pre viac informácií:{0}}

Identifikácia a overenie vaskulárneho bunkového adhézneho proteínu 1 ako imunitne podmieneného hubgénu spojeného s tubulointersticiálnym poškodením pri diabetickej chorobe obličiek

Yan Jia a kol

ABSTRAKT

Diabetické ochorenie obličiek(DKD) je hlavnou príčinouchronické ochorenie obličiek(CKD) a konečné štádium renálneho ochorenia (ESRD), ale patogenéza nie je úplne objasnená. Tubulointersticiálne poškodenie hrá rozhodujúcu úlohu vo vývoji a progresii DKD(Diabetické ochorenie obličiek). Cieľom tejto štúdie bolo preskúmať profil infiltrácie tubulointersticiálnych imunitných buniek a odhaliť základné mechanizmy medzi poškodením tubulárnych buniek a intersticiálnym zápalom v DKD(Diabetické ochorenie obličiek)pomocou bioinformatických stratégií. Po prvé, analýza xCell identifikovala imunitné bunky vykazujúce významné zmeny v DKD(Diabetické ochorenie obličiek)tubulointerstitium, vrátane upregulovaných CD4 plus T buniek, Th2 buniek, CD8 plus T buniek, M1 makrofágov, aktivovaných dendritických buniek (DC) a konvenčných DC, ako aj downregulovaných Tregs. Po druhé, pyroptóza bola identifikovaná ako hlavná forma bunkovej smrti v porovnaní s inými formami programovanej bunkovej smrti. Vaskulárny bunkový adhézny proteín 1 (VCAM1) bol identifikovaný ako vrchol génu. Korelačná analýza ukázala, že VCAM1 významne pozitívne koreloval s pyroptózou a infiltrovanými imunitnými bunkami v tubulointerstíciu. Upregulácia VCAM1 v DKD tubulointerstitiu bola ďalej overená v kohorte European Renal cDNA Bank a pozorovalo sa, že negatívne koreluje s rýchlosťou glomerulárnej filtrácie (GFR). Naša in vitro štúdia potvrdila zvýšenú expresiu VCAM1 v bunkách HK{10}} za diabetických podmienok a inhibícia pyroptózy disulfiramom znížila expresiu VCAM1, uvoľňovanie zápalových cytokínov a fibrózu. Na záver, naša štúdia identifikovala upregulovanú expresiu VCAM1 v renálnych tubulárnych bunkách, ktoré by mohli interagovať s infiltrovanými imunitnými bunkami, a tak podporovať fibrózu. Liek disulfiram schválený FDA môže zlepšiť fibrózu v DKD(Diabetické ochorenie obličiek)zacielením tubulárnej pyroptózy a expresie VCAM1.

KĽÚČOVÉ SLOVÁ:DKD; tubulointerstitium; imunitné bunky; pyroptóza; VCAM1; disulfiram

Cistanche dokáže liečiťDiabetické ochorenie obličiek

Kliknite na Cistanche pre ochorenie obličiek

Úvod

Diabetické ochorenie obličiek(DKD), jedna z častých komplikácií diabetu, je hlavnou príčinou chronickej obličkovej choroby (CKD) a konečného štádia obličkovej choroby (ESRD) v mnohých rozvinutých a rozvojových krajinách [1,2]. Podľa správy od China Kidney Disease Network (CK NET), DKD(Diabetické ochorenie obličiek)predstavuje 26,70 percent všetkých prípadov CKD a predstavuje veľkú medicínsku a ekonomickú záťaž [2]. Patogenéza DKD je komplexná a zahŕňa množstvo rôznych dráh. Objasnenie patologických charakteristík a patogenézy DKD pomôže zlepšiť klinický manažment a identifikovať nové terapeutické ciele.

Hoci glomerulárne poškodenie je hlavným patologickým znakom DKD(Diabetické ochorenie obličiek)Čoraz viac dôkazov nedávno odhalilo, že tubulointersticiálna patológia [3,4], ako je tubulárna atrofia, intersticiálna fibróza a intersticiálne infiltrujúce imunitné bunky, hrá rozhodujúcu úlohu vo vývoji a progresii DKD.(Diabetické ochorenie obličiek)[5 – 7]. Bioinformatická analýza predstavuje efektívnu metódu na spracovanie veľkého množstva údajov v extrémne krátkom čase a poskytuje cenné informácie o ochorení. Bioinformatické štúdie skúmajúce expresiu tubulointersticiálneho génu a infiltráciu imunitných buniek v DKD sú však relatívne zriedkavé.

