Beta-glukán zlepšil imunitnú odpoveď na vakcínu proti pseudomoru hydiny a zmenil expresiu MRNA sleziny u kurčiat

ABSTRAKT

Táto štúdia sa uskutočnila s cieľom preskúmať účinok perorálneho podávania b-glukánu (G70), produktu získaného z bunkovej steny kvasiniek, na titre špecifickej inhibície hemaglutinácie (HI) vírusu pseudomoru hydiny (NDV), proliferáciu lymfocytov a úlohu subpopulácií T lymfocytov u kurčiat liečených živou vakcínou proti NDV. Okrem toho sa skúmal vplyv b-glukánu na expresiu génu v slezine pomocou sekvenovania transkriptómu. Výsledky odhalili, že suplementácia b-glukánu zvýšila titer NDV HI v sére, zvýšila NDV stimulačný index lymfocytov v periférnej krvi a črevnom trakte a podporila diferenciáciu T lymfocytov na CD4+ T bunky. Analýza sekvenovania RNA (RNA-seq) ukázala, že G70 upreguloval expresie mRNA súvisiace s receptorom spojeným s G-proteínom a polypeptidom MHC triedy I a znížil expresiu mRNA súvisiacu s katelicidínom a betadefenzínom. Imunomodulačný účinok G70 môže fungovať prostredníctvom mitogénom aktivovanej proteínkinázovej signálnej dráhy. Stručne povedané, G70 by mohol zvýšiť imunologickú účinnosť živej vakcíny NDV u kurčiat a mohol by sa použiť ako potenciálny kandidát na adjuvans v hydinárskom priemysle.

cistanche tubulosa - zlepšenie imunitného systému

Kľúčové slová: vakcína proti pseudomoru hydiny, beta-glukán, adjuvans, kura z čiernej kosti, RNA-seq

ÚVOD

Polysacharidy bunkovej steny kvasiniek sú priamo riginované z bunkovej steny Saccharomyces cerevisiae a sú široko používané ako rastové stimulátory, antimikrobiálne látky alebo imunomodulátory u hydiny na zlepšenie produkcie a zdravia (Schiavone a kol., 2017; Hasted a kol., 2021). Predtým sa preukázalo, že produkt s názvom PW220, ktorý obsahuje polysacharidy bunkovej steny kvasiniek, posilňuje imunitnú odpoveď vyvolanú vírusom pseudomoru hydiny (NDV) a mení mikrobiálnu komunitu slepého čreva kurčiat pri perorálnom podaní (Bi et al., 2020 ). Polysacharidy bunkovej steny kvasiniek sú primárne tvorené b-glukánom a manán-oligosacharidmi (Wang et al., 2018). V tejto štúdii sa skúmal účinok b-glukánu na imunitnú odpoveď na vakcínu proti NDV u kurčiat. Slezina je kľúčovým orgánom na spustenie imunitnej odpovede. Nedávna štúdia ukázala, že PW220, čo je produkt bunkovej steny kvasiniek, upreguloval expresiu mRNA TGF-b, IL-6, TLR5, GATA-3 a T-bet v slezine kurčiat ( Bi a kol., 2022). Je však potrebné objasniť konkrétny mechanizmus. Sekvenovanie RNA (RNA-seq) je jednou z vysoko výkonných technológií, ktoré možno použiť na testovanie kvantitatívnej génovej expresie a poskytnúť analýzu rôznych profilov expresie na úrovni celého transkriptómu (Zhao et al., 2018). S výhodami vysokej citlivosti a nízkych nákladov sa RNA-seq široko používa v štúdiách hospodárskych zvierat a hydiny (Teixeira a kol., 2019; Yuan a kol., 2020). V tejto štúdii sa teda hodnotil účinok podávania b-glukánu na NDV-špecifické titre hemaglutinačnej inhibície (HI), proliferáciu lymfocytov a subpopulácie T-lymfocytov u kurčiat perorálne očkovaných NDV vakcínou. Okrem toho sa na vyhodnotenie účinku b-glukánu na génovú expresiu a základné signálne transdukčné dráhy v slezine kurčiat použila transkriptómová analýza.

cistanche tubulosa - zlepšenie imunitného systému

Kliknite sem pre zobrazenie produktov Cistanche Enhance Immunity

【Požiadať o viac】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Zvieratá

Jednodňové komerčné kurčatá s čiernymi kosťami (samci) boli získané od Guizhou Yushun Poultry Co., Ltd. (Anshun, Čína). Kurčatá boli rozdelené do drôtených klietok umožňujúcich voľný prístup ku krmivu a vode. Počas prvých 7 dní sa teplota v miestnosti udržiavala na 33 °C až 35 °C, potom sa postupne znižovala o 1 °C každé 2 dni až do 27 °C. Všetky kurčatá boli spracované podľa štandardov stanovených Southwest University Animal Care a Výbor pre používanie (číslo etického certifikátu: IAC-2021-0057). Všetky pokusné vtáky boli na konci štúdie usmrtené CO2.

cistanche výhody pre mužov - posilnenie imunitného systému

Vakcína

Živú vakcínu NDV (kmeň La Sota) poskytla spoločnosť Qingdao YEBIO Bioengineering Co., Ltd. (Qingdao, Čína).

Činidlá 

Produkt bunkovej steny kvasiniek (YP) G70 sa získal zo steny kvasinkových buniek (Saccharomyces cerevisiae), ktorá obsahuje b-glukán (Väčší alebo rovný 70 %) (AngelG70, QB/T4572, Angel Yeast, Yichang, Čína). Antigén aj pozitívne kontrolné séra na meranie NDV-špecifických HI titrov boli zakúpené od Qingdao Regen Diagnostics Development Center (Qingdao, Čína). Anti-chicken CD3-APC (C2818-T9580), CD4-FITC (D0117-WA78E) a CD8- PE (L{{14 }}TH49T) u potkanov ponúkla Nanjing Zeweil Biological Technology Co., Ltd. (Nanjing, Čína).

