínom (obr. 7C).

Diskusia

Táto štúdia využívala fyziologicky a farmakologicky relevantný model oviec pre pľúcnu fibrózu [12,13] na zistenie účinnosti pinocembrínu. Celkovo sme zistili, že liečba pinocembrínom bola účinná pri zmierňovaní experimentálne vyvolanej pľúcnej patológie a nespôsobila žiadne nežiaduce účinky na zdravie u všetkých desiatich oviec podstupujúcich test.

každý testovaný parameter (obr.⑥). Dôležité je, že segmenty pľúc, ktoré dostávali poškodzujúcu látku bleomycín a mali liečbu pinokembrínom, mali nižšie priemerné skóre pre každý hodnotený parameter (Eig ⑥). Liečba pinocembrínom významne znížila zápalové a celkové skóre patológie v porovnaní so segmentmi, ktoré dostávali iba infúziu bleomycínu (obr. 6). Zatiaľ čo segmenty pľúc, ktoré dostali infúziu bleomycínu a pinocembrínu, mali nižšie skóre fibrózy v porovnaní so segmentmi, ktoré dostali iba infúziu bleomycínu, rozdiel nebol štatisticky významný (obr. 6).

Účinky pinocembrínu na obsah spojivového tkaniva

Mikroskopické pozorovania Massonových rezov zafarbených trichrómom ukázali, že liečba pinocembrínom znížila množstvo spojivového tkaniva, ktoré bolo vyvolané infúziou bleomycínu (obr. 7A). EigZB ukazuje údaje pre percento plochy spojivového tkaniva zafarbenej Massonovou trichrómom po štyroch ošetreniach pinocembrínom raz týždenne. Dáta na obrázku 7B ukázali, že liečba pinocembrínom významne znížila percento modrého zafarbenia v pľúcnych segmentoch vystavených bleomycínu v porovnaní s pľúcami s infúziou bleomycínu, ktoré nedostali liečbu pinocembrínom (obr. 7B). Obr. ZC ukazuje údaje pre hydroxyprolínový test na obsah kolagénu po štyroch týždenných ošetreniach pinocembrínom. Údaje na obr. 7C boli zozbierané od všetkých 10 zvierat v teste a ukázali, že infúzia bleomycínu samotná (bez pinocembrínu) významne zvýšila koncentráciu kolagénového proteínu v porovnaní s príslušnými meraniami zo zdravých pľúcnych kontrolných segmentov, ktoré nedostali ani bleomycín, ani pinokembrín. Podávanie pinocembrínu však neznížilo zvýšenie koncentrácie kolagénu vyvolané bleomycínom (obr. 7C).

Diskusia

Táto štúdia využívala fyziologicky a farmakologicky relevantný model oviec pre pľúcnu fibrózu [12,13] na zistenie účinnosti pinocembrínu. Celkovo sme zistili, že liečba pinocembrínom bola účinná pri zmierňovaní experimentálne vyvolanej pľúcnej patológie a nespôsobila žiadne nežiaduce účinky na zdravie u všetkých desiatich oviec podstupujúcich test.

Účinky pinocembrínu na histopatológiu

Eig6 ukazuje údaje histopatologického skóre po štyroch ošetreniach pinocembrínom raz týždenne. Sledované histopatologické parametre boli zápal, fibróza a celková patológia. Ako sa očakávalo pre normálne zdravé pľúca, kontrolné segmenty pľúc, ktoré boli ponechané neošetrené, mali nízke skóre pre každý hodnotený patologický parameter (obr. 6). Naproti tomu segmenty pľúc poškodené bleomycínom bez liečby pinocembrínom mali významne vysoké priemerné skóre pre

každý testovaný parameter (Eig⑥). Dôležité je, že segmenty pľúc, ktoré dostávali poškodzujúcu látku bleomycín a mali liečbu pinokembrínom, mali nižšie priemerné skóre pre každý hodnotený parameter (Eig ⑥). Liečba pinocembrínom významne znížila zápalové a celkové skóre patológie v porovnaní so segmentmi, ktoré dostávali iba infúziu bleomycínu (obr. 6). Zatiaľ čo segmenty pľúc, ktoré dostali infúziu bleomycínu a pinocembrínu, mali nižšie skóre fibrózy v porovnaní so segmentmi, ktoré dostali iba infúziu bleomycínu, rozdiel nebol štatisticky významný (obr. 6).