Účelom štúdie bolo opísať charakteristiky DKD(Diabetické ochorenie obličiek)infiltráciu tubulointersticiálnych imunitných buniek a identifikovať niektoré kľúčové imunitné a zápalové gény, aby poskytli nové poznatky o patogenéze a terapii DKD. Po prvé, tubulointersticiálny mikročipový súbor údajov DKD(Diabetické ochorenie obličiek)bol stiahnutý z databázy Gene Expression Omnibus (GEO). Pomocou xCell [8], webového nástroja, ktorý vykonáva analýzu obohatenia o bunkový typ údajov o génovej expresii pre 64 typov imunitných a stromálnych buniek, sme najprv skúmali rozdiely v infiltrácii imunitných buniek medzi obličkovými tkanivami od jedincov s DKD.(Diabetické ochorenie obličiek)a normálne ovládacie prvky. Po druhé, vykonal sa skríning zoznamu imunitne podmienených rozdielne exprimovaných génov (DEG), medzi ktorými bol identifikovaný špičkový gén, vaskulárny bunkový adhézny proteín 1 (VCAM1), ako gén imunitného uzla v DKD.(Diabetické ochorenie obličiek). Potom sa z GeneCards získali súbory génov spojené s rôznymi formami bunkovej smrti a pyroptóza sa vyhodnotila ako hlavná forma bunkovej smrti pomocou analýz variácií génových súborov (GSVA) ​​a analýzy obohatenia génových súborov (GSEA). Okrem toho korelačná analýza ukázala, že VCAM1 pozitívne koreloval s infiltráciou tubulointersticiálnych imunitných buniek a pyroptózou. Upregulovaná expresia VCAM1 v tubulointerstitiu DKD bola ďalej overená v kohorte Európskej renálnej cDNA banky (ERCB) a pozorovalo sa, že negatívne koreluje s funkciou obličiek u pacientov s DKD. Štúdia in vitro potvrdila zvýšenú expresiu VCAM1 v bunkách HK-2 kultivovaných za diabetických podmienok a inhibícia pyroptózy liekom disulfiram schváleným FDA znížila expresiu VCAM1, uvoľňovanie zápalových cytokínov a fibrózu. Tubulárna pyroptóza a upregulovaná expresia VCAM1 teda môžu byť cieľmi imunoterapie DKD.

Metódy

Microarray dáta

Súbor údajov o expresii ľudských génov GSE30529 bol stiahnutý z Národného centra pre biotechnologické informácie (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO, databáza. GSE30529 (GPL571 [HG U133A_2] Affymetrix Human Genome U133A 2.0 Array ) pozostával z 10 DKD(Diabetické ochorenie obličiek)vzorky tubulov a 12 kontrolných vzoriek

Spracovanie dát

Nespracované údaje v súbore údajov GSE30529 boli stiahnuté a spracované pomocou balíka Limma a balíka Oligo [9,10]. Spracovanie údajov zahŕňalo korekciu pozadia, normalizáciu a výpočet výrazu. Keď sa na jeden génový symbol mapovalo viacero sond, vypočítala sa priemerná úroveň expresie sond a považovala sa za úroveň génovej expresie tohto génu. Sondy, ktoré sa nezmapovali na gény, boli odstránené.