Experimentálny dizajn

Štyridsaťosem kurčiat s čiernymi kosťami vo veku 5 dní bolo náhodne rozdelených do 3 skupín (tabuľka 1) a dostali buď základnú diétu (tabuľka 2), alebo základnú diétu s 0,1 % G7{{10} } (b-glukán, 0,7 g/kg) suplementácia počas trvania súčasného výskumu. Skupina H (G70 + vakcína) a C (vakcína) boli perorálne imunizované NDV vakcínou 14. a 28. deň. Skupina S (Sailne) bola ošetrená rovnakým objemom fyziologického roztoku. Vzorky krvi sa odoberali pomocou venepunkcie z krídel vo veku 5, 7, 14, 21, 28, 35 a 42 dní na testovanie titra HI. Sedem dní po posilňovacej vakcinácii sa náhodne vybralo 8 kurčiat v každom stĺpci a usmrtili sa zadusením pomocou CO2. Lymfocyty boli oddelené z periférnej krvi a jejuna, aby sa vykonala proliferácia lymfocytov a analýza prietokovou cytometriou. V prípade odberu z jejuna bol suspenzorný väz dvanástnika východiskovým bodom jejuna a zo začiatočného bodu jejuna sa odobral 5 cm dlhý úsek. Slezina sa rýchlo zmrazila v tekutom dusíku a potom sa skladovala pri -80 stupni na RT-qPCR a profilovanie sekvencie.

Tabuľka 1. Experimentálny dizajn

Tabuľka 2. 1 Zloženie a obsah živín v experimentálnej bazálnej výžive brojlerov.

HI Štúdia

Test na NDV-špecifické HI titre v sére sa uskutočnil podľa predchádzajúceho opisu (Ball et al., 2019). Stručne povedané, sérum sa zriedilo fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom (PBS) v pomere 1:2 až 1:1 024 v mikrotitračnej platni s 96-jamkovým dnom v tvare V. Potom sa pridalo 25 ml riedenia NDV na jamku a inkubovalo sa pri 37 stupňoch počas 30 minút. Potom sa do každej jamky pridalo 25 ml 1% suspenzie kohútích erytrocytov a inkubovalo sa pri 37 stupňoch počas 30 minút. Všetky vzorky boli testované dvakrát a na každej platni boli zahrnuté pozitívne aj negatívne kontroly. HI titre boli založené na najväčšom zriedení, ktoré viedlo k úplnej inhibícii hemaglutinácie. Priemerný HI titer a štandardná chyba (SE) boli merané na skupinu.

Izolácia lymfocytov z periférnej krvi

Lymfocyty sa izolovali a odoberali z lymfocytov periférnej krvi pomocou súpravy Lymphocyte Separation Medium Kit (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd., Tianjin, Čína). Potom sa lymfocyty skladovali v suspenzii s médiom RPMI 1640 (Solarbio, Peking, Čína) vrátane 5 % fetálneho teľacieho séra a 25 mM HEPES (pH 7,0).

Izolácia lymfocytov z jejuna

Proces priraďovania bol vykonaný v súlade s predchádzajúcim popisom a s miernymi úpravami (Yuan et al., 2020). Stručne povedané, použite 70 mm bunkový filter na rozdelenie čreva do 4 ml studeného PBS. Potom sa suspenzia vzoriek buniek centrifugovala pri 4 500 ot./min. počas 12 minút s odstránením supernatantu. Potom resuspendujte črevné bunky na plnom médiu (Solarbio Co., Peking, Čína) pozostávajúcom z 5 % fetálneho bovinného séra (FBS) v RPMI 1640 (Sijiqing Co., Hangzhou, Čína). Nakoniec súprava na izoláciu kuracích lymfocytov (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd.) na oddelenie lymfocytov. črevné tkanivo sa rozdelilo do 4 ml studeného PBS s použitím 70 mm bunkového filtra. Potom sa suspenzia vzoriek buniek centrifugovala pri 4 500 otáčkach za minútu počas 12 minút a supernatant sa zlikvidoval. Potom boli črevné bunky resuspendované v RPMI 1640 (Solarbio Co.) obsahujúcom 5 % FBS (Sijiqing Co.). Nakoniec sa lymfocyty oddelili pomocou súpravy na izoláciu kuracích lymfocytov (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd.).

Proliferácia lymfocytov 

Bunky boli nasadené na 96-jamkové platne (5 105 GBP na jamku), stimulované antigénom inaktivovaného NDV na 4 hemaglutinačné jednotky alebo rovnaký objem fyziologického roztoku. Každá vzorka bola testovaná v 3 opakovaniach. Bunky a antigén boli inkubované počas 44 hodín pri 37 stupňoch v 5% C02 a potom bolo do každej jamky pridaných 50 ml metyltiazolyltetrazolia (MTT) (2 mg/ml) a inkubované ďalšie 4 hodiny. Vzorky sa centrifugovali pri 1 200 £ g počas 8 minút pri vnútornej teplote. Potom sa supernatant opatrne odstránil a do každej jamky sa pridalo 100 ml DMSO. Doštičky sa pretrepávali 8 minút, aby sa kryštály úplne rozpustili. Nakoniec sa zaznamenala priemerná optická hustota (OD) pri 570 nm. Stimulačný index (SI) sa získal pomocou rovnice: hodnoty OD stimulovaných jamiek/hodnoty OD nestimulovaných jamiek (Cui et al., 2020).

