Životaschopné a teplom usmrtené probiotické kmene zlepšujú orálnu imunitu zvýšením koncentrácie IgA v ústnej sliznici

Abstraktné

Imunita ústnej a nosovej sliznice hrá kľúčovú úlohu pri ochrane tela pred bakteriálnou a vírusovou inváziou. Bezpečné probiotické produkty sa používajú na posilnenie ľudskej imunity a zdravia ústnej dutiny. V tejto štúdii sme overili priaznivé účinky zmiešaných životaschopných probiotických tabliet, ktoré pozostávali z Lactobacillus salivarius subsp. salicinius AP-32, Bifdobacterium animalis subsp. lactis CP-9 a Lactobacillus paracasei ET-66 a teplom usmrtené probiotické tablety pozostávajúce z L. salivarius subsp. salicinius AP-32 a L. paracasei ET-66 o orálnej imunite medzi 45 zdravými účastníkmi. Účastníci boli náhodne rozdelení do skupín životaschopných probiotík, probiotík usmrtených teplom a placeba. Podávanie liečby trvalo 4 týždne. Vzorky slín sa odoberali v týždňoch 0, 2, 4 a 6 a merali sa populácie Lactobacillus, Bifidobacterium a Streptococcus mutans a koncentrácia IgA. Koncentrácie IgA a hladiny TGF-beta a IL-10 v bunkách PBMC boli kvantifikované metódou ELISA. Výsledky ukázali, že hladiny IgA v slinách boli významne zvýšené po podaní oboch životaschopných (119,30 ± 12,63 %, ***P<0.001) and heat-killed (116.78±12.28%, ***P<0.001) probiotics for 4 weeks. Among three probiotic strains, AP-32 would effectively increase the levels of TGF-beta and IL-10 in PBMCs. The oral pathogen Streptococcus mutans was significantly reduced on viable probiotic tablet administration (49.60±31.01%, ***P<0.001). The in vitro antibacterial test confirmed that viable probiotics effectively limited the survival rate of oral pathogens. Thus, this clinical pilot study demonstrated that oral probiotic tablets both in viable form or heat-killed form could exert beneficial effects on oral immunity via IL-10, TGB-beta mediated IgA secretion. The effective dosage of viable probiotic content in the oral tablet was 109 CFUs/g and the heat-killed oral tablet was 1× 1010 cells/g.

výhody doplnku cistanche-zvýšenie imunity

Úvod

Sliznica úst a nosa, vstupná brána pre kontakt s inhalovanými antigénmi, je hlavnou líniou obrany ľudského imunitného systému [1, 2]. Patogénne vírusy alebo baktérie zvyčajne napádajú povrchy sliznice ústnej a nosnej dutiny bojom proti lokálnemu imunitnému systému a zdravej mikroflóre [3]. Zápal a symptómy, vrátane kašľa, bolesti hrdla, nádchy a horúčky, sa vyvíjajú v dôsledku imunitných reakcií proti invazívnym patogénnym vírusom a baktériám [4]. Okrem toho je imunoglobulín A (IgA) hlavným imunitným faktorom v slinách a reguluje homeostázu orálnej mikroflóry [5]. Niekoľko štúdií uvádza schopnosť sekrečného IgA chrániť telo pred infekciou vírusovými patogénmi, vrátane respiračného syncyciálneho vírusu [6], rotavírusu [7] a vírusu chrípky [7]. Funkcia sekrečného IgA chráni slizničný epitel. Nicolas Millet a kol. zistili, že mukozálny IgA môže zabrániť komenzálnej dysbióze Candida albicans v ústnej dutine [8]. Zabraňuje tiež agregácii orálneho patogénu Streptococcus mutans, ktorý spôsobuje zubný povlak [9].

Okrem toho výskumníci zistili, že orálna mikroflóra a jej metabolity môžu lokálne ovplyvňovať imunitu na ústnej bariére [10]. Predchádzajúce štúdie preukázali účinnosť probiotík pri zvyšovaní koncentrácie IgA v ústnej sliznici [11]. Ericson a kol. preukázali, že žuvačky obsahujúce Lactobacillus reuteri sa podieľajú na adaptívnej imunitnej odpovedi zdravých jedincov zvýšením hladín IgA v slinách [12]. U ľudí sú imunitné cytokíny TGF-beta a IL-10 v korelácii s produkciou IgA [13].