Cistanche dokáže liečiťDiabetické ochorenie obličiek

Analýza imunitných a stromálnych buniek

Použili sme novú metódu založenú na génovom podpise, xCell [8], aby sme odhadli skóre obohatenia bunkového typu a určili profil infiltrujúcich imunitných buniek v tubulointerstíciu pacientov s DKD.(Diabetické ochorenie obličiek). xCell je metóda na analýzu obohatenia bunkového typu pomocou jednovzorkovej analýzy obohatenia génovej sady (ssGSEA), ktorá vypočítava skóre obohatenia pre 64 typov buniek vrátane 34 typov imunitných buniek, 30 typov stromálnych buniek a iných buniek. Vo veľkej miere prekonáva iné analýzy in silico (vrátane CIBERSORT) tým, že zahŕňa viac typov imunitných buniek a využíva kompenzačnú techniku ​​prelievania na zníženie závislostí medzi úzko súvisiacimi typmi buniek. 34 typov imunitných buniek bolo kategorizovaných do deviatich skupín, vrátane subpopulácií CD4 plus T buniek, CD8 plus T bunkových subpopulácií, gama delta T buniek (T δ bunky), NK buniek, NKT buniek, subpopulácií B buniek, subpopulácií monocytov/makrofágov, subpopulácie dendritických buniek (DC) a subpopulácie granulocytov.

Analýza obohatenia génovej sady (GSEA) a analýzy variácie génovej sady (GSVA)

Použitím charakteristických génových súborov ako referenčného génového súboru sme vykonali analýzy variácií génových súborov (GSVA) ​​medzi DKD(Diabetické ochorenie obličiek) and control tissues using the GSVA Bioconductor package [11]. The thresholds were set to enrichment score change > 1.0, p-value < 0.05 and t value >2. Boli identifikované upregulované aj downregulované dráhy. GSEA bola vykonaná pomocou desktopovej aplikácie GSEA [12] a miera falošných objavov (FDR)<0.25 and="" p-value=""><0.05 were="" set="" as="" the="">

Konštrukcia génových súborov reprezentujúcich rôzne formy bunkovej smrti a analýzy obohatenia

Génové sady reprezentujúce rôzne formy bunkovej smrti boli skonštruované vyhľadaním kľúčových slov „pyroptóza“, „nekróza“, „nekropóza“, „apoptóza“, „ferroptóza“ a „autofágia“ v databáze GeneCards (https://www.genecards .org/). Gény nekódujúce proteíny boli odstránené. Génové sady sú uvedené v tabuľke S2. Potom sa uskutočnila génová sada GSEA s použitím desktopovej aplikácie GSEA na vyhodnotenie formy bunkovej smrti v tubulointerstíciu. Vykonali sme Pearsonove korelačné analýzy, aby sme preskúmali vzťah medzi kľúčovými cestami bunkovej smrti a infiltráciou imunitných buniek v tubulointerstíciu.

Analýza DEGs a skríning génov imunitných uzlov

DEG medzi pacientmi s DKD(Diabetické ochorenie obličiek)a zdravé kontroly boli identifikované pomocou balíka „Limma“ [13] v softvéri R. Upravená hodnota P<0.05 and="" log="" fold="" change="" (fc)="" ≥="" 1="" were="" set="" as="" the="" thresholds.="" a="" list="" of="" 1793="" immune-related="" genes="" was="" down-loaded="" from="" immport="" shared="" data="" (https://www.="" immport.org/shared/genelists),="" and="" shared="" genes="" from="" the="" two="" datasets="" (degs="" and="" immunerelevant="" gene="" list)="" were="" determined="" by="" constructing="" a="" venn="" diagram="" to="" identify="" immune-related="" hub="" genes.="" an="" analysis="" of="" the="" functional="" interactions="" between="" proteins="" might="" provide="" insights="" into="" the="" mechanisms="" of="" dkd="">(Diabetické ochorenie obličiek). V tejto štúdii boli siete interakcie proteín-proteín (PPI) deväťdesiatich štyroch zdieľaných génov generované pomocou databázy STRING (https://string-db.org/) a vizualizované pomocou softvéru Cytoscape (verzia 3.7.1, http ://www.cytoscape.org/). Skóre interakcie vyššie ako 0.4 (stredná spoľahlivosť) sa považovalo za štatisticky významné. CytoHubba, zásuvný modul Cytoscape, sa použil na preskúmanie génov rozbočovačov siete PPI [14]. Medzi nimi bol gén VCAM1 najvyššie hodnotený. Analýzy obohatenia tridsiatich génov imunitných uzlov identifikovaných vyššie sa uskutočnili pomocou online nástroja Metascape [15]. Okrem toho boli dominantné moduly v sieti PPI identifikované pomocou zásuvného modulu MCODE (verzia 1.4.2, http://apps.cytoscape.org/apps/MCODE) v softvéri Cytoscape.

