Trojrozmerná architektúra nefrónov v normálnej a cystickej obličke
Mar 17, 2022
pre viac informácií:{0}}
Thomas Blanc1,2,7, Nicolas Goudin3,7, Mohamad Zaidan1,4,7, Meriem Garfa Traore3, Frank Bienaime1,5,Lisa Turinsky1, Serge Garbay1, Clement Nguyen1, Martine Burtinová1, Ge´rard Friedlander1,6, Fabiola Terzi1,8a Marco Pontoglio1,8
1Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale U1151, Centre National de la Recherche Scientifique UMR8253, Université deParis, Institut Necker Enfants Malades, Département « Croissance et Signalisation », Paríž, Francúzsko;2Service de Chirurgie Viscérale etUrologie Pédiatrique, AP-HP, Hôpital Necker Enfants Malades, Paríž, Francúzsko;3Structure Fédérative de Recherche Necker, US{0}}UMS3633, Paríž, Francúzsko; 4Service de Néphrologie-Transplantation, AP-HP, Hôpital Bicêtre, Le Kremlin-Bicêtre, Francúzsko;5Service d'ExplorationsFonctionnelles, AP-HP, Hôpital Necker Enfants Malades, Paríž, Francúzsko; a6Service d'Explorations Fonctionnelles, AP-HP, HôpitalEuropéen Georges Pompidou, Paríž, Francúzsko
KĽÚČOVÉ SLOVÁ: cystickáobličkychoroba;obličky; nefrón; nefronoftízu; čistenie tkaniva
Prekladové vyhlásenie
Metódy čistenia poskytujú jedinečný nástroj na pochopenie toho, ako morfologické zmeny vedú k patologickým následkom.Obličkysú kritické orgány, ktoré udržiavajú telesnú homeostázu prostredníctvom vody, metabolitov a elektrolytov, ktoré zásadne závisia od komplexnej 3-rozmernej štruktúrynefrónovKeď je táto štruktúrna organizácia zmenená, nasleduje renálna patofyziológia. V tejto štúdii sme vyvinuli výkonnú metódu založenú na optickom čistení, multifotónovej mikroskopii a digitálnom sledovaní na štúdiumobličkyna úrovni jedného nefrónu za fyziologických a patologických podmienok. Predovšetkým poskytujeme prvú 3-rozmernú rekonštrukciu polycystickidney v mierke jednéhonefrónov. Túto metódu možno aplikovať na viaceré patologické súvislosti, čo nám umožňuje lepšie pochopiť komplexný proces zhoršovania obličiek a následne vyvinúť cielenejšie terapeutické stratégie
Obličky udržiavajú telesnú homeostázu prostredníctvom svojho komplexu3-rozmerný(3D) štruktúra nefrónu. Keď sa táto štrukturálna organizácia zmení, dochádza k patofyziológii obličiek. Chronickýobličkychoroby sú charakterizované rozvojom renálnych lézií. Je zaujímavé, že patológovia zaznamenali veľkú heterogenitu v distribúcii lézií počas chronických ochorení obličiek.1,2 Či to odráža skutočnosť, že špecifické segmenty nefrónov môžu byť rôzne poškodené, alebo alternatívne, že niektoré nefróny majú rôznu náchylnosť na poranenie ako celok, nie je známe. Na vyriešenie tohto problému je povinné zrekonštruovať 3D (Trojrozmerný) tvarnefrónovv patologických súvislostiach.
Podľa našich vedomostí,nefrónovboli úplne zrekonštruované len pomocou sériových 2D rezov.3–5 Hoci štandardné histologické rezy poskytujú vysoké rozlíšenie, 3Drekonštrukcie sú prácne a ťažko sa získavajú. Je to spôsobené predovšetkým mechanickými deformáciami, ktoré sú nevyhnutným efektom procesu krájania. Okrem toho 3D ( rekonštrukcia z 2D obrázkov neumožňuje priame zobrazovanie 3D štruktúr v celých tkanivách.
Multifotónová mikroskopia zlepšila našu schopnosť detegovať morfologické zmeny v hrubých rezoch. Významným obmedzením je však malá prístupná hĺbka kvôli rozptylu svetla. Minimalizáciou rozdielov v indexe lomu čistiace činidlá dramaticky zlepšili schopnosť snímať hĺbku obrazu.6,7 Napriek skutočnosti, že prvý čistiaci prostriedok bol predstavený pred storočím,8 len nedávno bolo vyvinutých niekoľko čistiacich protokolov, väčšinou pre mozog.9 –17Nedávne štúdie preukázali ich potenciál na zobrazovanie iných pevných orgánov, ako sú pečeň, pankreas aleboobličky.18–26
Polycystickéobličkychoroba, geneticky heterogénna porucha zahŕňajúca mutácie niekoľkých ciliárnych génov, je najčastejším dedičným ochorením obličiek.27,28 Polycystickéobličkyochorenie je charakterizované vývojom cýst, ktoré vedú k úplnej deštrukcii obličky.28 Mikrodisekčné štúdie naznačujú, že cysty sa môžu vyvinúť buď ako „vytlačenie“ segmentu nefrónu, ako pri autozomálnom dominantne polycystickom ochorení obličiek; ako extatická expanzia zberných kanálikov (CD), ako pri autozomálne recesívnych polycystickýchobličkychoroba; alebo výlučne v medulárnych tubuloch, ako pri nefronoftíze (NPHP).27,29 Ako sa však cysty vyvíjajú v 3D (Trojrozmerný) a organizovať sa navzájom a normálne susedné tubuly stále neznáme.
Tu sme spojili optické čistenie s multifotonmikroskopiou, aby sme poskytli nové poznatky o tom, akonefrónovsa formujú a organizujú vo fyziologických podmienkach a ako sa modifikujú počas choroby, ako je cystogenéza. Naše výsledky ukazujú, že existujú 3 typynefrónova že cievy môžu ovplyvňovať priestorovú organizáciu nefrónov. Je zaujímavé, že sme pozorovali, že nefróny majú tendenciu ležať v špecifických rovinách. Neočakávane, keď sme túto techniku aplikovali na myši, zistili sme, že cysty sa vyvinuli iba v špecifických segmentoch nefrónu s vretenovitými cystami zmiešanými s normálnymi tubulmi.
Kliknite naCistanchevedľajšie účinkyna ochorenie obličiek
VÝSLEDKY
Experimentálne nastavenie
Študovať tvar celkunefrónovvo vzťahu k ich prostrediu sme prijali techniku založenú na optickom čistení a multifotónovej mikroskopii (doplnkový obrázok S1A). Porovnaním rôznych protokolov optického čistenia sme zistili, že preobličkybenzylalkohol/benzylbenzoát (BABB) bol najvhodnejší z hľadiska účinnosti (doplnkový obrázok S1B a C a doplnková tabuľka S1).
3D (Trojrozmerný) rekonštrukcia a digitálne sledovanie vyžadujú vysokokvalitné obrázky s vysokým rozlíšením a vysokým pomerom signálu k pozadiu. Zistili sme, že optický signál poskytovaný natívnou fluorescenciou nebol jednotný na rezoch obličiek. Najmä obrázky z medully boli zle kontrastované s nízkym pomerom signálu k pozadiu (doplnkový obrázok S2). Na zlepšenie pomeru signálu k pozadiu sme rezy zafarbili kyselinou periodickou – Schiff (doplnkový obrázok S1D), pretože sme empiricky poznamenali, že toto farbenie spôsobilo vysoký kontrast v tenkých rezoch počas 2-fotónfluorescencie. Signál však nebol rovnomerný v celej hustej farbe kyseliny jodistej – Schiffobličkyrezy (doplnkový obrázok S1E). Preto sme rezy obličiek zafarbili lektínmi spojenými s fluorochrómom: aglutinínom z arašidov a aglutinínom z pšeničných klíčkov, ktoré farbia glomeruly a tubuly, a aglutinínom Griffonia simple I folia, ktorý označuje krvné cievy.30 Je pozoruhodné, že pri kombinácii selektínov sa pomer signálu k pozadiu sa dramaticky zvýšil v celých častiach obličiek s výrazným zlepšením v rovine XY aj v osi z (doplnkový obrázok S1E a doplnkový film S1).