Stále však nie je jasné, či orálna mikroflóra zvýšila hladiny sekrečného IgA prostredníctvom cytokínov TGF-beta a IL-10. Okrem toho orálne patogény zahŕňajú S. mutans, P. gingivalis a F. nucleatum subsp. polymorfizmus a A. actinomycetemcomitans vykazovali vysokú koreláciu s periodontálnym ochorením a zápachom z úst [14]. Probiotické produkty by mohli byť potenciálnou alternatívnou terapiou parodontitídy inhibíciou orálnych patogénov Fusobacterium nucleatum, ale Porphyromonas gingivalis a Aggregatibacter actinomycetemcomitans nepreukázali žiadny významný pokles [15]. Suplementácia probiotikami môže tiež zabrániť patogénnym infekciám [16]. Uvádza sa, že kľúčové druhy mikrobioty obmedzovali rast patogénnej Streptococcus pneumonia [17]. Udržiavanie vyváženého mikrobiálneho ekosystému prostredníctvom príjmu probiotických kmeňov môže byť teda alternatívnym spôsobom regulácie ústnej imunity a zlepšenia ústneho zdravia. Predchádzajúce zistenia o inhibícii orálnych patogénov probiotickými kmeňmi odhalili, že Lactobacillus salivarius subsp. salicinius AP-32, Bifdobacterium animalis subsp. lactis CP-9 a Lactobacillus paracasei ET-66 vykazujú vynikajúce antibakteriálne účinky in vitro; nie však mechanizmom zvyšovania hladín H2O2 [18]. Hlavnými stratégiami pre probiotické kmene na obmedzenie orálneho patogénneho rastu bola spoločná agregácia patogénov orálne, produkcia biosurfaktantov, zmena orálneho prostredia a tvorba antimikrobiálnych látok [19]. Štúdia in vitro navyše ukázala, že L. salicinius AP-32 sprostredkovával expresiu zápalového cytokínu [interleukín (IL)-8, IL-10] v ľudských epitelových bunkách [20]. Preto sme v tejto štúdii overili, či zmiešané životaschopné probiotické tablety pozostávajúce z L. salivarius subsp. salicinius AP-32, B. animalis subsp. lactis CP-9 a L. paracasei ET-66 a teplom usmrtené probiotické tablety pozostávajúce z L. salivarius subsp. Salicinius AP-32 a L. paracasei ET-66, zlepšil imunitnú funkciu prostredníctvom TGF-beta, IL-10 alebo zvýšil hladinu koncentrácie IgA v slinách. Bola testovaná antibakteriálna funkcia príjmu probiotického produktu v ústnej dutine.

Výhody doplnku cistanche-ako posilniť imunitný systém

Kliknite sem pre zobrazenie produktov Cistanche Enhance Immunity

【Požiadať o viac】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Materiál a metódy

Účastníci

Celkovo bolo prijatých 45 zdravých účastníkov vo veku 20–40 rokov, ktorí boli náhodne rozdelení do troch podskupín: životaschopné probiotické perorálne tablety, tepelne usmrtené probiotické perorálne tablety a skupiny s placebom. Každá skupina pozostávala z 15 účastníkov. Účastníci s fajčením a stravovacími návykmi betelových orechov boli vylúčení. Účastníkom boli slepo pridelené perorálne tablety. Všetci účastníci užívali perorálne tablety trikrát denne (ráno, napoludnie a večer) počas 4 týždňov. Vzorky slín (2 ml) sa odobrali na meranie koncentrácie IgA a populácií mikroorganizmov v 0., 2., 4. a 6. týždni. Informovaný súhlas bol získaný od všetkých účastníkov zahrnutých do tejto štúdie. Protokol bol schválený Inštitucionálnou revíznou radou Chung Shan Medical University, Taiwan (CS19052).

Životaschopné probiotické perorálne tablety

Životaschopná probiotická perorálna tableta (1 g) obsahovala tri životaschopné probiotické kmene, L. salivarius subsp. salicinius AP-32, B. animalis subsp. lactis CP-9 a L. paracasei ET-66. Zmiešali sme 0.01 g 1011 jednotiek tvorby kolónií (CFU) jedného probiotika v perorálnej tablete. Každý jednotlivý probiotický kmeň bol nameraný okolo 0,33 x 109 CFU/g. Celkový obsah probiotík v perorálnej tablete bol 109 kolónií CFU/g. Aktívna dávka probiotickej perorálnej tablety bola v súlade s predchádzajúcimi publikovanými prácami [18]. Všetky probiotické kmene boli získané z laboratória Biofag Biotech Co., Ltd. (Tainan, Taiwan). L. salivarius subsp. salicinius AP-32 bol izolovaný zo zdravého ľudského čreva a uložený vo Výskumnom a vývojovom inštitúte potravinárskeho priemyslu na Taiwane (ID: BCRC 910437) a na univerzite Wuhan, Čína (ID: CCTCC-M2011127); B. animalis subsp. mliečny CP-9 bol izolovaný zo zdravého ľudského materského mlieka a uložený v Food Industry Research and Development Institute, Taiwan (ID: BCRC 910645) a na Wuhan University (ID: CCTCC-M2014588); L. paracasei ET-66 bol izolovaný zo zdravého ľudského materského mlieka a uložený v Food Industry Research and Development Institute, Taiwan (ID: BCRC 910753) a v China General Microbiological Culture Collection Center, Peking, Čína (ID: CGMCC{ {22}}). Lactobacillus. salivarius subsp. salicinius AP-32 a L. paracasei ET-66 boli kultivované na agarových platniach de Man, Rogosa a Sharpe (MRS) (110 660, Merck, Darmstadt, Nemecko) a inkubované za fakultatívnych anaeróbnych podmienok pri 37 stupňoch počas 48 hodín. B. animalis subsp. Lactis CP-9 bol kultivovaný na MRS agare doplnenom 0,05% cysteínom a anaeróbne inkubovaný pri 37 stupňoch počas 48 hodín. Na kvantifikáciu bakteriálnych CFU po kultivácii probiotických kmeňov sa uskutočnilo počítanie kolónií [18].

cistanche rastlina zvyšujúca imunitný systém

Teplom usmrtené probiotické perorálne tablety

Teplom usmrtené probiotické perorálne tablety (1 g) pozostávali z inaktivovaného L. salivarius subsp. salicinius AP-32 a L. paracasei ET-66. Životaschopné kmene sa kultivovali a inkubovali, ako už bolo opísané. Potom boli AP-32 a ET-66 inaktivované inkubáciou životaschopných kmeňov v médiu MRS pri 100 stupňoch počas 1 hodiny. Obsah probiotík v perorálnej tablete bol 1 x 1010 buniek/g. Aktívna dávka teplom usmrtených probiotických perorálnych tabliet bola po predtým publikovanom testovaní in vitro [11]. Všetky experimentálne postupy boli uskutočnené v laboratóriu Biofag Biotech Co., Ltd. (Tainan, Taiwan).

