Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Deficit mitochondriálneho transkripčného faktora A cielený na obličkový epitel má za následok progresívnu mitochondriálnu depléciu spojenú so závažným cystickým ochorením--Časť I

Ken Ishii^1,2,11 a kol

Abnormálna mitochondriálna funkcia je dobre známym znakom akútnej a chronickejobličky choroby. Získať prehľad o úlohe mitochondrií vobličkyhomeostázy a patogenézy sme sa zamerali na mitochondriálny transkripčný faktor A (TFAM), proteín potrebný na replikáciu a transkripciu mitochondriálnej DNA, ktorý hrá rozhodujúcu úlohu pri udržiavaní mitochondriálnej hmoty a funkcie. Skúmať dôsledky narušenej mitochondriálnej funkcie vobličkyepiteliálnych buniek, inaktivovali sme TFAM v homeoboxe súvisiaceho s sínusovým okulisom 2-exprimujúcimobličkyprogenitorové bunky. Nedostatok TFAM viedol k signifikantne zníženej mitochondriálnej génovej expresii, mitochondriálnej deplécii, inhibícii dozrievania nefrónov a rozvoju ťažkého postnatálneho cystického ochorenia, ktoré malo za následok predčasnú smrť. Súviselo to s abnormálnou mitochondriálnou morfológiou, znížením spotreby kyslíka a zvýšeným glykolytickým tokom. Ďalej sme zistili, že expresia TFAM bola znížená u myší a ľudípolycystické obličky, ktorý bol sprevádzaný mitochondriálnou depléciou. Naše údaje teda naznačujú, že dysregulácia expresie TFAM a mitochondriálna deplécia sú molekulárnymi znakmiobličkycystické ochorenie, ktoré môže prispieť k jeho patogenéze.

KĽÚČOVÉ SLOVÁ: glykolýza; vývoj obličiek; mitochondrie;polycystické ochorenie obličiek; TFAM

cistancheje dobré prepolycystické ochorenie obličiek

Prekladové vyhlásenie

Na pochopenie úlohy mitochondriálnej dysfunkcie sme použili genetiku myšíobličkyhomeostázy. Inaktivácia mitochondriálneho transkripčného faktora A (TFAM) v epitelových progenitorových bunkách súvisiacich s homeoboxom 2 súvisiacim so sínusovým okom viedla kobličkovézlyhaniez dôvodu ťažkejpolycystická oblička choroba. Naše zistenia ukazujú, že progresívna mitochondriálna dysfunkcia je spojená s defektnou diferenciáciou epitelu aobličkovécystogenéza. Ďalej sme zistili, že expresia TFAM a počet mitochondrií boli u človeka zníženépolycystická obličkatkaniva. Naše štúdie naznačujú, že terapeutické stratégie, ktorých cieľom je zlepšenie mitochondriálneho zdravia, môžu byť prospešné pri liečbe pacientov s autozomálne dominantnýmipolycystická obličkachoroba.

Mitochondriálna (mt) dysfunkcia je dobre známym patologickým znakom spoločnéhoobličky chorobya môže spustiť poškodenie buniek, zápal a fibrózu.1 VobličkyTubulárne epitelové bunky sú vysoko závislé od adenozíntrifosfátu (ATP) generovaného oxidatívnou fosforyláciou (OXPHOS), pretože vykonávajú viaceré energeticky náročné epiteliálne transportné funkcie. Preto je udržiavanie účinnej produkcie mt ATP nevyhnutné pre normálnu funkciu obličiek a systémovú homeostázu elektrolytov. Okrem toho nedávne dôkazy naznačujú, že mitochondrie majú hlavnú úlohu v génovej regulácii, bunkovej signalizácii a diferenciácii buniek prostredníctvom vytvárania intermediárnych metabolitov a reaktívnych foriem kyslíka (ROS).2 Napriek týmto pokrokom zohráva úlohu mt signalizácie v patogenéze bežnýchobličkychorobynie je dobre pochopené.