cistanche výhody pre mužov - posilnenie imunitného systému

Analýza prietokovou cytometriou subpopulácií T-lymfocytov

Suspenzie lymfoidných buniek sa izolovali a premyli dvakrát PBS. Koncentrácia buniek sa upravila na 106/ml a potom sa udržiavala na ľade. Každá vzorka bola zafarbená 2 ml potkanieho anti-kuracieho CD3-APC, CD4- FITC a potkanieho anti-kuracie CD8-PE za podmienok nepriepustných pre svetlo počas 30 minút, potom 2 premytiami PBS. Bunky boli testované pomocou analýzy prietokovou cytometriou na prietokovom cytometri (BD Bioscience, San Jose, CA).

Analýza RT-qPCR

Celková RNA bola odvodená zo sleziny pomocou činidla TRIzol (Takara, Shiga, Japonsko) podľa pokynov výrobcu a potom konvertovaná na cDNA pomocou PrimeScript RT Master Mix (Takara, Dalian, Čína) na tepelnom cykléri T100 (Bio-Rad, Hercules, CA). Kurací beta-aktín sa použil ako vnútorný kontrolný gén. RT-qPCR vybraných génov sa uskutočnila na systéme Multiple Real-Time PCR System (AB, Carlsbad, CA) s SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Takara). Na posúdenie kvantitatívnej variácie sa použila relatívna kvantitatívna metóda (244CT) (Bi et al., 2022). Sekvencie primérov sú uvedené v tabuľke 3.

Extrakcia RNA

Každá z 3 vzoriek sleziny zo skupiny H (G70 +vakcína) a skupiny C (vakcína) sa použila na RNA-seq s činidlom TRIzol (Takara). Potom sa RNA testovala na kontamináciu a degradáciu pomocou 1% agarózového gélu a čistota RNA sa analyzovala pomocou spektrofotometra NanoPhotometer (IMPLEN, Westlake Village, CA). Koncentrácia RNA sa určila pomocou súpravy Qubit RNA Assay Kit v Qubit 2.0 Fluorometer (Life Technologies, Carlsbad, CA). Integrita RNA sa merala pomocou súpravy RNA Nano 6000 Assay Kit systému Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Výsledky ukázali, že RNA bola úplná a bez kontaminácie DNA.

Analýza transkriptómu

Sekvenovanie transkriptómov, zostavenie sekvencií a analýzu údajov poskytla spoločnosť Novogene Bioinformatics Technology Co. Ltd. (Peking, Čína). Hlavné postupy pre transkriptóm boli uvedené nasledovne: 1) Purifikácia mRNA z celkovej RNA sa uskutočnila pomocou magnetických guľôčok pripojených k poly-T oligo. Fragmentácia sa uskutočnila s dvojmocnými katiónmi v reakčnom pufri NEB Next First Strand Synthesis (5X) pri vysokej teplote. 2) Prvý reťazec cDNA bol syntetizovaný s použitím náhodného hexamérneho priméru a reverzného Moloneyho vírusu myšacej leukémie (M-MuLV). Syntéza druhého vlákna cDNA sa potom syntetizovala pomocou DNA polymerázy I a RNázy H. 3) Zostávajúce previsy sa transformovali na tupé konce prostredníctvom aktivít exonukleázy/polymerázy. Štruktúra vlásenkovej slučky NEB Next Adapter sa potom ligovala, aby sa pripravila hybridizácia po adenylácii 3' konca DNA fragmentov. 4) Získali sa približne 250 až 3{45}}0 bp fragmenty cDNA a knižnica sa purifikovala pomocou systému AMPure XP od Beckman Coulter (Beckman Coulter, Beverly, MA). Potom sa aplikovali 3 ml NEBU SER Enzyme (Thermo Fisher, Hillsboro, OR) s cDNA s vybranou veľkosťou, naviazanou na adaptér pri 37 °C počas 15 minút a potom 5 minút pri 95 °C. PCR amplifikácia sa uskutočnila pomocou Phusion High-Fidelity DNA polymerázy. Nakoniec sa produkty PCR purifikovali (systém AMPure XP) a kvalita knižnice sa odhadla pomocou systému Agilent Bioanalyzer 2100. Zhlukovanie indexovo kódovaných vzoriek sa uskutočnilo na TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS (Illumina, San Diego, CA). Potom sa uskutočnilo sekvenovanie na platforme Illumina Novaseq a vygenerovali sa 150 bp párové čítania. Referenčné súbory anotácií genómu a génového modelu boli stiahnuté z webovej stránky genómu (ftp://ftp.ensembl.org/pub/release- 98/fasta/gallus_gallus/ a ftp://ftp. ensembl.org/ pub/re-lease-98/gtf/gallus_gallus/). Index referenčného genómu bol stanovený s použitím HISAT2 (v2.0.5) a párové čisté čítania boli zarovnané s referenčným genómom. Počet čítaní mapovaných ku každému génu a počet fragmentov na kilobázu na milión (FPKM) pre každý gén na základe dĺžky génu a počtu čítaní mapovaných na gén sa vypočítali pomocou funkcie Feature Counts v1.5.{{38} }p3. Diferenciálna expresia medzi skupinou H (G70 + vakcína) a skupinou C (vakcína) bola odvodená pomocou balíka DESeq2 R (1.16.1). Gény s P < 0,05 a |log2 (násobná zmena)| > 1 boli definované ako diferenciálne expresné gény (DEG).

Tabuľka 3. Sekvencie primérov pre RT-qPCR.

