Bieliaci účinok novej zmesi peptidov reguláciou biogenézy melanozómu, prenosu a degradácie, časť 2

Zmes peptidov inhibuje expresiu faktorov súvisiacich s biogenézou melanozómu/transportom

Aby sa preskúmal mechanizmus depigmentačného účinku, ktorý ukazuje zmes peptidov, analyzovali sa hladiny expresie faktorov súvisiacich s melanogenézou a faktorov súvisiacich s transportom melanozómov.

Navyše,cistanchemá tiež funkciu podpory produkcie kolagénu, čo môže zvýšiť pružnosť a lesk pokožky a pomôcť opraviť poškodené kožné bunky.CistancheFenyletanolové glykozidy majú významný down-regulačný účinok na aktivitu tyrozinázy a účinok na tyrozinázu sa ukázal ako kompetitívna a reverzibilná inhibícia, čo môže poskytnúť vedecký základ pre vývoj a využitie bieliacich zložiek v Cistanche. pretocistanchemá kľúčovú úlohu pri bielení pokožky. Môže inhibovať produkciu melanínu, aby sa znížilo sfarbenie a matnosť; a podporujú tvorbu kolagénuzlepšiť pružnosť a žiarivosť pokožky. Vzhľadom na rozšírené uznanie týchto účinkov cistanche, mnohoprodukty na bielenie pokožkyzačali pridávať bylinné zložky, ako je Cistanche, aby uspokojili dopyt spotrebiteľov, čím zvýšili komerčnú hodnotu Cistanche vbielenie kožeProdukty. Stručne povedané, úloha cistanche vbielenie kožeje rozhodujúca. Jeho antioxidačný účinok a účinok na produkciu kolagénu môže znížiť zafarbenie a matnosť, zlepšiť elasticitu a lesk pokožky a tým dosiahnuť bieliaci účinok. Tiež široké uplatnenie Cistanche vbielenie kožeproduktov dokazuje, že jeho úlohu v komerčnej hodnote nemožno podceňovať.

Kliknite na Kde môžem kúpiť Cistanche of Whitening

Požiadajte o viac:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Ako je znázornené na obr. 2A, hladiny transkripcie MITF a jeho downstream génov, TYR, TYPR1 a TYRP2, boli znížené zmesou peptidov v bunkách B16F10. Okrem toho, -MSH-indukované proteínové hladiny MITF a tyrozinázy boli významne znížené zmesou peptidov v B16F10 bunkách (obr. 2B).

Tieto výsledky naznačujú, že k inhibičnému účinku zmesi peptidov na melanogenézu došlo inhibíciou expresie faktorov súvisiacich s melanogenézou.

Bolo publikované, že MITF pôsobí aj ako transkripčný faktor, ktorý aktivuje motorické proteíny, ktoré majú úlohu v transporte melanozómov [28,29]. Aby sme zistili, či zmes peptidov, ktorá má inhibičný účinok na expresiu MITF, znížila expresiu motorických proteínov, analyzovali sme hladiny mRNA a proteínov. Ako je znázornené na obr. 2C, hladiny transkripcie génov RAB27A, MLPH a MYO5A boli významne znížené zmesou peptidov v bunkách B16F10. Okrem toho, -MSH-indukované proteínové hladiny Rab27a a melanofilínu boli znížené zmesou peptidov v B16F10 bunkách (obr. 2D).

Tieto výsledky naznačujú, že inhibícia expresie MITF zmesou peptidov môže viesť k inhibícii transportu melanozómov.

Zmes peptidov inhibuje aktivitu MITF prostredníctvom regulácie fosforylácie CREB a ERK

Aby sme preskúmali mechanizmus účinku zmesi peptidov na expresiu MITF, analyzovali sme hladinu fosforylácie transkripčných a posttranslačných regulačných faktorov MITF.

Ako je znázornené na obr. 3A, fosforylovaný CREB, transkripčný faktor aktivujúci expresiu MITF, bol v závislosti od dávky znížený zmesou peptidov. Predtým sa zistilo, že aktivita MITF závisí od jeho posttranslačných modifikácií a degradácia proteínu MITF sprostredkovaná proteazómom môže byť indukovaná fosforylovaným ERK1/2 [30]. Zmes peptidov významne zvýšila hladinu p-ERK1/2 za podmienok stimulovaných a-MSH v bunkách B16F10 (obr. 3B).

Tieto výsledky naznačujú, že expresia a aktivita MITF môže byť znížená prostredníctvom regulácie fosforylácií CREB a ERK1/2 peptidovou zmesou.