Verifikácia VCAM1 a korelačná analýza s funkciou obličiek

Diferenciálna expresia VCAM1 v tubulointerstíciu pacientov s DKD(Diabetické ochorenie obličiek)bola validovaná v kohorte ERCB (31 zdravých kontrol a 17 pacientov s DKD). Potom sme použili online databázu Nephroseq v5 (http://v5.nephroseq.org), integrovanú platformu na dolovanie údajov pre súbory údajov o génovej expresii ochorení obličiek, aby sme potvrdili koreláciu medzi expresiou VCAM1 a klinickými znakmi pacientov s DKD pomocou Pearsonova korelačná analýza v ERCB. P-hodnota<0.05 was="" considered="" statistically="">

Imunofluorescenčné farbenie pre VCAM1

Parafínové rezy obličky od pacienta s klinicko-patologickou diagnózou DKD(Diabetické ochorenie obličiek)boli zafarbené VCAM1. Toto bolo schválené Výborom pre etiku výskumu prvej nemocnice Pekingskej univerzity (č. 20171280). Nešpecifická väzba bola blokovaná 3 percentami BSA po fixácii a tepelnom spracovaní na získanie antigénu. Rezy obličiek sa potom inkubovali s primárnou protilátkou proti VCAM1 (Abcam, ab134047, 1:200) cez noc pri 4 stupňoch. Cy3-značená sekundárna protilátka bola získaná od Jackson ImmunoResearch. Ako normálna kontrola sa použilo obličkové tkanivo susediace s nádorom zo vzoriek z nefrektómie. Reprezentatívne snímky boli zachytené pomocou fotoaparátu Leica DFC 7000 T prostredníctvom softvéru Leica Application Suite V4.7.1.

Bunková kultúra

Bunky ľudskej obličky 2 (HK-2), bunková línia proximálnych tubulárnych buniek ľudskej obličky, boli kultivované v DMEM (11885084, Gibco, USA) doplnenom 10 percentným fetálnym hovädzím sérom (10099141 C, Gibco, USA) a 1 percento penicilínu/streptomycínu (10378016, Gibco, USA) pri 37 stupňoch s 5 percentami CO2. Vysoká hladina glukózy (30 mM D-glukóza, G8644, Sigma) [16] a TNF (40 ng/ml, 300–01A, PeproTech) [17] sa použila na vyvolanie poškodenia buniek HK-2 in vitro. Disulfiram (DSL, 0,3 μM [18,19], NSC190940, Selleck), inhibítor tvorby pórov, bol pridaný 3 hodiny pred indukciou poškodenia HK-2 buniek.

Western blot

Celkový proteín bol extrahovaný z buniek HK{{0}} pomocou RIPA pufra (Sigma, R0278) a koncentrácia proteínu bola stanovená pomocou súpravy Pierce BCA Protein Assay kit (Thermo Fisher Scientific, 23227). Ďalej sa denaturované proteíny oddelili elektroforézou na dodecylsulfát-polyakrylamidovom géli sodnom (SDS-PAGE) a potom sa elektricky preniesli na polyvinylidéndifluoridové membrány (Millipore, IPVH00010). Membrány boli blokované počas 60 minút 5 percentným odtučneným mliekom rozpusteným v Tris-pufrovanom fyziologickom roztoku obsahujúcom 0,1 percenta Tween 20 (TBST). Bloty sa inkubovali s nasledujúcimi relevantnými primárnymi protilátkami cez noc pri 4 stupňoch: GSDMD (Abcam, ab209845, 1:1000), VCAM1 (Abcam, ab134047, 1:2000) a tubulín (ZSBio, TA{20}}, 1 :5000). Inkubácia so sekundárnou protilátkou konjugovanou s HRP v riedení 1:1000 sa uskutočňovala 1 hodinu pri teplote miestnosti. Po piatich premytiach TBST boli membrány inkubované s chemiluminiscenčným substrátom (Millipore, WBKLS0100) počas 5 minút a snímky boli zachytené pomocou systému Image Quant LAS 4000 Mini (GE Healthcare). Semikvantitatívna analýza sa uskutočnila pomocou softvéru ImageJ (Media Cybernetics, Silver Spring, MD).