Meranie populácií Lactobacillus a Bifidobacterium vo vzorkách slín

Vzorky slín (2 ml) boli odobraté od každého účastníka v týždňoch 0, 2, 4 a 6. Vzorky slín (100 µL) boli sériovo nariedené a pridané do MRS taniere. Na meranie populácií Lactobacillus sa Lactobacillus kultivoval a inkuboval na MRS agarových platniach za fakultatívnych anaeróbnych podmienok pri 37 stupňoch počas 48 hodín. Na meranie populácií Bifdobacterium sa Bifdobacterium kultivovalo a anaeróbne inkubovalo na MRS agare doplnenom 0,05 % cysteínom pri 37 stupňoch počas 48 hodín. Počítanie kolónií sa uskutočnilo na kvantifikáciu bakteriálnych CFU po kultivácii probiotických kmeňov. Populácia Lactobacillus a Bifidobacterium bola normalizovaná na počet probiotickej populácie v týždni 0. Populácia Lactobacillus a Bifidobacterium zozbieraná v týždni 0 sa považovala za 100 %. Experimentálna metóda nasledovala skôr publikované práce [18].

Meranie koncentrácie IgA v ústnej sliznici

Vzorky slín (2 ml) boli odobraté od každého účastníka v 0, 2., 4. a 6. týždni a udržiavané pri 20 stupňoch . Na analýzu koncentrácie IgA sa použila súprava IgA Human Uncoated ELISA Kit (katalógové č. 88-50600-88; Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA). Najprv sme potiahli anti-humánne IgA protilátky na 96-jamkovú doštičku. Slinný IgA prítomný vo vzorke alebo štandarde sa pridal do mikrojamky a potom sa pridala HRP-konjugovaná anti-ľudská IgA protilátka pri teplote miestnosti počas 1 hodiny. Pipetovanie TMB substrátu do každej jamky počas 30 min. Nakoniec sa merala koncentrácia IgA na spektrofotometri pri 450 nm. Všetky experimentálne postupy sa uskutočňovali trojmo, podľa pokynov výrobcu. Rýchlosť koncentrácie IgA zozbieraného v 0. týždni sa považovala za 100 %. Experimentálna metóda nasledovala skôr publikované práce [18].

cistanche tubulosa - zlepšenie imunitného systému

Meranie koncentrácie TGF-Beta a IL-10 v PBMC

Testovanie probiotikami indukovaného zvýšenia hladín TGF-beta a IL-10 po predchádzajúcej štúdii [20]. Mononukleárne bunky periférnej krvi (PBMC) boli získané zo vzoriek krvi zdravých darcov (Tainan Blood Center, Taiwan Blood Services Foundation). Odstredením plnej krvi cez gradient Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Švédsko) sa eluovala frakcia s hustotou svetla z rozhrania 42,5 %-50} %. Naočkovanie 4 x 105 bunkami extrahovaných PBMC buniek v 100 ul RPMI-1640 s 1% FBS (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) do každej jamky 96-jamkových doštičiek. Potom pridanie 5 x 105 cfu/20 ul probiotického ošetrenia do každej jamky naočkovanej PBMC (bunky: probiotické kmene=1:10). Pozitívne kontroly pridávali 10 ug/ml fytohemaglutinínu (PHA) (Sigma-Aldrich, Mníchov, Nemecko) do jamiek naočkovaných PBMC na produkciu TGF-, IL-10 v tomto poradí [21]. Spoločná kultivácia probiotík s PBMC počas 48 hodín. Meranie supernatantu obsahujúceho cytokíny IL-10 a TGF- pomocou analýzy ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) (Thermo Scientific, Carlsbad, CA, USA). Všetky experimenty sa merali a postupovali podľa komerčného protokolu aspoň v troch vyhotoveniach.

Hodnotenie antibakteriálnej funkcie v ústnej dutine

Streptococcus mutans je bežnou hrozbou pre zdravie ústnej dutiny, ktorá spôsobuje zubný kaz tvorbou moru alebo biofilmu [22]. Vzorky Streptococcus mutans boli odobraté z výterov, ktorými sme odobrali S. mutans na supragingiválnej časti, ďasnách a ústnej sliznici v týždňoch 0, 2, 4 a 6. S. mutans sa udržiaval v tryptickom sójový bujón (TSB, 5 ml) doplnený 50% glycerolom. Médium S. mutans bolo sériovo nariedené a pridané na platňu Mitis Salivarius-Bacitracin Agar (MSBA, 0,2 U/ml), ktorá bola inkubovaná pri 37 stupňoch počas 2 dní. Nakoniec sa spočítal počet kolónií S. mutans v každej účastníckej vzorke, aby sa vypočítala miera prežitia patogénov; miera prežitia S. mutans zozbieraná v 0. týždni sa považovala za 100 %. Experimentálna metóda nasledovala skôr publikované práce [18].

