Jednoznačné NMR štrukturálne stanovenie (plus)-katechínu-lakázovej dimérnej reakcie ako potenciálnych markerov oxidácie hrozna a vína

Pre viac informácií kontaktujte:tina.xiang@wecistanche.com

Abstraktné:( plus )-Katechin—lakcaseoxidáciadimérne štandardy boli hemisyntetizované použitím lakázy z Trametes Versicolor je roztok voda-etanol s pH 3,6. Detegovalo sa osem frakcií zodpovedajúcich ôsmim potenciálnym oxidačným dimérnym produktom. Profily frakcií sa porovnávali s profilmi získanými s dvoma ďalšími oxidoreduktázami:polyfenoloxidázaextrahovaný z hrozna a lakázy z Botrytis cinerea. Profily boli veľmi podobné, aj keď niektoré menšie rozdiely naznačovali možné rozdiely v reaktivite týchto enzýmov. Päť frakcií sa potom izolovalo a analyzovalo 1D a 2D NMR spektroskopiou. Pridanie stôp dusičnanu kademnatého do vzoriek rozpustených v acetóne viedlo k úplne rozlíšeným NMR signálom fenolových protónov, čo umožnilo jednoznačné štrukturálne určenie šiestich reakčných produktov, pričom jedna z frakcií obsahovala dva enantioméry. Tieto produkty môžu byť ďalej použité ako oxidačné markery na skúmanie ich prítomnosti a vývoja vo víne počas výroby vína a dozrievania vína.

Kľúčové slová: oxidačný marker;( plus )-katechín; fenolové NMR signály; laccase; dusičnan kademnatý; polyfenoloxidáza

Kliknutím získate ďalšie informácie

1. Úvod

Polyfenolysú rodinou chemických zlúčenín široko prítomných v prírode. Vo významnom množstve sa nachádzajú v čaji [1], kakau [2,3], čučoriedkach [4], hrozne [5 l a fermentovaných produktoch ako víno [6]. Chemické štruktúry polyfenolov sa ako primárne oxidačné ciele J7,8] neustále vyvíjajú. Tieto zmeny ovplyvňujú organoleptické vlastnosti mnohých druhov potravín; sú zodpovedné za javy ako hnednutie potravín [9]a modifikácie senzorických vlastností vína [10,11. V enológii tento oxidačný jav prebieha v hrozne alebo vínach. Pokiaľ ide o enzymatickú oxidáciu, hlavnými enzýmami zodpovednými za hnednutie sú oxidoreduktázy, presnejšiepolyfenoloxidázaprítomný v hrozne a lakáze produkovanej Botrytis cinerea [12].

Enzymatickéoxidáciavyskytuje sa najmä v hroznovom mušte, ale ďalšie hnednutie vína môže byť spôsobené chemickými oxidačnými reakciami |7,13]alebo Botrytis cinerea laccase, ktorá môže byť počas dozrievania vína veľmi stabilná14. Na fenolových substrátoch sa môžu vyskytnúť dve oxidačné enzymatické aktivity: monofenoloxidázová aktivita charakterizovaná hydroxyláciou existujúcej susediacej polohy hydroxylovej skupiny a difenoloxidázová aktivita zodpovedajúca oxidácii orto-dihydroxybenzénov na orto-benzochinóny.

Podľa Výboru pre názvoslovie Medzinárodnej únie biochémie a molekulárnej biológie (NC-IUBMB) sú tieto enzymatické aktivity katalyzované enzýmami triedy EC1- zodpovedajúcimi oxidoreduktázam. Medzi nimi sú tri hlavné triedy oxidoreduktáz katalyzujúce oxidáciu polyfenolov EC1.14.18.1 (monofenolmonooxygenáza), EC1.11.1 (peroxidáza/POD) a EC1.10.3 (oxidoreduktázy pôsobiace na difenoly).

Táto posledná trieda je rozdelená do rôznych podtried a dve z nich sa javili pre túto štúdiu obzvlášť zaujímavé: EC1.10.3.1 (polyfenoloxidáza/PPO) a EC1.10.3.2 (lakáza) (pozri doplnkové materiály obrázok S1).

PPO, lakáza a peroxidáza sú oxidoreduktázy zodpovedné najmä za hnednutie počas spracovania hrozna [13]. Hnednutie spôsobené POD je u ovocia zanedbateľné, ale v kombinácii s PPO môže zvýšiť degradáciu fenolov[15]. PPO je prirodzene prítomný v hrozne a je schopný katalyzovať oxidáciu monofenolov na katecholy a katecholov na hnedé pigmenty [8,13,16]. Lakázy vyskytujúce sa v hrozne infikovanom botrytídou majú širšie spektrum účinku|17|pretože môžu katalyzovať oxidáciu mnohých rôznych substrátov. Hlavnými cieľmi oxidácie lakáz zostávajú 1-2 a 1-4 dihydroxybenzén.

