Trombomodulín zlepšuje chronické ochorenie obličiek sprostredkované transformujúcim rastovým faktorom b1 prostredníctvom signálnej dráhy receptora 15/Akt spojeného s G-proteínom

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Atsuro Takeshita1,2,8 , Taro Yasuma1,2,8 , Kota Nishihama1 , Corina N. D'Alessandro-Gabazza2, Masaaki Toda2 , Toshiaki Totoki4 , Yuko Okano1,2 , Akihiro Uchida1 , Ryo W5angianger6 , Shuque6, Liqangi Qinie Fridman D'Alessandro2 , Tetsu Kobayashi3 , Yoshiyuki Takei4 , Akira Mizoguchi5 , Yutaka Yano1,9 a Esteban C. Gabazza2,9

1 Oddelenie diabetu, metabolizmu a endokrinológie, Mie University Graduate School of Medicine, Tsu-city, Mie, Japonsko; 2 Department of Immunology, Mie University Graduate School of Medicine, Tsu-city, Mie, Japonsko; 3 Oddelenie pľúcnej medicíny a medicíny kritickej starostlivosti, Vysoká škola medicíny Univerzity Mie, mesto Tsu, Mie, Japonsko; 4 Katedra gastroenterológie a hepatológie, Lekárska fakulta pre postgraduálne štúdium Univerzity Mie, mesto Tsu, Mie, Japonsko; 5 Oddelenie neurálnej regenerácie a bunkovej komunikácie, Lekárska fakulta Mie University, Tsu-city, Mie, Japonsko; 6 Centrálny inštitút pre pokusné zvieratá, Kawasaki-ku, Kawasaki, Kanawaga, Japonsko; a 7 Oddelenie nefrológie, Nemocnica Taizhou, Lekárska univerzita Wenzhou, Lihai, provincia Zhejiang, Čínska ľudová republika.

Kidney International (2020) 98, 1179 – 1192; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2020.05.041

Copyright ª 2020, International Society of Nefrology. Vydal Elsevier Inc. Toto je článok s otvoreným prístupom pod licenciou CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Korešpondencia: Esteban C. Gabazza, Oddelenie imunológie, Lekárska fakulta Univerzity Mie, Edobashi 2-174, Tsu-city, Mie 514-8507, Japonsko. E-mail: gabazza@doc.medic.mie-u.ac.jp; alebo Yutaka Yano, Diabetes, Metabolism and Endokrinology, Mie University Graduate School of Medicine, Edobashi 2-174, Tsu-city, Mie 514-8507, Japonsko. E-mail: yanoyuta@clin.medic.mie-u.ac.jp 8 AT a TY prispeli k tejto práci rovnakým dielom. 9 YY a EKG sú spoluautormi. Prijaté 1. septembra 2019; revidované 24. apríla 2020; prijaté 7. mája 2020

KĽÚČOVÉ SLOVÁ: apoptóza; chronické ochorenie obličiek; receptor spojený s G-proteínom; rekombinantný ľudský trombomodulín; transformujúci rastový faktor-b1

Fibróza obličiek je bežným dôsledkom chronických ochorení obličiek, ktoré neúprosne progredujú do konečného štádia ochorenia obličiek s orgánovým zlyhaním liečiteľným iba substitučnou liečbou. Keďže transformujúci rastový faktor-b1 je hlavným hráčom v patogenéze fibrózy obličiek, predložili sme hypotézu, že rekombinantný trombomodulín môže zlepšiť progresívnu fibrózu a zlyhanie obličiek sprostredkovanú transformujúcim rastovým faktorom-b1. Aby sme vyšetrili našu hypotézu, vytvorili sme novú transgénnu myš s ľudským transformujúcim rastovým faktorom b1 špecifickým pre glomerulus, aby sme vyhodnotili terapeutický účinok rekombinantného trombomodulínu. U tejto transgénnej myši sa vyvinula progresívna glomerulárna skleróza a tubulointersticiálna fibróza so zlyhaním obličiek. Terapia rekombinantným trombomodulínom počas štyroch týždňov významne inhibovala fibrózu obličiek a zlepšila funkciu orgánov v porovnaní s neliečenými transgénnymi myšami. Liečba rekombinantným trombomodulínom významne inhibovala apoptózu a mezenchymálnu diferenciáciu podocytov interakciou s receptorom 15 spojeným s G-proteínom, aby sa aktivovala signálna dráha Akt a aby sa upregulovala expresia antiapoptotických proteínov vrátane survivínu. Naša štúdia teda silne naznačuje potenciálnu terapeutickú účinnosť rekombinantného trombomodulínu na liečbuchronické ochorenie obličieka následné zlyhanie orgánov.

cistanchemôcťliečiť ochorenie obličiekzlepšiť funkciu obličiek

Prekladové vyhlásenie

Fibróza a dysfunkciaobličkysú v súčasnosti veľké zdravotné problémy na celom svete. V súčasnosti nie je schválené žiadne antifibrotické liečivo na liečbu fibrózy obličiek. Transformujúci rastový faktor-b1 je hlavnou a bežnou hnacou silou renálnej fibrogenézy pri chronickom ochorení obličiek spôsobenom mnohými poruchami. Zistili sme, že rekombinantný trombomodulín, liek schválený v Japonsku na liečbu diseminovanej intravaskulárnej koagulácie, potláča progresiu glomerulárnej sklerózy, tubulointersticiálnej fibrózy a renálneho zlyhania spôsobeného nadmernou expresiou ľudského transformujúceho rastového faktora-b1, čo naznačuje jeho potenciálnu terapeutickú hodnotu pre liečbu. zchronické ochorenia obličiek.

Chronické ochorenie obličiekje hlavným problémom verejného zdravia spojeným s vysokou chorobnosťou a úmrtnosťou, ktorý postihuje približne 13 percent dospelej populácie v rozvinutých krajinách.1 Svetová zdravotnícka organizácia uviedla, žechronické ochorenie obličiek(CKD) bola príčinou 1,5 percenta úmrtí na celom svete v roku 2012.1 Nedávne epidemiologické údaje navyše naznačujú celosvetový stabilný nárast počtu pacientov s CKD.2,3 Vo väčšine prípadov sa patologický proces postupne vyvíja, čo nakoniec vedie ku koncu- štádiu zlyhania obličiek, ktoré je liečiteľné výlučne doživotnou dialýzou alebo transplantáciou obličky.4,5 Diabetes mellitus (DM) a arteriálna hypertenzia sú najčastejšími príčinami CKD, po ktorých nasleduje ischémia, glomeruloskleróza neznámej etiológie, urologické obštrukcie a chronické infekcie.6 Bez ohľadu na základnú poruchu je konečným a bežným patologickým dôsledkom CKD fibróza obličiek.7 Renálna fibróza je aberantné hojenie a prestavba parenchymálnych štruktúr obličiek vystavených predĺženému alebo opakovanému poškodeniu charakterizované prítomnosťou tubulointersticiálnej fibrózy, glomeruloskleróza a tubulárna atrofia.8 Hlavnou hnacou silou renálnej fifibrogenézy je transformujúci rastový fakt alebo (TGF)-b1.8,9 TGFb1 môže podporovať fibrózu stimuláciou sekrécie proteínov extracelulárnej matrice a chemotaktických faktorov alebo proliferačných faktorov fibroblastov, inhibíciou metaloproteináz a podporou epitelovo-mezenchymálneho prechodu.10 Okrem liečby základného ochorenia , schválený liek, ktorý sa špecificky zameriava na fibrózu obličiek, je v súčasnosti nedostupný.6

Trombomodulín (TM) je transmembránový glykoproteín s viacerými biologickými funkciami vrátane modulácie systému zrážania krvi, imunitnej odpovede, zápalových reakcií a prežívania buniek.11 Molekulárna štruktúra TM obsahuje doménu podobnú lektínu, 6 domén podobných epidermálnemu rastovému faktoru , doména bohatá na serín/treonín, transmembránová časť a cytoplazmatický chvost.12 Trombín, prokoagulačný faktor generovaný počas aktivácie koagulačného systému, sa po naviazaní na TM stáva antikoagulačným a antifibrinolytickým faktorom.13 Komplex TM-trombín zvyšuje tvorbu aktivovaného proteínu C (APC), antikoagulantu s protizápalovou a cytoprotektívnou aktivitou, aktiváciou proteínu C. Okrem toho samotná TM môže priamo znížiť zápalovú odpoveď inhibíciou aktivity proteínu B skupiny s vysokou pohyblivosťou-1 (HMGB1), potlačením imunogénnych dendritických buniek, eozinofilov, žírnych buniek a komplementového systému.13–18

Existujú publikované výsledky poukazujúce na preventívne účinky TM pri diabetickej renopatii a ischemicko-reperfúznom poškodení obličiek.19-21 Žiadna štúdia však nehodnotila účinok rekombinantnej TM na progresívnu fibrózu obličiek vyvolanú TGFb1, čo je častá hnacia sila renálnej fibrózy v viaceré ochorenia spôsobujúce CKD. Predložili sme hypotézu, že TM môže zlepšiť fibrózu obličiek sprostredkovanú TGFb{3}} a zlyhanie obličiek. Na preskúmanie tejto hypotézy sme hodnotili terapeutický účinok rekombinantnej TM u novo vyvinutej transgénnej (TG) myši TGFb1 špecifickej pre glomeruly, ktorá vyvíja progresívnefibróza obličiek a zlyhanie obličiek.

cistanche pre obličky

VÝSLEDKY

Zvýšené cirkulujúce fragmenty TM korelujú s renálnou dysfunkciou

TM, glykoproteín viazaný na membránu endotelových buniek, sa štiepi na fragmenty, pričom počas poškodenia endotelu stráca svoje ochranné funkcie.22 Diabetická nefropatia je spojená s poškodením endotelu.23,24 Pacienti s DM s nefropatiou v porovnaní s pacientmi bez nefropatie vykazovali signifikantne vysoké cirkulujúce hladiny TM (4,4 oproti 3,3 pg/ml) a aktívneho TGFb1 (0,28 oproti 0,24 ng/ml) (doplnková tabuľka S1, doplnkový obrázok S1A). TM významne koreluje s kreatinínom, aktívnym TGFb1 a rozpustným podocínom (doplnkový obrázok S1B). Tieto pozorovania naznačujú, že strata funkčnej membránovo viazanej TM je spojená so zvýšeným uvoľňovaním aktívneho TGFb1 a dysfunkciou obličiek.