Kvantitatívna PCR v reálnom čase Validácia 

Dva up-regulované stupne a 4 down-regulované stupne v porovnaní skupiny H (G70 + vakcína) vs. skupina C (vakcína) boli vybrané na potvrdenie výsledkov transkriptómového sekvenovania pomocou RT-qPCR. RNA bola konvertovaná na cDNA pomocou PrimeScript RT Master Mix (Takara) na tepelnom cykléri T100 (Bio-Rad). Sekvencie primérov sú uvedené v tabuľke 3. Ako vnútorný kontrolný gén sa použil kurací b-aktín. RT-qPCR vybraných génov sa uskutočnila na systéme Multiple real-time PCR System (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) s SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Takara). Na posúdenie variácie v kvantifikácii sa použila relatívna kvantitatívna metóda (244CT). Všetky vzorky boli na analýzu uskutočnené trojmo.

Štatistická analýza

Jednosmerná ANOVA s Duncanovým post hoc testom sa použila na viacnásobné porovnanie medzi skupinami pomocou softvéru SPSS (verzia 21.0, SPSS Inc., Chicago, IL). Údaje sú vyjadrené ako priemer § SE. Hodnota P < 0,05 bola považovaná za štatisticky významnú.

VÝSLEDKY Účinok b-glukánu na titre sérových protilátok

Ako je znázornené na obrázku 1, titre Hl špecifické pre NDV sa znížili vo všetkých skupinách pred očkovaním a zvýšili sa v skupinách H (G70+vakcína) a C (vakcína) po imunizácii. Je zaujímavé, že vyššie titre HI boli pozorované v skupine H (G70+vakcína) pri 21 (P > 0.05), 28 (P < 0.{{{{101} 14}}5), 35 (P > 0,05) a 42 (P > 0,05) d veku ako v skupine C (vakcína).

Účinok b-glukánu na proliferáciu lymfocytov

Účinok G70 na proliferáciu lymfocytov periférnej krvi je znázornený na obrázku 2A. SI v krvných lymfocytoch bol zvýšený u vtákov suplementovaných G70 (G70 + vakcína) na 7. deň (P < 0,05) posilňovacej imunizácie v porovnaní so skupinou s vakcínou. Okrem toho sa SI v jejunálnych lymfocytoch významne zvýšil 7 dní (P < 0,05) po posilňovacej imunizácii v porovnaní so skupinou s vakcínou (obrázok 2B).

Vplyv b-glukánu na pomer CD4 +/CD8 + T buniek v periférnej krvi 

Obrázky 3A a 3B ukazujú vrátkovanie lymfocytov a CD{2}} buniek a obrázky 3C až 3E ukazujú pomer CD4 +/CD8 + T buniek v G70, vakcína, respektíve fyziologický roztok. Ako je znázornené na obrázku 3F, medzi skupinou s vakcínou a skupinou s fyziologickým roztokom nebol po posilňovacej imunizácii (P > 0,05) žiadny významný rozdiel, zatiaľ čo podiel CD4 +/CD{{12} } T bunka bola zjavne vyššia v skupine G70 (G70 + vakcína) ako v skupine s vakcínou (P < 0,05).

Obrázok 1. Účinok perorálneho podávania b-glukánu na titre sérových protilátok proti NDV vakcíne. Údaje sú vyjadrené ako priemer § SE.

Súvisiaca génová expresia

Ako je znázornené na obrázku 4, výrazne zvýšená mRNA expresia TGF-b (P < 0.05), IL-6 (P < 0.{{13} }5) a TLR5 (P < 0.05) bol detegovaný v slezine kurčiat liečených G70 (G70 + vakcína) v porovnaní so skupinou s vakcínou. Nezistil sa žiadny významný rozdiel v expresii mRNA IFN-g (P > 0,05), TLR4 (P > 0,05) a TLR3 (P > 0,05) v slezine medzi G70 (G70 + vakcína) a vakcínou skupiny.

Analýza dát sekvenovania RNA 

Sekvenovanie RNA z 8 knižníc sleziny poskytlo 24,1 G nespracovaných údajov, ako je uvedené v tabuľke S1 doplnkového materiálu. CN znamená skupinu vakcíny a HN znamená skupinu G70 + vakcíny. Knižnica C1, C2, C3, C4, H1, H2, H3, respektíve H4, pozostáva z 45,591,492, 47,424,782, 46,193,492, 54,403,376, 47,118,476, 45,44,899 a 45,41,899 38 pôvodných prečítaní. Po aptaméri boli nejednoznačné sekvencie a sekvencie nízkej kvality odstránené, pričom zostalo 44 050 198, 45 449 884, 44 261 112, 52 097 846, 45 542 404, 44 566 290, 4290, 61, 60 prečítaných Viac ako 96% čistých čítaní bolo medzi pôvodnými čítaniami a 8 knižníc bolo porovnaných pomocou HISAT2 na sekvenovanie čítaní s referenčnou databázou pozostávajúcou z genómu Gallus. Ďalej, čisté čítania boli mapované do tejto databázy vo viac ako 95% prípadov. Špecifické pre knižnice z C1, C2, C3, C4, H1, H2, H3 a H4 boli 40,921,384 (92,9 %), 41,302,100 (90,87 %), 40,771,075 (92,11 %), 426,904,305, 426,904,3 2 %), 40 213 444 (90,23 %), 40 922 895 (92,77 %) a 40 971 972 (93,06 %) čítaní bolo priradených jednoznačne referenčnej databáze.