Na vyšetrenie funkcie mt vobličkovéhomeostázy a patogenézy sme sa zamerali na mitochondriálny transkripčný faktor A (TFAM). TFAM je jadrovo kódovaný faktor nevyhnutný pre funkciu mt, udržiavanie počtu kópií mt a štrukturálnu stabilitu mt DNA, pretože reguluje replikáciu a transkripciu mt genómu ohýbaním promótorovej DNA.3,4 Cicavčia mt DNA obsahuje 37 génov, 13 z ktorých kóduje proteínové podjednotky komplexu dýchacieho reťazca, 22 kóduje transferové RNA a 2 ribozomálne RNA.3 TFAM sa teda priamo podieľa na regulácii transportu elektrónov mt a syntéze ATP prostredníctvom transkripcie génov, ako je mitochondriálne kódovaný cytochróm b ( MT-CYB), mitochondriálne kódovaná cytochróm c oxidáza podjednotka 1 (MT-CO1) a mitochondriálne kódovaná ATP syntáza membránová podjednotka 6 (MTATP6).3,5Bez TFAM strácajú bunky schopnosť produkovať ATP prostredníctvom OXPHOS, nemôžu generovať významné množstvá mt ROS a postupne sa zbavujú mitochondrií.6–9 Genetické štúdie ukázali, že TFAM je nevyhnutný pre normálnu embryogenézu, pretože globálna homozygotná inaktivácia Tfam viedla k intrauterinnej letalita do embryonálneho dňa 10,5, zatiaľ čo heterozygotný deficit, hoci znížil počet kópií mt o ~40 percent a viedol k deficitu dýchacieho reťazca, neviedol k embryonálnej letalite.6 Genetické zacielenie TFAM je teda užitočnou experimentálnou stratégiou na skúmanie úlohy progresívnej mt dysfunkcie v bunkovej diferenciácii a tkanivovej homeostáze. Podmienená inaktivácia Tfam špecifická pre bunkový typ naznačuje, že tvorba OXPHOS a/alebo mt ROS je rozhodujúca pre bunkovú diferenciáciu, funkciu a normálnu fyziológiu.6–10

Môžu sa vyskytnúť primárne poruchy mt spôsobené jadrovými alebo mt génovými mutáciamiobličky chorobanajčastejšie sa prejavuje ako tubulointersticiálne poškodenie alebo izolovaná tubulárna dysfunkcia.11,12 Hoci sa podieľajú na patogenéze určitých ľudských chorôb, ako sú neurodegeneratívne poruchy,13 špecifické mutácie v TFAM spôsobujúceobličkovéochorenie nebolo hlásené. Nedávno bola znížená expresia TFAM spojená s chronickouobličkychoroba. Strata integrity mt v dôsledku inaktivácie Tfam spôsobila tubulointersticiálne ochorenie aobličkové zlyhanieu myší, čo bolo čiastočne spôsobené aktiváciou cyklickej GMP-AMP syntázy (cGAS) – stimulátora interferónových génov (STING) závislých zápalových reakcií vyvolaných stresom mt DNA.14

Tu uvádzame, že u myší s podmienenou inaktiváciou Tfam v homeoboxe 2 (SIX2) súvisiacich s homeoboxom 2 (SIX2) exprimujúcim nefrónové progenitorové bunky15 sa vyvinie ťažké cystické ochorenie a predčasne umierajúobličkovézlyhanieako mladé nedospelé myši.Tfam^-/- myši boli charakterizované defektmi v dozrievaní nefrónov, ktoré súviselo s depléciou mt, znížením OXPHOS a metabolickým posunom smerom ku glykolýze vTfam^-/- obličkovéepitel. Vzhľadom na závažnosť cystického ochorenia vTfam^-/- myši, analyzovali sme 2 myšacie modelypolycystická obličkachoroba(PKD), ktoré sú výsledkom mutácií buď v polycystíne{0}} (PKD(polycystické ochorenie obličiek)1) alebo cystín-1 (Cys1), ako aj ľudské tkanivá od pacientov s autozomálne dominantným polycystickým ochorením obličiek (ADPKD). Ustanovujeme toTfam^-/- je dysregulovaná v cystách z myšacej aj ľudskej PKD(polycystické ochorenie obličiek), tkanivá. Celkovo naše štúdie naznačujú, že dysregulácia TFAM a vyčerpanie mt sú charakteristické znakyobličkovécystické ochorenia a môžu sa podieľať na ich patogenéze.