TG myš s glomerulus špecifickou expresiou ľudského génu TGFb1 plnej dĺžky

Vyvinuli sme TG myš nadmerne exprimujúcu ľudský gén TGFb1 plnej dĺžky v podocytoch. Myš bola vytvorená umiestnením ľudského TGFb1 pod kontrolu promótora podocínu na konštrukt bakteriálneho umelého chromozómu (BAC) (doplnkový obrázok S2; doplnkový obrázok S3). Získali sme 5 základných myší exprimujúcich 3 kópie a 3 základné myši exprimujúce 1 kópiu ľudského transgénu TGFb1. Expresia transgénu bola špecifická pre obličky a potomstvo zakladateľov bolo životaschopné (doplnkový obrázok S3). Myši mali donosené tehotenstvá a podstielka mala normálnu veľkosť. Myši sa narodili v očakávanom mendelovskom pomere.

Aby sme charakterizovali TG myši, namerali sme ich niekoľkorenálne parametrekaždé 4 týždne počas 16 týždňov (doplnkový obrázok S4). Koncentrácie TGFb1 v plazme a moči boli významne zvýšené u myší TGFb1- TG v porovnaní s myšami divokého typu (WT) od prvých týždňov po narodení a potom zostali stabilné na vysokej úrovni (obrázok 1a). TGFb1-TG myši vykazovali významné zvýšenie obsahu hydroxyprolínu v obličkovom tkanive v 2. 0. týždni (190,5 vs. 96.0 mg/obličky ), mezangiálna expanzia od 4. týždňa (1,9 oproti 1,1 skóre) a v ukladaní kolagénu od 12. týždňa (0,9 percent oproti 0,1 percenta) po narodení v porovnaní s ich WT náprotivkami (obrázok 1a–f ). Bežná optická mikroskopia ukázala rozšírenie bazálnej membrány Bowmanovej kapsuly, zhrubnutie glomerulárnej bazálnej membrány, zvýšené ukladanie kolagénu v mezangiálnych a intersticiálnych priestoroch a tubulárnu atrofiu (obrázok 1bd). Transmisná elektrónová mikroskopia ukázala glomerulosklerózu vrátane mikrovilóznej transformácie a vyhladzovania podocytov na chodidle, zníženú fenestráciu endotelu glomerulárnej kapiláry, zhrubnutie glomerulárnej bazálnej membrány a zvýšené ukladanie mezangiálnej matrice (obrázok 2a–i). Koncentrácie skorých markerov nefropatie v moči Proteín viažuci mastné kyseliny (185,1 vs. 87,0 pg/ml) apoškodenie obličiekmolekula 1 (441,9 vs. 256,9 pg/ml) boli významne zvýšené u myší TGFb1-TG od 4. a 8. týždňa veku v porovnaní s ich vekovo zodpovedajúcimi WT myšami (doplnkový obrázok S5). Celková proteinúria a pomer celkového proteínu a kreatinínu v moči sa významne zvýšili v 4., 8., 12., 16. a 2. týždni u myší TGFb1-TG v porovnaní s ich náprotivkami WT (obrázok 3a) . Plazmatická hladina močovinového dusíka v krvi bola významne zvýšená od 4. týždňa (5,1 vs. 4,1 mg/dl) a koncentrácia kreatinínu od 8. týždňa (1,1 vs. 0,4 mg/dl) u TGFb1-TG myší v porovnaní s ich náprotivkami WT (obrázok 3b).

rhTM inhibuje glomerulosklerózu a tubulointersticiálnu fibrózu

V porovnaní s TGFb{0}}TG myšami liečenými fyziologickým roztokom (SAL) a WT myšami liečenými rekombinantným ľudským (RH) TM alebo SAL, TGFb{1}}TG myši liečené rytmom vykazovali významne znížený mezangiál expanzia/celularita (1,3 vs. 3.{{30}} skóre) a významne nízke tubulointersticiálne ukladanie kolagénu a glomeruloskleróza (121,3 percenta vs. 139,7 percenta) (obrázok 4a–e). V súlade s týmito pozorovaniami bol obsah hydroxyprolínu (11,7 vs. 19,9 mg/g), koncentrácie kolagénu I v obličkovom tkanive (101,3 vs. 196,7 ng/mg proteínu) a periostínu (21,7 vs. 40,8 ng/ mg proteínu) a relatívna mRNA expresia kolagénu I bola významne znížená v obličkových tkanivách z TGFb1-TG myší liečených rhTM v porovnaní s obličkovými tkanivami z kontrolných myší (obrázok 4f, doplnkové tabuľky S2 a S3). Transmisná elektrónová mikroskopia ukázala významné zníženie vymazania podocytov procesom chodidla a zhrubnutie glomerulárnej bazálnej membrány u myší liečených rhTM v porovnaní s myšami liečenými samotným SAL (doplnkový obrázok S6AB a B). Okrem toho koncentrácie profibrotických cytokínov, monocytov, chemoatraktantu proteínu -1 (45,0 vs. 76,1 pg/mg proteínu), interleukínu-13 (612,1 vs. 1002,0 pg/mg proteínu) a aktívneho TGFb1 v tkanive obličiek (131,0 vs. 151,5 pg/mg proteínu) boli významne znížené u TGFb1-TG myší liečených rhTM v porovnaní s kontrolnými myšami (doplnkový obrázok S7). Koncentrácia HMGB1 v obličkovom tkanive bola tiež významne znížená v obličkových tkanivách myší TGFb1-TG liečených rhTM v porovnaní sobličkové tkaniváz kontrolných myší (doplnkový obrázok S7). Plazmatická koncentrácia trombín antitrombínového komplexu bola významne zvýšená v skupine TGFb1-TG/SAL v porovnaní so skupinou WT/SAL, ale nezistil sa žiadny rozdiel medzi skupinami TGFb1-TG/rhTM a WT/rhTM (Doplnkový obrázok S8A). Ako sa očakávalo, v plazme myší TGFb1-TG a WT liečených rhTM bola vysoká koncentrácia TM. Plazmatická koncentrácia komplexu APC/antitrypsín bola významne znížená v skupine TGFb1-TG/SAL v porovnaní so skupinami WT/SAL a TGFb1-TG/rhTM (280,5 vs. 384,6 pg/ml) a nebol žiadny významný rozdiel v hladine inhibítora aktivátora plazminogénu-1 (doplnkový obrázok S8A). Hladiny C5a v plazme, moči aobličkové tkanivo(630,1 vs. 1075,0 pg/mg proteínu) a podocínu rozpustného v plazme boli významne znížené u myší TGFb1-TG liečených rhTM v porovnaní s myšami TGFb1-TG liečených SAL (Doplnkový obrázok S8B). Hladina podocínu v moči bola vyššia v skupine TGFb1-TG/SAL ako v skupinách WT/SAL a TGFb1-TG/rhTM (doplnkový obrázok S9A–C).