In vitro antibakteriálna aktivita perorálnych tabliet

Oral tablets (1 g) that contained viable (AP-32, CP-9, and ET-66; > 109 CFUs) and heat-killed (AP-32 and ET-66,>1010 CFU) probiotických kmeňov sa rozpustilo v TSB a mozgovom srdcovom infúznom médiu, aby sa získala konečná koncentrácia 0,1 g/ml. Pre slepú skupinu bolo použité iba médium, zatiaľ čo tablety (1 g) bez akýchkoľvek probiotických zložiek boli rozpustené v príslušnom médiu pre placebo skupinu. Potom boli orálne patogény (106 CFU) zavedené do tabletových roztokov a inkubované pri 37 stupňoch pre 2 (S. mutans) alebo 3 (Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum a Aggregatibacter aktinomy cetemcomitans) d. Patogény boli získané z BCRC. Miera inhibície orálneho patogénu (%) sa vypočítala nasledovne: (CFU slepá kontrola – CFU experimentálna skupina)/ CFU slepá kontrola. Experimentálna metóda nasledovala skôr publikované testovanie [11].

Štatistická analýza

Na štatistickú analýzu výsledkov obojstranného t-testu sa použil softvér GraphPad Prism. Údaje boli prezentované ako priemerná štandardná odchýlka (SD) alebo priemer výsledkov dvoch alebo troch nezávislých experimentov. Štatistické rozdiely sa považovali za významné pri hodnote P<0.05.

Výsledky

Probiotické tablety zvýšili populáciu bifidobaktérií v ústnej dutine

Populácia Bifidobacterium bola stabilne zvýšená v ústnej dutine po podaní probiotickej tablety. Populácie baktérií po ošetreniach boli normalizované populáciami baktérií pred ošetrením (početnosť populácie %=CFU po ošetrení/CFU pred ošetrením). V životaschopnej probiotickej skupine sa miera populácie významne zvýšila na 244,14 ± 164,96 % v 2. týždni (**P<0.01, Fig. 1a) and 438.41±308.58 at Week 4 (***P<0.001), compared to Week 0. The Bifidobacterium population rate remained high at Week 6 (no administration of viable probiotic tablets for 2 weeks after Week 4, 550.16±448.19%, ***P<0.001), compared to Week 0. The Bifidobacterium population number was significantly different between the viable probiotic and placebo groups at Week 6 (**P<0.01). In the heat-killed probiotic group, the Bifidobacterium population was increased at Weeks 2 (149.92±60.47%, **P<0.01) and 4 (199.87±148.64%, *P<0.05), but was decreased at Week 6 after administration of the heat-killed probiotic tablets was stopped for 2 weeks (182.98±163.73%, Fig. 1a).

Probiotické tablety zvýšili populáciu Lactobacillus v ústnej dutine

Zmena v orálnej populácii Lactobacillus v dôsledku podávania probiotických tabliet odhalila vzor podobný tomu, po ktorom nasledovala zmena v orálnej populácii Bifidobacterium. Populácie baktérií po ošetreniach boli normalizované populáciami baktérií pred ošetrením. V životaschopnej probiotickej skupine sa miera populácie Lactobacillus významne zvýšila na 447,74 ± 337,89 % v 2. týždni (**P<0.01, Fig. 1b) and 982.27±726.66% at Week 4 (***P<0.001), compared to Week 0. The Lactobacillus population rate was higher at Week 6 (no administration of viable probiotic tablets for 2 weeks after Week 4, 727.57±539.76%, ***P<0.001) than at Week 0. The Lactobacillus population number was significantly different between the viable probiotic and placebo groups at Week 6 (***P<0.001). In the heat-killed probiotic group, the Lactobacillus population was increased at Weeks 2 (256.66±183.78%, **P<0.01) and 4 (312.85 ± 279.71%, *P < 0.05). Additionally, the Lactobacillus number remained but showed no significant difference at Week 6 after the administration of heat-killed probiotics was stopped for 2 weeks (208.00±199.50%, Fig. 1b).

Obr. 1 a Meranie populácií Bifidobacterium na povrchoch ústnej sliznice. V životaschopné probiotické tablety; H teplom usmrtené inaktivované probiotické tablety; C placebo tablety (kontrola); a LAB baktérie mliečneho kvasenia. Odber a analýza vzoriek slín sa uskutočnili v 0, 2., 4. a 6. týždni. Údaje boli prezentované ako priemerná štandardná odchýlka (SD). Na analýzu štatistických rozdielov sa použil dvojstranný t-test. Štatistické významnosti boli označené *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. b Measurement of Lactobacillus populations on the oral mucosal surfaces. V viable probiotic tablets; H heat-killed inactivated probiotic tablets; C placebo tablets (control); and LAB lactic acid bacteria. Collection and analysis of salivary samples at Weeks 0, 2, 4, and 6 were performed. Data were presented as the mean standard deviation (SD). A two-tailed t-test was used to analyze statistical differences. Statistical significances were marked with *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

Probiotické tablety obsahujúce AP-32, ET-66 a CP-9 významne zvýšili koncentráciu IgA v ústnej sliznici