Izolácia RNA a analýza RT-PCR

Celková RNA bola extrahovaná z HK{0}} buniek pomocou súpravy RNAsimple Total RNA Kit (Tiangen, DP419) podľa pokynov výrobcu a reverzne transkribovaná do cDNA pomocou súpravy FastKing RT Kit (Tiangen, KR116). Kvantitatívna PCR sa uskutočnila pomocou systému StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA) s dvojkrokovými metódami. Sekvencie použitých primérov sú uvedené v tabuľke S4. Porovnávacia génová expresia sa vypočítala pomocou metódy 2-AACt, ako je opísané vyššie.

Štatistická analýza

Na štatistické analýzy sa použil softvér GraphPad Prism 6.{1}} a údaje sú prezentované ako priemer ± SEM. Na porovnanie medzi dvoma skupinami sa použil dvojstranný nepárový t-test. Rozdiely na úrovni P < 0,05="" sa="" považovali="" za="" štatisticky="">

Cistanche dokáže liečiťDiabetické ochorenie obličiek

Výsledky

Hromadné dôkazy nedávno odhalili, že tubulointersticiálna patológia hrá rozhodujúcu úlohu vo vývoji a progresii DKD(Diabetické ochorenie obličiek). Účelom štúdie bolo opísať charakteristiky DKD(Diabetické ochorenie obličiek)infiltráciu tubulointersticiálnych imunitných buniek a identifikovať niektoré kľúčové imunitné a zápalové gény, aby poskytli nové poznatky o patogenéze a terapii DKD. V tejto štúdii sme skúmali profil infiltrácie tubulointersticiálnych imunitných buniek a identifikovali sme pyroptózu ako hlavnú formu programovanej bunkovej smrti v DKD(Diabetické ochorenie obličiek)pomocou bioinformatickej analýzy. VCAM1 bol identifikovaný ako top gén imunitného spojenia a pozitívne koreloval s pyroptózou a infiltrovanými imunitnými bunkami. Okrem toho sa potvrdilo, že expresia VCAM1 je zvýšená v renálnych tubulárnych bunkách kultivovaných za diabetických podmienok. Liek disulfiram schválený FDA inhiboval pyroptózu renálnych tubulárnych buniek a znižoval expresiu VCAM1, hladiny zápalových cytokínov a fibrózu in vitro.

1. Pracovné postupy bioinformatických analýz

Hlavné kroky pracovného postupu sú znázornené na obrázku 1. Najprv sme hodnotili infiltráciu imunitných buniek v tubulointersticiálnych tkanivách od pacientov s DKD(Diabetické ochorenie obličiek). Potom bola pomocou GSEA a GSVA objavená pyroptóza, hlavná forma bunkovej smrti v tubulointerstíciu. Ďalej sme preskúmali zoznam génov úzko súvisiacich s infiltráciou imunitných buniek a identifikovali sme gény hubu. Uskutočnila sa korelačná analýza medzi infiltrovanými imunitnými bunkami, pyroptózou a hlavným génom VCAM1. Okrem toho sa uskutočnila klinická validácia a validácia imunofarbenia VCAM1. Nakoniec sme ďalej vykonali štúdiu in vitro na overenie výsledkov bioinformatickej analýzy.

2. Analýza dekonvolúcie imunitných a stromálnych buniek

Použili sme xCell, ktorý generuje skóre obohatenia bunkového typu pomocou údajov o hromadnej génovej expresii, na určenie typov buniek potenciálne zapojených do tubulointersticiálneho poškodeniadiabetické ochorenie obličiek. Pre každú vzorku sa získali skóre obohatenia 64 typov buniek, vrátane 34 typov imunitných buniek a 30 typov stromálnych a iných buniek (obrázok 2 (a)). Tepelná mapa 34 skóre obohatenia imunitných buniek bola znázornená na identifikáciu imunitnej krajiny DKD(Diabetické ochorenie obličiek)tubulointerstitium (obrázok 2(b)). V porovnaní s normálnymi kontrolami bola väčšina skóre obohatenia T buniek relatívne vyššia u pacientov s DKD(Diabetické ochorenie obličiek)s výnimkou CD4 plus Tcm, Tregs, Th1 buniek, CD8 plus naivných T buniek a NKT buniek. Skóre obohatenia aDC a cDC boli vyššie u pacientov s DKD(Diabetické ochorenie obličiek)ako u kontrol, zatiaľ čo skóre obohatenia Pro-B buniek bolo nižšie u pacientov s DKD. Skóre obohatenia väčšiny podskupín monocytov/makrofágov a granulocytov sa medzi DKD významne nelíšilo(Diabetické ochorenie obličiek)a normálne tkanivá, s výnimkou M1 makrofágov a neutrofilov a eozinofilov (tabuľka 1).