Obrázok 1|U transgénnej (TG) myši ľudského transformujúceho rastového faktora b1 (TGFb1) sa vyvíja progresívna fibróza obličiek. (a) Koncentrácie proteínu TGFb1 v plazme a moči sa merali enzýmovým imunitným testom a obsah hydroxyprolínu v tkanive kolorimetrickým testom. (b–d) Rezy obličkového tkaniva boli zafarbené (b) kyselinou jodistou – Schiff (stĺpce ¼ 20 mm) a (c,d) Massonovým trichrómom (stĺpce ¼ 10{{ 40}} mm) a potom (e,f) kvantifikované pomocou bodovacieho systému alebo zobrazovacieho softvéru WinROOF (Mitani Corporation, Tokio, Japonsko). Počet myší na vyhodnotenie obličkového tkaniva: pre myši divokého typu (WT), n=4 v 4., 12. a 20. týždni; pre TG myši n ¼ 7 v 4. týždni, n ¼ 8 v 16. týždni a n ¼ 9 vo veku 20 týždňov. Počet myší na vyhodnotenie plazmy a moču: pre WT myši, n ¼ 12 v 4. týždni, n ¼ 8 v 8. týždni, n ¼ 7 v 12. týždni a n ¼ 4 v 16. a 20. týždni; pre TG myši n=24 v 4. týždni, n=17 v 8. a 12. týždni a n=9 v 16. a 20. týždni. Údaje sú vyjadrené ako medián medzikvartilového rozsahu. Štatistická analýza Mann-Whitney U testom. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ****p="">< 0,0001.="" ns,="" nie="" je="" významné.="" ak="" chcete="" optimalizovať="" zobrazovanie="" tohto="" obrázka,="" pozrite="" si="" online="" verziu="" tohto="" článku="" na="" adrese="">

Obrázok 2|Transmisné elektrónové mikroskopické nálezy v modeli fibrózy obličiek indukovanej transformujúcim rastovým faktorom b1. Fixácia, manipulácia a odstránenie obličiek z myší sa uskutočnilo tak, ako je opísané v metódach. (a,b) Mikrovilózna transformácia a (a,b,d,e,g) vyhladenie výbežku chodidla (biele šípky) podocytov, (c – e) znížená fenestrácia glomerulárnej kapilárnej endotelu (žlté šípky), (f) zhrubnutie je prítomná glomerulárna bazálna membrána (hviezdičky) a (h,i) zvýšené ukladanie mezangiálnej matrice (biele šípky). CL, kapilárny lúmen. Ak chcete optimalizovať zobrazovanie tohto obrázka, pozrite si online verziu tohto článku na adrese www.kidney-international.org.

rhTM zlepšuje funkciu obličiek

hladiny proteínu viažuceho L-mastné kyseliny (197.0 oproti 313,4 pg/ml),molekula poškodenia obličiek1 (299,9 vs. 596,2 pg/ml), močovinový dusík v krvi (12,9 vs 34,8 mg/dl), kreatinín (0,5 vs. 1,4 mg/dl) a pomer albumín-kreatinín boli významne znížené v TGFb1-TG myši s renálnou fibrózou liečené rhTM v porovnaní s ich neliečenými TG náprotivkami (obrázok 5). Celkový proteín v moči a pomer celkového proteínu kreatinínu sa tiež znížil u myší TGFb1-TG liečených rhTM v porovnaní s ich neliečenými náprotivkami (obrázok 5).

rhTM znižuje apoptózu glomerulárnych buniek

Farbenie koncového značenia dUTP nick sprostredkované deoxynukleotidyltransferázou ukázalo významne znížený počet apoptotických buniek v glomerulách z TGFb1-TG myší liečených rhTM v porovnaní s glomerulami z TGFb1- TG myší liečených SAL (doplnkové Obrázok S10A a B). Štiepenie kaspázy-3 bolo tiež významne znížené v obličkových tkanivách od TGFb1-TG myší liečených rhTM v porovnaní s obličkovými tkanivami od TGFb1-TG myší liečených SAL (doplnkový obrázok S10C). Theobličkové tkaniváz myší TGFb1-TG liečených rhTM v porovnaní s myšami z TGFb1-TG liečených SAL vykazovali významné zvýšenie hladín mRNA B-bunkového lymfómu 2 (Bcl-2), B - extra veľký bunkový lymfóm (Bcl-XL), bakulovírusový inhibítor repetície apoptózy obsahujúci 5 (BIRC5, tiež známy ako survivín) a BIRC6 (Apollon) so zvýšeným pomerom Bcl-2-Bax (doplnkový obrázok S11 ).

Obrázok 3|Transgénna (TG) myš s ľudským transformujúcim rastovým faktorom b1 (TGFb1) má renálnu dysfunkciu. (a) Celkový proteín a (b) dusík močoviny v krvi (BUN) sa merali kolorimetrickými metódami a kreatinín enzymatickou metódou. Počet myší na vyhodnotenie plazmy a moču: pre myši divokého typu (WT) n ¼ 12 v 4. týždni, n=7 v 8. a 12. týždni a n=4 v 16. a 2. {21}} týždňov; pre TG myši, n =24 v 4. týždni, n=17 v 8. a 12. týždni a n=9 v 16. a 2. 0 týždni. Údaje sú vyjadrené ako medián ± medzikvartilový rozsah. Štatistická analýza Mann-Whitney U testom. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ****="" p=""><>

rhTM inhibuje apoptózu podocytov

Predošetrenie podocytov pomocou rhTM významne znížilo apoptózu podocytov kultivovaných v prítomnosti TGFb1, ako bolo hodnotené počtom buniek vo fáze subG1 (3,2 percenta oproti 5,2 percenta), terminálne deoxynukleotidyltransferázou sprostredkované dUTP nick end-labeling-pozitívne bunky ( 1.0 vs. 5,4 bunky/Fifield) a stupeň štiepenia kaspázou{12}} (pomery 0,9 oproti 1,1) (obrázok 6a–e). Skríning antiapoptotických faktorov v kultivovaných podocytoch ukázal, že rhTM významne zvyšuje expresiu mRNA antiapoptotického faktora Bcl-2 v porovnaní s expresiou v neošetrených bunkách (doplnkový obrázok S12). Expresia mRNA antiapoptotického faktora BIRC5 sa tiež zvýšila v bunkách ošetrených rhTM v porovnaní s expresiou v neošetrených bunkách (doplnkový obrázok S12). Expresia mRNA proapoptotického faktora Bax bola významne znížená liečbou rhTM v porovnaní so žiadnou liečbou (doplnkový obrázok S12). Liečba rhTM tiež významne inhibovala expresiu anexínu V a farbenia koncového značenia dUTP dUTP sprostredkovaného deoxynukleotidyltransferázou v podocytoch kultivovaných v prítomnosti peroxidu vodíka (doplnkový obrázok S13A–E) a za podmienok vysokej hladiny glukózy (doplnkový obrázok S14A–E ) ďalej potvrdzujúce antiapoptotické vlastnosti rhTM na podocytoch. Skúmanie dráhy antiapoptickej proteínkinázy B (Akt)25 ukázalo, že rhTM zosilnil fosforyláciu Akt v ľudských primárnych podocytoch kultivovaných v prítomnosti peroxidu vodíka alebo TGFb1 (doplnkový obrázok S15A a B). Potom sme izolovali podocyty z každej skupiny myší a hodnotili Akt fosforyláciu pomocou Western blottingu. V podocytoch izolovaných zo skupiny TGFb{{30}}TG/rhTM bola významne zvýšená fosforylácia Akt v porovnaní s podocytmi z neošetrenej skupiny (pomery 1,1 vs. 0,7) (doplnkový obrázok S16A a B).

Sprostredkovanie GPR15

Predchádzajúce štúdie uviedli, že TM aktivuje intracelulárne dráhy interakciou s receptorom fibroblastového rastového faktora 1 (FGFR1) areceptor spojený s G-proteínom15 (GPR15).26,27 Podocyty exprimujú FGFR128, ale či exprimujú GPR15, nie je jasné. Tu sme izolovali podocyty z každej skupiny myší a ukázali sme, že podocyty tiež exprimujú GPR15 (doplnkový obrázok S17A–E). Zistili sme, že podocyty zo zdravej kontroly a pacienta s glomerulosklerózou tiež exprimujú GPR15 (doplnkový obrázok S18). Aby sme objasnili, či FGFR1 alebo GPR15 sprostredkúva inhibičnú aktivitu rhTM na apoptózu podocytov, vyhodnotili sme antiapoptickú aktivitu rhTM v podocytoch ošetrených TGFb{12}} v prítomnosti inhibítora FGFR1 alebo po transfekcii buniek malou interferujúcou RNA (siRNA) proti FGFR1 alebo GPR15. Predbežné ošetrenie podocytov inhibítorom FGFR1 (doplnkový obrázok S19A a B) alebo siRNA FGFR1 (13,2 percenta vs. 7,9 percenta) (obrázok 7a a b) nebolo schopné zrušiť inhibičnú aktivitu rhTM na apoptózu podocytov. Transfekcia buniek siRNA GPR15 však úplne zrušila inhibičnú aktivitu rhTM (14,6 percenta vs. 13,8 percenta) naapoptóza podocytov(Obrázok 7a–c).