3D vizualizácia segmentu nefrónu
Pre vizualizáciu tvaru celkunefrónov, sledovali sme ich cesty, začínajúce na močovom póle glomerulu a končiace na križovatke CD (doplnkový film S2). Napriek skutočnosti, že použité lektíny globálne viažu všetky nefronsegmenty, všimli sme si, že pri dôkladnej kontrole sa selektíny vyznačovali špecifickým vzorom v spôsobe, akým farbili bazálne alebo luminálne membrány v rôznych nefronzegmentoch. Inými slovami, využili sme stereotypný vzor farbenia lektínom na identifikáciu rôznych segmentov nefrónu. Týmto spôsobom by sme mohli ľahko identifikovať 6 entít: proximálny tubulus (PT), tenkú končatinu (TL) henleloopu (HL), hrubú vzostupnú končatinu (TAL) HL, distálny stočený tubul (DCT), spojovací tubul (CNT), a CD. Prechod medzi PT a TL bol charakterizovaný náhlou stratou typického signálu PT kefového lemu a zmenšením šírky lúmenu, ktoré v TL takmer prakticky chýbalo (obrázok 1a). Naopak, prechod medzi TL a TAL bol charakterizovaný významným zvýšením vonkajšieho tubulárneho priemeru a relatívne konštantnou šírkou lúmenu (obrázok 1b). Vo všetkých nefrónoch bol prechod TAL na DCT systematicky zistený na cievnom póle glomerulu. Tento prechod bol charakterizovaný náhlym zväčšením vonkajšieho tubulárneho priemeru, ktoré bolo spôsobené predovšetkým výrazným zvýšením priemeru lúmenu (obrázok 1c). Prechod medzi DCT a CNT bol charakterizovaný aredukciou v tubulárnom priemere aj v lúmene (obrázok 1d). Napokon, spojenie medzi CNT a kortikálnym CD bolo charakterizované náhlym zvýšením priemeru tubulov aj lúmenu (obrázok 1e). Kvantifikácia týchto morfologických prechodov bola štatisticky významná (obrázok 1f) a jej relevantnosť sa overila farbením špecifickými tubulárnymi markermi (doplnkové obrázky S3–S5 a doplnkový film S3–S5).
Tvar a veľkosť PT sa líšia podľa ich hĺbky
Farbenie tlobličkyrezy nám umožnili sledovať súradnice priestorového vývoja celých segmentov PT. Zaujímavé je, že sme zistili, že ich tvar bol extrémne variabilný a určený polohou ich glomerulov v kortexe. Globálne sme identifikovali 3 vzory. Prvý zodpovedal tomu najpovrchnejšiemunefrónov(SNs) (obrázok 2a; doplnkový film S6), ktorý zaberal najvonkajšiu časť kôry (najvonkajších 30 percent blízko obličkovej kapsuly). Ich stočené časti tvorili kompaktné štruktúry s iba 6 až 7 zákrutami okolo vlastného glomerulu, ktoré zaberali veľmi malé a tesne zbalené priestory. Konvolúcia týchto SN sa skončila dlhými a rovnými pars recta, ktoré zostúpili do drene. Na opačnom konci tohto spektra sme pozorovali druhý vzor nefrónov umiestnených v najhlbšej časti kôry (o 40 percent väčšia vnútorná hĺbka), vedľa drene (juxtamedulárne nefróny [JN]) (obrázok 2a; doplnkový obrázok S6 a doplnkový film S6). Ich PT boli charakterizované počiatočnou krátkou slučkou, ktorá systematicky klesala smerom k papile a potom sa U otočila, aby stúpala smerom k obličkovej kapsule. Na rozdiel od SN boli proximálne stočené tubuly JN charakterizované ako bilaterálne cievky, ktoré sa vyvinuli okolo ich vlastného glomerulu a zaberali veľké, voľne zbalené domény v juxtamedulárnom kortexe. Svinutá časť PT JN mala 10 až 15 závitov, ktoré tvorili veľké domény. Nakoniec tretí vzor zahŕňal nefróny umiestnené v strednej časti kôry (stredné nefróny [MN]) (obrázok 2a; doplnkový film S6). Je zaujímavé, že tieto tubuly mali tvar a priestorovú orientáciu, ktorá predstavovala prechod medzi SN a JN. V skutočnosti obsahovali 8 až 9 závitov s cievkami, ktoré boli väčšie ako SN, ale menšie ako JN. Okrem toho mali MN dlhšie pars recta ako JN. Zaujímavé je, že globálne porovnanie tvarov PT ukázalo, že SN a MN mali homogénny vzor, zatiaľ čo JN boli extrémne heterogénne (doplnkový obrázok S6). Okrem toho priestorová rekonštrukcia viacerýchnefrónov odhalili, že PT sa nikdy neprelínajú (doplnkový film S6), čo naznačuje, že každý nefrón zaberá svoj vlastný individuálny priestor v kôre.
Morfometrické analýzy potvrdili veľké rozdiely vo veľkosti a tvare SN a JN, so stredným aspektom pre MN. PT JN bol viac ako 2-krát dlhší ako PT SN (obrázok 2b); priamosť však bola väčšia v SN ako v JN (obrázok 2c), čo je v súlade s pozorovaním, že tubuly JN boli oveľa kľukatejšie (obrázok 2a; doplnkový obrázok S6).
Obrázok 1|Morfologické kritériá používané na identifikáciu segmentov nefrónov. (a – e) Morfológia rôznych segmentov myší s nefrónovou kontrolou.Nefrónyboli vysledované od močového pólu glomerulu k zbernému kanáliku (proximálny tubul [PT]: tyrkysový; tenké rameno [TL] Henleovej slučky: svetlosivé; hrubé vzostupné rameno [TAL] Henleovej slučky: tmavosivé; distálne stočený tubulus [DCT]: ružový; spojovací tubul [CNT]: žltý; kortikálny zberný kanál [CCD]: oranžový). Šípky označujú priemer rôznych segmentov nefrónu. (pokračovanie)
Obrázok 1|(Pokračovanie) (f) Kvantifikácia vonkajšieho tubulárneho priemeru rôznych segmentov nefrónu. Údaje sú vyjadrené ako priemer±SEM. Analýza rozptylu, po ktorej nasleduje Tukey-Kramerov test: **P < 0.01, ***P < 0,001.