Rozdielne vyjadrené gény

Ako je znázornené na obrázku 5A, bolo identifikovaných celkom 198 odlišne exprimovaných génov, vrátane 47 up-regulovaných génov a 151 down-regulovaných génov. Stupne boli podrobne opísané v tabuľke S2 ​​doplnkového materiálu. Obrázok 5B ukazuje, že DEG majú dobrú reprodukovateľnosť ošetrení.

Analýza klasifikácie génovej ontológie a Kjótska encyklopédia obohacovania génov a genómov

Gény, ktoré sú rozdielne exprimovanými génmi, boli klasifikované do 3 hlavných funkčných kategórií na základe klasifikačného systému génovej ontológie (GO): biologický proces, bunková zložka a molekulárna funkcia. Prvých 10 GO výrazov v 3 kategóriách je uvedených na obrázku 6. Prevládali gény zapojené do „reakcie na humorálnu imunitu“, „chemokínovej reakcie“, „reakcie na antimikrobiálnu humorálnu“, „obrannej reakcie proti baktérii, "imunitná odpoveď na antimikrobiálny humor sprostredkovaná antimikrobiálnymi peptidmi", "obranná odpoveď proti gramnegatívnej baktérii" a "obranná odpoveď proti grampozitívnej baktérii" v kategórii biologických procesov. Okrem toho v kategórii molekulárnej funkcie pozoruhodný pomer génov súvisel s „väzbou chemokínového receptora motívu CC (CCR) na chemokínový receptor“, „väzbou na chemokínový receptor“ a „väzbou lipopolysacharidov“. Okrem toho „komplex I mitochondriálneho dýchacieho reťazca“, „komplex NADH dehydrogenázy“ a „respiračný reťazec“ boli najdominantnejšie obohatené výrazy v kategórii bunkových komponentov. Analýza dráhy Kjótskej encyklopédie génov a genómov sa uskutočnila aj na rozdielne exprimovaných génoch. Výsledky naznačujú, že gény boli zoskupené hlavne do 7 dráh vrátane "Neuroaktívna interakcia ligand-receptor", "Gap junction", "mitogénom aktivovaná proteínkináza (MAPK) signálna dráha", "ABC transportéry", "Biosyntéza aminokyselín," "Léčivový metabolizmus" a "Export bielkovín."

Obrázok 2. Účinok perorálneho podávania b-glukánu na index stimulujúci lymfocyty (SI). (A) Lymfocyty periférnej krvi; (B) črevné lymfocyty. Údaje sú vyjadrené ako priemer § SE.

Obrázok 3. Vplyv perorálneho podania b-glukánu na pomer CD4+/CD8+ buniek periférnej krvi. (A) Brána na lymfocytoch; (B) brána na CD3+ T bunkách; (C) frekvencie CD3+CD4 +CD8 + T buniek v skupine G70+vakcíny; (D) frekvencie CD3+ CD4 + CD8 + T buniek v skupine vakcín; (E) frekvencie CD3+ CD4 + CD8 + T buniek v skupine s fyziologickým roztokom; (F) čiarový diagram predstavujúci pomer CD4+/CD{19}}. Údaje sú vyjadrené ako priemer § SE.

Obrázok 4. Účinok perorálneho podávania b-glukánu na expresiu mRNA v kuracej slezine. Údaje sú vyjadrené ako priemer § SE.

Obrázok 5. Súhrn údajov RNA-Seq. (A) Zoznam rozdielne exprimovaných génov, (B) zhluková mapa DEG.

Overenie génov exprimovaných diferencovane pomocou RT-qPCR

6 stupňov, ktoré boli up- alebo down-regulované, boli potvrdené kvantitatívnou PCR v reálnom čase. Výsledok naznačil, že údaje RT-qPCR boli vo všeobecnosti v súlade s údajmi RNA-seq, čo naznačuje spoľahlivý výsledok sekvenovania (obrázok 7). Expresia mRNA génov asociovaných s dráhou MAPK Ako je znázornené na obrázku 8, výrazne sa znížila mRNA expresia FAS (P < 0.05) a CACNA2 (P < 0,05). zistené v slezine kurčiat v skupine G70 (G70 + vakcína) v porovnaní so skupinou s vakcínou. Navyše numericky zvýšená expresia mRNA DUSP5 a DUSP4 a numericky znížená expresia mRNA p38, JNK a ERK bola detegovaná v skupine G70 (G70 + vakcína) v porovnaní so skupinou s vakcínou (P > 0,05) .