Obrázok 4|Rekombinantný ľudský trombomodulín (rhTM) inhibuje glomerulosklerózu a tubulointersticiálnu fibrózu. Rezy obličkového tkaniva boli zafarbené (a, b) kyselinou jodistou – Schiff a (c, d) Massonovým trichrómom a (e) potom kvantifikované pomocou skórovacieho systému alebo zobrazovacieho softvéru WinROOF. (e) Priemerná hodnota skupiny divokého typu (WT)/fyziologického roztoku (SAL) bola braná ako 100 percento. Štatistická analýza Mann-Whitney U testom. (f) Obsah hydroxyprolínu v tkanive sa meral kolorimetrickou metódou, koncentrácia kolagénu I-al (Col1a1) a periostínu enzýmovým imunotestom a expresia mRNA reverznou transkriptázou-polymerázovou reťazovou reakciou. Štatistická analýza Kruskal Wallis analýza rozptylu a opravený Dunn test. n=8 v každej skupine. Tyče {{10}} (a,c) 50 mm a (d) 20 mm. Údaje sú vyjadrené ako medián ± medzikvartilový rozsah. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" ****p="">< 0,0001.="" tg,="" transgénny;="" tgfb1,="" transformujúci="" rastový="" faktor="" b1.="" ak="" chcete="" optimalizovať="" zobrazovanie="" tohto="" obrázka,="" pozrite="" si="" online="" verziu="" tohto="" článku="" na="" adrese="">

rhTM inhibuje EMT podocytov

U myší TGFb1-TG/SAL bola v porovnaní s TGFb1-TG výrazne zväčšená plocha s pozitívnym zafarbením na podocin a aktín hladkého svalstva (a-SMA) (1,4 percenta oproti 11,2 percenta ) / rhTM myši (obrázok 8a a b). Potom sme kultivovali in vitro primárne ľudské podocyty, vopred ošetrené rhTM pred pridaním proteínu TGFb1 do kultivačného média. Morfológia podobná fibroblastom a zvýšená expresia a-SMA boli potlačené v podocytoch ošetrených rhTM v porovnaní s neošetrenými bunkami (doplnkový obrázok S20A). Okrem toho rhTM inhiboval expresiu mRNA fibronektínu a vimentínu, hoci zvýšil expresiu mRNA E-kadherínu v podocytoch v porovnaní s expresiou v neošetrených bunkách (doplnkový obrázok S20B). Členovia rodiny SMAD 2 (Smad2) a Smad3 hrajú rozhodujúcu úlohu v TGFb1-sprostredkovanom epiteliálno-mezenchymálnom prechode (EMT).29 Liečba pomocou rhTM významne potlačila aktiváciu Smad2 a Smad3 u TGFb1-TG myší v porovnaní s neliečenými TG myšami (obrázok 8c) a v ľudských podocytoch kultivovaných v prítomnosti TGFb1 (doplnkový obrázok S20C).29 TG myši liečené rhTM (TGFb1-TG/rhTM) tiež vykazujú menšiu expresiu a-SMA (3,7 percenta vs. 17,2 percenta) v tubulárnych epiteliálnych bunkách v porovnaní s ich neošetrenými náprotivkami (doplnkový obrázok S21A a B).

Obrázok 5|Rekombinantný ľudský trombomodulín (rhTM) zlepšuje poškodenie obličiek a renálnu dysfunkciu. Kreatinín bol meraný enzymatickou metódou; celkový obsah bielkovín kolorimetrickou metódou; a dusík močoviny v krvi (BUN) a albumín, molekula 1 poškodenia obličiek (KIM-1), proteín viažuci L-mastné kyseliny (L-FABP) a celkový transformujúci rastový faktor b1 (TGFb1) pomocou enzýmového imunitného testu. n=8 v každej skupine. Údaje sú vyjadrené ako medián ± interkvartilný rozsah. Štatistická analýza pomocou Kruskal-Wallisovej analýzy rozptylu a nekorigovaného Dunnovho testu. * P < {{10}}.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" ****="" p="">< 0,0001,="" #p="0.06." ns,="" nevýznamné;="" sal,="" fyziologický="" roztok;="" tg,="" transgénny;="" wt,="" divoký="">

GPR15 sprostredkováva inhibičnú aktivitu rhTM na EMT

Transfekcia podocytov siRNA FGFR1 nebola schopná zrušiť inhibičnú aktivitu rhTM na relatívne expresie mRNA kolagénu I-al a a-SMA v podocytoch ošetrených TGFb 1- (doplnkový obrázok S22). Transfekcia buniek s GPR15 siRNA však významne zrušila inhibičnú aktivitu rhTM na relatívne expresie mRNA kolagénu I-al a a-SMA v podocytoch ošetrených TGFb{10}} (doplnkový obrázok S22).

DISKUSIA

TGFb1 a poškodenie glomerulárnych buniek

Spoločným dôsledkom porúch spôsobujúcich CKD je renálna fibróza.8,30,31 TGFb1 je bežným hnacím motorom fibrogenézy v obličkách spojenej s CKD spôsobenou chorobami vrátane DM, arteriálnej hypertenzie a autoimunitných porúch.10 Bunky z glomerulov a tubulointersticiálnych priestorov môže vylučovať latentné formy TGFb1, ktoré pri nadmernej aktivácii počas poškodenia tkaniva môžu viesť k zjazveniu obličiek.32 Keďže TGFb1 môže stimulovať svoju vlastnú sekréciu, fibrotický proces sa vo všeobecnosti stáva začarovaným kruhom.8 Skorá udalosť v patogénnom procese TGFb 1- sprostredkovanéfibróza obličiekje poranenie podocytov a glomerulárnych endotelových buniek.33–35 Plazmatická hladina solubilnej TM je markerom poškodenia endotelu. V súlade s úlohou TGFb1 pri poškodení obličkových buniek sme tu zistili významnú koreláciu aktívneho TGFb1 s rozpustným TM, rozpustným podocínom a kreatinínom v plazme od pacientov s DM. Presluchy medzi glomerulárnymi endotelovými bunkami a podocytmi počas apoškodenie obličiekvedie k lokálnej expresii proteáz spôsobujúcich degradáciu glomerulárnej bazálnej membrány.34–36 To môže vysvetliť detekciu solubilného podocínu a jeho významnú koreláciu so solubilným TM u našich pacientov s DM.

Obrázok 6|Rekombinantný ľudský trombomodulín (rhTM) potláča apoptózu podocytov indukovanú transformujúcim rastovým faktorom b1 (TGFb1). (a) rhTM sa pridal do kultivačného média podocytov 1 hodinu pred indukciou apoptózy s 10 ng/ml TGFb1 počas 48 hodín. ( b ) Percento buniek vo fáze subG1 sa detegovalo ďalšou cytometriou. (a,b) n=3 v každej skupine. (c,d) Počet buniek s fragmentáciou DNA sa meral analýzou koncového značenia dUTP nick end-labeling (TUNEL) sprostredkovanou terminálnou deoxynukleotidyltransferázou (n=3 vo fyziologickom roztoku [SAL]/SAL a rhTM/SAL skupiny; n=6 v skupinách SAL/TGFb1 a rhTM/TGFb1) a (e) stupeň štiepenia kaspázou-3 sa meral pomocou Western blottingu (n=4 v každej skupine). Pruhy=100 mm. Údaje sú vyjadrené ako medián ± medzikvartilový rozsah. Štatistická analýza Mann-Whitney U testom. *P < 0,05.="" dapi,="" 40,="" 6-diamidino-2-fenylindol;="" hpf,="" vysokovýkonné="" pole;="" ns,="" nie="" je="" významné.="" histogramy="" sa="" zobrazujú="" ako="" percento="" max="" (percento="" maximálnej="" hodnoty),="" pričom="" každá="" krivka="" sa="" škáluje="" do="" režimu="100" percent.="" ak="" chcete="" optimalizovať="" zobrazovanie="" tohto="" obrázka,="" pozrite="" si="" online="" verziu="" tohto="" článku="" na="" adrese="">

Ľudská fibróza obličiek spojená s nadmernou expresiou TGFb1 špecifická pre podocyty

Liečivo, ktoré môže pôsobiť proti účinku TGFb1, by bolo ideálne na blokovanie fibrózy obličiek. Tu sme vytvorili TG myš nadmerne exprimujúcu ľudský gén TGFb1 v glomerule, u ktorej sa vyvíja spontánna a progresívna glomerulárna skleróza a tubulointersticiálna fibróza so zlyhaním obličiek už 4 týždne po narodení. Model ukazuje pokročilú glomerulopatiu s poranením podocytov a glomerulárnych endotelových buniek; zhrubnutie glomerulárnej bazálnej membrány a mezangiálna expanzia s intersticiálnym zjazvením; zvýšené markery poškodenia obličkového tkaniva a renálnej dysfunkcie; a zvýšený TGFb1 v plazme,obličkové tkanivoa moč. Zvýšenie vylučovania proteínov, TGFb1 močom a aktivácia komplementového systému môže vysvetliť súčasný vývoj intersticiálneho zjazvenia v našom súčasnom modeli.37–40 Ďalšie experimenty odhalili zvýšený výskyt apoptotických buniek a aktiváciu proteínov Smad v tkanive obličiek z neošetreného TGFb{ {3}}TG myši v porovnaní s WT myšami. Celkovo tieto zistenia poukazujú na túto novú myš TGFb1-TG ako vhodný model na objavovanie liekov vfibróza obličiek.