Účinky pinocembrínu na obsah spojivového tkaniva

Mikroskopické pozorovania Massonových rezov zafarbených trichrómom ukázali, že liečba pinocembrínom znížila množstvo spojivového tkaniva, ktoré bolo vyvolané infúziou bleomycínu (obr. 7A). EigZB ukazuje údaje pre percento plochy spojivového tkaniva zafarbenej Massonovou trichrómom po štyroch ošetreniach pinocembrínom raz týždenne. Dáta na obrázku 7B ukázali, že liečba pinocembrínom významne znížila percento modrého zafarbenia v pľúcnych segmentoch vystavených bleomycínu v porovnaní s pľúcami s infúziou bleomycínu, ktoré nedostali liečbu pinocembrínom (obr. 7B). Obr. ZC ukazuje údaje pre hydroxyprolínový test na obsah kolagénu po štyroch týždenných ošetreniach pinocembrínom. Údaje na obr. 7C boli zozbierané od všetkých 10 zvierat v teste a ukázali, že infúzia bleomycínu samotná (bez pinocembrínu) významne zvýšila koncentráciu kolagénového proteínu v porovnaní s príslušnými meraniami zo zdravých pľúcnych kontrolných segmentov, ktoré nedostali ani bleomycín, ani pinokembrín. Podávanie pinocembrínu však neznížilo zvýšenie koncentrácie kolagénu vyvolané bleomycínom (obr. 7C).

Účinnosť pinocembrínu na zlepšenie niekoľkých parametrov ochorenia na modeli experimentálneho pľúcneho ochorenia oviec

V súčasnej štúdii sme zistili, že pinocembrín bol schopný zlepšiť niekoľko parametrov ochorenia v modeli pľúcnej fibrózy oviec. Naše hlavné zistenia boli, že podávanie pinocembrínu bolo schopné zlepšiť funkciu pľúc, zmierniť zápal pľúc a znížiť celkové skóre patológie, ktoré bolo vyvolané poškodením bleomycínom. Dôležité je, že štatistické analýzy údajov odhalili, že tieto hodnoty ochorenia sa významne zlepšili v segmentoch pľúc liečených pinocembrínom v porovnaní so zodpovedajúcimi údajmi z segmentov pľúc poškodených bleomycínom a neliečených segmentov pľúc.

Na ovčom modeli pľúcnej fibrózy vyvolanej bleomycínom spôsobuje poškodenie bleomycínom stratu lokalizovanej poddajnosti pľúc (miera tuhosti pľúc) v segmentoch pľúc s infúziou bleomycínu [12-14,16,22,23]. V súčasnej štúdii zistili sme, že liečba pinocembrínom významne zlepšila funkčnú poddajnosť v pľúcnych segmentoch poškodených bleomycínom. To ukázalo, že liečba pinocembrínom v poškodených segmentoch pľúc viedla k tomu, že tieto segmenty fungovali na vyšších úrovniach, ako keby sa neliečili.

V súčasnej štúdii identifikácia zápalových buniek z výplachu pľúc získaných z pľúcnych segmentov ukázala, že liečba pinocembrínom významne znížila počet zápalových buniek, ktoré zaberajú liminálne priestory alveol a malých dýchacích ciest. Hlavným typom zápalových buniek, ktorý bol znížený v tekutine na výplach pľúc, boli neutrofily, ktoré klesli zo 7,4 percenta z celkového počtu buniek BAL v segmentoch pľúc bez liečby bleomycínom na 3,7 percenta v segmentoch pľúc poškodených bleomycínom ošetreným pinocembrínom. Zníženie CD4 a CD8 T buniek v pľúcnom parenchýme spojené s pinocembrínom bolo úplne v súlade so znížením počtu zápalových buniek získaných z výplachu pľúc segmentov pľúc exponovaných pinocembrínu a bleomycínu. CD4 a CD8 plus T bunky sú dôležitými zložkami v bunkových ramenách mnohých imunitných reakcií. Celkovo tieto údaje podporujú názor, že pinocembrín mal v študovanom modeli ochorenia silné protizápalové vlastnosti.