cistancheje dobré prepolycystické ochorenie obličiek

VÝSLEDKY

Inaktivácia Tfam v bunkách línie SIX2 spôsobuje závažné cystické ochorenie, ktoré má za následokobličkovézlyhanieAby bolo možné preskúmať funkciu mt vobličkovéepitelu, inaktivovali sme Tfam v SIX2-exprimujúcich progenitorových bunkách, z ktorých vznikli všetky segmenty nefrónov okrem zberného kanálika (CD).15 Na tento účel sme skrížili floxovanú alelu Tfam s bakteriálnymi umelými chromozómovými transgénnymi myšami, ktoré exprimujú zosilnený zelený fluorescenčný proteín/Cre rekombinázový fúzny proteín (eGFP/Cre) pod transkripčnou kontrolou promótora Six2 (obrázok 1a).16 Myši homozygotné pre floxovanú alelu Tfam a heterozygotné pre transgén eGFP/Cre (Šesť2-eGFP/Cretg/^{tg plus}; Tfam^fl/fl) sa odteraz nazýva šesť2-Tfam^-/- mutantov. Šesť2-Tfam^-/- myši sa narodili v očakávaných mendelovských pomeroch a vizuálnou kontrolou pri narodení sa nedali odlíšiť od kontrol Crea. Rozdiely v telesnej hmotnosti medzi šiestimi2-Tfam^-/- mutanty a Cre kontroly súrodencov sa prejavili v postnatálny deň (P) 14 (5,7 plus -0,3 g pre mutanty oproti 7,5 plus -0,3 g pre kontroly, n=4 každá, P =0.004; doplnková tabuľka S1). Šesť2-Tfam^-/- mutantné myši boli charakterizované zväčšenímobličkyv porovnaní s kontrolami (obličky/pomer telesnej hmotnosti 1,45 percent plus -0,19 percent pre mutanty oproti 0,60 percent plus - 0,02 percent pre kontrolu, n {{8} } každý, P < 0,001;="" obrázok="" 1b,="" doplnková="" tabuľka="" s1)="" a="" zomreli="" medzi="" vekom="" p20="" a="" p30="" (obrázok="" 1b).="" juvenilná="" letalita="" v="" kohorte="" mutantov="" bola="" spojená="">obličkovézlyhanieod ťažkého cystického ochorenia s hladinami močovinového dusíka v krvi 68,40 plus -5,32 mg/dl pre mutantné myši oproti 16.8 2.0 mg/dl pre kontroly ( n= 6 a 7; P < 0.0001;="" obrázok="" 1b="" a="" c).="" okrem="" toho="" sa="" u="" šiestich2-tfam="" mutantov="" vyvinula="" významná="" albuminúria="" (pomer="" albumín/kreatinín="" v="" moči="" 43,58="" plus="" -362="" 0,475,18="" mg/g="" v="" prípade="" six{18}}tfam="" mutanty="" oproti="" 3,39="" mg/g="" u="" kontrol="" pri="" p14,="" n="6" a="" 10;="" p="">< 0,0001).="" to="" je="" v="" súlade="" s="" expresným="" vzorom="" cre="" rekombinázy="" v="" six2="" progenitorových="" bunkách="" nefrónu,="" ktoré="" spôsobujú="" vznik="" mezenchýmu="" odvodeného="" od="">obličkovétubuly a podocyty.15 Na rozdiel od Six2-Tfam^-/- mutanty, myši s heterozygotným deficitom Tfam v progenitorových bunkách SIX2 sa vyvíjali normálne, boli plodné a nevyvinuli sa zjavnéobličkychoroba(Doplnkový obrázok S1).