Vo víne môže benzochinón vyrobený oxidáciou (PPO alebo lakázy) ľahko prejsť ďalšími reakciami v závislosti od ich redoxných vlastností a elektrónových afinit [15]. Môžu pôsobiť buď ako elektrofily a reagovať s aminoderiváty [18] alebo pôsobiť ako oxidanty a reagovať okrem iného s fenolickými substrátmi. V závislosti od ich chemickej konformácie (chinón alebo semichinón) môže benzochinón viesť k rôznym produktom oxidačnej reakcie. Pri neutrálnom pH sa (plus)-katechín oxiduje na chinón na A-kruhu v polohe C5 alebo C7 a povedie k vytvoreniu šiestich možných dimérnych izomérov, z čoho vyplýva prepojenie medzi B-kruhovými polohami C2', C5' alebo C6' hornej katechínovej jednotky a poloha A-krúžku C6 alebo C8 spodnej jednotky [19,20]. Dehydrodikakín je dobre známym produktom tejto spojky [21]. Polohy značenia štruktúr sú znázornené na obrázku 1. Za kyslých podmienok môžu byť semichinónové formy prítomné aj na kruhu B (poloha OH3' alebo OH4') a viesť k štyrom možným dimérnym izomérom [20,22] s hornú katechínovú jednotku a A-krúžok spodnej jednotky (pozícia C6 alebo C8). Enzymatická oxidácia katechínov bola skúmaná v predchádzajúcich štúdiách [22,23] a súvisiace oxidačné produkty boli charakterizované pomocou HPLC [24], hoci zriedkavejšie izolované a nikdy úplne charakterizované NMR.

Cieľom tejto práce bolo najprv porovnať pomocou UHPLC-MS profily dimérnych (plus)-katechínových oxidačných produktov v prítomnosti troch oxidoreduktázových extraktov, tj. PPO extrahovaného z hrozna, lakázy z huby Botrytis cinerea prítomnej v botrytizovaných sladkých vínach. [14] a lakázu z Trametes Versicolor.

Druhým cieľom bolo hemisyntetizovať a charakterizovať štruktúry niektorých dimérnych oxidačných produktov pomocou NMR spektroskopie získanej s lakázou z Trametes Versicolor.

2. Výsledky a diskusia

2.1. Porovnanie profilov produktov dimérnej reakcie s tromi rôznymi oxydoreduktázami a(plus)-katechínom

(plus)-Katechín bol najprv oxidovaný v prítomnosti lakázy z Trametes Versicolor pri pH 3,6 v roztoku modelového vína. Po oddelení dimérnej frakcie od zvyškového (plus)-katechínu a iných polymérnych frakcií sa zozbieralo osem hlavných frakcií a analyzovalo sa pomocou UHPLC-UV-MS, zaznamenané od N1 do N8 v poradí zvyšujúcich sa retenčných časov (tabuľka 1). Elektrosprejové hmotnostné spektrá v pozitívnom móde ukázali iónové píky [M plus H] plus pri m/z 579 pre N1 až N6, hypoteticky zodpovedajúce diméru tvorenému jednoduchou väzbou medzi dvoma katechínovými jednotkami a [M plus H] plus pri m/577 pre N7 a N8, čo hypoteticky naznačuje vytvorenie ďalšej väzby.

Týchto osemoxidáciafrakcie boli potenciálne pozorované po chemickej depolymerizácii tanínovej frakcie v predchádzajúcich prácach [25,26] a mohli by byť rovnaké ako tie, ktoré už opísali Guyot et al. [20], aj keď experimentálne podmienky boli mierne odlišné. V tejto predchádzajúcej štúdii sa skutočne použil surový extrakt PPO pri pH 3 a 6 na získanie ôsmich frakcií. V tejto štúdii sa porovnávali tri rôzne enzýmy pri pH 3,6 v modelovom vínnom roztoku. Porovnávacia analýza LC-MS hlavných oxidačných frakcií získaných pomocou troch rôznych enzýmov (lakáza z Trametes Versicolor, lac-case z Botrytis cinerea a polyfenoloxidáza extrahovaná z hrozna) sú uvedené v tabuľke 2. Pre každú z ôsmich frakcií retenčné časy boli takmer totožné s rôznymi enzýmami a podobné m/z boli stanovené pomocou MS analýzy. Tieto výsledky podporujú hypotézu, že rovnaké frakcie boli získané pre každý enzým, obsahujúci produkty so štruktúrami podobnými tým, ktoré predpokladali Guyot et al. [20]. Lopez-Serrano a Ros Barcel6 [27] tiež vykonali porovnávaciu štúdiu produktov oxidácie (plus)-katechínu s dvoma rôznymi enzýmami: peroxidázou a polyfenoloxidázou, oba extrahované z jahôd. Dospeli k záveru, že produkty získané týmito dvoma enzýmami boli kvalitatívne rovnaké. Ďalšia zlúčenina pomenovaná N4' s m/z=578Th a Rt=15.66 min bola pozorovaná v experimentoch s lakázou z Botrytis cinerea a extrahovaným PPO, ale nie s lakázou z Trametes Versicolor, čo naznačuje možné rozdiely v reaktivite na tieto enzýmy.

2.2. Štúdium a optimalizácia fyzikálno-chemických parametrov 1H-NMR fenolických a alifatických OH signálov

Štrukturálnu charakterizáciu prokyanidínových dimérov možno získať NMR analýzou. Presnú polohu spojenia medzi jednotkami možno určiť najmä pomocou korelačných spektier HMBC a/alebo ROESY [28,29] (obrázky S2 a S3). V prípade väzby éterového typu (COC) je priradenie hydroxylových signálnych protónov nevyhnutné. V prípade CC väzieb môže byť tiež rozhodujúce, či sa niektoré alifatické alebo aromatické protóny prekrývajú alebo ak chýbajú niektoré kľúčové korelácie. Avšak aj v aprotickom rozpúšťadle sa hydroxylové protóny polyfenolov často javia ako široké signály, z ktorých nemožno získať štruktúrne informácie [30]. Tento problém bol predbežne vyriešený pridaním stôp o

Cd(NO3)2 v roztokoch vzoriek. V skutočnosti, H široké signály OH skupín sú spôsobené intermolekulárnou výmenou medzi týmito OH protónmi a inými protónmi v rozpúšťadle alebo rozpustenej látke. Znížením medzimolekulových väzieb môže prítomnosť dusičnanu kademnatého vo vzorkách znížiť tieto výmeny, čím sa zlepší ostrosť protónových signálov OH.