Obrázok 7|Receptor spojený s G-proteínom (GPR15) sprostredkuje inhibíciu apoptózového rekombinantného ľudského trombomodulínu (rhTM) v podocytoch. Ľudské primárne podocytové bunky boli transfekované fibroblastovým rastovým faktorom receptora 1 (FGFR1), malou interferujúcou RNA (siRNA), GPR15 siRNA alebo zmiešanou siRNA počas 48 hodín, a potom sa k bunkovej kultúre pridal rhTM 1 hodinu pred ošetrením transformujúcim rastovým faktorom b1. (TGFb1). Apoptotické bunky boli (a) hodnotené ďalšou cytometriou a (b) potom kvantifikované. (c) Bunkové lyzáty sa pripravili na Western blotting. n{{10}} v každej skupine. Údaje sú vyjadrené ako medián ± medzikvartilový rozsah. Štatistická analýza Mann-Whitney U testom. *P < 0,05,="" #p="0.1." sal,="" fyziologický="">

Obrázok 8|Inhibícia epitelovo-mezenchymálneho prechodu rekombinantným ľudským trombomodulínom (rhTM). ( a ) Podocin a a-aktín hladkého svalstva (a-SMA) boli zafarbené, ako je opísané v metódach. (b) Oblasť pozitívna na farbenie a-SMA bola kvantifikovaná softvérom na spracovanie obrazu WinROOF. n=3 v skupinách divokého typu (WT)/fyziologický roztok (SAL) a WT/rhTM a n=5 vtransformujúci rastový faktor-b1-transgénny(TGFb{{0}}TG)/SAL a TGFb1-TG/rhTM skupiny. (c) Celkové (t) a fosforylované (p) proteíny člena rodiny SMAD (Smad) boli hodnotené pomocou Western blottingu. n=8 v každej skupine. Údaje sú vyjadrené ako medián ± medzikvartilový rozsah. Štatistická analýza pomocou Kruskal-Wallisovej analýzy rozptylu a korigovaného Dunnovho testu. *P < 0.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" #p="0,08." ak="" chcete="" optimalizovať="" zobrazovanie="" tohto="" obrázka,="" pozrite="" si="" online="" verziu="" tohto="" článku="" na="" adrese="">

rhTM zlepšuje fibrózu obličiek

Ukázali sme, že rhTM zlepšuje pľúcnu fibrózu vyvinutú u myší nadmerne exprimujúcich ľudský TGFb1 v pľúcach potlačením apoptózy alveolárnych epitelových buniek.41 Klinické štúdie tiež preukázali zlepšenie idiopatickej pľúcnej fibrózy po liečbe rhTM.42,43 Tieto predchádzajúce pozorovania naznačujú potenciál na terapiu orgánovej fibrózy. Predpokladali sme, že rhTM by bol účinný pri fibróze obličiek spojenej s TGFb{4}}. Na testovanie tejto hypotézy sme liečili TGFb1-TG myši špecifické pre obličky pomocou rhTM.44. Podávanie rhTM počas 4 týždňov významne zmiernilo poškodenie, dysfunkciu a fibrózu obličiek. Myši liečené rhTM vykazovali nízke hladiny celkového proteínu, albumínu, TGFb1, C5a v moči a znížené renálne hladiny profibrotických cytokínov, C5a a HMGB1.45. Terapia s rhTM tiež inhibovala apoptózu aj EMT podocytov. rhTM však nevykazoval žiadny vplyv na trombínový antitrombínový komplex, marker aktivácie koagulácie, hoci zvýšil tvorbu APC, antikoagulačného faktora s protizápalovou a antiapoptotickou aktivitou.23 Stojí za zmienku, že trombín, prokoagulačný enzým, môže paradoxne podporujú antikoaguláciu pri nízkom stupni protrombotických stavov tvorbou komplexu TM/trombín, ktorý zvyšuje tvorbu antikoagulačného APC. Trombín však funguje hlavne ako prokoagulant pri nadmerných protrombotických stavoch (napr. pri sepse).46 Tento dvojitý a paradoxný účinok trombínu môže vysvetliť zjavnú neúčinnosť rhTM pri inhibícii aktivácie koagulácie v našom modeli, ktorý je v nízkom protrombotickom stave . Celkovo tieto pozorovania naznačujú, že rhTM zlepšuje progresívnu fibrózu a dysfunkciuobličkypredĺžením prežitia alebo prevenciou EMT glomerulárnych buniek a potlačením zápalu, aktivácie komplementu a aktivity rastového faktora priamo alebo nepriamo prostredníctvom aktivácie dráhy proteínu C a zníženia expresie HMGB1. Zlepšenie diabetickej nefropatie u myší so zvýšenou cirkulujúcou TM doménou podobnou lektínu a zhoršenie ochorenia u myší, ktorým chýba doména podobná lektínu, podporujú priaznivý účinok rhTM na fibrózu obličiek.20,21

Inhibícia apoptózy podocytov

Podocyty hrajú rozhodujúcu úlohu pri udržiavaní glomerulárnej filtračnej bariéry a tvorbe štrbinovej membrány, aby sa zabránilo strate základných cirkulujúcich proteínov.47Poranenie obličiekspôsobené reaktívnymi formami kyslíka, vysokou hladinou glukózy alebo zápalovými mediátormi vrátane TGFb1 indukujú apoptózu podocytov vedúcu k deplécii podocytov, ktorá môže nakoniec spôsobiť renálnu dysfunkciu.47 Po naviazaní a aktivácii transmembránového heteromérneho receptorového komplexu serín/treonínkinázy typu I a typu II TGFb1 vysiela intracelulárne signály prostredníctvom transkripčných faktorov rodiny Smad alebo prostredníctvom signálnych dráh nezávislých od Smad.48 K aktivácii dráhy závislej od Smad dochádza, keď aktivovaný receptor TGFb1 fosforyluje Smad2 a Smad3, ktoré sa Smad4 translokujú do jadra.49 Smad2/ Komplex Smad3/Smad4 stimuluje transkripciu proapoptotických faktorov a znižuje transkripciu antiapoptotických faktorov vedúcich k apoptóze buniek.49 V súlade s tým sme zistili vysokú renálnu hladinu proapoptotického faktora Bax a nízku hladinu antiapoptotických faktorov Bcl2 a Bcl-XL u TGFb1- TG myší. TM môže inhibovať apoptózu rôznych typov buniek.21,41,49 V súlade s tým sme tu zistili, že rhTM inhibuje apoptózu podocytov indukovanú peroxidom vodíka, vysokým obsahom glukózy alebo TGFb1 a toto zistenie môže vysvetliť priaznivý účinok rhTM na CKD . Okrem toho rhTM naklonil rovnováhu smerom k inhibícii apoptózy znížením expresie Bax, zvýšením expresie Bcl2, Bcl-XL, BIRC5 a BIRC6 a zvýšením aktivácie Akt dráhy vobličkové tkanivá. Celkovo tieto pozorovania naznačujú, že rhTM stimuluje prežitie podocytov uprednostňovaním aktivácie Akt a expresie antiapoptotického faktora.

cistanche pre chronické ochorenie obličiek

Inhibícia EMT

EMT podocytov tiež prispieva k renálnej fibróze. Podocyty, ktoré podstupujú EMT, uvoľňujú proteíny extracelulárnej matrice, ktoré sa akumulujú a ukladajú počas renálnej fifibrogenézy spojenej s TGFb1-.50 TGFb1 podporuje EMT prostredníctvom receptorom sprostredkovanej aktivácie komplexu Smad2/Smad3/Smad4. Fosforylovaný Smad3 podporuje EMT stimuláciou transkripcie matricových proteínov a znížením expresie epiteliálnych markerov.51 V súlade s tým sme zistili zvýšenú EMT podocytov u TGFb1-TG myší a podocytov kultivovaných v prítomnosti TGFb1 alebo pod oxidačné alebo vysokoglukózové podmienky. Predchádzajúce správy naznačovali, že rhTM potláča EMT.52,53 Tu sme zistili, že rhTM inhibuje EMT podocytov a tubulointersticiálnych epiteliálnych buniek u TGFb1-TG myší. Zdá sa, že inhibícia aktivácie proteínu Smad je mechanizmom priaznivého účinku rhTM na EMT, pretože TGFb1-TG myši a primárne podocyty liečené rhTM vykazovali významne zníženú fosforyláciu Smad2 a Smad3 v porovnaní s neliečenými stavmi. Tieto zistenia podporujú inhibičnú aktivitu TM na EMT.

Sprostredkovanie receptorov v ochrannej aktivite rhTM

Predchádzajúce štúdie ukázali, že GPR15 alebo FGFR1 sprostredkúva cytoprotektívnu aktivitu TM.26,27,54 Testovali sme, či tieto receptory sprostredkúvajú ochrannú aktivitu rhTM proti apoptóze a EMT. Zatiaľ čo downregulácia proteínu GPR15 pomocou siRNA úplne zrušila supresívnu aktivitu rhTM na apoptózu podocytov sprostredkovanú TGFb1-, ani FGFR1 siRNA, ani jej inhibítor ju nezrušili, čo naznačuje, že GPR15 sprostredkúva ochrannú aktivitu rhTM. V kultivovaných podocytoch a podocytoch izolovaných z TGFb1-TG myší po liečbe rhTM bola zvýšená fosforylácia Akt, čo naznačuje zapojenie intracelulárnej Akt dráhy. Práca, ktorá ukazuje, že rhTM aktivuje dráhu Akt v endotelových bunkách podporuje toto zistenie.55 Aktivácia signálnej dráhy Akt môže ďalej zosilniť účinok rhTM zvýšením povrchovej expresie GPR15.56 Tieto pozorovania naznačujú, že rhTM chráni podocyty pred apoptózou v našom TGFb{ {13}} TG myši aktiváciou osi GPR15/Akt, čo vedie k zvýšenej expresii antiapoptotických faktorov a zníženiu expresie proapoptotických faktorov.57 Na druhej strane predchádzajúce štúdie ukázali, že anafylatoxíny C3a a C5a prostredníctvom ich GPR môžu prispieť k CKD poranením podocytov a že APC môže inhibovať apoptózu podocytov a fibrózu obličiek prostredníctvom svojho endotelového receptora proteínu C a receptora aktivovaného proteázou 1.23,58–61 Tu sme zistili, že rhTM inhibuje systém komplementu a zvyšuje tvorbu APC. Preto okrem aktivácie dráhy GPR15/Akt, inhibícia faktorov komplementu a zvýšená aktivácia proteínu C a jeho receptorov môžu tiež vysvetliť priaznivé účinky rhTM v našom TGFb1-spojenom smodel fibrózy obličiek.