Obrázok 2. Analýza infiltrácie imunitných buniek pomocou xCell v tubulointerstíciu DKD(Diabetické ochorenie obličiek). (a) Porovnanie bunkového skóre 64 typov buniek v tubulointerstíciu medzi DKD a kontrolným obličkovým tkanivom v súbore údajov GSE30529. (b) Bunková krajina imunitného mikroprostredia v DKD(Diabetické ochorenie obličiek). Tepelná mapa predstavuje skóre obohatenia o bunkový typ každého typu imunitných buniek pre všetky vzorky. DC, dendritická bunka; Tcm, centrálna pamäťová T bunka; Tem, efektívna pamäťová T bunka; T 5 bunka, gama delta T bunka.

3. GSVA a GSEA súborov charakteristických génov

Vykonali sme GSVA a GSEA súboru charakteristických génov v súbore údajov GSE30529 s cieľom preskúmať biologické procesy v DKD(Diabetické ochorenie obličiek)tubulointerstitium. Signálne dráhy „interferón-alfa“, „reakcia interferónu-gama“ a „komplement“ boli významne aktivované v patogenéze tubulointersticiálneho poškodenia u pacientov s DKD (obrázok 3(a)) a je zobrazený súhrn výsledkov GSVA v tabuľke S1. Potom sme vykonali GSEA troch génových súborov a zistili sme, že boli pozitívne obohatené v súbore údajov. Normalizované skóre obohatenia (NES) bolo 1,89, 1,89 a 1,7{{10}}, s normalizovanými hodnotami p (hodnoty NOM p) 0.000, 0,002 a 0,019, v uvedenom poradí (obrázok 3(bd)). Všetky významne obohatené dráhy identifikované pomocou GSEA sú uvedené v tabuľke 2. Tieto údaje naznačujú, že tubulointersticiálna imunitná odpoveď hrá dôležitú úlohu v patogenéze DKD(Diabetické ochorenie obličiek).

4. GSEA a GSVA génových súborov spojených s rôznymi formami bunkovej smrti

Bunková smrť zahŕňa pyroptózu, nekrózu, nekroptózu, apoptózu, feroptózu a autofágiu, ktoré majú rôzne patofyziologické mechanizmy a signálne dráhy. Uvádza sa, že rôzne formy programovanej bunkovej smrti sú spojené so zápalovými a imunitnými odpoveďami. Skonštruovali sme génové sady niekoľkých typov bunkovej smrti z GeneCards (tabuľka S2) a potom sme vykonali GSEA aj GSVA, aby sme preskúmali zapojenie bunkovej smrti do tubulointersticiálneho zápalu u pacientov s DKD.(Diabetické ochorenie obličiek). GSEA ukázala, že iba súbory génov pyroptózy boli významne obohatené u pacientov s DKD(Diabetické ochorenie obličiek)v porovnaní s normálnymi kontrolami (NES=1,65, hodnota FDR q=0,023, FWER=0,013) (obrázok 3(e)). Medzitým bolo skóre GSVA pre pyroptózu najvyššie spomedzi všetkých rôznych analyzovaných typov bunkovej smrti (tabuľka S3). Na základe tohto výsledku môže pyroptóza hrať úlohu v patogenéze tubulointersticiálnych poranení u pacientov s DKD(Diabetické ochorenie obličiek).

Obrázok 3. Analýza obohatenia génovej sady (GSEA) a analýzy variácie génovej sady (GSVA). (a) Barplot výsledkov GSVA 50 charakteristických génových súborov. (b)-(d) Výsledky GSEA „Hallmark_ odozvy na interferón-alfa“, „Hallmark_ odpovede na interferón-gama“ a „Hallmarkov komplement“. (e) GSEA výsledok pyroptózy.