2.2.1. Účinok pridania kadmia

Po lyofilizácii sa päť frakcií N2, N3, N4, N6 a N8 solubilizovalo v acetóne-dg. Potom sa získali 1D protónové NMR spektrá pri 25 stupňoch pred (obrázok 2A) a po pridaní malých množstiev kadmia (obrázok 2B). V čistom acetóne-d. sa fenolové OH protóny všetkých frakcií javili ako široké píky. Po pridaní kadmia tieto protóny vykazovali vysoko rozlíšené signály v prípade frakcií N6 a N8, zatiaľ čo pre frakcie N2, N3 a N4 boli signály len trochu ostrejšie. Malo by sa tiež spomenúť, že zvýšenie obsahu Cd nemalo žiadny vplyv na rozlíšenie signálu OH, pretože pri postupnom pridávaní malých množstiev Cd do vzoriek nebola pozorovaná žiadna ostrosť alebo šírka šírky piku (údaje nie sú uvedené).

Vysoko rozlíšené fenolické OH signály z produktov N2, N3 a N4 sa dosiahli vďaka dodatočnému sušeniu a resolubilizácii (obrázok 2C, D).

Rozdiel v správaní po pridaní Cd medzi frakciami možno vysvetliť silou molekulárnych interakcií: silnejšie v prípade N2, N3 a N4 v porovnaní s N6 a N8, pričom na prerušenie týchto väzieb je potrebný ďalší krok.

Tento dodatočný krok môže byť kľúčovým krokom pri použití Cd na získanie vysoko rozlíšených fenolických OH signálov v akejkoľvek situácii, bez ohľadu na pôvod vzoriek, syntetickú reakciu alebo prírodné polyfenolové produkty.

Predchádzajúca práca zaoberajúca sa jednoznačnou štruktúrnou charakterizácioupolyfenoldimérov pomocou vysoko rozlíšených OH fenolických NMR signálov vďaka pridaniu dusičnanu kademnatého bola publikovaná v roku 1996[30]. Pokiaľ je nám známe, odvtedy nebola publikovaná žiadna iná výskumná práca využívajúca túto metodológiu. Na dosiahnutie tohto cieľa sa následne vykonali ďalšie výskumy, a to buď pridávaním kyseliny pikrovej [31] alebo použitím nízkej akvizičnej teploty [32]. Toto môže byť vysvetlené ďalším krokom potrebným na dosiahnutie rozhodujúceho účinku na ostrosť OH vrcholu s prídavkom Cd, ako je opísané vyššie. Zdá sa však, že kadmium má veľkú hodnotu, pretože vysoko rozlíšené signály možno získať bez potreby pridávať presné množstvá, na rozdiel od získavania spektier kyseliny pikrovej alebo NMR pri nízkych teplotách.

2.2.2. Vplyv teploty

Pokles teploty z 25 stupňov C na 15 stupňov nemal žiadny vplyv na ostrosť signálov fenolických OH alebo alifatických OH. Napriek tomu nám posuny vymeniteľných protónových píkov smerom nadol umožnili oddeliť niektoré prekrývajúce sa fenolické a alifatické OH signály, čím sa ich identifikácia stala zrejmejšou (obrázok 3). Znížením teploty sa znížil výmenný kurz protónov a možno očakávať výraznejšie alifatické OH píky [31]. Teplota 15 stupňov zjavne nie je dostatočne nízka na získanie dobre rozlíšených alifatických OH signálov. Umožnilo nám to však jasne identifikovať rezonanciu dvoch alifatických OH protónov vo vzorkách N3 a N6 a jedného vo vzorke N8. Spektrum vzorky N2 tiež vykazovalo dva signály OH alifatických protónov, ktoré boli lepšie rozlíšiteľné pri 25 °C ako pri 15 °C (obrázok 2E). V prípade vzorky N4 boli signály pochádzajúce z alifatických OH len čiastočne viditeľné v spektrá, či už bola teplota nastavená na 25 stupňov alebo na 15 stupňov C v dôsledku pretrvávajúceho prekrývania (obrázok 2E).

2.3. Štrukturálna charakterizácia dimérnych štandardov - NMR spektrálna analýza

NMR spektrá frakcií N2, N3, N4, N6 a N8 ukázali, že oxidačné produkty mali vysokú čistotu, pretože intenzity signálu iných detekovaných zlúčenín boli menšie ako 10 percent v porovnaní s týmito produktmi.