Okrem toho downregulácia GPR15, ale nie regulácia FGFR1, blokovala inhibičný účinok rhTM na EMT, čo naznačuje, že GPR15 tiež sprostredkúva túto ochrannú aktivitu rhTM. Inhibícia proteínov Smad sa podieľa na supresii EMT, pretože liečba pomocou rhTM inhibovala fosforyláciu Smad2 aj Smad3 u TGFb1-TG myší a kultivovaných podocytov. Presný mechanizmus inhibície proteínu Smad prostredníctvom GPR15 je však nejasný. Niektoré dôkazy ukazujú, že dráha Akt môže presahovať a regulovať signálnu dráhu Smad62–64 a že Akt môže zabrániť fosforylácii Smad3 priamou interakciou s nefosforylovaným Smad3, aby ho sekvestroval mimo jadra, čo vedie k inhibícii transkripcie a EMT.62– 64 Na základe týchto správ je možné si predstaviť, že Akt aktivovaný po naviazaní rhTM na GPR15 sekvestruje nefosforylovaný Smad3, čo vedie k inhibícii EMT podocytov. Stojí za zmienku, že tento Akt-sprostredkovaný priaznivý účinok sa pozoruje iba v nemalígnych bunkách.65–67 V malígnych bunkách môže interakcia TGFb1 s jeho receptormi priamo aktivovať fosfoinozitidovú 3-kinázovú/Akt/slimači dráhu a spôsobiť EMT.65–67 Výsledky našej štúdie celkovo podporujú úlohu GPR15 ako receptora sprostredkujúceho priaznivé účinky rhTM na podocyty.

Záver

V súhrne tu uvádzame prvýkrát novú transgénnu TG myš nadmerne exprimujúcu celý ľudský gén TGFb1 v plnej dĺžke špecificky v glomerulách, u ktorých sa vyvíja spontánna a progresívna glomerulárna skleróza, tubulointersticiálna fibróza azlyhanie obličieka zlepšenie potvrdenej fibrózy obličiek/zlyhanie obličiek interakciou rhTM s GPR15, ktorá inhibuje apoptózu a mezenchymálny prechod podocytov.

METÓDY

Generovanie myši TGFb1 BAC TG

Myš TGFb1-BAC-TG exprimujúca kompletný ľudský gén TGFb1 pod kontrolou promótora myšieho podocínu bola vytvorená pronukleárnou injekciou do 392 myších embryí C57BL/6J (CLEA Japan, Inc., Tokio, Japonsko). Hodnotili sme zakladateľov TG a prenos zárodočnej línie konštruktu BAC TG pomocou Southern blotting (doplnkové materiály a metódy).

Pokusné zvieratá

Myši TGFb{0}}TG boli pred použitím v experimentoch chované viac ako 10 generácií na pozadí C57BL/6. Ako kontrolné zvieratá sa použili WT súrodenci. Všetky zvieratá boli chované v špecifickom prostredí bez patogénov a vystavené 12-hodinovému cyklu svetlo-tma pri teplote a vlhkosti okolia v rozsahu od 22 stupňov do 26 stupňov a 40 percent a 70 percent a s prístupom ad libitum na jedlo a vodu v dome zvierat Mie University (doplnkové materiály a metódy).

Etické vyhlásenie

Výbor pre bezpečnosť experimentov s rekombinantnou DNA (schválenie č. I-629; dátum: 19. septembra 2013) a Výbor pre výskum zvierat Mie University (číslo schválenia 27-4; dátum: 19. augusta 2015) schválil protokoly štúdie. Všetky postupy na zvieratách boli vykonané v súlade s inštitucionálnymi smernicami Mie University a podľa medzinárodne schválených zásad starostlivosti o laboratórne zvieratá publikovaných Národným inštitútom zdravia (https://olaw.nih.gov/).

Pre klinické skúšanie dali všetci pacienti a zdraví jedinci písomný informovaný súhlas a protokol štúdie bol schválený Etickou komisiou pre klinické skúšanie Mie University (schválenie č. 1043 a 2194).

Experimentálny dizajn

Pre charakterizáciuobličkymodel fibrózy, rozdelili sme samcov myší TGFb{{0}}TG myší (n=24) a samcov myší WT (n=12) vo veku 4 týždňov a s hmotnosťou 20 až 23 g do 3 skupiny s 8 myšami TGF b1-TG a 4 myšami WT v každej skupine. Myši z každej skupiny WT a TGFb1-TG boli usmrtené v 0., 8. alebo 16. týždni, aby sa odobrali vzorky moču, krvi a obličiek na vyhodnotenie zmien parametrov fibrózy a funkcie obličiek v priebehu času.

Na vyhodnotenie terapeutickej účinnosti rhTM (rhTM láskavo poskytla spoločnosť Asahi Kasei Pharma Corporation, Tokio, Japonsko) pri renálnej fibróze, TGFb1-TG myšiach (n= 8) alebo WT súrodencom (n {{2 }}) boli liečené rhTM (3 mg/kg) ip injekciou, 3-krát týždenne počas 4 týždňov pred usmrtením myší. TGFb1-TG myši (n =8) alebo WT súrodenci (n= 8), ktoré dostávali rovnaké množstvo fyziologického SAL ip injekciou, boli použité ako negatívne kontrolné myši.

Protokol tejto štúdie sa riadil pokynmi Animal Research: Reporting of In vivo Experiments (ARRIVE) pre výskum na zvieratách. Myši boli randomizované a výskumníci, ktorí merali parametre, boli zaslepení voči liečebným skupinám.

Biochemická analýza

Koncentrácie celkového proteínu (BCA proteínová testovacia súprava; Pierce, Rockford, IL), TGFb1 (R&D System, Minneapolis, MN), monocytový chemoatraktant proteín-1 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA), trombínový antitrombínový komplex (Cedarlane Laboratories, Hornby, Ontario, Kanada) boli merané s použitím komerčných súprav pre enzýmový imunotest podľa pokynov výrobcu (doplnkové materiály a metódy).

Bunková kultúra

Primárne bunky ľudských podocytov boli zakúpené od CELPR OGEN (Torrance, CA). Primárne bunky ľudských podocytov boli kultivované v Dulbeccovom modifikovanom Eagle médiu vo zvlhčenej atmosfére s 5 percentami CO2 pri 37 stupňoch. Médium bolo doplnené 10 percentami tepelne inaktivovaného fetálneho bovinného séra (Bio Whittaker, Walkersville, MD), 100 IU/ml penicilínu, 100 mg/ml streptomycínu a L-glutamínu (doplnkové materiály a metódy).

Štatistická analýza

Údaje sú vyjadrené ako medián ± interkvartilný rozsah. Štatistický rozdiel medzi premennými sa vypočítal Kruskal-Wallisovou analýzou rozptylu s post hoc analýzou s použitím Dunnovho testu. Na vyhodnotenie rozdielov medzi 2 skupinami bol použitý Mann-Whitney U test. Štatistické analýzy boli vykonané pomocou GraphPad Prism verzie 8.0.1 (GraphPad Software, San Diego, CA). Štatistická významnosť sa považovala za P <>

DISCLOSURE

EKG, CND-G a YY majú patent na myš TGFb1-TG srenálna fibrózapoužité v tejto štúdii. CND-G a YY získali grant od Ministerstva školstva, kultúry, športu, vedy a technológie Japonska na túto štúdiu. ECG, TY, CND-G a MT získali grant od Shionogi Pharmaceuticals. Všetci ostatní autori nedeklarovali žiadne konkurenčné záujmy.

POĎAKOVANIE

Tento výskum bol čiastočne podporený grantmi Ministerstva školstva, kultúry, športu, vedy a technológie Japonska (Kakenhi č. 17K09824 pre YY; Kakenhi č. 17K08442 pre CND-G) a čiastočne grantom od Shionogi & Co, Ltd., Japonsko. Investori nezohrávali žiadnu úlohu pri navrhovaní štúdie, analýze údajov, rozhodovaní o publikovaní alebo príprave rukopisu.

Časť tejto práce bola publikovaná v abstraktnej forme.

AUTORSKÉ PRÍSPEVKY

AT pripravil model choroby a napísal prvý návrh rukopisu. TY, KN, TT, RI a CND-G pripravili modely chorôb a merané parametre. AM a SW vykonali transmisnú mikroskopickú štúdiu. MT, YO a AU merali parametre a uskutočňovali in vitro experimenty. YT, LQ, TK a VFD poskytli intelektuálne príspevky. YY a EKG opravili návrh rukopisu a navrhli štúdiu.

cistanche na príznaky zlyhania obličiek

DOPLNKOVÝ MATERIÁL

Doplnkový súbor (PDF) Doplnkové materiály a metódy.