Pokiaľ ide o histopatologické skóre, priemerné skóre zápalu a celkovej patológie sa zlepšilo v poškodených segmentoch pľúc po liečbe pinocembrínom. Dôležité je, že tieto hodnoty boli štatisticky nižšie v poškodených pľúcach liečených pinocembrínom v porovnaní s experimentálne poškodenými pľúcami bez liečby pinocembrínom. Zatiaľ čo priemerné skóre patológie fibrózy bolo nižšie v poškodených pľúcach liečených pinocembrínom v porovnaní s experimentálne poškodenými pľúcami bez liečby pinocembrínom, nedosiahli štatistickú významnosť.

Pretože údaje o skóre patológie fibrózy neboli pre pinocembrín definitívne, hydroxyprolínový test sa uskutočnil na vzorkách tkaniva z rozdielne ošetrených segmentov pľúc. Skúška hydroxyprolínu meria hladinu kolagénu vo vzorke proteínu a je zlatým štandardom na kvantifikáciu hladín fibrózy v tkanivách. Tento test ukázal, že pinocembrín neznížil ukladanie extracelulárneho kolagénu spojeného s poškodením bleomycínom. Massonov trichrómový test (ďalšie meranie, ktoré sa často používa na posúdenie rozsahu fibrózy) ukázalo, že percento modrého sfarbenia (tj miera obsahu spojivového tkaniva) bolo výrazne nižšie v rezoch pľúc vystavených bleomycínu a pinocembrínom v porovnaní s exponovanými bleomycínom. pľúcne rezy, ktoré neboli liečené liekmi. Celkovo možno povedať, že údaje z hydroxyprolínových a Massonových trichrómových testov naznačujú, že pinocembrín mal schopnosť redukovať niektoré proteíny extracelulárnej matrice (ukázané Massonovými údajmi o trichróme), ale nie nevyhnutne kolagén (ako to potvrdzujú údaje o hydroxyprolíne). Celkovo údaje zo skóre fibrózy, Massonovho trichrómu a hydroxyprolínových testov naznačujú, že pinocembrín má len mierne antifibrotické a antiremodelačné vlastnosti.

Už skôr sa ukázalo, že mnohé bioaktívne zlúčeniny majú protizápalové, ako aj antifibrotické vlastnosti prostredníctvom modulácie niekoľkých profibrotických a prozápalových biomarkerov, ako sú TNF, TGF-endotelín-1, IFN-y, interleukíny, VEGF, FGF -2, PDGF MMP-9, TIMP, NF-kB a kolagén-I [24]. Ďalej sa zistilo, že podávanie protizápalových zlúčenín myším modelom pľúcnej fibrózy s infúziou bleomycínu často viedlo k zníženiu fibrotickej patológie. Bolo to tak najmä vtedy, ak sa protizápalové molekuly aplikovali skoro po expozícii bleomycínu počas zápalového (profibrotického) štádia patológie v týchto modeloch [25]. Dôležité však je, že keď sa mnohé z týchto protizápalových molekúl testovali na klinike na liečbu fibrotických stavov, zistilo sa, že sú neúčinné [25]. Na zvieracích modeloch, kde sa zistilo, že pinocembrín účinne spomaľuje fibrózu, ktorá bola indukovaná v iných orgánoch, pinocembrín tiež inhiboval prozápalové cytokíny TNF-c, IL-1 a IL-6 a tlmil zápalové reakcie prostredníctvom depresie NF-K signálnej dráhy 9, 10. Ďalšie štúdie mechanizmu s myšou LPS a bleomycínom modely naznačujú, že TLR4 (toll-like receptor 4) a zápaly sú kauzálne spojené s pinocembrínovou supresiou NF-K zápalovej signalizácie [2]. Rovnako ako u všetkých modelov pľúcnej fibrózy vyvolanej bleomycínom je načasovanie liekovej intervencie rozhodujúce pre určenie relatívneho antifibrotického a protizápalového prínosu liečby [25. Načasovanie liečby pinocembrínom v súčasnej štúdii bolo 7 dní po poslednej infúzii bleomycínu, čo je v tomto modeli na začiatku fibrotickej fázy [12,13]. Hoci bol zápal v tomto časovom bode-7 oveľa nižší, bol stále prítomný, takže nemôžeme vylúčiť, že niektoré slabé antifibrotické účinky pinocembínu boli spôsobené jeho protizápalovými aktivitami.