Vo všetkých spektrách možno rozlíšiť štyri oblasti chemického posunu lH typické pre katechínové jednotky (obrázok 2C): signály alifatických protónov pyránových kruhov (kruhy C) sa nachádzajú v oblasti od 2,3 do 5.0 ppm, a protóny aromatických signálnych protónov rezorcinolových kruhov (kruhy A) a katecholových kruhov (Brings) od 5,5 do 6,3 ppm a 6,3 až 7,1 ppm, v danom poradí. OH fenolové signály oboch kruhov A a B sa objavili od 7,1 do 10 ppm. NMR spektrá oboch frakcií ukázali prítomnosť odlišných signálových sád katechínových jednotiek v pomere konštantnej intenzity: v spektrách frakcií N2, N3, N6 a N8 boli pozorované dve sady signálov v súlade s prítomnosťou dimérov a štyri sady v N4 spektrách, ktoré môžu zodpovedať jednému tetraméru, dvom dimérom alebo zmesi rôznych oligomérov, to znamená jeden trimér plus jeden monomér. Na stanovenie stupňa oligomerizácie produktov prítomných vo frakcii N4 sa uskutočnil experiment 'H DOSY s použitím zmesi obsahujúcej alikvóty oboch frakcií N4 a N2. Difúzne koeficienty všetkých signálov vykazovali podobné hodnoty (obrázok 4), čo naznačuje prítomnosť dvoch dimérov katechínu vo frakcii N4.

Vďaka plne rozlíšeným signálom OH fenolu, ktoré poskytujú spoľahlivé kvantitatívne výsledky, je možné typ väzby medzi katechínovými jednotkami priamo odvodiť z integrácie povrchovej plochy vrcholu. Takže pre obe frakcie, N3 a N6, nedostatok jedného OHfenolu (patriaceho buď rezorcinolu alebo katecholového kruhu) a nedostatok jedného rezorcinolového aromatického protónu indikovali interflavanickú väzbu (IFL) éterového typu, čo znamená opozíciu v A. alebo B kruh a C6 alebo C8 poloha v A kruhu. V prípade vzorky N2 chýbali dva aromatické protóny, jeden z kruhu B a jeden z kruhu A, čo znamená CA-CB IFL. 1D'H spektrum frakcie N4 ukázalo, že chýbajú dva protóny kruhu B, ako aj dva protóny kruhu A. Väzby medzi dimérnymi jednotkami frakcie N4 sú teda obidva typy CC. Spektrá frakcie N8 boli celkom odlišné od štyroch ostatných. Niektoré signály boli typické pre katechínové jednotky, v ktorých chýbali tri OH fenoly, jeden aromatický kruh A a jeden protón B kruhu, ako aj jeden alifatický OH. Na druhej strane, niektoré ďalšie signály NMR sú atypické pre katechínovú jednotku: metylén s odslepenými chemickými posunmi 13C (~40 ppm) a ketónová skupina (~192 ppm).

Protónové spinové systémy C, A a B kruhov boli stanovené s použitím 'H1D a 1H 2D TOCSY spektier (nie je znázornené). Dva ABMX C-kruhové spinové systémy (typické pre katechín) boli pozorované v spektrách frakcií N2, N3, N6 a N8 a štyri pre frakciu N4. V spektrách frakcií N2, N3, N6 a N8 boli k protónom kruhu A neviazanej katechínovej jednotky priradené dva meta-spojené dublety (J~2Hz) a jeden v oblasti aromatického kruhu A. a zvyškový protón kruhu A C6-alebo C{17}}pripojenej katechínovej jednotky. V spektrách N4 boli v dôsledku prítomnosti dvoch dimérov detegované a priradené štyri meta-spojené dublety a dva singlety, ako je opísané vyššie. Protónové systémy kruhu B boli tiež ľahko určené z týchto spektier a umožnili nám identifikovať dva ABM protónové spinové systémy pre diméry frakcií N3 a N6, zatiaľ čo jeden ABM a jeden AB protónový spinový systém bol detegovaný pre dimér N2 a jeden ABM a jeden AM protónový spinový systém pre dimér N4. Dimér N8 vykazoval iba jeden ABM B-kruhový spinový systém typický pre katechínový monomér.

2.3.1. Určenie polohy kruhu A IFL dimérov frakcií N2, N3, N4 a N6

Vytvorenie mostíka umiestneného na kruhu A dimérov (tj. poloha C6A alebo C8A) vyžaduje priradenie zvyškového HA protónu katechínovej jednotky spojenej s CA. Vďaka vysoko rozlíšeným fenolickým OH signálom bola jednoduchým východiskovým bodom identifikácia dvoch OHfenolových protónov jednotiek spojených s kruhom A, tj kruhu A, ktorý

had one isolated lHspin. This may be achieved using lH-13C long-range correlations, as illustrated in Figure5. The OH5A has readily been identified thanks to a correlation with the C4aC. This quaternary carbon is indeed characterized by both its chemical shift at~100 ppm and a long-range correlation observed with the H4Cprotons. OH5A also correlated with two other carbons∶ the most deshielded （δ>145 ppm） was obviously C5A, while the other (6>125 ppm) was C6A, which also showed a correlation with the other OHA phenol proton,i.e., OH7A. This latter correlated with two other carbons: a deshielded quaternary carbon（δ>145ppm） and a more shielded carbon（δ>125 ppm), ktoré sa dali ľahko pripísať C7A a C8A. Po priradení C6A a C8A možno zvyškový protón HA priamo priradiť spektrám HSQC. Zistilo sa teda, že tento zvyškový protón HA bol H6A pre všetky frakcie N2, N3, N4, N6. IFL medzi katechínovými jednotkami teda implikovala pozíciu C8A pre všetky diméry.