Keďže bolo dokázané, že konzumácia probiotických tabliet (životaschopných alebo tepelne usmrtených) zvyšuje hladiny Bifidobacterium a Lactobacillus v ústnej dutine, ďalej sme analyzovali zmeny koncentrácie IgA v slinách, ku ktorým došlo v dôsledku príjmu probiotických produktov. Hladiny IgA po liečbe boli normalizované hladinami IgA pred liečbou. V skupine životaschopných probiotík sa koncentrácia IgA v slinách mierne zvýšila na 103,24 ± 8,10 % v 2. týždni (obr. 2) a na 104,81 ± 13,26 v 4. týždni, ale bez štatisticky významných rozdielov. Avšak koncentrácia IgA v slinách v životaschopnej probiotickej skupine v porovnaní so skupinou s placebom bola významne zvýšená na 119,30 ± 12,63 % v 6. týždni (bez podávania životaschopných probiotických tabliet počas 2 týždňov po 4. týždni) v porovnaní s týždňom 0 ( ***P<0.001). Furthermore, in the heat-killed probiotic group, the salivary IgA concentration was slightly increased at Weeks 2 (102.51± 7.20%) and 4 (104.35 ± 10.27%). The saliva IgA concentration was increased at Week 6 (116.78 ± 12.28%, ***P < 0.001, Fig. 2), compared to Week 0.

Životaschopné kmene zvýšili hladiny IL-10 a TGF-Beta v PBMC

Pozitívna kontrola 10 µg/ml fytohemaglutinínu (PHA) úspešne zvýšila hladiny IL-10 (58,2 ± 7,9 pg/ml, ***P < 0,001, obr. 3a) a TGF- (53,4±8 pg/ml, ***P<0.001, Fig. 3b) in PBMCs by comparing to the negative control (PBMCs treated with medium only). Viable strains of CP-9, AP-32 and ET-66 signifcantly increased the levels of IL-10 in PBMCs to 84.2±9 pg/ml (***P<0.001, ##P<0.01), 303.1±170.9 pg/ml (*P<0.05, ##P<0.01) and 98.2±17.5 pg/ml (***P<0.01, ##P<0.01), respectively. Symbol *indicated a significant difference by comparing to the medium-treated control; symbol #indicated a significant difference by comparing to the PHA control (Fig. 3a). Besides, viable strains of CP-9, AP-32, and ET-66 significantly increased the levels of TGF-beta in PBMCs to 23.2 ± 4.7 pg/ml (***P < 0.001), 130.9 ± 16 pg/ ml (***P < 0.001, ###P < 0.001) and 31.4 ± 5.5 pg/ml (***P<0.01), respectively (Fig. 3b).

Obr. 2 Koncentrácia imunoglobulínu A (IgA) vo vzorkách slín. V životaschopné probiotické tablety; H teplom usmrtené inaktivované probiotické tablety; C placebo tablety (kontrola); a LAB baktérie mliečneho kvasenia. Odber a analýza vzoriek slín sa uskutočnili v 0, 2., 4. a 6. týždni. Údaje boli prezentované ako priemerná štandardná odchýlka (SD). Na analýzu štatistických rozdielov sa použil dvojstranný t-test. Štatistické

Probiotické tablety obsahujúce AP-32, ET-66 a CP-9 zakázali populáciu S. mutans v slinách

Zvýšená populácia Bifidobacterium a Lactobacillus a zvýšená koncentrácia IgA v slinách môžu prispieť k boju proti orálnym patogénnym mikroorganizmom. V nasledujúcom experimente sme testovali zmenu v populácii orálneho patogénu S. mutans v dôsledku probiotickej intervencie. Populácie baktérií po ošetreniach boli normalizované populáciami baktérií pred ošetrením. V životaschopnej probiotickej skupine bola populácia S. mutans významne znížená v 2. týždni (53,55 ± 31,60 %, ***P<0.001), 4 (49.60±31.01%, ***P<0.001), and 6 (55.19±42.72%, **P<0.01, Fig. 4). At week 6, S. mutans was significantly inhibited in the viable probiotic group (55.19±42.72%, ***P<0.001), compared to in the placebo group. Furthermore, in the heat-killed probiotic group, the S. mutans population was slightly decreased at Week 2 (85.81±49.87%) and significantly reduced at Week 4 (58.35 ± 33.17%, ***P<0.001). The S. mutans population level in the heat-killed probiotic group (202.81±167.99%) reverted to that in the placebo group (225.05±127.01%) at Week 6 (no administration of heat-killed probiotic tablets for 2 weeks from Week 4) (Fig. 4).

Obr. 3 Životaschopné kmene zvýšili hladiny IL-10 a TGF-beta v PBMC. Hladina IL-10 a b TGF-beta v PBMC sa testovala ošetrením probiotických kmeňov. Pridanie 5 * 105 cfu/20 µl životaschopných kmeňov CP-9, AP-32 a ET-66 do PMBC 10 µg/ml. Ako pozitívna kontrola sa použil fytohemaglutinín (PHA). Negatívnou kontrolou boli PBMC ošetrené iba médiom RMPI{12}}. Boli vykonané trojité testy. Údaje boli prezentované ako priemerná štandardná odchýlka (SD). Na analýzu štatistických rozdielov sa použil dvojstranný t-test. Štatistické významnosti boli označené P<0.05, P<0.01, P<0.001. The symbol *indicated a significant difference by comparing to the medium-treated control; symbol #indicated significant difference by comparing to the PHA control

Obr. 4 Meranie patogénnych populácií Streptococcus mutans na povrchoch ústnej sliznice. V životaschopné probiotické tablety; H teplom usmrtené inaktivované probiotické tablety; C placebo tablety (kontrola); a LAB baktérie mliečneho kvasenia. Odber a analýza vzoriek slín sa uskutočnili v 0, 2., 4. a 6. týždni. Údaje boli prezentované ako priemerná štandardná odchýlka (SD). Na analýzu štatistických rozdielov sa použil dvojstranný t-test. Štatistické významnosti boli označené *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