DISKUSIA

Živá vakcína proti ND sa vo veľkej miere inokuluje na kuracích farmách a napriek tomu stále existujú sporadické prepuknutia pseudomoru hydiny v imunizovaných kŕdľoch hydiny (Zhang et al., 2022). Optimálne vakcíny sú definované tak, aby stimulovali bunkovú a slizničnú imunitu, ako aj účinnú humorálnu imunitu (Shan et al., 2019). Preto sa čoraz viac pozornosti venovalo adjuvanciám, ktoré by mohli spôsobiť slizničné, ako aj bunkové imunitné reakcie (Chen et al., 2014; Yu et al., 2015). V porovnaní s injekčnou cestou je perorálne podávanie jednoduchší prístup, ktorý znižuje náklady a vyvoláva menší stres u brojlerových kurčiat (Boyaka a kol., 2003; Zhang a kol., 2008). Výsledky tejto štúdie ukázali, že strava doplnená b-glukánom výrazne zvýšila hladinu NDV-špecifických HI titrov v sére kurčiat, čo je v súlade s predchádzajúcimi správami (Horst et al., 2019). NDV-špecifická protilátka je nevyhnutná pre rozvoj humorálnej imunitnej odpovede na ochranu kurčiat pred infekciou NDV (Martinez a kol., 2018; Li a kol., 2020). B lymfocyty produkujú protilátky a T lymfocyty expandujú v reakcii na mitogén (Bohacová et al., 2021). V tejto štúdii bol stimulačný index kuracích periférnych krvných lymfocytov voči NDV v skupine G70 zjavne vyšší ako v skupine s vakcínou, čo naznačuje, že bolo aktivovaných viac T lymfocytov. Prevládajúcimi subpopuláciami T lymfocytov sú CD4 + a CD{15}} T bunky (Cui et al., 2020). CD4 + T bunky produkujú hlavne cytokíny a podporujú dozrievanie B buniek, zatiaľ čo CD8 + T bunky sú spojené so zabíjaním cieľových buniek (Zhang et al., 2021b). V tomto výskume sa pomer CD4 +/CD8 + T buniek detekovaných v skupine G70 jasne zvyšoval, čo naznačuje, že G70 by mohol aktivovať viac CD4 + T buniek z periférnej krvi. Okrem toho sme pozorovali výrazne vyšší index stimulácie črevných lymfocytov v skupine G70 ako v skupine s vakcínou, čo potvrdilo, že b-glukán môže stimulovať aj črevné lymfocyty. Naše predchádzajúce experimenty potvrdili, že extrakt bunkovej steny kvasiniek PW220 významne zvýšil intestinálne špecifické sIgA a IgA + bunky (Bi et al., 2020). To znamená, že b-glukán G70 aj PW220 sú účinné pri podpore imunity črevnej sliznice.

cistanche výhody pre mužov - posilnenie imunitného systému

Zlepšenie imunity zvierat podávaním b-glukánu už bolo hlásené. Guo a spol. (2003) potvrdili, že podávanie b-glukánu zlepšilo index bursa a NDV-špecifických protilátok u kurčiat. Levine a kol. (2018) navrhli, že suplementácia b-glukánom môže upregulovať črevný MHC Ⅱ a zvýšiť počet CD45 + buniek na zmiernenie poškodenia čreva.

