Celkové glykozidy Cistanche Deserticola podporujú obnovu neurologických funkcií indukciou neurovaskulárnej regenerácie prostredníctvom Nrf- 2/Keap{1}} dráhy u potkanov MCAO/R-Ⅱ

TG podporujú neurálnu remodeláciu u I/R zranených potkanov

Podľa mnohých štúdií môže neurogenéza po mŕtvici výrazne zlepšiť funkčné zotavenie. Synaptofyzín (SYN), proteíny postsynaptické hustoty 95 (PSD{1}}) a proteín 2 spojený s mikrotubulami (MAP-2) sa použili ako markery na vyšetrenie neuronálnej plasticity v ischemickej penumbre kôry. Na posúdenie účinkov liečby TG, PS a OS na neurogenézu u potkanov s poranením I/R sa uskutočnila imunofluorescencia a western blot pre expresie SYN, PSD95 a MAP-2. Ako je znázornené na obrázkoch 9 a 10, hladiny expresie SYN, PSD95 a MAP{10}} u potkanov I/R po 14 dňoch reperfúzie klesli v porovnaní s potkanmi NOR, zatiaľ čo vyliečenie TG a PS sa mohlo výrazne zvýšiť regulujú úroveň ich expresie. Skupina OS nemala žiadnu významnú zmenu v porovnaní so skupinou MOD. Údaje ukázali, že vyliečenie TG a PS bolo schopné dramatickypodporujú neurálnu remodeláciu po poranení I/R. 

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA OCHRANU PRED ISCHEMICKOU CESTOU PHGS75% ECH 30% ACT 12%

TGs Alter Nrf-2 And Keep{1}} Expressions in I/R Injured I/R

Oxidačný stres je hlavným patogénnym mechanizmom pri poranení I/R. Štúdie potvrdili, že Nrf-2 je hlavným regulátorom antioxidačných reakcií. Aby sme preskúmali oxidačné reakcie sprostredkované Nrf-2 a Keap{2}} po poranení I/R, vyhodnotili sme cytoplazmatické

expresiu, ako aj jadrovú translokáciu Keap-1. Medzitým sa tiež testovala expresia Nrf-2 v mozgových tkanivách potkanov poškodených I/R (obrázky 10 a 11). Podľa imunofluorescenčnej analýzy sa zistilo, že Nrf-2 sa nachádza hlavne v cytoplazme v skupine NOR. V skupine TGs bola expresia Nrf-2 v cytoplazmatickej lokalizácii downregulovaná, ale upregulovaná v jadre, a tiež bola pozorovaná znížená expresia Keap{6}}. Údaje ukázali, že ochrana mozgu TG môže byť spojená s moduláciou Nrf-2 a Keap-1.

TG zmierňujú oxidačný stres mozgového tkaniva u potkanov s poranením I/R

Na potvrdenie antioxidačných účinkov TG boli hodnotené aktivity SOD, CAT, GSH-Px a MDA u potkanov s poranením I/R. Na obrázku 12 bol obsah MDA výrazne zvýšený v skupine MOD a súčasne boli znížené aktivity SOD, CAT a GSH-Px v porovnaní s normálnymi potkanmi. Naopak, liečba TG viedla k významnému zníženiu obsahu MDA a zvýšeniu aktivít SOD, CAT a GSH-Px. Tieto výsledky ďalej potvrdili antioxidačnú aktivitu TG.

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA LIEČBU ISCHEMICKEJ CESTOVNICE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

DISKUSIA

Mnohé štúdie naznačujú, že TČM C. deserticola má rozsiahle biologické aktivity, napr. zlepšuje schopnosť učiť sa, pamäť a imunitu. Avšak aktívne zložky C. deserticola na neuroprotekciu zostávajú nejasné. Súčasná práca sa zameriava na skríning aktívnych komponentovC. deserticola proti ischemickej cievnej mozgovej príhodena modeli MCAO/R. Tri extrakty z C. deserticola (TG, PS a OS) sa použili na vyhodnotenie ich účinkov na MCAO/R potkany, ako aj možných mechanizmov.