Tabuľka S1. Charakteristika predmetov.

Tabuľka S2. Priméry pre RT-PCR myších tkanív.

Tabuľka S3. Priméry pre RT-PCR ľudských podocytov.

Obrázok S1. Rozpustné fragmenty trombomodulínu korelujú s TGFb1 a kreatinínom u pacientov s DM.

Obrázok S2. Konštrukt ľudského TGFb1 – bakteriálneho umelého chromozómu (BAC). Obrázok S3. Zakladateľské myši exprimujúce celú dĺžku ľudského génu TGFb1.

Obrázok S4. Charakterizácia transgénnej myši s transformujúcim rastovým faktorom b1 špecifickým pre glomeruly.

Obrázok S5. Ľudská transgénna myš TGFb1 má zvýšené markery poškodenia obličiek.

Obrázok S6. Terapia rekombinantným ľudským trombomodulínom (rhTM) znižuje proces vyhladzovania podocytov na nohách a zhrubnutie glomerulárnej bazálnej membrány.

Obrázok S7. TGFb1 transgénne myši liečené rekombinantným ľudským trombomodulínom (rhTM) majú nízku koncentráciu profibrotických faktorov a HMGB1 v obličkovom tkanive. Obrázok S8. Terapia rekombinantným ľudským trombomodulínom (rhTM) zvyšuje tvorbu aktivovaného proteínu C, inhibuje komplementový systém, znižuje cirkulujúci rozpustný podocin, hoci nemá žiadny vplyv na koagulačný systém u TGFb1 transgénnych myší.

Obrázok S9. Liečba rekombinantným ľudským trombomodulínom (rhTM) znižuje koncentráciu podocínu v moči.

Obrázok S10. Liečba rekombinantným ľudským trombomodulínom (rhTM) znižuje apoptózu glomerulárnych buniek.

Obrázok S11. Liečba fibrózy obličiek spojenej s nadmernou expresiou TGFb{1}} pomocou rekombinantného ľudského trombomodulínu (rhTM) inhibuje apoptózu v obličkovom tkanive.

Obrázok S12. Rekombinantný ľudský trombomodulín (rhTM) zvyšuje expresiu antiapoptotických faktorov v podocytoch.

Obrázok S13. Rekombinantný ľudský trombomodulín (rhTM) potláča apoptózu podocytov indukovanú peroxidom vodíka.

Obrázok S14. Rekombinantný ľudský trombomodulín (rhTM) potláča apoptózu podocytov vyvolanú vysokými hladinami glukózy.

Obrázok S15. Rekombinantný ľudský trombomodulín (rhTM) zvyšuje aktiváciu Akt dráh v podocytoch.

Obrázok S16. Liečba rekombinantným ľudským trombomodulínom (rhTM) zvyšuje fosforyláciu Akt v podocytoch myší TGFb1-TG.

Obrázok S17. Podocyty z každej liečenej skupiny myší exprimujú GPR15 mRNA.

Obrázok S18. Farbenie GPR15 v podocytoch od zdravého jedinca a pacienta s fokálnou segmentálnou glomerulosklerózou.

Obrázok S19. Receptor fibroblastového rastového faktora-1 sa nezúčastňuje na inhibičnej aktivite rekombinantného ľudského trombomodulínu (rhTM) v podocytoch.

Obrázok S20. Rekombinantný ľudský trombomodulín (rhTM) inhibuje epitelovo-mezenchymálny prechod podocytov.

Obrázok S21. Liečba rekombinantným ľudským trombomodulínom (rhTM) inhibuje expresiu a-aktínu hladkého svalstva v obličkových tubuloch.

Obrázok S22. Receptor spojený s G-proteínom (GPR15) sprostredkováva inhibičnú aktivitu rekombinantného ľudského trombomodulínu (rhTM) na epitelovo-mezenchymálny prechod podocytov.

Doplnkové referencie.

LITERATÚRA

1. Webster AC, Nagler EV, Morton RL, a kol. Chronické ochorenie obličiek. Lancet. 2017;389:1238–1252.

2. Bello AK, Levin A, Tonelli M, a kol. Hodnotenie globálneho stavu zdravotnej starostlivosti o obličky. JAMA. 2017;317:1864–1881.

3. Levin A, Tonelli M, Bonventre J, a kol. Globálne zdravie obličiek 2017 a neskôr: plán na odstránenie medzier v starostlivosti, výskume a politike. Lancet. 2017;390:1888–1917.

4. Ackland P. Prevalencia, detekcia, hodnotenie a manažment chronického ochorenia obličiek. BMJ. 2014;348:f7688.

5. Turner JM, Bauer C, Abramowitz MK, a kol. Liečba chronického ochorenia obličiek. Kidney Int. 2012;81:351–362.

6. Breyer MD, Susztak K. Ďalšia generácia terapeutík pre chronické ochorenie obličiek. Nat Rev Drug Discov. 2016;15:568–588.

7. Liu Y. Renálna fibróza: nové pohľady na patogenézu a terapeutiká. Kidney Int. 2006;69:213–217.

8. Liu Y. Bunkové a molekulárne mechanizmy renálnej fibrózy. Nat Rev Nephrol. 2011;7:684–696.

9. Xavier S, Vasko R, Matsumoto K, a kol. Obmedzenie endotelovej signalizácie TGF-beta je dostatočné na zníženie endotelovo-mezenchymálneho prechodu a fibrózy pri CKD. J Am Soc Nephrol. 2015;26:817–829.

10. Higgins SP, Tang Y, Higgins CE, a kol. Signalizácia TGF-beta1/p53 v renálnej fifibrogenéze. Cell Signal. 2018;43:1–10.

11. Conway EM. Trombomodulín a jeho úloha pri zápale. Semin Immunopathol. 2012;34:107–125.

12. Martin FA, Murphy RP, Cummins PM. Trombomodulín a vaskulárny endotel: pohľad na funkčné, regulačné a terapeutické aspekty. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2013;304:H1585–H1597.

13. Morser J. Trombomodulin spája koaguláciu so zápalom a imunitou. Curr Drogové ciele. 2012;13:421–431.

14. Roeen Z, Toda M, D'Alessandro-Gabazza CN, a kol. Trombomodulín inhibuje aktiváciu eozinofilov a žírnych buniek. Cell Immunol. 2015;293:34–40.

15. Takagi T, Taguchi O, Toda M, et al. Inhibícia alergickej bronchiálnej astmy trombomodulínom je sprostredkovaná dendritickými bunkami. Am J Respir Crit Care Med. 2011;183:31–42.

16. Tateishi K, Imaoka M, Matsushita M. Duálne modulačné funkcie trombomodulínu v alternatívnej komplementovej dráhe. Biosci Trends. 2016;10:231–234.

17. Toda M, D'Alessandro-Gabazza CN, Takagi T, a kol. Trombomodulín moduluje dendritické bunky prostredníctvom antagonizmov proteínu B1 skupiny s vysokou mobilitou a nezávislého mechanizmu. Allergol Int. 2014;63:57–66.

18. Van de Wouwer M, Plaisance S, De Vriese A, et al. Doména trombomodulínu podobná lektínu interferuje s aktiváciou komplementu a chráni pred artritídou. J Thromb Haemost. 2006;4:1813–1824.

19. Sharfuddin AA, Sandoval RM, Berg DT a kol. Rozpustný trombomodulín chráni ischemické obličky. J Am Soc Nephrol. 2009;20:524–534.

20. Wang H, Vinnikov I, Shahzad K, a kol. Doména trombomodulínu podobná lektínu zlepšuje diabetickú glomerulopatiu prostredníctvom inhibície komplementu. Thromb Haemost. 2012;108:1141–1153.

21. Yang SM, Ka SM, Wu HL a kol. Trombomodulínová doména 1 zlepšuje diabetickú nefropatiu u myší prostredníctvom zápalu sprostredkovaného anti-NF-kappaB/NLRP3 zápalom, zvýšením antioxidačnej aktivity NRF2 a inhibíciou apoptózy. Diabetológia. 2014;57:424–434.

22. Ohlin AK, Larsson K, Hansson M. Aktivita rozpustného trombomodulínu a rozpustný trombomodulínový antigén v plazme. J Thromb Haemost. 2005;3: 976–982.

23. Gil-Bernabe P, D'Alessandro-Gabazza CN, Toda M, et al. Exogénne aktivovaný proteín C inhibuje progresiu diabetickej nefropatie. J Thromb Haemost. 2012;10:337–346.

24. Yasuma T, Yano Y, D'Alessandro-Gabazza CN, a kol. Zlepšenie cukrovky proteínom S. Diabetes. 2016;65:1940–1951.

25. Havasi A, Borkan SC. Apoptóza a akútne poškodenie obličiek. Kidney Int. 2011;80:29–40.

26. Kuo CH, Sung MC, Chen PK, a kol. FGFR1 sprostredkuje angiogenézu indukovanú rekombinantnou trombomodulínovou doménou. Cardiovasc Res. 2015;105:107–117.