Obrázok 2 |Trojrozmerný(3D) rekonštrukcia proximálneho tubulu odhaľuje 3 rôzne tvary a organizácie. (a) Reprezentatívne 3Drekonštrukčné snímky proximálnych tubulov cez celú kôru obličiek, rozdelené do 3 úrovní (biele čiary) podľa tvaru proximálnych tubulov (PT): povrchová (modrá), stredná (zelená) a juxtamedulárna (červená) kôra, čo zodpovedá vonkajším 30 percentám, stredným 30 percentám a vnútorným 40 percentám kôry. Všimnite si rôzne tvary 3 typovnefrónova najmä dĺžku a tortuozitu juxtamedulárnych tubulov. Tyč {{0}} mm. (b,c) Kvantifikácia (b) dĺžky a (c) priamosti 3 typov proximálnych tubulov. (d) Kvantifikácia objemu glomerulov z každej oblasti kôry. Údaje sú vyjadrené ako priemer SEM. Analýza rozptylu nasledovaná Tukey-Kramerovým testom: juxtamedulárna PT verzus povrchová PT: ###P < 0.001;="" juxtamedulárna="" pt="" verzus="" stredná="" pt:="" ***p="">< 0,001;="" povrchový="" pt="" verzus="" stredný="" pt:="" $$$p=""><>
Obrázok 3 |Trojrozmerný(3D) rekonštrukcia nefrónov odhaľuje 3 rôzne typy nefrónov. (a) Reprezentatívne 3D obrázky celého nefrónu (ľavé panely) od glomerulov po zberný kanál v povrchovej kôre (modrá), stredná kôra (zelená) a juxtamedulárna oblasť (červená) u kontrolných myší. Segmentácia nefrónov (pravé panely) pre 3 rôzne typy nefrónov. Pruh=150 mm. (b) Kvantifikácia vnútornej vzdialenosti medzi 2 ramenami Henleovej slučky pre 3 typy nefrónov. (c) Kvantifikácia dĺžky nefrónu pre (pokračovanie)
Obrázok 3|(pokračovanie) 3 druhynefrónov. (d) Kvantifikácia dĺžky rôznych segmentov nefrónu podľa typu nefrónu. Údaje sú vyjadrené ako priemer±SEM. Analýza rozptylu nasledovaná Tukey-Kramerovým testom: juxtamedulárny nefrón (JN) verzus povrchový nefrón (SN): ###P < 0.001;="" jn="" verzus="" stredný="" nefrón="" (mn):="" *p="">< 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001.="" cnt,="" spojovací="" tubul;="" dct,="" distálny="" stočený="" tubulus;="" pt,="" proximálny="" tubulus;="" tal,="" hrubé="" stúpajúce="" rameno="" henleho="" slučky;="" tl,="" tenký="" člen="" henleho="">
Glomerulárna veľkosť sa mení s hĺbkou
Potom sme analyzovali hĺbku a priemer glomerulov náhodne vybraných z každej z 3 zón. Morfometrické analýzy odhalili, že glomeruly boli umiestnené v priemere 783 a 355 mm od obličkovej kapsuly v JN a SN. Ako už bolo uvedené, pozorovali sme, že veľkosť glomerulov sa líšila podľa ich hĺbky. Najmä glomerulárny objem JN bol 3-krát väčší ako objem SN a MN (obrázok 2d).
3D rekonštrukcia nefrónu
Potom sme sledovali priestorový vývoj celkunefrónovz PT na CNT. Globálny pohľad na ich 3D (Trojrozmerný) rekonštrukcia potvrdila, že tvar nefrónu sa medzi SN, MN a JN líšil (obrázok 3a; doplnkový film S7). Tento rozdiel bol spôsobený najmä štruktúrou PT. Okrem toho sme zistili, že HL má inú 3D priestorovú organizáciu. Najmä TL a TAL boli vzdialenejšie oddelené v JNsthan v SN a MN (obrázok 3b). Morfometrické analýzy odhalili, že JN boli globálne 2-krát dlhšie ako SN (obrázok 3c). Zvýšená dĺžka bola proporcionálne distribuovaná vo všetkých segmentoch, s výnimkou TAL a DCT, ktoré mali tendenciu mať podobnú absolútnu dĺžku vo všetkých typoch nefrónov (obrázok 3d). To naznačuje, že predlžovanie nefrónov je prekvapivo homogénne vzorovaný proces.
Oblúkové cievy ovplyvňujú juxtamedulárnu konvolúciu PT
Ak chcete získať komplexnejší pohľad naobličkyštruktúry, využili sme farbenie Griffonia simplicifoliaagglutinin, čo nám umožnilo vysledovať oblúkovité cievy a ich vetvy do kortikálnych radiatových ciev (obrázok 4a; doplnkový film S8). Zaujímavé je, že sprievodné 3D (Trojrozmerný) rekonštrukcia nefrónov a ciev ukázala, že oblúkové cievy majú tendenciu byť v prekvapivo paralelnej priestorovej organizácii s blízkymi tubulmi. Najmä sme pozorovali, že cesta, po ktorej nasledujú špecifické JN (obmedzené JN), má tendenciu sledovať cestu blízkeho plavidla (obrázok 4b; doplnkový film S9). Je pozoruhodné, že táto zaujatosť (pozorovaná iba v podskupine JNnefrónov) predstavovali veľkú heterogenitu v tvaroch PT (doplnkový obrázok S6). Morfometrické analýzy odhalili, že „obmedzené“ PT boli výrazne dlhšie a viac kľukaté (znížená priamosť) ako „neobmedzené“ (obrázok 4c a d). Stojí za zmienku, že stočené časti SN aj MN boli umiestnené nad oblúkovými nádobami a neboli obmedzené.
Cistanche-chronické ochorenie obličiek
Tubuly majú tendenciu ležať v rovinách
Zaujímavé je, že kontrola 3D (Trojrozmerný) tvarynefrónovnaznačili, že majú tendenciu ležať v rovinách (obrázok 5a; doplnkový film S10). Na kvantifikáciu tohto parametra a na posúdenie možnej štatistickej odchýlky tejto konformácie sme merali všeobecnú tendenciu tubulov ohýbať sa z roviny definovanej ich slučkami. Naše merania ukázali, že v porovnaní so simulovaným modelom náhodnej chôdze generovaným s rovnakým súborom po sebe idúcich nameraných uhlov a dĺžky medzi po sebe idúcimi bodmi (obrázok 5b), tubuly mali tendenciu sa vyvíjať s menšou odchýlkou od roviny (obrázok 5c). To naznačovalo, že trubice obmedzili ich cestu pozdĺž roviny. Pozorované rozdiely boli vysoko štatisticky významné (P <>
3D rekonštrukcia nefrónu odhaľuje špecifický vzor pre vývoj cysty
Aby sme určili, či náš protokol umožňuje sledovanie nefrónov v dezorganizovaných patologických tkanivách, charakterizovali sme tvary a priestorovú distribúciu cýst u jack myší, čo je široko používaný model NPHP a cystickej choroby.31–33 3D snímky ukázali, že napriek vzhľad prominentných cýst, všeobecný 3D (Trojrozmerný) priebeh nefrónov sa významne nelíšil od kontrolných myší (doplnkový film S11). Podobne morfometrické analýzy potvrdili, že globálna dĺžkanefrónov, glomerulárny objem a dĺžka každého segmentu nefrónu boli porovnateľné s tými u kontrolných myší (doplnkový obrázok S7). Je potrebné poznamenať, že kvôli vývoju cysty sme neboli schopní odlíšiť TL od TAL v HL. Všetky nefróny vyvinuli fúzovité cysty (doplnkové filmy S11 a S12). Jedným z najvýraznejších znakov bolo pozorovanie, že fusiformné cystické dilatácie sa vyskytli na viacerých miestach pozdĺž toho istého segmentu nefrónu (doplnkové filmy S12 a S13). Je zaujímavé, že sme pozorovali, že cysty sa nikdy nevyvinuli v PT a HL zostupných končatinách (obrázok 6a; doplnkový film S12). Na rozdiel od toho boli detegované prevažne v HL ascendentných končatinách, DCT, CNT a v hornej časti CD v kontinuite s CNT (obrázok 6a; doplnkový film S12). Najmä sme pozorovali, že DCT, ako aj segmenty CNT, mali mimoriadne zvýšenú pravdepodobnosť vzniku cýst v príslušných vzdialenejších častiach (obrázok 6b). Kvantitatívne morfometrické analýzy 3D rekonštrukčných obrazov odhalili, že celkový objem cysty na nefrón bol obzvlášť vysoký v CNT (obrázok 7a). Okrem toho sme pozorovali, že zväčšenia cysty v HL a DCT boli väčšie v JN ako v SNs a MN (obrázok 7a; doplnkový film S12). Okrem toho výskyt cýst bol významne vyšší u JN ako u iných typovnefrónov(Obrázok 7b). Tiež sme pozorovali, že priemerná glomerulárna vzdialenosť (vypočítaná na najbližších 5 glomerulov) mala tendenciu byť obzvlášť zvýšená u incystických myší, najmä v povrchnejšom kortexe (doplnkový obrázok S8).