Mŕtvica je bežné akútne cerebrovaskulárne ochorenie. Epidemiologické štúdie ukazujú, že mŕtvica je častejšia u mužov ako u žien. V našom experimente boli teda na testy adoptované samce potkanov. Naše výsledky dokázali, že indukcia I/R zrýchlila oxidačný stres a objem infarktu, porušila BBB a viedla k nervovému a cerebrovaskulárnemu poškodeniu. Po skríningu sa zistilo, že TG znižujú objem infarktu a podporujú neurálnu remodeláciu a angiogenézu. Okrem toho sa pozorovalo, že TG zachovávajú integritu BBB po poranení I/R. Naopak, PS a OS neprinášajú žiadne významné zmiernenie I/R zranenia. TG sa teda považujú za hlavnú aktívnu frakciu C. deserticola na neuroprotekciu, potenciálne prostredníctvom podpory neurálnej remodelácie, angiogenézy a integrity BBB prostredníctvom aktivácie dráhy Nrf{0}}/Keap{1}}.

Pribúdajúce dôkazy naznačujú, že vytvorenie účinnej kolaterálnej cirkulácie je významne dôležité na zabránenie vzniku infarktu a ischemickej penumbry a je kritickou liečbou v ranom štádiu ischemickej cievnej mozgovej príhody. Proliferácia vaskulárnych endotelových buniek a buniek hladkého svalstva po ischemickom infarkte určuje vytvorenie kolaterálnej cirkulácie. Modely ischémie však majú spoločný jav – to znamená, že v mikrovaskulatúre mozgu široko existuje oxidačný stres. Údaje zo štúdií ukázali, že veľké množstvo antioxidantov môže narušiť funkciu BBB a vlastnosti angiogenézy. CD31 a a-SMA sú markery vaskulárnych endotelových buniek, ako aj buniek hladkého svalstva. Na skúmanie účinku vyššie uvedenej bunkovej proliferácie extraktov z C. deserticola sme skúmali expresie CD31 a a-SMA v homogenáte mozgovej ischemickej penumbry. Naše údaje ukázali, že TG výrazne zvýšili expresiu CD31 a a-SMA. Medzi skupinami PS a OS však neboli žiadne významné rozdiely. Preto sme usúdili, že TG môžu znížiť poškodenie mozgu podporou angiogenézy prostredníctvom zvýšenia expresie CD31 a a-SMA, zatiaľ čo PS a OS neposkytujú takúto ochranu pred poškodením mozgu. Tieto výsledky ďalej potvrdili, že iba TG môžu zabrániť cerebrálnemu I/R poraneniu.

Ischemickú mozgovú príhodu možno považovať za výsledok cerebrálnej ischémie spôsobenej poruchou neuronálnej plasticity alebo prestavbou oblastí mozgu. Väčšina pacientov s mŕtvicou trpí neurologickým deficitom. Aktivácia neurogenézy je sľubnou stratégiou pre pacientov s mŕtvicou na zlepšenie ich neurologických funkcií. Neurogenéza sa priamo podieľa na obnove neurologických funkcií po poranení I/R mozgu. Predchádzajúce výskumy ukazujú, že TG môžu zlepšiť mieru prežitia hipokampálnych pyramídových buniek a vyvolať neurogenézu. Oxidačný stres spôsobuje stratu neurónov pri mnohých chorobách, ako je Parkinsonova choroba, mŕtvica atď. Nrf-2 prepisuje veľa génov súvisiacich s neuroprotekciou v oblasti ich promótora, najmä vrátane SOD, MDA, CAT a g-glutamylcysteín ligáz atď. SYN, PSD-95 a MAP{{ 4}} proteíny, ktoré sú úzko spojené so synaptickou tvorbou a neurotransmisiou, možno považovať za markery plasticity výskumov neurónov v oblasti ischemickej penumbry. Po štúdiu sme zistili, že liečba pomocou TG môže významne zvýšiť expresiu PSD95, SYN a MAP-2, čo naznačuje, že cerebrálna ochrana TG bola v korelácii so zvýšenou plasticitou neurónov počas I/R. Je však škoda, že medzi skupinami PS a OS nie je zjavný rozdiel. Tieto výsledky ukázali, že TG môžu zvýšiť neuroplasticitu po cerebrálnom I/R poranení.