2.3.2. Určenie polohy krúžku B IFL

Diméry frakcií N2 a N4. Spektrá frakcie N2 ukázali dva rôzne typy protónových spinových systémov kruhu B: jeden AMX zodpovedajúci kruhu B neviazanej jednotky a jeden AM s väzbovou konštantou približne 8 Hz, charakteristický pre H6'B a H5' B C2'B-viazanej jednotky. Väzba medzi jednotkami N2 diméru je teda C2'B-C8A. NMR spektrá frakcie N4 tiež ukázali rôzne B spin systémy: dva AMX, zodpovedajúce nespojenému B-kruhu, a dva AXspin systémy, oba vykazujú interakčné konštanty približne 2 Hz, ktoré sú charakteristické pre H2'B a H6' B protóny C5'B-viazaných jednotiek. Prítomnosť korelácií s dlhým dosahom'H/13C medzi H6'Band C8A, ktoré boli pozorované v HMBC spektrách dvoch dimérov, je v súlade s väzbou C5/'B-C8A (obrázok 5).

Diméry frakcií N3 a N6. Spektrá frakcií N3 a N6 ukázali prítomnosť dvoch AMX B-kruhových protónových systémov a absenciu jedného OH fenolového signálu. Pretože boli identifikované všetky OHA fenolické protóny dimérnych jednotiek (ako je opísané vyššie), chýbajúci OH fenolový signál môže byť buď signál OH3'B, alebo signál OH4'B.

Poloha OH (3'B alebo 4'B) sa môže ľahko určiť pomocou korelácií ROE s H2'Bor H5'B alebo pomocou korelácií HMBC s dlhým dosahom, ako je znázornené na obrázku 5.

Priradenie zvyškového OH kruhov B sa ľahko uskutočnilo pomocou korelácií HMBC alebo ROESY s dlhým dosahom, ako je znázornené na obrázku 5. V prípade diméru N3 sa pozorovala korelácia ROE medzi H5'B a zvyškovým OH „B katechínovej jednotky prepojenej cez jej B krúžok. Tento OH bol teda identifikovaný ako OH4'B. V prípade frakcie N6 bol zvyškový OH'B priradený k OH3'B, pretože bola pozorovaná ROE korelácia medzi týmto OH a H2'B. Dlhodobé korelácie HMBC sú v súlade s týmito priradeniami. Väzbové polohy týchto dvoch dimérov sa potom určili nasledovne: C03'B-C8A a C04'B-C8A pre N3 a N6. resp.

Frakcia N8. Spektrálna analýza diméru N8 ukázala, že jednou jednotkou tohto diméru je katechín s dvoma väzbovými polohami, jednou je kruh A, jedna je v polohe C8A a druhá v polohe C-O7A, pretože protóny H8A a OH7A sú chýba. Ďalšia jednotka tohto diméru vykazovala jedinečné spektrálne vlastnosti, čo naznačuje stratu aromaticity kruhu B a prítomnosť niekoľkých väzbových polôh na kruhoch B aj C.

Signály 'H NMR vznikajúce z kruhu B boli dva dublety pri 2,49 a 2,71 ppm, vykazujúce geminálnu kopuláciu -15 Hz (12,03 ppm) typickú pre metylénovú skupinu a singlet pri 6,38 ppm vznikajúci z etylenického protónu. Pretože tieto metylénové a etylénové protóny neboli spojené, sú pravdepodobne v polohách 2'B a 5'B. Spektrum HIMBC ukázalo všetky korelácie, čo umožňuje presné priradenie týchto uhlíkov v kruhu B, ako je znázornené na obrázku 5. H2C tejto jednotky poskytuje tri korelácie s uhlíkmi v kruhu B: jeden je metylénový uhlík pri ~45 ppm, ktorý sa teda pripisuje C2'B a zvyšné dva s uhlíkmi rezonujúcimi pri ~90 ppm a ~162 ppm, ktoré možno priradiť k C1'B a C6'B.H5'B poskytli iba silné 3J korelácie s dvoma kvartérnymi uhlíkmi tohto kruhu B : jeden je uhlík, ktorý bol predtým priradený k C3'B (~95 ppm), a druhý, ktorý rezonoval pri ~90 ppm, by teda mohol byť priradený k C1'B. Uhlík pri -162 ppm sa potom odvodil ako C6'B.

Prítomnosť alifatického OH (-5,8 ppm) v polohe C3'B (-95 ppm) sa určila prostredníctvom jeho ROE korelácie s oboma protónmi H2'B. Okrem toho OH3/B poskytla HMBC koreláciu s kvartérnym uhlíkom pri~192,5 ppm, charakteristickú pre ketónovú skupinu v polohe C4'B.

Tienenie tohto CľB asi 40 ppm je v súlade so stratou aromaticity B kruhu. Okrem toho, nedostatok OH v polohe C7A druhej jednotky je v súlade s éterovou väzbou C1'BO-C7A.

Údaje NMR ukázali, že kruh C tejto jednotky neobsahuje žiadny OH3C. Prítomnosť väzby C3C-0-C3'B je v súlade s tienením C3C približne 1,5 ppm, ako aj chemickým posunom C3'B, ktorý je typický pre hemiketalový uhlík (95 ppm).

Celkovo nám NMR spektrálne údaje umožňujú dospieť k záveru, že tento dimér zodpovedá dehydrokatechínu A, ktorý opísali skôr Winges et al.[33] a potom Guyot a kol.[20].

Štruktúry šiestich dimérnych zlúčenín stanovené týmito NMR analýzami sú znázornené na obrázku 6, kde N2, N3, N6 a N8 sú čisté produkty a N4 je zmes dvoch izomérov.