Obrázok 1|Inaktivácia Tfam v bunkách línie SIX2 vedie k závažnému cystickému ochoreniu a zlyhaniu obličiek. ( a ) Schéma ilustrujúca experimentálny prístup a umiestnenie cielených sekvencií v rámci alely floxovanej Tfam. Analýza polymerázovej reťazovej reakcie celkovej genómovej obličkovej DNA izolovanej z kontroly súrodencov (Cre) a Six2-Tfam^-/-myši vo veku postnatálny deň (P) 7; nerekombinantná Tfam floxovaná alela je označená 2-lox (2); rekombinovaná alela podľa 1-lox, alela divokého typu podľa wt; þ alebo - označujú prítomnosť alebo neprítomnosť transgénu Six2-eGFP/Cre. (b) Ľavé panely, fotografie obličiek z kontroly Cre a Six2-Tfam^-/- myši vo veku P20. Hmotnosť obličiek (KW) je vyjadrená ako percento telesnej hmotnosti (BW) (n= 4–14). Pravé panely, hladiny močovinového dusíka v krvi (BUN) v kontrolnej skupine Cre (spolu) a Six2-Tfam^-/-myši vo veku P7 (n=7 a 6, v tomto poradí) a Kaplan-Meierove krivky prežitia pre kontrolu Cre a šesť2-Tfam^-/- myši v porovnaní s log-rank testom (n=10–13). (c) Reprezentatívne snímky rezov obličiek fixovaných formalínom a zaliatych do parafínu z kontroly Cre a Six2-Tfam^-/-myši vo veku P7 a P29 farbené hematoxylínom a eozínom (H&E) a analyzované imunohistochémiou na a-aktín hladkého svalstva (ACTA2) a klastrový diferenciačný (CD) antigén 31. Číselné znaky zobrazujú cystické štruktúry a hviezdičky zobrazujú glomeruly. Pruhy ¼ 1 mm pre prierezy celej obličky, 100 mm pre vysokovýkonné H&E snímky a 50 mm pre IHC snímky. Údaje sú vyjadrené ako priemer plus - SEM a boli analyzované 2-tailovým Studentovým t-testom. ***P < 0,001.="" ak="" chcete="" optimalizovať="" zobrazovanie="" tohto="" obrázka,="" pozrite="" si="" online="" verziu="" tohto="" článku="" na="" adrese="">

Analýza šiestich2-Tfam^-/- myši, ktoré tiež exprimovali reportérovú alelu ROSA26-ACTB-tdTomato,-eGFP Cre, tu označovanú ako Six{3}}mT/mG;Tfam^-/- myši, čo naznačuje, že veľká väčšina cystických štruktúr vTfam^-/- obličky boli odvodené z buniek s históriou expresie šiestich{0}}eGFP/Cre (doplnkový obrázok S2). Cysty v šiestich2-Tfam^-/- obličkyvykazovali dôkaz proliferácie, čo dokazuje prítomnosť Ki67-pozitívnych epiteliálnych buniek výstelky cysty (v priemere 40 percent všetkých epiteliálnych buniek výstelky cysty), zatiaľ čo bunky pozitívne na štiepenú kaspázu 3 sa v cystách nezistili (doplnkový obrázok S3 ). Tieto zistenia sú v súlade so zvýšenými hladinami fosforylovanej extracelulárnej signálom regulovanej kinázy (p-ERK) a b-katenínu v Six2-Tfam^-/- obličkové tkanivo (doplnkový obrázok S3). Celkovo z našich údajov vyplýva, že šesť2-Tfam^-/- obličky vykazujú molekulárne vlastnosti, ktoré sú často spojené sobličkovécystické ochorenia.

Obrázok 3 |Tfam^-/-cysty neexprimujú bežné markery špecifické pre segment nefrónu. (a) Reprezentatívne snímky rezov obličiek fixovaných vo formalíne a zaliatych do parafínu zo šiestich2-mT/mG;Tfam^-/-mice at age postnatal day (P) 14 stained for enhanced green fluorescent protein (eGFP), megalin, uromodulin, thiazide-sensitive sodium chloride cotransporter (NCC), and aquaporin 2 (AQP2) by immunofluorescence (IF). 4',6-diamidino-2-phenylindole was used for nuclear staining (blue fluorescence). Arrows depict tubular structures expressing respective nephron segment-specific markers. Nephron segment marker expression was assessed in cysts with a maximal diameter of >50 mm. (b) reprezentatívne snímky rezov obličiek fixovaných vo formalíne a zaliatych do parafínu zo šiestich2-mT/mG;Tfam^-/-myši vo veku P14 zafarbené na eGFP a uromodulín pomocou IF. Hviezdičky zobrazujú cysty s intraluminálnym uromodulínom. Prítomnosť intraluminálneho uromodulínu bola vyšetrovaná v cystách s maximálnym priemerom 50–100μm alebo pri cystách väčších ako 100 mm v maximálnom priemere. Tyče=(a,b) 100 mm. Ak chcete optimalizovať zobrazenie tohto obrázka, pozrite si online verziu tohto článku na adresewww.kidney-international.org.