5. Korelácia medzi skóre obohatenia pyroptózou a infiltráciou imunitných buniek

Skóre obohatenia GSVA pre pyroptózu boli korelované s podielom infiltrácie imunitných buniek vykonaním Pearsonovej korelačnej analýzy na vyhodnotenie korelácie medzi pyroptózou a infiltráciou imunitných buniek. Pozorovali sme významnú koreláciu medzi 15 typmi imunitných buniek a pyroptózou (obrázok 4), čo naznačuje úzku interakciu medzi imunitnými bunkami a pyroptózou.

6. Objav základných génov

Uskutočnila sa diferenciálna expresná analýza, aby sa ďalej preskúmal vzťah medzi renálnymi tubulárnymi bunkami a intersticiálnymi imunitnými bunkami. Medzi DKD bolo identifikovaných štyristo osem stupňov(Diabetické ochorenie obličiek)skupina a kontrolná skupina, z ktorých 65 bolo downregulovaných a 343 upregulovaných (obrázok 5). Bol stiahnutý zoznam imunitne príbuzných génov na identifikáciu imunitne príbuzných DEG a 94 hubových imunitných génov bolo získaných z dvoch súborov údajov (DEG a zoznam imunitne príbuzných génov) prostredníctvom Vennovho diagramu (obrázok 6 (a)). Analýza PPI týchto deväťdesiatich štyroch hubových imunitných génov odhalila 97 uzlov a 694 interakcií (obrázok S1). Prvých 30 uzlov vypočítaných pomocou algoritmu MCC bolo identifikovaných ako gény hub (obrázok 6(b) a tabuľka 3). Potom sa uskutočnila analýza obohatenia hubových génov. „Odmietnutie aloštepu“, „reakcia na interferón-gama“, „zápalová odpoveď“, „reakcia na interferón-alfa“, „epitelio-mezenchymálny prechod“ a „komplement“ boli najviac obohatenými položkami v analýze charakteristických znakov. „Reumatoidná artritída“, „interakcia cytokínového receptora“, „signálna dráha Toll-like receptora“, „pertussis“ a „signálna dráha NF-kappa B“ boli najviac obohatené výrazy KEGG. Najviac obohatenými GO termínmi boli „bunková odozva interferón gama“, „chemokínová aktivita“, „adhézia leukocytov a buniek“ a „regulácia produkcie cytokínov“ (obrázok 6(c)). Okrem toho skórovací systém MCODE identifikoval dva klastre so skóre väčším alebo rovným 5. PTRPC, TRIM22, PSMB8, KNG1 a CXCL6 boli uzly uzlov s vyšším stupňom uzlov v module 1 (obrázok 6(d)) a CD1C, EGF, FCER1G, CD3D a CD48 boli uzly uzla v module 2 (obrázok 6(e)).

7. Korelácia medzi expresiou VCAM1 a infiltráciou imunitných buniek

Spomedzi identifikovaných hubových génov bol najvyššie hodnotený gén, VCAM1, identifikovaný ako gén imunitného hubu v DKD(Diabetické ochorenie obličiek). Expresia VCAM1 bola významne zvýšená u pacientov s DKD(Diabetické ochorenie obličiek)(Obrázok 7 (a)). Korelačná analýza odhalila, že expresia VCAM1 pozitívne korelovala s CD4 plus T bunkami (r=0.6877, P=0.0004), CD4 plus T pamäťové bunky (r=0.7102, P=0.0002), Th2 bunky (r=0.7358, P < 0,0001),="" cd8="" plus="" tcm="" (r="" {{18="" }}.6026,="" p="0.0030)," t="" δ="" bunky="" (r="0.5864," p="0.0041)," nk="" bunky="" (r="0.5692," p="0.0057)," makrofágy="" (r="0.5068," p="0.0161)," makrofágy="" m1="" (r="0.4441," p="0" .0384),="" adc="" (r="0.4814," p="0.0233)" a="" cdc="" (r="0.6562," p="0.0009)," ale="" negatívne="" korelujú="" s="" naivitou="" cd8="" plus="" t="" bunky="" (r="−0,4909," p="0,0204)" a="" nkt="" bunky="" (r="−0,5548," p="0,0074)" (obrázok="" 7(b="">

8. Korelácia medzi expresiou VCAM1 a pyroptózou

Uskutočnila sa Pearsonova korelačná analýza, aby sa zistilo, či upregulovaná expresia VCAM1 v tubulointerstíciu pacientov s DKD(Diabetické ochorenie obličiek)súvisí s pyroptózou. Expresia VCAM1 úzko súvisela s pyroptózou (r=0.6118, P=0.0025) (obrázok 7(c)), čo naznačuje, že pyroptóza môže indukovať expresiu VCAM1.