Li a spol. (2005) odhalili, že diétny b-glukán môže zvýšiť hladinu expresie mRNA IL-8 a TGF-b v črevnom trakte ošípaných. Mechanizmus imunomodulačného účinku b-glukánu nie je jasný. Kim a spol. (2010) ukázali, že b-glukán podporoval dozrievanie dendritických buniek zvýšením regulácie expresie CD40, CD80 a CD86. Okrem toho Lee a Kim (2014) a Su et al. (2020) uviedli, že b-glukán aktivoval receptory na rozpoznávanie vzorov, ako je receptor Dectin-1, Toll-like receptor a CR3 (Baert et al., 2015). Slezina je kritickým orgánom pre iniciáciu imunitnej reakcie a hrá zásadnú úlohu vo vrodenej aj získanej imunite (Bronte a Pittet, 2013). Existuje však len malý výskum založený na RNA-seq analýze expresie mRNA v slezine po orálnom podaní kvasinkových polysacharidov. V tejto štúdii analýza dráhy Kjótskej encyklopédie génov a genómov naznačila, že tieto gény boli primárne zoskupené do 2 dráh, vrátane „Neuroaktívnej interakcie ligand-receptor“ a „signálnej dráhy MAPK“. Receptory na rozpoznávanie vzorov zacielené na b-glukán boli obohatené na povrchu imunitných buniek (Goodridge et al., 2009). Po rozpoznaní b-glukánu boli týmito receptormi stimulované tyrozínkináza a jadrový faktor kappaB (NF-kappaB), čo viedlo k indukcii sekrécie prozápalových cytokínov a aktivácii imunitných reakcií (Kankkunen et al., 2010; Masuda et al. ., 2012; Xu a kol., 2016; Bode a kol., 2019). MAPK, ako rodina serín-treonínových proteínkináz, hrá rozhodujúcu úlohu pri zápale a produkcii cytokínov u kurčiat. Byun a kol. (2016) preukázali, že b-glukán zvýšil produkciu interferónu-ga interleukínu-2 a spustil významne vyššie hladiny fosforylácie MAPK p38 v peritoneálnom makrofágu. Wang a kol. (2014) uviedli, že b-glukán tlmí zápalové reakcie v THP-1 bunkách inhibíciou aktivácie p38 MAPK. V tejto štúdii bolo v signálnej dráhe MAPK identifikovaných 13 stupňov vrátane DUSP4, CACNA2D1, PDGFD, PTPRR, ENSGALG00000006351, FAS, MAP2K3, MYC, DUSP5, MAX, SRF, PRKCB a EGFR, čo by mohlo naznačovať, že imunitná odpoveď b-glukánu sleziny prostredníctvom MAPK u kurčiat. MAPK je konzervovaná trieda Ser/Thr kináz v bunkách, ktoré sa podieľajú hlavne na bunkových odpovediach, ako je imunitná odpoveď, apoptóza a proliferácia. Rodina MAPK zahŕňa aspoň 3 podrodiny: c-Jun N-koncovú kinázu (JNK), p38 MAPK a kinázu regulovanú extracelulárnym signálom (ERK) (Hong a kol., 2020; Zhang a kol., 2021a). DUSP4 a DUSP5 sú fosfatázy s duálnou špecifickosťou, ktoré špecificky inhibujú aktivitu členov rodiny MAPK, ako sú p38, JNK a ERK, pričom zohrávajú dôležitú regulačnú úlohu pri prevencii nadmernej zápalovej reakcie a podpore regresie zápalu v tele (Imasato et al. ., 2002; Talreja a kol., 2021). Okrem toho sa uvádza, že malá nekódujúca RNA s názvom gga-miR-200a-3p potláča expresiu prozápalových faktorov, a tak reguluje autoimunitnú odpoveď hostiteľa negatívnou reguláciou dráhy MAPK a jeho downstream signálnych molekúl (Pham et al., 2017). V tejto štúdii analýza RT-qPCR ukázala, že expresia mRNA P38, JNK a ERK sa znížila a expresia mRNA DUSP4 a DUSP5 sa zvýšila u kurčiat kŕmených b-glukánom (G70). Tieto výsledky naznačujú, že účinok b-glukánu (G70) na zvýšenie imunity na vakcínu proti pseudomoru hydiny môže súvisieť s negatívnou spätnou väzbou regulácie prozápalových faktorov sprostredkovaných prostredníctvom MAPK. Okrem toho je FAS základnou látkou, ktorá sprostredkúva apoptózu a je životne dôležitá pre imunitnú homeostázu (Krueger et al., 2003; Guegan a Legembre, 2018). Medzitým je CACNA2 podjednotka vápnikového kanála závislá od napätia, ktorá má propagačný účinok na bunkovú proliferáciu, migráciu a inváziu (Sun et al., 2020). V tejto štúdii boli FAS a CACNA2 významne znížené u kurčiat suplementovaných b-glukánom (G70), čo naznačuje, že b-glukán (G70) vykazuje imunitu zvyšujúce účinky hlavne inhibíciou apoptózy imunitných buniek a vyrovnávaním autoimunity. Tieto zistenia poskytujú teoretický odkaz na použitie b-glukánu (G70) ako posilňovača imunity v klinických podmienkach. Mechanizmus imunitnej odpovede zosilňujúcej b-glukán prostredníctvom negatívneho spätnoväzbového účinku dráhy MAPK však potrebuje ďalší dôkaz. Je zaujímavé poznamenať, že gény kódujúce katelicidín zahŕňajúce CATH3, CATH1, CATH2 a gény kódujúce b-defenzín vrátane AvBD6, AvBD7, AvBD1 a AvBD4 boli výrazne znížené v porovnaní s H (vakcína skupiny G{104}}) vs. kontrola (skupinová vakcína). Host obranné peptidy (HDP) sú efektorové molekuly, ktoré zohrávajú kľúčovú úlohu vo vrodenom imunitnom systéme (Cuperus et al., 2013). Tieto peptidy boli objavené u rôznych živočíšnych druhov od cicavcov po vtáky. U kurčiat sú 4 katelicidíny pozostávajúce z CATH1, CATH2, CATH3 a CATHB1, ktoré účinne zabíjajú rôzne baktérie (Hamad et al., 2017). Vtáčie beta-defenzíny (AvBD), alternatívne nazývané gallinacean, sú malé katiónové peptidy s 3 cysteínovými disulfidovými väzbami medzi ich cysteínovými zvyškami a zohrávajú dôležitú úlohu vo vrodenom imunitnom systéme (Yoshimura, 2015). Zníženie expresie katelicidínov a beta-defenzínu možno vysvetliť reguláciou spätnou väzbou, kde boli bakteriálne a parabakteriálne populácie znížené polysacharidmi bunkovej steny kvasiniek (Bi et al., 2020). Podobné výsledky boli odhalené v iných štúdiách. Shao a kol. (2016) ukázali, že suplementácia kvasinkového b-glukánu u brojlerových kurčiat potlačila infekciu Salmonella a znížila expresiu HDP prostredníctvom kvantitatívnej PCR analýzy v reálnom čase. V tejto štúdii produkt G70 zložený hlavne z b-glukánu zvýšil hladinu NDV-špecifických protilátok v sére, zvýšil NDV stimulačný index lymfocytov periférnej krvi a črevných lymfocytov a podporil diferenciáciu T lymfocytov periférnej krvi na CD{{ 123}} T bunky. Okrem toho analýza RNA-seq ukázala, že G70 upreguloval expresie mRNA súvisiace so serotonínovým receptorom spojeným s G-proteínom a polypeptidom MHC triedy I a znížil expresiu mRNA týkajúcu sa katelicidínu a beta-defenzínu. Vzhľadom na zvýšený účinok G70 na vakcínu proti ND u kurčiat možno ďalej študovať účinok G70 na iné vakcíny pre hydinu, ako je vakcína proti vtáčej chrípke.

Obrázok 6. Analýza KEGG dráhy.

Obrázok 7. RT-qPCR potvrdenie vybraných kandidátov DEG. Údaje sú vyjadrené ako priemer § SE.

Obrázok 8. Relatívna expresia mRNA v slezine. Celková RNA bola extrahovaná zo sleziny. Kurací b-aktín slúžil ako vnútorný kontrolný gén. Údaje sú vyjadrené ako priemer § SE.

LITERATÚRA

Baert, K., E. Sonck, BM Goddeeris, B. Devriendt a E. Cox. 2015. Rozdiely špecifické pre bunkový typ v rozpoznávaní a signalizácii b-glukánu v bunkách vrodenej imunity ošípaných. Dev. Comp. Immunol. 48:192-203.

Ball, C., A. Forrester, A. Herrmann, S. Lemiere a K. Ganapathy. 2019. Porovnávacia ochranná imunita poskytovaná živými vakcínami vírusu pseudomoru hydiny alebo vtáčieho metapneumovírusu pri súbežnom podávaní spolu s klasickými a variantnými kmeňmi vírusu infekčnej bronchitídy u jednodňových brojlerových kurčiat. Vakcína. 37:7566–7575.