cistancheje dobré preobličky

Zrenie nefrónov je v Six{0}}Tfam chybné^-/-myši

Pretože môže trvať až niekoľko týždňov, kým sa u myší s tkanivovo špecifickou inaktiváciou Tfam rozvinie patológia,17 sme ďalej skúmali časový priebehobličkovévývoj choroby v šiestich2-Tfam^-/-myši. Odobrali sme obličky od kontrolných a mutantných myší vo veku P0, P7 a P14 a použili sme histologické metódy, imunofluorescenčné (IF) farbenie a analýzu génovej expresie v celkuobličkyvýpisy na posúdenie. Farbenie IF na SIX2 a E-kadherín vo veku P0 preukázalo, že obličky z kontroly a šesť2-Tfam^-/-boli histologicky podobné. Tvorba štruktúr kortikálnej nefrogénnej zóny, ako je mezenchým SIX2þ cap, E-kadherín – exprimujúce ureterické hroty a vznikajúce štruktúry nefrónu, ako napr.obličkovévezikuly a telá v tvare čiarky a písmena S neboli v Six blokované2-Tfam^-/-obličky (obrázok 2a). Tieto histologické nálezy boli v súlade s hladinami expresie génov kódujúcich nefrogénne markery. Hladiny mRNA Six2, párového boxu 2 (Pax2), LIM homeobox proteínu 1 (Lhx1) a spalt-like transkripčného faktora 1 (Sall1) sa medzi kontrolou a Six významne nelíšili2-Tfam^-/- celkovo myšiobličkyhomogenizuje z P0obličky(Obrázok 2b). To naznačuje, že inaktivácia TFAM v progenitoroch nefrónov SIX2 významne neovplyvnila tvorbu nefrogénnych štruktúr.

Hoci tvorba rodiacej sa štruktúry nefrónu nebola inhibovaná, farbenie alciánovou modrou/kyselinou jodistou – Schiffovým a lotosovým tetragonolobusovým lektínom indikovalo defektné dozrievanie terminálnych nefrónov v šiestich2-Tfam^-/-myši vo veku P{{0}}. Alciánová modrá/kyselina jodistá-Schiff, ktorá farbí tubulárne bazálne membrány a kefový lem, a lotosový tetragonolobus lektín, ktorý identifikuje špecifické oligosacharidy v kefovom lemovaní buniek proximálneho tubulu, boli v mutantných obličkách znížené. Obrázok 2c ukazuje farbenie alciánová modrá/kyselina jodistá – Schiff v časových bodoch P0, P7 a P14. Histochémia lektínu Lotus tetragonolobus a farbenie IF pre proteín Wilmsovho nádoru 1 v časových bodoch P{{1{13}}}}, P7 a P14 sú znázornené na doplnkovom obrázku S4. Vo veku P0 bola relatívna plocha pozitívne zafarbená lektínom lotosového tetragonolobusu 2,10 percent, 0,51 percent a {{30}},39 percent 0,1 percenta vo veku P7 oproti 6,25 percenta 0,28 percenta a 6,2 percenta 1,1 percenta pre kontroly (n ¼ 3–4, P ¼ 0,0004 a 0,0007, v uvedenom poradí; doplnkový obrázok S4). V súlade s týmito histologickými nálezmi je významný pokles expresie génov kódujúcich markery špecifické pre glomerulárne a nefrónové segmenty podocin, nefrín, akvaporín 1 (Aqp1), kotransportér fosforečnanu sodného 2a (NaPi2a), uromodulín, kotransportér chloridu sodno-draselného 2 ( Nkcc2) a kotransportér chloridu sodného citlivý na tiazidy (Ncc) v šiestich2-Tfam^-/-myši (obrázok 2b). Celkovo tieto údaje naznačujú, že šesť2-Tfam^-/- obličkyvykazujú progresívne znižovanie počtu zrelých proximálnych segmentov nefrónu a glomerulov.