Obrázok 4|Plavidlá určujú tvar nefrónu. (a)Trojrozmernýrekonštrukcia architektúry ciev od oblúkovitých ciev po kortikálne lúčovité cievy. Tyč ¼ 200 mm. (b) Reprezentatívne obrázky „neobmedzených“ (horný panel) a „obmedzených“ (spodný panel) juxtamedulárnych proximálnych tubulov. Tyč ¼ 100 mm. (c, d) Kvantifikácia (c) dĺžky a (d) priamosti "neobmedzených" a "obmedzených" juxtamedulárnych proximálnych tubulov. Údaje sú vyjadrené ako priemer±SEM. Mann-Whitney test: "obmedzený" verzus "neobmedzený":*P < 0.05,="" ***p=""><>
3D (Trojrozmerný) rekonštrukcia mnohých cýst odhalila, že boli extrémne variabilné v tvare a objeme (obrázok 6c; doplnkové filmy S11 a S13). V HL ascendentnej končatine mali cysty vretenovitý tvar s malým priemerom. V DCT mali cysty skôr sférický a väčší tvar a boli rozptýlené medzi nedilatovanými tubulmi. Je zaujímavé, že prechod medzi DCT a CNT bol systematicky charakterizovaný normálnou nedilatovanou štruktúrou. Naopak, v CNT sme systematicky pozorovali súvislú dilatovanú cystickú štruktúru priamo v kontakte s CD. Je zaujímavé, že v CD sa táto štruktúra postupne zmenšila na normálnu veľkosť tubulov. Viac distálne nebolo možné detegovať žiadne ďalšie cysty v susediacej časti CD. Ďalším konzistentným znakom bola zvláštna priestorová organizácia cýst vo vzostupnej končatine HL. V skutočnosti, hoci cysty boli hlbšie a bližšie k slučke v SN, boli povrchnejšie a bližšie k DCT v JN (obrázok 6c). Cysty opäť zaujímali strednú polohu v MN (obrázok 6c).
Obrázok 5|Nefrónové tubuly majú tendenciu sa vyvíjať ako plochá štruktúra. (a) Typická dráha proximálneho tubulu nefrónu. Táto dráha ilustruje jej tendenciu ležať v rovine. Rovinnosť vývoja dráhy možno lepšie vidieť, keď je správne otočená a zarovnaná s uhlom pohľadu pozorovateľa (pozri pravostranné znázornenie toho istého rúrkového segmentu, ktorý je na ľavej strane znázornený v inom uhle) . (b) Schematické znázornenie rúrkovej dráhy zloženej zo 4 segmentov (medzi 5 bodmi definujúcimi danú rúrkovú dráhu zobrazenú ako príklad). Mieru, do akej majú dráhy tendenciu vychádzať zo svojej roviny, môže byť znázornený uhlom, ktorý je tu označený ako „beta“. (pokračovanie)
Obrázok 5|(Pokračovanie) Tento uhol sa meria medzi segmentom p3-p4 vzhľadom na rovinu (definovanú bezprostredne predchádzajúcimi bodmi p3, p2 a p1) a v schéme je znázornený tmavosivým obdĺžnikom. Výpočet beta uhlov sa potom rekurzívne vypočítal spolu so súborom bodov v rúrkovej dráhe. Aby sme vyhodnotili rozsah zaujatosti týchto beta uhlov, simulovali sme náhodnú chôdzu (Monte Carlosimulation [MCs]) pomocou rovnakej sady po sebe nasledujúcich uhlov alfa každej rúrkovej dráhy (merané medzi všetkými po sebe nasledujúcimi segmentmi). Táto náhodná chôdza vytvorila cestu s identickým súborom alfa uhlov a náhodných beta uhlov. (c) Husľové grafy globálnej distribúcie beta uhlov a výsledok MC v proximálnom tubule (PT), tenkej vetve (TL) Henleovej slučky, hrubej vzostupnej vetve (TAL) Henleovej slučky, distálnom stočenom tubule (DCT ) a spojivového tubulu (CNT). MCs, P <>
DISKUSIA
Tradičné histologické metódy sú obmedzené vo svojej schopnosti odhaliť patologické zmeny, ktoré ovplyvňujú celkový tvarnefrónov. Tu predstavujeme účinný prístup založený na zúčtovaní tkanív, ktorý má potenciál riešiť zásadné otázkyobličkyarchitektúra s bezprecedentnými priestorovými detailmi za normálnych a patologických podmienok. Naše výsledky potvrdili existenciu 3 typov nefrónov, ktoré sa líšia svojou polohou, tvarom a veľkosťou v súlade s ich funkčnými špecifikami. Okrem toho sme preukázali, že nefronsten leží v rovinách a prispôsobuje sa priestorovej organizácii plavidiel. Je zaujímavé, že keď sme túto techniku aplikovali na model cystického ochorenia obličiek, pozorovali sme, že cysty sa vyvíjajú vo všetkých nefrónoch, ale iba v špecifických segmentoch. Zaujímavé je, že sme ukázali, že tvar cysty sa mení podľa nefronsegmentu a že pozdĺž toho istého nefrónu cysty interkalujú s normálnymi nedilatovanými tubulmi. Celkovo tieto výsledky poskytujú prvé 3D (Trojrozmerný) charakteristika priestorového usporiadania onefrónova cievy a čo je dôležité, poskytujú základ pre pochopenie patologického procesu, ako je ascystogenéza.
Optické čistenie obličiek je náročné z dôvodu vysokej úrovne autofluorescencie a hustoty buniek. Porovnaním rôznych zúčtovacích protokolov sme v BABB identifikovali výkonnú techniku na implementáciu vizualizácie a rekonštrukcie štruktúr nachádzajúcich sa v najhlbšej častiobličky, teda dreň. Okrem toho je BABB rýchly a škálovateľný a po vymazaní možno vzorky uložiť niekoľko mesiacov pred získaním snímky. Ďalšou hlavnou výhodou tejto techniky je jej nízka cena. Čistiace látky môžu viesť k zmenšeniu alebo zväčšeniu štruktúr.9–17 Avšak, keďže tieto modifikácie veľkosti obličiek sú izotropné, neočakáva sa, že budú ovplyvnené relatívne merania alebo skreslenie ich interpretácie. Jedným z najdôležitejších obmedzení je anotácia štruktúr, ktorá je časovo veľmi náročná. Napriek tomu rastie počet techník založených na hlbokom učení, ktoré by toto obmedzenie mali rýchlo prekonať.