Potvrdenie schopnosti probiotických tabliet inhibovať rast orálneho patogénu testom in vitro

Štúdia in vitro odhalila, že životaschopné probiotické tablety významne inhibovali mieru prežitia orálnych patogénov (obr. 5a). Populácie baktérií po ošetreniach boli normalizované populáciami baktérií pred ošetrením. Miera prežitia S. mutans, P. gingivalis, F. nucleatum a A. aktinomy cetemcomitans v skupine životaschopných probiotík v porovnaní so skupinou s placebom sa znížila na 4,23 % (***P < 0 .001, placebo=91 %), 8,64 % (***P < 0,001, placebo=89 %), 5,77 % (**P<0.01, placebo=98%), and 6.23% (**P<0.01, placebo=87%), respectively. However, the heat-killed probiotic tablet exerted weaker antibacterial effects than the viable probiotic tablet (Fig. 5b). The survival rate of S. mutans, P. gingivalis, F. nucleatum, and A. antinomy cetemcomitans in the heat-killed probiotic group, compared to in the placebo group, was slightly decreased without statistical significance (82%, placebo=91%), significantly reduced to 53% (*P<0.05, placebo=89%), not inhibited (96.88%, placebo=98%), and significantly reduced to 80% (**P<0.01, placebo=87%), respectively.

Diskusia

V porovnaní so skupinou s placebom by sa orálne populácie Lactobacillus a Bifidobacterium výrazne zvýšili podávaním životaschopných probiotických tabliet alebo tepelne usmrtených probiotických tabliet počas 4 týždňov. Okrem toho počet Lactobacillus a Bifidobacterium zostal na významne vysokých úrovniach počas 2 týždňov po prerušení konzumácie životaschopných probiotík (obr. 1a a b). Podobne Camila Casuccio Almeida a kol. preukázali, že štvortýždňové podávanie probiotickej liečby môže pretrvávať pri zmierňovaní symptómov u pacientov s intoleranciou laktózy najmenej 3 mesiace po ukončení konzumácie probiotík [23]. Pretrvávajúci účinok probiotík pri dlhodobej liečbe by sa však mal v budúcnosti zhodnotiť. Okrem toho sa koncentrácia IgA v slinách významne zvýšila pri podávaní životaschopných a teplom usmrtených probiotických tabliet. Teplom usmrtené aj životaschopné probiotické skupiny zvýšili IgA v slinách podávaním perorálnych tabliet počas 4 týždňov, ale bez štatistického rozdielu oproti placebu. Koncentrácia IgA v tepelne usmrtených a životaschopných probiotických skupinách vykazovala signifikantný nárast v 6. týždni. Mechanizmus zvýšenia IgA po prerušení podávania probiotík na 2 týždne by sa však mal ďalej skúmať (obr. 2) Braathen et al. uviedli podobné výsledky o imunomodulačnej úlohe probiotických kmeňov v ústnej dutine [24]. Okrem toho sa uvádza, že probiotické kmene významne zvyšujú koncentráciu IgA v stolici u prasníc a prasiatok [25]. Štúdie o symptómoch zmierňujúcich IgA pri infekciách horných dýchacích ciest však zostávajú nedostatočné. Podrobný molekulárny mechanizmus inhibície a prevencie infekcií horných dýchacích ciest probiotickými kmeňmi CP-9, AP-32 a ET-66 by sa mohol preskúmať v budúcich štúdiách. V tejto štúdii by životaschopné kmene CP-9, AP-32 a ET-66 zvýšili hladinu IL-10 a TFG-beta v bunkách PBMC. AP-32 preukázal účinnú schopnosť zvyšovať IL-10 a TFG-beta v PBMC ich porovnaním s pozitívnou kontrolou PHA (obr. 3a a b). Predpokladalo sa, že životaschopné kmene CP-9, AP-32 a ET-66 môžu indukovať sekréciu B-buniek IL-10 a TFG-beta na zvýšenie hladín IgA v slinách. Korelácia medzi slinným IL-10, TFG-beta a slinným IgA by sa však mala ďalej testovať [26]. Okrem toho, či probiotiká usmrtené teplom zvýšili IgA prostredníctvom indukcie IL-10 a TFG-beta, je stále nejasné. Test in vitro ukázal, že teplom usmrtená AP-32 podporovala sekréciu interferónu a IL-12p70 a znižovala hladiny IL-13 [27]. V tejto klinickej štúdii teda schopnosť probiotických kmeňov CP-9, AP-32 a ET-66 a teplom usmrtených AP-32 a ET-66 kmeňov na inhibíciu patogénnych baktérií v ústnej dutine bola ďalej overená (obr. 4). Životaschopné probiotické pastilky vykazovali lepšiu antipatogénnu schopnosť ako pastilky usmrtené teplom prostredníctvom vylučovania organických kyselín, antimikrobiálnych peptidov [28], exopolysacharidov (EPS) [29] bakteriocínov [30] (obr. 5a a b). Funkčné antimikrobiálne zložky produkované životaschopnými probiotickými kmeňmi by sa v budúcnosti mali detegovať pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC) a kvapalinovej chromatografie (LC) – hmotnostnej spektrometrie [31]. Uvádza sa, že teplom usmrtené probiotiká mali kľúčové výhody životaschopných probiotík, ale bez určitých bezpečnostných obáv životaschopných probiotických kmeňov [32]. Antimikrobiálne zložky probiotík usmrtených teplom by sa však mali ďalej overovať.