Pretože aktivita Six2-eGFP/Cre vedie k segmentom nefrónu odvodeným od mezenchýmu s deficitom TFAM, predpokladali sme, že dozrievanie CD epitelových buniek, ktoré sú odvodené z ureterických pupenov, nebude ovplyvnené v Six{{2} }Tfam^-/-obličky. V súlade s touto predstavou je, že farbenie aglutinínom Dolichos biflorus, ktorý reaguje s N-acetyl-D-galaktózou v distálnom tubule a CD, naznačuje relatívne nadmerné zastúpenie aglutinín-pozitívnych štruktúr Dolichos biflorus v šiestich{3}}Tfam^-/-obličky. Vo veku P7 tvorili pozitívne zafarbené oblasti pre aglutinín Dolichos biflorus 13,91 percenta 0,9 percenta z celkovej plochy pre mutanty oproti 1,93 percenta 0,1 percenta pre kontrolu (n ¼ 3, P ¼ { {10}}.0002; doplnkový obrázok S4). Expresia mRNA epitelovej 1 alfa podjednotky sodíkového kanála (Scnn1a) alebo akvaporínu 2 (Aqp2), ktoré sú obidve exprimované v CD epitelových bunkách, nebola významne znížená v porovnaní s kontrolou (obrázok 2b). Na rozdiel od Six2-Tfam^-/-obličky, inaktivácia Tfam v progenitorových bunkách homeoboxu B7 (HOXB7), ktoré vedú k vzniku CD epitelových buniek, čo vedie k strate expresie CD nefrónového markera a miernej tubulárnej dilatácii, ale nie cystogenéze (doplnkový obrázok S5). Celkovo naše údaje naznačujú, že strata funkcie TFAM v progenitorových bunkách SIX2 neblokuje vývoj vznikajúcich nefrónových štruktúr, ale inhibuje dozrievanie terminálnych nefrónov.

Tfam^-/-cysty majú nedostatok bežných markerov segmentu nefrónu

Charakterizovať histogenetický pôvodTfam^-/- obličkovécysty, vykonali sme IF analýzyTfam^-/- obličkyat age P14 and examined the expression of nephron segment markers megalin (proximal tubule), uromodulin (medullary thick ascending limb of Henle), thiazide sensitive sodium chloride cotransporter (distal tubule), and aquaporin 2 (CD). The majority of cysts with a maximal diameter of >50 mm did not express these segment-specific markers, indicating a lack of cellular differentiation (Figure 3a, Supplementary Figure S6). Furthermore, approximately 50% of cysts with a maximal diameter of >50 mm boli charakterizované intraluminálnymi depozitmi uromodulínu, čo naznačuje pôvod zo segmentov nefrónu distálne od proximálneho tubulu a zostupnej slučky Henle (obrázok 3b).

Progresívne abnormality vo funkcii a morfológii mt vTfam^-/- epitelové bunky

Aby sme charakterizovali časový priebeh metabolických následkov delécie Tfam, najprv sme skúmali hladiny mRNA Tfam a TFAM-regulovaných mt-Co1, mt-Cyb a mt-Atp6 vTfam^-/- obličkyvo veku P0, P7 a P14. Ako sa očakávalo, hladiny mRNA Tfam, mt-Co1, mt-Cyb a mt-Atp6 boli významne znížené (obrázok 4a).Tfam^-/-epitelové bunky označené eGFP (šesť {{0}}} mT / mG; Tfam / myši) vykazovali významné zníženie expresie proteínu MT-CO1 (doplnkový obrázok S7). Počet kópií mt DNA sa znížil o 63 percent, čo je v súlade s vyčerpaním mt, čo je charakteristickým znakom nedostatku TFAM (obrázok 4a). Naproti tomu expresia jadrových génov kódujúcich nikotínamid adeníndinukleotid: jadrová podjednotka 3 ubichinón oxidoreduktázy (Ndufs3) a flavoproteínová podjednotka A sukcinátdehydrogenázového komplexu (Sdha) nebola ovplyvnená vo veku P0, ale bola znížená vo veku P7 a P14 (obrázok 4a). Tieto zistenia z analýzy génu mt a proteínu sú v súlade s progresívnou stratou počtu kópií mt v Tfam / epiteli.