V súlade s výsledkami získanými klasickými technikami naša štúdia ukázala, že nefróny sa líšia svojim tvarom a dĺžkou podľa ich polohy. Najmä sme pozorovali, že JN majú rozvinutejšie stočené PT a väčšie glomeruly a sú 2-krát dlhšie ako SN. Zvýšená dĺžka je výsledkom harmonického procesu, pretože predlžovanie ovplyvňuje proporcionálne všetky segmenty nefrónu. Wealso pozoroval, že JN majú väčší HL. Celkovo tieto údaje jasne ukazujú, že mikroanatómia SN a JN je výrazne odlišná a že MN vykazujú stredné vlastnosti. Zaujímavé je, že to ukázali fyziologické štúdienefrónovsú aj funkčne odlišné.2 Morfogenetické javy, ktoré sú základom týchto rozdielov, zatiaľ nie sú známe. Je teda lákavé špekulovať, že konkrétna štruktúra JNs môže zodpovedať za špecifickosť ich funkcií.
Zaujímavé je, že po prvýkrát poskytuje 3D (Trojrozmerný) rekonštrukcianefrónova ich okolitých ciev sme objavili priestorové obmedzenie medzi oblúkovitými cievami a podskupinou nefrónov. Je teda možné si myslieť, že cievy môžu diktovať spôsob, akým sa nefróny počas vývoja predlžujú.34,35 Kontrola 3D tvarov nefrónov v kombinácii s výpočtovými simuláciami tiež odhalila, že nefróny sa nikdy nepremiešajú a že každý nefrón má tendenciu ležať v rovine. Funkčný význam tohto pozorovania zostáva objasniť.
Vývoj cysty počas polycystickýchobličkychoroba je stále zaujímavý proces. NPHP, patologický stav charakterizovaný vývojom cysty, je najčastejším genetickým ochorením spôsobujúcim konečné štádium renálneho ochorenia u detí a dospievajúcich. Doteraz bolo identifikovaných dvadsať génov NPHP.36 Spomedzi nich kóduje NEK8 člena rodiny kináz spojených s nikdy inmitózou A, ktorá hrá úlohu vo funkcii riasiniek a progresii bunkového cyklu.37 Nek8 bol pôvodne charakterizovaný ako gén zmutovaný u myší jck.32 Predovšetkým sa ukázalo, že amutácia v rovnakej proteínovej doméne vedie u ľudí k NPHP9.38 2Štúdie D naznačujú, že vývoj cysty sa medzi rôznymi formami polycystickej choroby obličiek dramaticky líši.27,29 Najmä v prípade NPHP sa cysty zrejme odvodzujú výhradne z CD a DCT.31 Hoci sú tieto imunohistochemické štúdie informatívne, nemôžu argumentovať proti možnosti, že strata špecifických tubulárnych markerov39 umelo zodpovedá za toto pozorovanie. Takže naše 3D (Trojrozmerný) štúdia poskytuje prvý jasný dôkaz, že vývoj cysty je proces, ktorý môže zahŕňať iba špecifické nefronsegmenty. Je zaujímavé, že hoci kináza 8 (NEK8) súvisiaca s NIMA (Nikdy v mitosisgéne A) je exprimovaná v cytoplazme všetkých segmentov nefrónu, jej expresia v riasinkách je obmedzená na DCT a CD. Pretože iba tieto segmenty sú náchylné na rozvoj cýst,31 môžeme predpokladať, že narušenie funkcie mihalníc NEK8 je rozhodujúcou udalosťou pre tvorbu cysty. Je zaujímavé, že sme tiež pozorovali, že fuziformné cysty sú v kontinuite s normálnymi nedilatovanými tubulmi. Skutočnosť, že recesívna zárodočná mutácia vedie k patologickému fenotypu iba v podskupine buniek, naznačuje, že druhá udalosť by mohla spustiť vývoj cysty v týchto bunkách, ako sa navrhuje pre autozomálne dominantné polycystickéobličkychoroba.40,41
Obrázok 6 |Trojrozmerný(3D) rekonštrukcia nefrónu odhaľuje, že cysty sa vyvíjajú iba v špecifických segmentoch nefrónu. (a) Reprezentatívne 3D obrázky s vykreslením objemu cysty celého nefrónu (ľavé panely) od glomerulov až po zberný kanál v povrchovej kôre (modrá), strednom kortexe (zelená) a juxtamedulárnej oblasti (červená) u myší jack. Segmentácia nefrónov (pravé panely) pre 3 rôzne typynefrónov. Pruh=150 mm. (b) Pravdepodobnosť vzniku cýst v rôznych segmentoch nefrónov u myší jack. (pokračovanie)
Obrázok 6|(Pokračovanie) Horizontálna os je normalizovaná dĺžka nefrónov zodpovedajúca 50 zásobníkom (proximálny tubulus [PT], tyrkysový; Henleloop [HL], biely; distálny stočený tubulus [DCT], ružový; spojovací tubul [CNT], žltý). (c) Reprezentatívne obrázky rekonštrukcie 3D cýst s vykreslením objemu cysty vzostupnej končatiny HL (ľavé panely), DCT (stredné panely) a CNT a kortikálnych zberných kanálikov (CCD) (pravé panely) v povrchových (horné panely), stredné (stredné panely) panely) a juxtamedulárne (spodné panely) nefróny u jack myší. Pruh= 50 mm.
Obrázok 7|Charakterizácia distribúcie a objemu cysty v celom nefrone. (a) Kvantifikácia celkového objemu cysty (súčet cýst na nefrón) pre každý segment nefrónu (Henleho slučka [HL], biela; distálny stočený tubulus [DCT], ružový; spojovací tubul [CNT], žltý) a (b) dĺžka tubulu obsadeného cystami pre každý typ nefrónu (povrchový: modrý; stredný: zelený; juxtamedulárny: červený) u králikov. Údaje sú vyjadrené ako priemer±SEM. Analýza rozptylu nasledovaná Tukey-Kramerovým testom: juxtamedulárny nefrón [JN] verzus povrchový nefrón [SN]: #P < 0.05;="" jn="" verzus="" stredný="" nefrón="" [mn]:="" *p="">< 0,05,="" **p=""><>
Tiež sme pozorovali, že zväčšenie cýst je viac prevládajúce v JN ako v SN, prinajmenšom vzhľadom na cysty, ktoré sa nachádzajú medzi PT a CNT. Stále sa uvádza, že v kontexte glomerulosklerózy sa glomerulárne lézie nachádzajú častejšie u JN ako u inSN.1,21,42 Či prepracovanie v dôsledku zvýšenej rýchlosti glomerulárnej filtrácie jedného nefrónu a transportných/enzymatických aktivít zodpovedá za zvýšenú náchylnosť JN zhoršovať sa je zaujímavá hypotéza, ktorá si zaslúži ďalšie skúmanie.
Stručne povedané, popíšeme novú techniku obrázkuobličkyv 3D (Trojrozmerný) s dostatočnou molekulárnou špecifickosťou a rozlíšením na priame zaznamenanie priestorovej a kvantitatívnej distribúcie špecificky označených vnútorných štruktúr (nefrónovcievy a cysty). Vzhľadom na pohodlie, rýchlosť a schopnosť priamej kvantifikácie predpokladáme, že táto technika sa stane silným nástrojom na pochopenie patofyziológie obličiek.
METÓDY
Zvieratá
Všetky postupy na zvieratách boli schválené „Službami veterinárnej polície de Paris“ a etickou komisiou Université Paris Descartes. Dvojmesačné FVB/N myši (n=20) sa použili na nastavenie experimentálnych podmienok preobličkyŠtúdia sa potom uskutočnila na 2-týždňových samcoch myší jack (n=4) a kontrolných súrodencoch (n=3).
Príprava obličkových tkanív
Pred usmrtením boli myši perfundované intrakardiálnou katetrizáciou 25 ml heparinizovaného fyziologického roztoku (1000 IU/l) a následne 75 ml 4 % paraformaldehydu vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS). Experimenty sa uskutočňovali pod xylazínom (Rompun 2 percentá, Bayer, Leverkusen, Nemecko, 6 mg/g telesnej hmotnosti) a ketamínom (Clorketam 1000, Vetoquinol SA, Lure, Francúzsko, 120 mg/g telesnej hmotnosti).