Obr. 5 Potvrdenie schopnosti probiotických tabliet inhibovať orálny rast patogénov testom in vitro. Bola overená schopnosť životaschopných a teplom usmrtených probiotických tabliet inhibovať mieru prežitia orálnych patogénov, vrátane Streptococcus mutans, Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum a Aggregatibacter aktinomycetemcomitans. Prázdna skupina, len médium; placebo skupina, tablety (1 g) bez akýchkoľvek probiotických zložiek. Boli vykonané trojité testy. Údaje boli prezentované ako priemerná štandardná odchýlka (SD). Na analýzu štatistických rozdielov sa použil dvojstranný t-test. Štatistické významnosti boli označené *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

Záver

Zmiešané životaschopné probiotické tablety, pozostávajúce z L. salivarius subsp. salicinius AP-32, B. animalis subsp. mliečny CP-9 a L. paracasei ET-66 a teplom usmrtené probiotiká, vrátane L. salivarius subsp. salicinius AP-32 a L. paracasei ET-66 prejavili svoje prospešné funkcie zvýšením orálnych populácií Lactobacillus a Bifdobacterium, redukciou S. mutans v ústnej dutine a zvýšením koncentrácie IgA v slinách u zdravých účastníkov. Výsledky testov in vitro potvrdili, že životaschopné probiotiká účinne inhibovali orálne patogény, vrátane S. mutans, P. gingivalis a F. nucleatum subsp. polymorfizmus a A. aktinomycetemcomitans. Orálna a nosová slizničná imunita je prvou obranou proti invázii mikroorganizmov, a to sa stalo kľúčovým problémom. Táto štúdia teda ponúkne alternatívnu stratégiu (probiotická suplementácia) na udržanie ústnej imunity a zdravia ústnej dutiny.

Výhody doplnku cistanche-ako posilniť imunitný systém

Referencie

1. Takaki H, Ichimiya S, Matsumoto M, Seya T (2018) Slizničná imunitná odpoveď v nazálnom lymfoidnom tkanive po intranazálnom podaní adjuvanciami. J Innate Immun 10(5–6):515–521

2. Wu RQ, Zhang DF, Tu E, Chen QM, Chen WJ (2014) Slizničný imunitný systém v ústnej dutine – orchester diverzity T buniek. Int J Oral Sci 6 (3): 125–132

3. Man WH, de Steenhuijsen Piters WAA, Bogaert D (2017) Mikrobiota dýchacieho traktu: strážca zdravia dýchacích ciest. Nat Rev Microbiol 15(5):259-270

4. Wald ER, Guerra N, Byers C (1991) Infekcie horných dýchacích ciest u malých detí: trvanie a frekvencia komplikácií. Pediatria 87 (2): 129–133

5. Marcotte H, Lavoie MC (1998) Orálna mikrobiálna ekológia a úloha slinného imunoglobulínu A. Microbiol Mol Biol Rev 62(1):71–109

6. Weltzin R, Traina-Dorge V, Soike K, Zhang JY, Mack P, Soman G et al (1996) Intranazálna monoklonálna IgA protilátka proti respiračnému syncyciálnemu vírusu chráni opice rhesus pred infekciou horných a dolných dýchacích ciest. J Infect Dis 174(2):256-261

7. Ruggeri FM, Johansen K, Basile G, Kraehenbuhl JP, Svensson L (1998) Antirotavírusový imunoglobulín A neutralizuje vírus in vitro po transcytóze cez epitelové bunky a chráni novorodenecké myši pred hnačkou. J virol 72(4):2708-2714

8. Proso N, Solis NV, Swidergall M (2020) Mucosal IgA zabraňuje komenzálnej dysbióze Candida albicans v ústnej dutine. Front Immunol 11:2448

9. Katz J, Harmon CC, Buckner GP, Richardson GJ, Russell MW, Michalek SM (1993) Ochranné reakcie slinného imunoglobulínu A proti infekcii Streptococcus mutans po intranazálnej imunizácii antigénom S. mutans I/II spojeným s B podjednotkou toxínu cholery . Infect Immun 61 (5): 1964–1971

10. Moutsopoulos NM, Konkel JE (2018) Tkanivovo špecifická imunita na ústnej slizničnej bariére. Trends Immunol 39 (4): 276–287

11. Lin CW, Chen YT, Ho HH, Hsieh PS, Kuo YW, Lin JH, Liu CR, Huang YF, Chen CW, Hsu CH, Lin WY, Yang SF (2021) Pastilky s probiotickými kmeňmi zlepšujú ústnu imunitnú odpoveď a zdravie . Oral Dis. https://doi.org/10.1111/odi.13854

12. Ericson D, Hamberg K, Bratthall G, Sinkiewicz-Enggren G, Ljunggren L (2013) Slinná IgA odpoveď na probiotické baktérie a streptokoky mutans po použití žuvačky obsahujúcej Lactobacillus reuteri. Pathog Dis 68 (3): 82–87

13. Defrance T, Vanbervliet B, Briere F, Durand I, Rousset F, Banchereau J (1992) Interleukín 10 a transformujúci rastový faktor beta spolupracujú pri indukcii anti-CD40-aktivovaných naivných ľudských B buniek, aby vylučovali imunoglobulín A. J Exp Med 175(3):671-682