Predtým sme použili tento ovčí model pľúcnej fibrózy na vyhodnotenie terapeutického potenciálu dvoch ďalších liekov, ktorých výsledky môžu byť užitočné na porovnanie účinkov pinocembrínu zistených v súčasnej štúdii. Testovali sme inhibítor iónového kanála KCa3.1 nazývaného senicapoc [15,16] a na modeli sme skúmali aj účinnosť lieku pirfenidón schváleného FDA[14]. Publikované návrhy štúdie boli v podstate podobné súčasnej štúdii pinocembrínu, pričom každá štúdia použila 10 oviec na skupinu. Obdobia liečby liekom mali podobnú dĺžku, pričom pre každý liek boli štyri až päť týždňov. Hlavným rozdielom bolo, že v štúdiách senicapocu a pirfenidónu sa lieky podávali perorálne, zatiaľ čo pinocembrín sa podával do pľúc do lokálnych segmentov pľúc. Okrem toho celé pľúca v súčasnej štúdii nedostali pinocembrín, zatiaľ čo celé pľúca boli vystavené liečivám v štúdiách s pirfenidónom a senicapocom. Analýzy údajov medzi týmito štúdiami odhaľujú, že úrovne zlepšenia markerov ochorenia pľúcnej kompliancie, celkového skóre patológie a zápalu boli na podobnej úrovni pre pokus s pinocembrínom v porovnaní s inými pokusmi s liekmi uskutočnenými s modelom oviec. Jedným z hlavných rozdielov medzi týmito štúdiami bolo to, že v predtým publikovaných štúdiách podávanie pirfenidónu alebo senicapocu viedlo k významnému zníženiu koncentrácie kolagénového proteínu, ako bolo hodnotené testom hydroxyprolínu [14, 16] Celkovo možno povedať, že porovnanie medzi skúšanými drogy naznačujú, že významné zlepšenie funkcie a patológie pľúc je spôsobené predovšetkým protizápalovými účinkami pinocembrínu a v menšej miere vďaka jeho antifibrotickým účinkom.

V súčasnej štúdii sa zistilo, že štyri 7 mg dávky pinocembrínu podávané do pľúc v týždenných intervaloch boli dobre tolerované a nemali žiadne nežiaduce vedľajšie účinky. To je v súlade s údajmi z randomizovanej dvojito zaslepenej, placebom kontrolovanej štúdie s 58 zdravými pacientmi, ktorá ukázala, že intravenózna injekcia pinocembrínu bola dobre tolerovaná až do 120 mg denne [26]. Štúdia hodnotila jednodávkové aj viacdávkové režimy a zistila, že neexistujú žiadne veľké bezpečnostné obavy, ktoré by bránili akémukoľvek budúcemu klinickému vývoju injekčného podávania pinocembínu [26]. Údaje v súčasnej štúdii ukázali, že priame dodávanie pinocembrínu do pľúc bolo nielen bezpečné a životaschopné, ale podporilo aj názor, že tento flavonoid by mohol byť užitočný pri liečbe mnohých zápalových ochorení pľúc. Astma je dôležitá alergická choroba dýchacích ciest, ktorá by mohla byť prístupná dodávke pinocembrínu do pľúc. Predbežné dôkazy podporujúce antiastmatické účinky pinocembrínu boli preukázané v štúdii, v ktorej intraperitoneálne injekcie pinocembínu inhibovali alergické ochorenie dýchacích ciest u myší [20]. Dalo by sa teda rozumne očakávať, že lokalizované dodávanie pinocembínu výlučne do pľúc bude účinnejšie pri liečbe stavov podobných astme na klinike.

Záver

Záverom možno povedať, že silné a významné údaje odvodené z tejto štúdie boli v súlade s tým, že pinocembrín je bioaktívny a zlepšuje kľúčové parametre ochorenia v prostredí zvieracieho modelu. Nápadné protizápalové a mierne antifibrotické remodelačné účinky podávania pinocembrínu boli pravdepodobne spojené s jeho schopnosťou zlepšiť pľúcnu patológiu a funkčnú komplianciu.