Bi, S., J. Zhang, Y. Qu, B. Zhou, X. He a J. Ni. 2020. Produkt bunkovej steny kvasiniek zvýšil črevnú IgA odpoveď a zmenil druhy mikroflóry slepého čreva po perorálnej vakcinácii u kurčiat. Poult. Sci. 99:6576-6585.

Bi, S., J. Zhang, L. Zhang, K. Huang, J. Li a L. Cao. 2022. Bunková stena kvasiniek upregulovala bunkami sprostredkované imunitné reakcie na vakcínu proti vírusu pseudomoru hydiny. Poult. Sci. 101:101712–101721.

Bode, K., F. Bujupi, C. Link, T. Hein, S. Zimmermann, D. Peiris, V. Jaquet, B. Lepenies, H. Weyd a PH Krammer. 2019. Väzba dektínu-1 na anexíny na apoptotických bunkách indukuje periférnu imunitnú toleranciu prostredníctvom NADPH oxidázy-2. Bunka. Rep. 29:4435–4446.

Boháčová, P., J. Kossl, M. Hájková, B. Hermánková, V. Holan a E. Javorková. 2021. Rozdiel medzi mitogénom stimulovanými B a T bunkami v nešpecifickej väzbe protilátok konjugovaných s R-fykoerytrínom. J. Immunol. Metódy. 493:113013–113023.

Boyaka, PN, A. Tafaro, R. Fischer, K. Fujihashi, E. Jirillo a JR McGhee. 2003. Terapeutická manipulácia imunitného systému: posilnenie vrodenej a adaptívnej slizničnej imunity. Curr. Pharm. Dizajn. 9:1965–1972.

Bronte, V. a MJ Pittet. 2013. Slezina v lokálnej a systémovej regulácii imunity. Imunita. 39:806-818.

Byun, E., S. Park, B. Jang, N. Sung a E. Byun. 2016. Gama-ožiarený b-glukán indukuje imunomodulačnú a protirakovinovú aktivitu prostredníctvom MAPK a NF-kB dráh. J. Sci. Jedlo. Agr. 96:695-702.

Chen, X., X. Chen, S. Qiu, Y. Hu, C. Jiang, D. Wang, Q. Fan, C. Zhang, Y. Huang, Y. Yu, H. Yang, C. Liu, Z Gao, R. Hou a X. Li. 2014. Účinky epimedium polysacharid-propolis flavónová perorálna tekutina na slizničnú imunitu u kurčiat. Int. J. Biol. Macromol. 64:6–10.

Cui, X., Y. Wang, R. Guan, M. Lu, L. Yuan, W. Xu a S. Hu. 2020. Posilnené imunitné reakcie s proteomickou analýzou séra oviec hu proti slintačke a krívačke emulgovanej v adjuvans rastlinného oleja. Vakcíny. 8:180–197

Cuperus, T., M. Coorens, A. van Dijk a HP Haagsman. 2013. Vtáčie hostiteľské obranné peptidy. Dev. Comp. Immunol. 41:352-369.

Goodridge, HS, AJ Wolf a DM Underhill. 2009. Rozpoznanie beta-glukánov vrodeným imunitným systémom. Immunol. Zj. 230:38–50.

Guegan, J. a P. Legembre. 2018. Neapoptotické funkcie Fas/CD95 v imunitnej odpovedi. FEBS J 285:809-827.

Guo, Y., RA Ali a MA Qureshi. 2003. Vplyv beta-glukánu na imunitné reakcie u brojlerových kurčiat. Immunopharm. Immunol. 25:461–472.

Hamad, SK, S. Kim, SW El-Kadi, EA Wong a RA Dalloul. 2017. Porovnávacia expresia obranných peptidov hostiteľa u moriek. Poult. Sci. 96:2083-2090.

Hasted, T., S. Sharif, P. Boerlin a MS Diarra. 2021. Imunostimulačný potenciál plodov a ich extraktov u hydiny. Predné. Immunol. 12:641696.

Hong, Y., J. Lee, TH Vu, S. Lee, HS Lillehoj a YH Hong. 2020. Kurací vtáčí b-defenzín 8 moduluje imunitnú odpoveď prostredníctvom mitogénom aktivovaných proteínkinázových signálnych dráh v bunkovej línii kuracích makrofágov. Poult. Sci. 99:4174-4182.

Horst, G., R. Levine, R. Chick a C. Hofacre. 2019. Účinky beta- 1,3-glukánu (AletaTM) na očkovanie u brojlerových kurčiat. Poult. Sci. 98:1643–1647.

Imasato, A., C. Desbois-Mouthon, J. Han, H. Kai, ACB Cato, S. Akira a J. Li. 2002. Inhibícia p38 MAPK glukokortikoidmi prostredníctvom indukcie MAPK fosfatázy-1 zosilňuje expresiu Toll-like receptora 2 indukovanú vplyvom netypizovateľného Haemophilus. J. Biol. Chem. 277:47444–47450.

Kankkunen, P., L. Teiril€a, J. Rintahaka, H. Alenius, H. Wolff a S. Matikainen. 2010. (1,3)-beta-glukány aktivujú dektín-1 aj zápal NLRP3 v ľudských makrofágoch. J. Immunol. 184:6335-6342.

Kim, HS, JY Kim, HK Lee, MS Kim, SR Lee, JS Kang, HM Kim, K. Lee, JT Hong, Y. Kim a S. Han. 2010. Aktivácia dendritických buniek glukánom izolovaným z umbilicaria esculenta. Imúnna. Netw. 10:188–197.

Krueger, A., SC Fas, S. Baumann a PH Krammer. 2003. Úloha CD95 v regulácii periférnej apoptózy T-buniek. Immunol. 193:58–69.