Pre zúčtovacie štúdie,obličkyboli fixované v 4% paraformaldehyde počas 4 hodín a zaliate do 4% agarózy a 1{4}}mm hrubé rezy obklopujúce obličkový híl boli narezané a uložené v PBS pri 4stupňa. Rezy obličiek boli najskôr zafarbené a potom vyčistené.
Pre imunohistochemické štúdie na tenkých rezoch boli obličky fixované v 4% paraformaldehyde cez noc a boli narezané 4-mm rezy zaliate parafínom.
Farbenie
Kyselina jodistá – Schiffove farbenie. 1.{1} mmobličkyrezy sa pred vyčistením inkubovali v čistej alebo 1:100 PBS-riedenej kyseline jodistej-Schiff počas 5 minút pri teplote miestnosti.
Imunohistochémia na tenkých rezoch zaliatych do parafínu. Štvormikrometrové rezy obličiek zaliatych v parafíne sa zahrievali na získanie antigénu a inkubovali sa cez noc pri 4.4 stupeňs lektínmi spojenými s flfluorochrómom na sledovanie tubulov (rodamínový aglutinín z arašidov [RL-1072-5] a aglutinín z rodamínových pšeničných klíčkov [RL-1022-5], Vector Laboratories, Burlingame, CA, zriedený v pomere 1:200) a segment- špecifická primárna protilátka na zobrazenie odlišných tubulárnych segmentov (biotinylovaný lektín Lotus tetragonolobus [B-1325], Vector Laboratories, zriedený v pomere 1:100; myšací anti-Calbindin D28K[D-4], Santa Cruz, Heidelberg, Nemecko, zriedený v pomere 1:200; kozia anti-AQP2 [C-17], Santa Cruz, zriedená v pomere 1:200). Nasledujúci deň boli rezy inkubované so sekundárnou protilátkou počas 1 hodiny pri teplote miestnosti (konjugát Alexa Fluor 488 [S32354], Invitrogen; anti-kozí Alexa Fluor 488 [A-11055], Invitrogen; anti-myší AlexaFluor 488 [A-21202], Invitrogen, Carlsbad, CA; všetko zriedené v pomere 1:500) pred farbením 40,6-diamidino-2-fenylindolom. Všetky obrázky boli získané mikroskopom Nikon Eclipse E800 (Champignysur Marne, Francúzsko) a pripravené s použitím softvéru Fiji (verzia 1.50). Farbenie lektínom na hrubých rezoch. Hrúbka 1{37}}mmobličkyrezy boli inkubované pri 44 stupeňpočas 1 mesiaca v lektínoch spojených s Texas Red alebo flfluoresceín izotiokyanátom: aglutinín z arašidov (RL-1072-5) a aglutinín z pšeničných klíčkov (RL-1022-5), zriedené v pomere 1:100 v 0,1 percenta PBS azidu a 0,1 percenta Triton-X. Rezy sa potom premývali každý deň počas 2 týždňov PBS pred vyčistením.
Cistanche-funkcia obličiek
Optické čistenie
Pre vyčistenie mierky 1.{1}} mmobličkyrezy boli inkubované v ScaleA2 (4 M močovina, 0,1 percenta Triton X-100, 10 percent glycerolu) alebo ScaleB4 (8 Murea, 0,1 percenta Triton X-100 ) na 2 týždne, až 1 rok, o 4stupňa.
Na vyčistenie BABB boli 1,{1}} mm rezy obličiek dehydratované postupným prepláchnutím etanolom pri izbovej teplote. Vzorky sa potom inkubovali v BABB (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) v pomere 1:2 počas aspoň 2 dní pri 4 stupňoch.
Akvizícia obrazu z dvojfotónovej mikroskopie
Tkanivá sa zobrazili vodným gélom na invertovanom multifotonmikroskope (LaVision BioTec) vybavenom titánovo-zafírovým laserom Mai Tai HP (Spectra-Physics, Santa Clara, CA) (doplnkový obrázok S1A). Excitačná vlnová dĺžka bola 815 nm pri 8 percentách výkonu. Použili sme 20XVodný imerzný objektív (XLUMPLFL20XW,Olympus [Tokio, Japonsko]; numerická apertúra, 0,95; pracovná vzdialenosť, 2,0 mm). Na získanie fluorescencie sme použili neskenovaný detektor na 80 percent s pásmovým filtrom 593/40 nm.
Prvý krok pozostával z akvizície 2D mozaikového obrazu v strede zásobníka z pomocou suboptimálnych parametrov akvizície (400 mm x 400 mm a 1011 x 1011 pixelov, s 10 percentným prekrytím a spriemerovaním línií na 2), aby sa usmernil výber najrelevantnejších centrálnych polí (doplnkový obrázok S9A ). Po definovaní XY mriežky a z polí záujmu sa parametre upravili na získanie vysokokvalitných obrázkov. Takýto prístup zredukoval oblasť záujmu na 5X12 polí na zásobník z. Potom sme získali 850z stohy/optické rezy (veľkosť kroku 1- mm) obklopujúce obličkový hilum v strednej častiobličkyoddiele.
Zošívanie, spracovanie a sledovanie obrázkov Každý stoh bol usporiadaný podľa metódy vyvinutej Preibischetom al.,43 ktorá umožňuje spájať veľkú zbierku obrázkov pomocou doplnku „Grid/Collection stitching“ softvéru Fidži (HTTP://Fiji. sc/Fiji). Pretože sme pozorovali dôležitý posun medzi 2 susednými obrázkami po zošití, napísali sme program na prispôsobenie v Pythone. Tento program kompenzuje posun obrazu, čo nám umožňuje správne zarovnať obrázky (doplnkový obrázok S9B). Snímky opravené zošitím sa analyzovali pomocou Imaris verzie 8.4.2 (Bitplane, Zurich, Švajčiarsko). Tubuly a cievy sledovali manuálny režim balíka filament tracer Imaris a spojili sa s Imaris Xtension, ktorý sme vyvinuli s MATLABom (https://www.dropbox.com/s/sm9u5em3orjrpmc/Standalone{11}}Pripojiť sa_ Filament_Tool.zip?dl=0) (doplnkový obrázok S9C). Glomeruliand cysty boli 3D rekonštruované s použitím manuálneho režimu povrchového balíka Imaris. 3D (Trojrozmerný) Priestorová organizácia glomerulov bola zobrazená pomocou manuálneho režimu balíka spotov Imaris.
Morfometria
Dĺžka tubulárneho segmentu, dĺžka nefrónu a priamosť sa určili pomocou balíka indikátora filamentov od Imaris. Podľa softvéru Imaris bola priamosť kvantifikovaná ako pomer medzi vzdialenosťou medzi 2 bodmi a dĺžkou dráhy segmentu nefrónu. Tridsaťjeden PT a 12 celýchnefrónovboli rekonštruované a merané u 3 myší divokého typu, zatiaľ čo 37 PT a 17 celých nefrónov bolo rekonštruovaných a meraných u 4 jack myší. Objemy cysty a glomerulov sa stanovili pomocou "povrchového balíka" od Imaris. Tridsaťjeden a 34 glomerulov sa nameralo u myší divokého typu a myšiach Jacka. Celkovo bolo nameraných 74 cýst.