Zobrazovací výskum u pacientov s mŕtvicou ukázal, že dysfunkciu BBB možno považovať za pozoruhodný atribút periischemického mozgu (Bang et al., 2007). TJ, ktoré sa skladajú z cytoplazmatických proteínov, transmembránových proteínov a spojovacích adhéznych molekúl medzi kapilárnymi endotelovými bunkami, sú veľmi dôležité pri udržiavaní integrity BBB (Ye et al., 2019). Spomedzi nich sú ZO-1, claudín-5 a okludín najdôležitejšie proteíny v TJ. Pribúdajúce dôkazy naznačujú, že zvýšená permeabilita BBB vyvolaná ischémiou vo všeobecnosti koreluje so zmenami ZO-1, claudínu-5 a okludínu (Cao a kol., 2016a; Page a kol., 2016; Yu a kol., 2017; V tejto práci výsledky ukázali, že hoci TG môžu významne zvýšiť expresiu proteínov ZO-1, claudínu-5 a okludínu v mozgových tkanivách indukovaných MCAO, PS ani OS to neurobili. BBB pozostáva z cerebrálnych endotelových buniek a je úzko spojená s pericytmi (Nyul-Toth et al., 2016). Pericyty sú životne dôležité pre integritu BBB (Bell et al., 2010). Ischemická mŕtvica spúšťa smrť pericytov a odlúčenie od endotelových buniek mozgu v akútnej fáze, čím destabilizuje mikrovaskulatúru a mení vlastnosti BBB (Zechariah et al., 2013). Naše údaje ukázali, že TG môžu zvýšiť pokrytie pericytov na kapilárach a zvýšiť hladiny expresie ZO-1, claudínu{19}} a okludínu. Tieto javy dokázali, že TG môžu účinne chrániť integritu BBB po cerebrálnom I/R poranení. Stručne povedané, TG môžu zmierniť cerebrálne poškodenie viacerými spôsobmi, ako je podpora angiogenézy, zlepšenie neuronálnej plasticity a udržiavanie integrity BBB.

Potom sme skúmali signálnu dráhu, aby sme preskúmali mechanizmus, ktorý je základom ochrany mozgu TG. Proces I/R poškodenia je multifaktoriálny, a preto sa na patogenéze podieľajú početné mechanizmy. Oxidačný stres je základným rizikovým faktorom, ktorý prispieva k I/R-indukovanému poraneniu mozgu, ako je poškodenie štruktúry BBB, vaskulárna endoteliálna dysfunkcia a zhoršenie ischemického poškodenia neurónov. Oxidačný stres sa teda stal atraktívnym terapeutickým cieľom pri I/R-indukovanom poranení mozgu. Enzýmy fázy 2, ktoré sú sprostredkované jadrovým faktorom E 2-faktorom súvisiacim s jadrom-2 (Nrf-2), sa považujú za dôležité prostriedky, ktorými sa neuróny chránia pred oxidačným stresom. Pribúdajúce dôkazy naznačujú, že aktivácia Nrf-2 počas I/R je potenciálnym terapeutickým cieľom neuroprotekcie. Nrf-2, ako dôležitý regulátor endogénnej antioxidačnej obrany, sprostredkúva hladinu hemoxygenázy 1 (HO-1) a ďalších antioxidačných enzýmov, ako je NAD(P)H chinónoxidoreduktáza 1 (NQO1), SOD, CAT, GSH a MDA. Okrem toho hrá Nrf{12}} dôležitú regulačnú úlohu v angiogenéze. Táto štúdia ukazuje, že Nrf-2 môže byť významne posilnené a aktivované v procese vaskulárneho vývoja.