3. Materiály a metódy

3.1.Chemikálie

(plus)-Katechín hydrát Viac alebo rovný 98 percentám; laccase od Trametes Versicolor(0.94 U·mg-1); dihydrát hydrogenfosforečnanu sodného Viac alebo rovný 98 percentám; kyselina citrónová (ACS činidlo, dusičnan kademnatý tetrahydrát 99,997 percent; kyselina mravčia a Amberlite XAD7HP boli získané od Sigma-Aldrich) (Saint-Louis, MO, USA). Acetón-dg bol zakúpený od Euriso-top (Saarbrüicken, Nemecko) a trifluóracetón kyselina (TFA) od Roth Labo (Karlsruhe, Nemecko). Vodné LC-MS, acetonitrilové LC-MS (ACN) a metanolové LC-MS (MeOH) boli všetky od VWR (Radnor, PA, USA).

3.2. Príprava roztoku modelového vína

Vzorovým vínnym roztokom bol roztok etanol/voda (12/88;o/o) s 0,033 M kyselinou vínnou, pH upravené na 3,6 pomocou 1 M NaOH [34].

3.3. Výťažky zo surového hrozna PPO

Extrakt PPO bol pripravený tak, ako už bolo opísané v Singleton et al.[35]. Zmrazené hrozno sa najprv zmiešalo v acetátovom pufri (1,5 M, pH 5; 10 gL-I kyseliny askorbovej). Zmes sa potom prefiltrovala a odstredila (3000 g; 10 minút). Zvyšok sa nakoniec premyl acetónom (80 %) a vysušil na vzduchu.

3.4.Lakcase z Botrytis Cinerea

Lakáza z Botrytis cinerea bola získaná tak, ako to opísali Quijada-Morin et al.[36]. Bol vyrobený z kmeňa VA612 (zozbieraný v roku 2005 vo vinici v Hautvillers, Champagne, Francúzsko, z kultivaru Pinot Noir). Stručne povedané, kultúry na pevnom sladovom kvasinkovom médiu sa nechali jeden týždeň pri 24 stupňoch pod modrým svetlom. Spóry sa potom zoškrabali a naočkovali do 500ml Erlenmeyerovej banky obsahujúcej 125 ml kultivačného média (4{{3{37}}}}gL-1glukóza, 7 gL{{10}}}glycerol, 0,5 g·L-1L-histidín, 0,1 g:L-1 CuSO,1,8gL-1 NaNO3,0,5g:L -1 KCl, 0,5 gL-1 CaCl2·H2O, 0,05 g:L-1 FeSO4,7H2O, 1,0 g L-1KH2PO4 a 0,7 gL-1 MgSO 4-7H2O). Po 3 dňoch inkubácie a 2 dňoch rastu v rovnakom predchádzajúcom médiu sa k predkultúram pridala kyselina galová (2 gL-1). Po 5 dňoch sa kvapalné médium prefiltrovalo a supernatant sa podrobil tangenciálnej filtrácii vo filtračnom systéme Quixstand (GE Healthcare UK, Little Chalfont, Anglicko) vybavenom membránou s odrezaním molekulovej hmotnosti 30 kDa. Koncentrát sa nakoniec podrobil diafiltrácii proti destilovanej vode a zachovali sa iba frakcie, ktoré vykazovali oxidačnú aktivitu proti ABTS (-80 stupeň).

3.5. Oxidačný postup

Roztok lakázy (1 gL-1) vo fosfátovo-citrátovom pufri bol vopred pripravený a pridaný k 6g.L-1(plus)-katechínovému roztoku (modelové víno), aby sa získala konečná koncentrácia lakázy { {6}}.3 gL-1. Získaný roztok sa potom pomaly miešal (180 otáčok za minútu) pri teplote miestnosti počas 2 hodín. Koncentrácie boli vopred optimalizované a experimentovanie sa uskutočnilo trojmo.

3.6. Zastavenie reakcie na živici Amberlite XAD7HP

Jantárová lite kolóna bola upravená etanolom (absolútnym) a premytá dvoma objemami kolóny milli-0 vodou. Predchádzajúce reakčné médium lakáza/(plus)-katechín bolo nakvapkané na kolónu a najskôr eluované dvoma objemami kolóny milli-Qwater [37]. Kolóna sa potom eluovala etanolom, kým sa zozbieraná frakcia nezafarbila. Len etanolové frakcie boli uchovávané, odparené a lyofilizované. Prášok sa skladoval pri -80 stupňoch až do použitia.

3.7. Postup čistenia dimérnej frakcie pomocou flash chromatografie

Lyofilizovaný prášok sa najskôr čistil pomocou systému flash chromatografie puriflash430 vybaveného UV detektorom nastaveným na 280 nm a kolónou Puriflash diol 50 um f0025. Binárna mobilná fáza pozostávala z acetonitrilu (rozpúšťadlo A) a metanolu (rozpúšťadlo B), obe okyslené 0,1 % TFA. Uskutočnila sa séria injekcií pri konštantnom prietoku 20 ml.min-1 s použitím nasledujúceho gradientu: 100 percent A počas 4,4 minúty; 0-10 percent B za 10 minút; 10 percent B za 5 minút; 10-90 percent B za 5 minút; 90 percent B za 3 minúty; 90-10 percent B za 2 minúty; 10 percent B za 10 minút. Objem injekcie bol 1 ml (300 mg lyofilizovaného prášku rozpusteného v 1 ml rozpúšťadla A). Zakaždým sa odobrali tri odlišné frakcie. Prvý zodpovedal zvyškovému (plus)-katechínu a tretí bol zmesou polyfenolov s vysokou molekulovou hmotnosťou. Druhá eluovaná frakcia obsahujúca zmes dimérnych oxidačných produktov sa pred druhým krokom čistenia odparila a lyofilizovala.