27. Pan B, Wang X, Kojima S, a kol. Piata oblasť trombomodulínu podobná epidermálnemu rastovému faktoru zmierňuje sepsu indukovanú LPS prostredníctvom interakcie s GPR15. Thromb Haemost. 2017;117:570–579.

28. Lu Y, Ye Y, Bao W, a kol. Celogenómová identifikácia génov nevyhnutných pre podocytové cytoskelety na základe jednobunkového sekvenovania RNA. Kidney Int. 2017;92:1119–1129.

29. Vigolo E, Marko L., Hinze C a kol. Kanonická signalizácia BMP v tubulárnych bunkách sprostredkuje zotavenie po akútnom poškodení obličiek. Kidney Int. 2019;95:108–122.

30. Nangaku M. Chronická hypoxia a tubulointersticiálne poškodenie: posledná spoločná cesta k zlyhaniu obličiek v konečnom štádiu. J Am Soc Nephrol. 2006;17: 17–25.

31. Thomas R., Kanso A., Sedor JR. Chronické ochorenie obličiek a jeho komplikácie. Prim Care. 2008;35:329–344, vii.

32. Mozes MM, Bottinger EP, Jacot TA a kol. Renálna expresia proteínov fibrotickej matrice a izoforiem transformujúceho rastového faktora-beta (TGF-beta) u TGF-beta transgénnych myší. J Am Soc Nephrol. 1999;10:271–280.

33. Arif E, Solanki AK, Srivastava P, a kol. Motorický proteín Myo1c reguluje signalizáciu transformujúceho rastového faktora beta a fibrózu v podocytoch. Kidney Int. 2019;96:139–158.

34. Ebefors K, Wiener RJ, Yu L, a kol. Endotelínový receptor-A sprostredkováva degradáciu glomerulárnej endotelovej povrchovej vrstvy prostredníctvom patologického presluchu medzi aktivovanými podocytmi a glomerulárnymi endotelovými bunkami. Kidney Int. 2019;96:957–970.

35. Fu J, Lee K, Chuang PY a kol. Poškodenie glomerulárnych endotelových buniek a krížové hovory pri diabetickej chorobe obličiek. Am J Physiol Renálny Physiol. 2015;308:F287– F297.

36. Masum MA, Ichii O, Elewa YHA a kol. Modifikovaná skenovacia elektrónová mikroskopia odhaľuje patologické presluchy medzi endotelovými bunkami a podocytmi na myšacom modeli membranoproliferatívnej glomerulonefritídy. Sci Rep. 2018;8:10276.

37. Abbate M, Zoja C, Rottoli D, et al. Proximálne tubulárne bunky podporujú fifibrogenézu indukciou peritubulárnych myofifibroblastov sprostredkovanou TGF-beta1-. Kidney Int. 2002;61:2066–2077.

38. Liu BC, Tang TT, Lv LL a kol. Poškodenie obličkových tubulov: hnacia sila smerom k chronickému ochoreniu obličiek. Kidney Int. 2018;93:568–579.

39. Loefflfler I, Wolf G. Transformujúci rastový faktor-beta a progresia renálneho ochorenia. Transplantácia nefrolového číselníka. 2014;29(suppl 1):i37–i45.

40. Murakami K, Takemura T, Hino S, a kol. Rastový faktor transformujúci moč-beta u pacientov s glomerulárnymi ochoreniami. Pediatr Nephrol. 1997;11:334–336.

41. Fujiwara K, Kobayashi T, Fujimoto H a kol. Inhibícia bunkovej apoptózy a zlepšenie pľúcnej fibrózy trombomodulínom. Am J Pathol. 2017;187:2312–2322.

42. Kataoka K, Taniguchi H, Kondoh Y, a kol. Rekombinantný ľudský trombomodulín pri akútnej exacerbácii idiopatickej pľúcnej fibrózy. Hrudník. 2015;148:436–443.

43. Tsushima K, Yamaguchi K, Yokoyama T, a kol. Trombomodulín pre akútne exacerbácie idiopatickej pľúcnej fibrózy: dôkaz koncepčnej štúdie. Pulm Pharmacol Ther. 2014;29:233–240.

44. Umemura Y, Yamakawa K. Optimálny výber pacientov na antikoagulačnú liečbu pri sepse: návrh z Japonska založený na dôkazoch. J Thromb Haemost. 2018;16:462–464.

45. Chen Q, Guan X, Zuo X, a kol. Úloha skupiny 1 s vysokou mobilitou (HMGB1) v patogenéze ochorení obličiek. Acta Pharm Sin B. 2016;6:183–188.

46. ​​Miyake Y, D'Alessandro-Gabazza CN, Takagi T, a kol. Od dávky závislé diferenciálne účinky trombínu pri alergickej bronchiálnej astme. J Thromb Haemost. 2013;11:1903–1915.

47. Assady S, Wanner N, Skorecki KL, a kol. Nové poznatky o biológii podocytov v glomerulárnom zdraví a chorobe. J Am Soc Nephrol. 2017;28: 1707–1715.

48. Derynck R, Zhang YE. Dráhy závislé od Smad a nezávislé od Smad v signalizácii rodiny TGF-beta. Príroda. 2003;425:577–584.

49. Schuster N, Krieglstein K. Mechanisms of TGF-beta-mediated apoptosis. Cell Tissue Res. 2002;307:1–14.

50. Greka A, Mundel P. Bunková biológia a patológia podocytov. Annu Rev Physiol. 2012;74:299–323.

51. Isaka Y. Zacielenie na signalizáciu TGF-beta pri fibróze obličiek. Int J Mol Sci. 2018;19:2532.

52. Chang YJ, Cheng YW, Lin RK, a kol. Trombomodulín ovplyvňuje prežitie pacientov s nemetastatickým kolorektálnym karcinómom prostredníctvom epitelového-mezenchymálneho prechodu (EMT). PLoS One. 2016;11:e0160550.

53. Zheng N, Huo Z, Zhang B, a kol. Trombomodulín znižuje tumorigénny a metastatický potenciál buniek rakoviny pľúc up-reguláciou E-kadherínu a down-reguláciou expresie N-kadherínu. Biochem Biophys Res Commun. 2016;476:252–259.

54. Pan B, Wang X, Nishioka C, a kol. Receptor 15 spojený s G-proteínom sprostredkúva angiogenézu a cytoprotektívnu funkciu trombomodulínu. Sci Rep. 2017;7:692.

55. Chen PS, Wang KC, Chao TH a kol. Rekombinantný trombomodulín má anti-autofagický účinok v endotelových bunkách a poskytuje antiaterosklerózny účinok u myší s deficitom apolipoproteínu E. Sci Rep. 2017;7: 3284.

56. Chung JJ, Okamoto Y, Coblitz B, a kol. Povrchová expresia proteínu sprostredkovaná signalizáciou PI3K/Akt snímaná 14-3-3 interakčným motívom. FEB J. 2009;276:5547–5558.

57. Sanchez-Capelo A. Dvojitá úloha TGF-beta1 pri apoptóze. Cytokine Growth Factor Rev. 2005;16:15–34.

58. Griffifin JH, Zlokovič BV, Mosnier LO. Aktivovaný proteín C, proteázou aktivovaný receptor 1 a neuroprotekcia. Krv. 2018;132:159–169.

59. Isermann B, Vinnikov IA, Madhusudhan T, a kol. Aktivovaný proteín C chráni pred diabetickou nefropatiou inhibíciou apoptózy endotelu a podocytov. Nat Med. 2007;13:1349–1358.

60. Klos A, Tenner AJ, Johswich KO, a kol. Úloha anafylatoxínov v zdraví a chorobe. Mol Immunol. 2009;46:2753–2766.

61. Morigi M., Perico L., Corna D. a kol. Blokáda C3a receptora chráni podocyty pred poškodením pri diabetickej nefropatii. JCI Insight. 2020;5: e131849.

62. Conery AR, Cao Y, Thompson EA, a kol. Akt interaguje priamo s Smad3, aby reguloval citlivosť na apoptózu indukovanú TGF-beta. Nat Cell Biol. 2004;6:366–372.

63. Derynck R, Muthusamy BP, Saeteurn KY. Spolupráca signálnej dráhy pri TGF-beta-indukovanom epitelovo-mezenchymálnom prechode. Curr Opin Cell Biol. 2014;31:56–66.

64. Remy I, Montmarquette A, Michnick SW. PKB/Akt moduluje signalizáciu TGF-beta prostredníctvom priamej interakcie so Smad3. Nat Cell Biol. 2004;6: 358–365.

65. Hamidi A, Song J, Thakur N, a kol. TGF-beta podporuje signalizáciu PI3K-AKT a migráciu buniek rakoviny prostaty prostredníctvom ubikvitylácie p85alfa sprostredkovanej TRAF{4}}. Sci Signal. 2017;10:eaal4186.

66. Peng Z, Weber JC, Han Z a kol. Dichotomické účinky signalizácie Akt pri rakovine prsníka. Mol Cancer. 2012;11:61.

67. Zhou F, Geng J, Xu S, a kol. Signalizácia FAM83A indukuje epiteliálny mezenchymálny prechod dráhou PI3K/AKT/Snail pri NSCLC. Starnutie (Albany NY). 2019;11:6069–6088.