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA ANTISCHEMICKÚ CESTOVNÚ CESTOVNÚ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Ako už bolo opísané, TG obsahujú veľa bioaktívnych zlúčenín, napríklad echinakozid, tubulozid A, akteozid, izoakteozid a 2'-acetylakteozid, a niektoré z nich vykazovali neuroprotektívne funkcie po cerebrálnom I/R poranení. Echinakozid má množstvo farmakologických účinkov, ako je antioxidačný, anti-senescenčný, neuroprotektívny, protizápalový, podpora cikatrizácie, hepatoprotekcia, podpora tvorby kostí a protinádorové aktivity. Nedávno bol echinakozid identifikovaný ako silný antioxidant v centrálnom nervovom systéme. Echinakozid môže znížiť obsah MDA a zlepšiť aktivity SOD a GSH-Px pri ischemickom poškodení mozgu a analýza molekulárneho dokovania ukázala, že echinakozid sa môže viazať na Keap-1, čo vedie k jadrovej translokácii Nrf-2. Štúdia od Xia ukázala, že akteozid môže znížiť objem infarktu a obsah vody v mozgu, aby sa zlepšil neurologický deficit u potkanov MCAO/R zmiernením oxidačného stresu. Iné štúdie ukázali, že izoakteozid by mohol zvýšiť aktivity bunkových antioxidačných enzýmov, SOD a CAT v H2O2-ošetrených V79-4 bunkách. Na základe vyššie uvedených správ o aktívnych zlúčeninách obsiahnutých v TG je možné odvodiť, že TG by mohlichrániť pred ischemickou mozgovou príhodou prostredníctvom antioxidačných ciest.

Li referoval o neuroprotektívnych účinkoch fenyletanoidných glykozidov (PhG) na H2O2-indukovanú apoptózu na bunkách PC12 prostredníctvom dráhy Nrf2/ARE (Li et al., 2018). Tieto PhG boli významne potlačené spustením jadrovej translokácie Nrf2 a zvýšením expresie HO-1, NQO1, glutamát-cysteínligáza-katalytickej podjednotky (GCLC) a glutamát-cysteínligázovej modifikačnej podjednotky (GCLM) (Li et al., 2018 Gong a kol., 2019). Tieto zistenia preto naznačujú, že dráha Nrf-2/ARE hrá kľúčovú úlohu v ochranných účinkoch sprostredkovaných PhGs na neurónové bunky. Podobne sme v tejto štúdii zistili, že TG môžu znížiť hladinu MDA a zvýšiť hladiny SOD, CAT a GSH-Px u I/R potkanov. Medzitým by TG mohli zvýšiť expresiu Nrf2 v jadre, znížiť zodpovedajúcu expresiu v cytoplazme a významne znížiť expresiu Keap{16}}. Preto sa dráha Nrf-2/Keap{18}} môže podieľať na neuroprotektívnych účinkoch sprostredkovaných TG. Ďalšia validácia tejto dráhy sa v budúcnosti uskutoční in vitro na bunkovej kultúre s modelmi poškodenia kyslíka a glukózy/reoxygenácie. Okrem toho sa extrakty C. deserticola v našej štúdii podávali nepretržite 14 dní. Pretože neurogenéza dospelých by ovplyvnila interpretáciu neuroprotektívnych účinkov počas 14 dní reperfúzie, neurogenézu nemožno vylúčiť z nášho súčasného dizajnu experimentu pri skúmaní neuroprotektívneho účinku CT. Toto je obmedzenie nášho výskumu.

Záverom, sú to TG z C. deserticola, ktoré môžuzvýšiť angiogenézu a neurogenézuako aj zachovať integritu BBB u potkanov s poranením I/R, ale nie PS a OS. Účinky by mohli byť sprostredkované aktiváciou cesty Nrf-2/Keap-1.

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA LIEČBU ISCHEMICKEJ CESTOVNICE PHGS75% ECH 30% ACT 12%