Uhly trubicových závitov "mimo rovinu" (označené ako "beta") sa merali medzi rovinou (definovanou 3 po sebe idúcimi bodmi) a smerom s ďalším po sebe idúcim štvrtým bodom v priestore (obrázok 5b). Na vyhodnotenie štatistickej významnosti pozorovaného skreslenia sme simulovali distribúciu beta uhlov s náhodnou rotáciou beta uhlov (simulácia Monte Carlo) v štruktúrach, ktoré boli zložené z rovnakých segmentov s rovnakou sadou alfa uhlov.
Na výpočet pravdepodobnosti vzniku cystickej lézie spolu so segmentmi nefrónu sme každý nefrón reprezentovali súborom bodov v priestore. Každý bod bol označený s ohľadom na prítomnosť cysty oproti normálnej štruktúre a typu segmentu. Pravdepodobnosť pri každej štandardizovanej dĺžke (nastavenej na 50 binov) sa vypočítala ako pomer medzi počtom bodov s cystickou anotáciou a celkovým počtom bodov v bine.
Pre výpočet priemernej glomerulárnej inter vzdialenosti sme uvažovali pre každý glomerulus priemernú glomerulárnu interdistanciu vypočítanú na najbližších 5 glomerulov.
Dátové analýzy a štatistiky
Údaje sú vyjadrené ako priemer ± SEM. Rozdiely medzi experimentálnymi skupinami boli hodnotené pomocou analýzy rozptylu, nasledovanej, keď je signifikantná (P < {{0}}.05),="" tukey-kramerovým="" testom.="" keď="" sa="" porovnávali="" iba="" 2="" skupiny,="" použil="" sa="" mann-whitney="" test.="" štatistické="" analýzy="" sa="" uskutočnili="" pomocou="" softvéru="" graph="" prism="" (sandiego,="" ca,="" verzia="">
DISCLOSURE
Všetci autori nedeklarovali žiadne konkurenčné záujmy.
POĎAKOVANIE
Ďakujeme Laboratoire Experimentation Animale et Transgenese (LEAT), Histology and Imaging Platforms of Structure Federative deRecherche Necker za technickú pomoc. Ďakujeme Pierrovi Isnardovi, Marie-Claire Gublerovej a Nicolasovi Kuperwasserovi za kritické prečítanie rukopisu. Túto prácu podporil Institut National de laSanté et de la Recherche Médicale, Université Paris Descartes, Assistance Publique – Hôpitaux de Paris, Agence Nationale de laRecherche, Whoami Laboratoire d'Excellence Who am I, RochePharma Research and Early Development (Bazilej, Švajčiarsko) a Institut Roche de Recherche et de Médecine Translationnelle (Paríž, Francúzsko).
AUTORSKÉ PRÍSPEVKY
TB, NG a MZ navrhli a vykonali experimenty a analyzovali údaje. FB, LT, MGT a SG tiež vykonali niekoľko experimentov a analyzovali údaje. MB a CN vykonali myšie experimenty. K napísaniu rukopisu prispeli aj TB a MZ. GF rukopis zrevidoval. FT a MP poskytli koncepčný rámec a navrhli štúdiu, dohliadali na projekt a napísali dokument.
Cistanche-Trojrozmerná architektúra nefrónov obličiek
DOPLNKOVÝ MATERIÁL
Doplnkový súbor (PDF)
Obrázok S1. Experimentálne nastavenie, postup získavania a spracovanie obrazu.
Obrázok S2. Hranice autofluorescenčného signálu v XY az rozlíšení.
Obrázok S3. Dvojrozmerný obraz prechodu medzi PT a TL na 4-mm zaliatom parafíneobličkyoddielov.
Obrázok S4. Dvojrozmerný obraz prechodu medzi TAL a DCT na 4-mm rezoch obličiek zaliatych v parafíne.
Obrázok S5. Dvojrozmerný obraz prechodu medzi DCT a CNT na 4-mm rezoch obličiek zaliatych v parafíne.
Obrázok S6. Trojrozmerná rekonštrukcia odhaľuje 3 rôzne tvary proximálnych tubulov.
Obrázok S7.Trojrozmernýrekonštrukcia ukazuje, že dĺžka a segmentácianefrónovnie sú ovplyvnené cystami.
Obrázok S8. Hustota glomerulov v kontrole a cystickáobličky.
Obrázok S9. Postup získavania a následné spracovanie obrazu. Tabuľka S1. Porovnanie metód čistenia. Doplnkový súbor (filmy)
Film S1. Farbenie lektínom výrazne zlepšuje rozlíšenie a pomer signálu k pozadiu.
Film S2. Sledovanie dráhy tubulu.
Film S3. Trojrozmerná rekonštrukcia vyčistenej obličky, ktorá ukazuje spojenie medzi proximálnym tubulom a tenkým limbom Henleovej slučky.
Film S4. Trojrozmerná rekonštrukcia vyčistenej obličky, ktorá ukazuje spojenie medzi hrubou vzostupnou končatinou Henleloop a distálnym stočeným tubulom.
Film S5.Trojrozmernýrekonštrukcia vyčistenéhoobličkyzobrazujúci spojenie medzi distálnym stočeným tubulom a spojovacím tubulom.
Film S6. Tvar a veľkosť proximálnych tubulov sa líši podľa ich hĺbky.
Film S7. Trojrozmerná rekonštrukcia nefrónu u kontrolných myší.
Film S8. Sledovanie cesty cievy z oblúkovej cievy do akortikálnej radiačnej cievy.
Film S9. Oblúkové cievy modelujú tvar juxtamedulárnych proximálnych tubulov.
Film S10.Nefrónymajú tendenciu ležať v lietadle.
Film S11. Trojrozmerná rekonštrukcia nefrónu ukazuje špecifický vzor pre vývoj cysty.
Film S12.Trojrozmernýsegmentácia nefrónov odhaľuje, že cysty sa vyvíjajú v špecifických segmentoch nefrónov.
Film S13. Priestorové usporiadanie a vzájomný vzťahnefrónova cievy v polycystikuobličky.
LITERATÚRA
1. Bohatá AR. Doteraz nepopísaná zraniteľnosť juxtamedulárnych glomerulov pri lipoidnej nefróze. Bull Johns Hopkins Hosp. 1957;100:173–186.
2. Bankir L, Bouby N, Trinh-Trang-Tan MM. Heterogenita nefronanatómie. Kidney Int Suppl. 1987;20:S25–S39.
3. Christensen EI, Grann B, Kristoffersen IB, a kol.Trojrozmernýrekonštrukcia nefrónu potkana. Am J Physiol Physiol. 2014;306:F664–F671.
4. Zhai XY, Birn H, Jensen KB a kol. Digitálna trojrozmerná rekonštrukcia a ultraštruktúra proximálneho tubulu myši. J Am Soc Nephrol.2003;14:611–619.
5. Zhai XY, Thomsen JS, Birn H, a kol. Trojrozmerná rekonštrukcia myšacieho nefrónu. J Am Soc Nephrol. 2006;17:77–88.
6. Puelles VG, Moeller MJ, Bertram JF. Teraz vidíme jasne: optické čistenie aobličkymorfometria. Curr Opin Nephrol Hypertens.2017;26:179–186.
7. Seo J, Choe M, Kim SY. Techniky čistenia a označovania biologických tkanív veľkého rozsahu. Mol Cells. 2016;39:439–446.
8. Spalteholz W. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen undtierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang:Über Knochenfärbung. Lipsko, Nemecko: S. Hierzel; 1914.
9. Hama H, Kurokawa H, Kawano H a kol. Stupnica: chemický prístup k fluorescenčnému zobrazovaniu a rekonštrukcii priehľadného mozgu myši. Nat Neurosci. 2011;14:1481–1488.