14. Papone V, Verolo C, Zafaroni L, Batlle A, Capo C, Bueno L et al (2015) Detekcia a prevalencia parodontálnych patogénov v uruguajskej populácii s chronickou parodontitídou pomocou konvenčnej metodológie a metagenomiky. Odontoestomatológia 17(25):23–32

15. Butera A, Gallo S, Maiorani C, Molino D, Chiesa A, Preda C, Scribante A (2021) Probiotická alternatíva k chlórhexidínu v parodontálnej terapii: hodnotenie klinických a mikrobiologických parametrov. Microorganisms 9(1):69

16. Wang Y, Li X, Ge T, Xiao Y, Liao Y, Cui Y et al (2016) Probiotiká na prevenciu a liečbu infekcií dýchacích ciest u detí: systematický prehľad a metaanalýza randomizovaných kontrolovaných štúdií. Medicína 95(31):e4509. https://doi.org/10.1097/ MD.0000000000004509

17. Laufer AS, Metlay JP, Gent JF, Fennie KP, Kong Y, Pettigrew MM (2011) Mikrobiálne spoločenstvá horných dýchacích ciest a zápal stredného ucha u detí. mBio 2(1):e00245-10. https://doi.org/10. 1128/mBio.{7}}

18. Chen YT, Hsieh PS, Ho HH, Hsieh SH, Kuo YW, Yang SF, Lin CW (2020) Antibakteriálna aktivita životaschopných a teplom usmrtených probiotických kmeňov proti orálnym patogénom. Lett Appl Microbiol 70(4):310-317

19. Bonifait L, Chandad F, Grenier D (2009) Probiotiká pre zdravie ústnej dutiny: mýtus alebo realita? J Can Dent Assoc 75 (8): 585–90

20. Hsieh PS, An Y, Tsai YC, Chen YC, Chuang CJ, Zeng CT, King AE (2013) Potenciál probiotických kmeňov modulovať zápalové reakcie epiteliálnych a imunitných buniek in vitro. New Microbiol 36(2):167–179

21. Elrefaei M, Burke CM, Baker CA, Jones NG, Bousheri S, Bangsberg DR, Cao H (2009) Produkcia TGF- a IL-10 HIV špecifickými CD8+ T bunkami je regulovaná CTLA{ {5}} signalizácia na CD4+ T bunkách. PloS ONE 4(12):e8194

22. Ranganathan V, Akhila CH (2019) Streptococcus mutans: Stal sa hlavným páchateľom orálnych prejavov? J Microbiol Exp 7(4):207-213

23. Almeida CC, Lorena SLS, Pavan ČR, Akasaka HMI, Mesquita MA (2012) Priaznivé účinky dlhodobej konzumácie probiotickej kombinácie Lactobacillus casei Shirota a Bifidobacterium breve Yakult môžu pretrvávať aj po prerušení liečby u pacientov s intoleranciou laktózy. Nutr Clin Pract 27(2):247–251

24. Braathen G, Ingildsen V, Twetman S, Ericson D, Jørgensen MR (2017) Prítomnosť Lactobacillus reuteri v slinách sa zhoduje s vyšším IgA v slinách u mladých dospelých po užití probiotických pastiliek. Benef Microbes 8 (1): 17–22

25. Scharek L, Guth J, Filter M, Schmidt MFG (2007) Vplyv probiotických baktérií Enterococcus faecium NCIMB 10415 (SF68) a Bacillus cereus var. vám NCIMB 40112 o vývoji sérového IgG a fekálneho IgA prasníc a ich prasiatok. Arch Anim Nutr 61 (4): 223–234

26. Ebrahimpour-Koujan S, Milajerdi A, Larijani B, Esmaillzadeh A (2020) Účinky probiotík na slinné cytokíny a imunoglobulíny: systematický prehľad a metaanalýza klinických štúdií. Sci Rep 10(1):1-11

27. Ou CC, Lin SL, Tsai JJ, Lin MY (2011) Baktérie mliečneho kvasenia usmrtené teplom zvyšujú imunomodulačný potenciál vychýlením imunitnej odpovede smerom k polarizácii Th1. J Food Sci 76(5):M260–M267. https://doi.org/10.1111/j.{14}}.2011. 02161.x

28. Nair MS, Amalaradjou MA, Venkitanarayanan K (2017) Antivirulentné vlastnosti probiotík v boji proti mikrobiálnej patogenéze. Adv Appl Microbiol 98:1–29

29. Wu MH, Pan TM, Wu YJ, Chang SJ, Chang MS, Hu CY (2010) Aktivity exopolysacharidov z probiotických bifidobaktérií: Imunomodulačné účinky (na makrofágy J774A. 1) a antimikrobiálne vlastnosti. Int J Food Microbiol 144(1):104-110

30. Barefoot SF, Klaenhammer TR (1983) Detekcia a aktivita laktacínu B, bakteriocínu produkovaného Lactobacillus acidophilus. Appl Environ Microbiol 45(6):1808–1815

31. Kim PI, Sohng JK, Sung C, Joo HS, Kim EM, Yamaguchi T, Kim BG (2010) Charakterizácia a identifikácia štruktúry antimikrobiálneho peptidu, hominínu, produkovaného Staphylococcus hominis MBBL 2–9. Biochem Biophys Res Commun 399(2):133-138

32. Piqué N, Berlanga M, Miñana-Galbis D (2019) Zdravotné prínosy tepelne zabitých (Tyndalizovaných) probiotík: prehľad. Int J Mol Sci 20(10):2534