3.8. Postup čistenia produktov oxidácie z dimérnej frakcie s použitím semipreparačného chromatografického systému

Frakcia obsahujúca dimérne oxidačné produkty sa purifikovala použitím semipreparatívneho systému strednotlakovej chromatografie Bio-Rad NGC 10 vybaveného kolónou Varian Dynamax C18 Microsorb s reverznou fázou (250 x 21,2 mm; 3 um). Binárna mobilná fáza pozostávala z vody milli-O (rozpúšťadlo A) a 80 percent acetonitrilu, 20 percent vody Milli-Q (rozpúšťadlo B), obe okyslené 0,05 percentami TFA. Séria injekcií (300 ul) lyofilizovaného prášku (20 mg rozpustených v 200 ul rozpúšťadla A a 100 ul ACN) sa uskutočnila za nasledujúcich elučných podmienok: 100 percent A počas 4 minút; 0-35 percent B za 46 minút;35-100 percent B za 2 minúty; 100 percent B za 5 minút. Zakaždým sa zozbieralo osem rôznych frakcií, čo zodpovedá čistým signálom UPLC pri 280 nm. Každá frakcia sa pred NMR analýzou odparila a lyofilizovala.

3.9. Príprava vzorky na NMR analýzu

Asi 1 mg každého lyofilizovaného prášku odváženého v Eppendorfových skúmavkách sa rozpustil v 500 ul acetónu-dg. Potom sa k vzorkám pridalo -10 ul koncentrovaného roztoku dusičnanu kademnatého v acetóne-d a výsledné roztoky sa preniesli do 5 mm NMR skúmaviek na NMR analýzu. Pre niektoré vzorky sa uskutočnil ďalší krok: po solubilizácii lyofilizovaných práškov v acetóne-dg v prítomnosti stôp kadmia sa vzorky odparili do sucha a potom sa znovu rozpustili v acetóne-d bez ďalšieho pridania Cd.

3.10. Špecifikácie prístroja

UPLC-MS analýza. Reakcie sa monitorovali pomocou dvoch systémov UPLC-MS. Prvý bol použitý na presnú identifikáciu retenčných časov produktov pomocou metódy dlhého gradientu. tj Watersova ultravysoko výkonná kvapalinová chromatografia s reverznou fázou spojená s hmotnostnou spektrometriou (UHPLC-MS). Systém kvapalinovej chromatografie bol Acquity UPLC (Waters, Milford, MA, USA) vybavený detektorom s fotodiódovým poľom. Použili sme stĺpec Acquity UPLC HSS T3 (1,8 um, 2,1 × 150 mm). Teplota kolóny bola 25 stupňov. Binárna mobilná fáza pozostávala z 0,1 percenta kyseliny mravčej vo vode (rozpúšťadlo A) a acetonitrilu (rozpúšťadlo B). Separácia sa uskutočňovala pri konštantnom prietoku 0,25 ml·min-1, s použitím nasledujúceho gradientu:8-11 percent B za 2 minúty; 11 percent B za 8 minút; 11-25 percent B za 15 minút;25-55 percent Bin 5 min;55-99 percent Bin 1 min;99 percent B počas 4 min;99-8 percent Bin1 min;8 percent B na 4 min. Objem injekcie bol 5 ul. Hmotnostný spektrometer bol Waters Acquity QDa elektrosprejová ionizácia (ESI) jednoduchý kvadrupól (Waters, Milford, MA, USA). Kapilárne napätie bolo nastavené na 0,8 kV. Hmotnostné spektrá boli získané v hmotnostnom rozsahu 200-900 v režime tenkých kladných iónov.

Druhý systém UHPLC-MS, ktorý sa použil na rýchle overenie počas purifikačných krokov, bol rovnaký ako predtým, s kolónou Acquity UHPLC HSS T3 （1,8 μm, 2,1×100 mm） vyhrievanou pri 38 stupňoch. Separácia sa uskutočňovala pri konštantnom prietoku 0,55 ml·min{10}} s použitím nasledujúceho rýchleho gradientu: 0.{12}} percent B za 5 minút; 40-99 percent B za 2 minúty; 99 percent B počas 1 minúty; 99-0.1 percenta B za 1 min. Objem injekcie bol 2 ul. Hmotnostný spektrometer bol iónový lapač Bruker Amazon X s elektrosprejovou ionizáciou (ESI) (Bruker Daltonics, Brémy, Nemecko). Kapilárne napätie bolo nastavené na -5,5 kV. Hmotnostné spektrá boli získané v hmotnostnom rozsahu 50-2000 v režime tenkých kladných iónov.

Všetky UPLC-MS analýzy sa uskutočnili trojmo.