Ďalej sme skúmali metabolické účinky inaktivácie Tfam v primárnych epiteliálnych bunkách proximálnych tubulov (PTEC) izolovaných vo veku P7.Tfam^-/- PTEC vykazovali významné zníženie bazálnej spotreby kyslíka (40.77 4.10 pre mutanty vs. 61.75 5.18 pmol/min/104 buniek pre kontroly, n=3 každý, P =0.034), dýchanie spojené s ATP (33.{12}}.91 pre mutanty vs. 46.92 4.91 pmol/min/104 buniek pre kontroly, n{{18} } každý, P=0.093), maximálne dýchanie (116.8 14.19 pre mutanty vs. 225.5 13.55 pmol/min/104 buniek pre kontroly, n{{ 28}} každý, P=0.005) a voľná respiračná kapacita (76.05 10.18 pre mutanty vs. 163.7 80,61 pmol/min/104 buniek pre kontroly , n =3 každého, P=0,003; Obrázok 4b).

Aby sme ďalej charakterizovali stupeň vyčerpania a poškodenia mt, skúmali smeTfam^-/- obličkypomocou transmisnej elektrónovej mikroskopie a {{0}}dimenzionálnej štruktúrovanej iluminačnej mikroskopie (3D SIM). Vo veku P7 vykazovali mitochondrie nepravidelné tvary a balóny, ktoré sú v súlade s predchádzajúcimi zisteniami u Tfam knockout myší. Transmisná elektrónová mikroskopická analýza ukázala, že štrukturálne abnormality mitochondrií, ako je zväčšenie veľkosti a abnormálne krísty, postupovali postnatálne, pretože morfologické rozdiely medzi mutantmi a kontrolou boli menej zjavné vo veku P0 a s vekom sa stávali závažnejšími (obrázok 4c ). 3D SIM sa použila na preskúmanie objemu mt a veľkosti siete v šiestich2-mT/mG; Tfam / mutanty v porovnaní so šiestimi2-kontrolnými myšami mT/mG vo veku P7; Objem mt sa meral v prierezoch 5 až 8 tubulov na sekciu, pričom sa skúmalo 25 až 4 0 eGFP-pozitívnych kortikálnych epiteliálnych buniek zafarbených na napäťovo závislý aniónovo selektívny kanál 1 farbením IF. Zistili sme, že celkový objem mt na eGFP pozitívnu bunku sa výrazne znížil (62.66 16,46 mm3/bunka pre mutanty vs. 177.4 300,17 mm3/bunka pre kontroly, každá n ¼ 3 , P ¼ 0.0289) a bola spojená so zmenou pomeru celkového objemu mt na celkový objem buniek z 0.230 0.01 v ovládacích prvkoch na 0.{{{101} 33}},016 v šiestich 2-Tfam / mutantoch (n ¼ 3 každý, P ¼ 0,0017; obrázok 4c). Maximálna veľkosť siete mt, ktorá meria najväčšiu sieť mt zaznamenanú vo všetkých skúmaných eGFP-pozitívnych bunkách, bola znížená v šiestich2-Tfam^-/- obličky(143.2 23.2 mm3 pre mutanty vs. 318.3 49.45 mm3 pre kontroly, n ¼ 3 každý, P ¼ 0,0327). Celkovo vzaté, ultraštrukturálne a SIM nálezy a zistenia z analýzy mt génu a proteínu sú v súlade s progresívnou stratou počtu kópií mt vTfam^-/- epitel.

Cistancheje dobré prepolycystické ochorenie obličiek

Nedostatok TFAM posúva metabolizmus renálneho epitelu smerom ku glykolýze

PTEC vobličkypoužívajú b-oxidáciu mastných kyselín a OXPHOS na tvorbu ATP a sú glukoneogenetické.18 Aby sme získali ďalšie poznatky o metabolických zmenách spojených s inaktiváciou Tfam, vykonali sme analýzu sekvenovania RNAobličkyod šiestich2-Tfam^-/-a Cre kontrolné myši z rovnakého vrhu vo veku P7. Zistili sme, že kľúčové regulačné gény zapojené do glykolýzy, ako je hexokináza 2 (Hk2) a enoláza 2 (Eno2), boli upregulované. Naopak, expresia väčšiny génov zapojených do cyklu trikarboxylových kyselín bola znížená (napr. izocitrátdehydrogenáza 1 [Idh1]), rovnako ako expresia génov zapojených do b-oxidácie mastných kyselín, ako je acetyl-koenzým A acyltransferáza 1B ( Acaa1b), acyl-koenzým A dehydrogenáza so stredne dlhým reťazcom (Acadm) (obrázok 5a a b, doplnkový obrázok S8). V súlade so zníženou expresiou génov zapojených do oxidačných génov cyklu trikarboxylových kyselín bola akumulácia neutrálnych lipidov, ako sa zistilo farbením olejovou červenou O v zmrazenom stave.obličkyrezy vo veku P14 (obrázok 5c).