10. Ertürk A, Becker K, Jährling N, a kol.Trojrozmernýzobrazovanie orgánov vyčistených rozpúšťadlom pomocou 3DISCO. Nat Protoc. 2012;7:1983–1995.
11. Kuwajima T, Sitko AA, Bhansali P, a kol. ClearT: metóda čistenia neurónových a neneurónových tkanív bez detergentov a rozpúšťadiel. Vývoj. 2013;140:1364–1368.
12. Ke MT, Imai T. Optické čistenie fixovaných vzoriek mozgu pomocou SeeDB. CurrProtoc Neurosci. 2014;66:2.22.1–2.22.19.
13. Chung K, Deisseroth K. CLARITY pre mapovanie nervového systému. NatMethods. 2013;10:508–513.
14. Tomer R, Ye L, Hsueh B, Deisseroth K. Advanced CLARITY pre rýchle zobrazovanie intaktných tkanív s vysokým rozlíšením. Nat Protoc. 2014;9:1682–1697.
15. Yang B, Treweek JB, Kulkarni RP, a kol. Jednobunková fenotypizácia v priehľadnom intaktnom tkanive prostredníctvom celotelového čistenia. Bunka. 2014;158:945–958.
16. Susaki EA, Tainaka K, Perrin D, a kol. Zobrazovanie celého mozgu s jednobunkovým rozlíšením pomocou chemických koktailov a výpočtovej analýzy. Cell.2014;157:726–739.
17. Alanentalo T, Asayesh A, Morrison H, a kol. Tomografické molekulárne zobrazovanie a 3D kvantifikácia v orgánoch dospelých myší. Nat Methods.2007;4:31–33.
18. Parra SG, Chia TH, Zinter JP a kol. Multifotónová mikroskopia vyčistených myších orgánov. J Biomed Opt. 2010;15:036017.
19. Renier N, Wu Z, Simon DJ a kol. iDISCO: jednoduchá, rýchla metóda na imunoznačenie veľkých vzoriek tkaniva pre objemové zobrazovanie. Bunka. 2014;159:896–910.
20. Lee H, Park JH, Seo I, a kol. Vylepšená aplikácia technológie elektroforetického čistenia tkaniva, CLARITY, na neporušené pevné orgány vrátane mozgu, pankreasu, pečene,obličky, pľúca a črevo. BMC Dev Biol. 2014;14:1–7.
21. Iversen BM, Amann K, Kvam FI, et al. Zvýšený glomerulárny kapilárny tlak a veľkosť sprostredkúvajú glomerulosklerózu v juxtamedulárnom kortexe SHR. Am J Physiol Physiol. 1998;274:F365–F373.
22. Angelotti ML, Antonelli G, Conte C, Romagnani P. Zobrazovanie obličiek: od svetla k mikroskopii s vysokým rozlíšením. Transplantácia nefrolových čísel.2021;36:19–28.
23. Puelles VG, van der Wolde JW, Schulze KE a kol. Validácia trojrozmernej metódy počítania a veľkosti podocytov v celých glomeruloch. J Am Soc Nephrol. 2016;27:3093–3104.
24. Pannabecker TL, Dantzler WH, Layton HE, Layton AT. Úlohatrojrozmernýarchitektúra v moči koncentračný mechanizmus therat renálnej vnútornej drene. Am J Physiol Physiol. 2008;295:F1271–F1285.
25. Saritas T, Puelles VG, Su XT a kol. Optické čistenie v obličkách odhaľuje prestavbu tubulov sprostredkovanú draslíkom. Cell Rep. 2018;25:2668–2675.e3.
26. Schuh CD, Polesel M, Platonova E, et al. Kombinované štrukturálne a funkčné zobrazenie obličky odhaľuje veľké axiálne rozdiely v endocytóze proximálneho tubulu. J Am Soc Nephrol. 2018;29:2696–2712.
27. Braun DA, Hildebrandt F. Ciliopatie. Cold Spring Harb Perspect Biol.2017;9:a028191.
28. Bergmann C, Guay-Woodford LM, Harris PC a kol. Polycystickéobličkychoroba. Nat Rev Dis Prim. 2018;4:50.
29. Wilson PD. Polycystické ochorenie obličiek. N Engl J Med. 2004;350:151–164.
30. Laitinen L, Virtanen I, Saxén L. Zmeny vo vzorci glykozylácie počas embryonálneho vývoja myších obličiek, ako sa ukázalo s lektínovými konjugátmi. J Histochem Cytochem. 1987;35:55–65.
31. Smith LA, Bukanov NO, Husson H, et al. Vývoj polycystickoidnej choroby u juvenilných myší s cystickou obličkou: pohľad na patogenézu, ciliárne abnormality a spoločné črty s ľudskými chorobami. J AmSoc Nephrol. 2006;17:2821–2831.
32. Liu S, Lu W, Obara T, a kol. Defekt v novej kináze z rodiny Nek spôsobuje cystickú chorobu obličiek u myší a u zebričiek. Vývoj.2002;129:5839–5846.
33. Franke M., Baeßler B., Bechtel J. a kol. Magnetické rezonančné mapovanie T2 a difúzne vážené zobrazovanie na včasnú detekciu cystogenézy a odozvy na terapiu v myšom modeli polycystickej choroby obličiek.ObličkyInt. 2017;92:1544–1554.
34. Barry DM, McMillan EA, Kunar B, a kol. Molekulárne determinanty vaskulárnej špecializácie nefrónu vobličky. Nat Commun. 2019;10:5705.
35. Perretta-Tejedor N, Jafree DJ, Long DA. Endotelovo-epiteliálna komunikácia u polycystickýchobličkychoroba: úloha signalizácie vaskulárneho endotelového rastového faktora. Cell Signal. 2020;72:109624.
36. Srivastava S, Molinari E, Raman S, Sayer JA. Mnohé gény-jedna choroba?Genetika nefronoftízy (NPHP) a porúch spojených s NPHP.Front Pediatr. 2017;5:287.
37. Fry AM, O'Regan L, Sabir SR, Bayliss R. Regulácia bunkového cyklu proteínkinázou rodiny NEK. J Cell Sci. 2012;125:4423–4433.
38. Otto EA, Trapp ML, Schultheiss UT a kol. Mutácie NEK8 ovplyvňujú ciliárnu a centrozomálnu lokalizáciu a môžu spôsobiť nefronoftízu. J Am SocNephrol. 2008;19:587–592.
39. Wilson PD. Apiko-bazálna polarita v epiteli polycystického ochorenia obličiek.Biochim Biophys Acta. 2011;1812:1239–1248.
40. Happé H, Leonhard WN, van der Wal A, a kol. Toxické poškodenie tubulov v obličkách od myší s deléciou Pkd1- urýchľuje cystogenézu sprevádzanú dysregulovanou polaritou planárnych buniek a kanonickými signálnymi dráhami Wnt. Hum Mol Genet. 2009;18:2532–2542.
41. Piontek K, Menezes LF, Garcia-Gonzalez MA, a kol. Kritický vývojový prepínač definuje kinetiku tvorby obličkových cýst po strate Pkd1. Nat Med. 2007;13:1490–1495.
42. Ikoma M, Yoshioka T, Ichikawa I, Fogo A. Mechanizmus jedinečnej náchylnosti hlbokých kortikálnych glomerulov dozrievaniaobličkyaž po ťažkú fokálnu glomerulárnu sklerózu. Pediatr Res. 1990;28:270–276.
43. Preibisch S, Saalfeld S, Tomančák P. Globálne optimálne šitie obkladačiek 3D (Trojrozmerný) akvizície mikroskopických snímok. Bioinformatika. 2009;25:1463–1465.