NMR prístrojové vybavenie. Všetky NMR spektrá boli zaznamenané na spektrometri Agilent DD {{0}}} MHz (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), pracujúcom pri 500,05 a 125,74 MHz pre protónové a uhlíkové-13 jadrá, s použitím 5 mm nepriamej detekčnej sondy vybavenej gradientovou cievkou. 1D'H a 13C, 2Dhomonukleárne1H TOCSY a ROESY a heteronukleárne 1H/13C HSQC a HMBCexperimenty sa uskutočnili s použitím klasických pulzných sekvencií a analyzovali sa pomocou VNMRJ4.2 a MestReNova 14. .1 (Mestrelab Research, Španielsko) softvér. Merania DOSY sa získali a spracovali tak, ako už bolo opísané 38]. Akvizičné parametre sekvencie impulzov DgcsteSL boli nasledovné: čas oneskorenia difúzie a šírka impulzu gradientu boli nastavené na 50 ms a 2 ms, intenzita gradientu (g) ​​sa zvyšovala v 16 krokoch s rovnakým rozostupom g2 od 0,3 do 32G·cm-I. Po fázovej korekcii boli skonštruované 2D DOSY spektrá z merania výšky píku pomocou softvéru VNMRJ4.2.

Všetky spektrá boli vztiahnuté na signály acetón-dg (zvyškový signál 'H pri 2,05 ppm a signál 13C pri 29,92 ppm).

4. Závery

Skúmalo sa pôsobenie troch rôznych oxidoreduktáz (polyfenoloxidáza extrahovaná z hrozna, lakáza z Botrytis cinerea a lakáza z Trametes Versicolor) na (plus)-katechín a výsledné profily LC-UV-MS boli veľmi podobné, aj keď niektoré menšie rozdiely naznačili možné rozdiely v reaktivite týchto enzýmov.

Štruktúry šiestich katechín-lakázových oxidačných produktov (s použitím lakázy od Trametes Versicolor) sa získali na základe špecifických NMR podpisov (štyri čisté produkty, tj N2, N3, N6 a N8 a N4, zodpovedajúce zmesi dva izoméry). Úplné priradenie fenolických OH signálov bolo možné vďaka pridaniu dusičnanu kademnatého s postupom prípravy vzorky, ktorý umožnil jednoznačné prisúdenie väzieb medzi katechínovými jednotkami pre niektoré zlúčeniny, ktoré sú predmetom záujmu. Tento postup výrazne zjednoduší NMR analýzu zmesí polyfenolov, buď syntetizovaných alebo extrahovaných z prírodných produktov.

Štandardy získané v tejto práci môžu byť v budúcnosti použité ako oxidačné markery na skúmanie ich prítomnosti a vývoja počas dozrievania hrozna a starnutia vína. Okrem katechínu sa môžu ako substráty lakázy použiť aj iné polyfenolové zlúčeniny vrátane flavonoidov a neflavonoidov na získanie ďalších nových štandardov.

Skratky

NMR: nukleárna magnetická rezonancia,

Cd: kadmium,

TOCSY: totálna korelačná spektroskopia,

ROESY: Spektroskopia jadrového Overhauserovho efektu s rotujúcim rámom,

HSQC: heteronukleárny jednokvantový korelačný experiment,

HMBC: heteronukleárne viacpásmové pripojenie,

DOSY: difúzne riadená spektroskopia.

Referencie

1. Khan, N.; Mukhtar, H. Čajové polyfenoly na podporu zdravia. Life Sci. 2007, 81, 519-533. [CrossRef]

2. Fayeulle, N.; Vallverdu-Queralt, A.; Meudec, E.; Hue, C.; Boulanger, R.; Cheynier, V.; Sommerer, N. Charakterizácia nových flavanových-3-derivátov vo fermentovaných kakaových bôboch. Food Chem. 2018, 259, 207–212. [CrossRef] [PubMed]

3. Rimbach, G.; Melchin, M.; Moehring, J.; Wagner, AE Polyfenoly z kakaa a cievne zdravie – kritický prehľad. Int. J. Mol. Sci. 2009, 10, 4290–4309. [CrossRef]

4. Avram, AM; Morin, P.; Brownmiller, C.; Howard, LR; Sengupta, A.; Wickramasinghe, SR Koncentrácie polyfenolov z extraktu z čučoriedkových výliskov pomocou nanofiltrácie. Food Bioprod. Proces. 2017, 106, 91–101. [CrossRef]

5. Antoniolli, A.; Fontana, AR; Piccoli, P.; Bottini, R. Charakterizácia polyfenolov a hodnotenie antioxidačnej kapacity v hroznových výliskoch Cv. Malbec. Food Chem. 2015, 178, 172–178. [CrossRef]

6. Saucier, C. Ako sa vyvíjajú polyfenoly vína počas starnutia vína? Cerevisia 2010, 35, 11–15. [CrossRef]

7. Oliveira, CM; Ferreira, ACS; De Freitas, V.; Silva, AMS Oxidačné mechanizmy vyskytujúce sa vo vínach. Food Res. Int. 2011, 44, 1115–1126. [CrossRef]

8. Singleton, VL Kyslík s fenolmi a súvisiace reakcie v muštoch, vínach a modelových systémoch: pozorovania a praktické dôsledky. Am. J. Enol. Vitic. 1987, 38, 69-77.

9. Mathew, AG; Parpia, HAB Browning Food as a Polyphenol Reaction. In Pokroky vo výskume potravín; Chichester, CO, Mrak, EM, Stewart, GF, Eds.; Academic Press: Cambridge, MA, USA, 1971; Zväzok 19, s. 75–145. [CrossRef]

10. Gambuti, A.; Rinaldi, A.; Ugliano, M.; Moio, L. Evolúcia fenolových zlúčenín a adstringencia počas starnutia červeného vína: Vplyv vystavenia kyslíku pred a po fľaškovaní. J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 1618–1627. [CrossRef] [PubMed]