Znížená expresia TFAM v myšacích a ľudských PKD tkanivách je spojená s depléciou mt

Pretože šesť2-Tfam^-/- obličkysa silne podobal na PKD(polycystické ochorenie obličiek) obličky, ďalej sme hodnotili, či bol TFAM dysregulovaný v PKD(polycystické ochorenie obličiek)tkanív. Najprv sme skúmali TFAM a TFAM regulovanú génovú expresiu v 2 dobre zavedených genetických modeloch myší PKD. Hladiny Tfam mRNA boli významne znížené v homogenátoch celých obličiek z Pkd^-/- a Cys^cpk/cpkmyši, ktoré nesú mutácie buď v PKD1(polycystické ochorenie obličiek)alebo Cys1. To bolo spojené so znížením expresie mitochondriálne a jadrovo kódovaných mt génov, ako aj s dysregulovanou expresiou glykolytického génu. Podobné ako Six2-Tfam^-/-obličky, PKD(polycystické ochorenie obličiek)^-/- a Cys^cpk/cpk obličkyboli charakterizované zvýšenými hladinami Eno2 a Hk2 a významne zníženými hladinami transkriptov fosfoglycerátkinázy (Pgk) 1, pyruvátdehydrogenázy kinázy (Pdk) 1 a Pdk4 (obrázok 6a). Expresia proteínu TFAM, ako bola hodnotená farbením IF, bola znížená v epiteliálnych bunkách lemujúcich cysty v porovnaní s epitelovými bunkami zo susedných necystických tubulov (obrázok 6b). To bolo spojené so zníženou expresiou mt-Co1 a mt-Atp6 fluorescenčnou in situ hybridizáciou RNA (obrázok 6b, doplnkový obrázok S9); Objem mt, stanovený pomocou 3D SIM, sa znížil o 55 percent v porovnaní s epitelovými bunkami zo susedných necystických tubulov alebo PTEC z normálnej kontrolyobličky. Rozdiely v objeme mt medzi normálnymi kontrolnými PTEC a PTEC z necystických tubulov sa nenašli (obrázok 6c).

Preskúmať, či je strata expresie TFAM bežnou molekulárnou črtou ľudskej PKD(polycystické ochorenie obličiek)analyzovali sme vzorky nefrektómie od 5 pacientov s ADPKD imunohistochémiou, farbením IF, fluorescenčnou in situ hybridizáciou RNA a 3D SIM. Znížená expresia TFAM bola pozorovaná u 75,2 percenta plus -7,5 percentaobličkovécysty analyzované imunohistochémiou. To súviselo so zníženou expresiou MT-CO1 a MT-ATP6 fluorescenčnou in situ hybridizáciou RNA (obrázok 7a, doplnkový obrázok S10); Objem mt v epiteliálnych bunkách výstelky cysty sa zmenšil približne o 70 percent, ako bolo hodnotené pomocou 3D SIM (obrázok 7b). Celkovo vzaté, analýza 2 PKD(polycystické ochorenie obličiek)myšacie modely a ľudské tkanivá ADPKD naznačujú, že nedostatok TFAM a deplécia mt sú bežné nálezy v PKD(polycystické ochorenie obličiek)tkanív a pravdepodobne ovplyvnia patogenézuobličkovécystická choroba.

cistanche je dobre napolycystické ochorenie obličiek

Diskusia

Kliknutím sem získate informácie o časti II (Diskusia) tohto článku.

Úryvok z: 'ObličkyNedostatok mitochondriálneho transkripčného faktora A cielený na epitel vedie k progresívnej mitochondriálnej deplécii spojenej so závažným cystickým ochorením (Ken Ishii1,2,11 et al.

---ObličkyInternational (2021) 99, 657–670