9. Overenie, klinický význam a imunofluorescenčná validácia expresie VCAM1

Vykonali sme relevantnú analýzu pacientov s DKD(Diabetické ochorenie obličiek)z ERCB na overenie zmeny expresie VCAM1 v DKD(Diabetické ochorenie obličiek)tubulointerstitium. Hladiny mRNA VCAM1 boli konzistentne významne vyššie u pacientov s DKD(Diabetické ochorenie obličiek)(Obrázok 8(a)). Expresia VCAM1 negatívne korelovala s rýchlosťou glomerulárnej filtrácie (GFR) (r=−0.5920, P=0.0123) (obrázok 8(b)) a pozitívne korelovala so sérom hladiny kreatinínu (r=0,5189, P=0,0328) (obrázok 8(c)). Ďalej sme vykonali imunofluorescenčné farbenie na VCAM1 v obličkovom tkanive pacienta s DKD(Diabetické ochorenie obličiek)a zistili, že renálna tubulárna expresia VCAM1 bola významne zvýšená v porovnaní s expresiou v normálnych obličkách (obrázok 8 (d)).

10. DSL inhibovala HG-indukovanú pyroptózu HK-2 buniek, expresiu VCAM1 a zápal

Kultivované bunky HK{0}} sme vystavili vysokej hladine glukózy (HG) a TNF- na 48 hodín, aby sme ďalej určili vzťah medzi pyroptózou tubulárnych buniek, expresiou VCAM1 a tubulointersticiálnou imunitnou odpoveďou u jedincov s DKD(Diabetické ochorenie obličiek). Pretože jadrom bunkovej pyroptózy je tvorba membránových pórov indukovaná štiepeným GSDMD, detegovali sme hladiny GSDMD N-terminálnej domény (GSDMD-NT) a VCAM1 pomocou westernového prenosu. HG aj TNF indukovali významné zvýšenie hladiny GSDMD-NT, čo naznačuje výskyt pyroptózy sprostredkovanej GSDMD (obrázok 9 (a)). Expresia VCAM1 sa štatisticky významne zvýšila v skupinách HG a TNF- (obrázok 9(b)). Disulfiram (DSL) je účinným inhibítorom tvorby pórov GSDMD [18]. Predbežné ošetrenie DSL zmiernilo zvýšenie hladín GSDMD-NT, čo naznačuje, že bunková pyroptóza bola potlačená. Medzitým sa expresia VCAM1 znížila v skupinách HG a TNF- vopred ošetrených DSL (obrázok 9 (ab)). Ďalej sa pomocou qPCR stanovil profil zápalových cytokínov. Výsledky ukázali, že upregulované hladiny mRNA MCP-1, IL-1 a IL{19}} indukované HG boli po predbežnej liečbe DSL významne znížené. V skupine TNF- sa hladina IL-1 významne znížila v skupine predliečenej DSL a hladiny MCP-1 a IL-18 sa významne nezmenili. V žiadnej skupine sa nezistili žiadne významné zmeny v hladinách IL-6 a IL{26}} mRNA. Dôležité je, že hladiny mRNA TGF- 1 sa tiež znížili v skupinách predliečených DSL. Pyroptotické tubulárne bunky teda zvýšili expresiu VCAM1 za diabetických podmienok a liečba rušiaca pyroptózu inhibovala expresiu VCAM1, zápal a fibrózu v HK-2 bunkách.

Cistanche dokáže liečiťDiabetické ochorenie obličiek

Kliknite sem pre časť II

Z: „Identifikácia a overenie vaskulárneho bunkového adhézneho proteínu 1 ako imunitne podmieneného hubového génu spojeného s tubulointersticiálnym poškodením pri diabetickej obličkovej chorobe“ od Yan Jia, et al.

---BIOENGINEERED 2021, VOL. 12, NO. 1, 6655-6673