Peptidová zmes potláča melanozómové vychytávanie HaCaT keratinocytov

Je známe, že melanozómy sa prenášajú z dendritických špičiek melanocytov na keratinocyty prostredníctvom fagocytózy keratinocytov. Aby sa zistilo, či by zmes peptidov mohla inhibovať prenos melanozómov na keratinocyty, keratinocyty HaCaT boli ošetrené zmesou peptidov v koncentráciách 10, 50, 100 a 200 M a ďalej ošetrené melanozómami izolovanými z buniek B16F10. Počet melanozómov prenesených do buniek bol v závislosti od dávky znížený zmesou peptidov (obr. 4A). Analýza obrazu pomocou farbenia Fontana-Masson ukázala, že distribúcia hnedo zafarbených melanozómov sa významne znížila v skupine liečenej zmesou peptidov spôsobom závislým od dávky (obr. 4B).

Okrem toho, expresia génu F2RL1 (PAR-2), receptora, ktorý reguluje fagocytózu keratinocytov, bola významne znížená zmesou peptidov za podmienok stimulovaných trypsínom (obr. 4C).

Tieto výsledky naznačujú, že zmes peptidov môže znížiť fagocytózu prostredníctvom inhibície expresie PAR-2 v keratinocytoch zmesou peptidov.

Zmes peptidov indukuje degradáciu melanozómov v keratinocytoch HaCaT

Je známe, že melanozómy prenesené do keratinocytov sú postupne eliminované kornifikáciou keratinocytov alebo degradované intracelulárnym autofagickým systémom. Aby sme zistili, či by zmes peptidov mohla podporovať degradáciu melanozómov, spracovali sme zmes peptidov na melanozóm obsahujúci keratinocyty HaCaT. Keď sa monitorovalo množstvo zostávajúcich melanozómov, bol pozorovaný od dávky závislý pokles z bunkového lyzátu ošetreného zmesou peptidov (obr. 5A). Obrazová analýza pomocou farbenia Fontana-Masson ukázala, že distribúcia hnedo zafarbených melanozómov sa významne znížila v skupine liečenej zmesou peptidov spôsobom závislým od dávky (obr. 5B).

Okrem toho, keď sa monitorovali hladiny proteínu súvisiaceho s autofagickou aktivitou v keratinocytoch, hladiny proteínov Beclin-1 a LC{2}}II o tvorbe autofagozómov sa zvýšili pôsobením zmesi peptidov, zatiaľ čo hladina proteínu p62 sa degradovala autofagolyzozómami bola znížená pôsobením zmesi peptidov (obr. 5C).

Tieto výsledky naznačujú, že zmes peptidov indukovala autofagickú aktivitu na podporu degradácie melanozómov v keratinocytoch.

Peptidová zmes vykazovala anti-pigmentačný účinok v modeli ekvivalentu kože

Uskutočnil sa experiment s použitím MelanoDerm, aby sa zistilo, či zmes peptidov môže viesť k antipigmentácii pokožky. Po topickom ošetrení lipozómu obsahujúceho 2,000 ppm zmesi peptidov v dávkach 50 a 100 g počas 2 týždňov sa uskutočnila svetelná mikroskopia. Tvorba tmavých melanozómov bola indukovaná výlučne v telách melanocytov a špičkách dendritov kontrolného tkaniva, zatiaľ čo celkové telá buniek boli svetlé s menším počtom dendritov, pretože produkcia melanínu bola inhibovaná v tkanive ošetrenom zmesou peptidov (obr. 6A ). Tiež obsahy melanínu boli v závislosti od dávky znížené zmesou peptidov, čo podporuje vizuálne pozorovanie (obr. 6B).

Okrem toho sa uskutočnila histológia na pozorovanie distribúcie melanínu v epiderme. Podľa výsledku kontrolné tkanivo vykazovalo výrazné zvýšenie melanogenézy v melanocytoch bazálnej vrstvy a hnedo sfarbený melanín bol pozorovaný v keratinocytoch v dôsledku sprievodného prenosu do blízkych keratinocytov. Značná hladina melanínu bola pozorovaná aj v horných zrohovatených vrstvách. Na druhej strane obsah melanínu v melanocytoch bol nízky v tkanivách ošetrených zmesou peptidov a v keratinocytoch a zrohovatených vrstvách bol pozorovaný významný pokles obsahu melanínu v porovnaní s kontrolnou skupinou (obr. 6C).

Tieto výsledky potvrdili významný antipigmentačný účinok zmesi peptidov na ekvivalenty pokožky.

DISKUSIA

Vývoj bieliacich materiálov bol zameraný hlavne na inhibíciu melanogenézy v melanocytoch prostredníctvom regulácie faktorov súvisiacich s melanogenézou [31-35]. Nedávno boli študované ďalšie ciele depigmentácie vrátane migrácie, prenosu a degradácie melanozómov a bolo identifikovaných niekoľko látok [36-42]. Pretože pigmentácia je akcia zahŕňajúca viacero mechanizmov, môže byť efektívne použiť kombináciu terapeutických činidiel, ktoré majú regulačné účinky pre každý cieľ.

Táto štúdia skúmala bieliacu aktivitu zmesi peptidov obsahujúcej štyri rôzne peptidy s rovnakým molárnym pomerom. Navrhovaný mechanizmus účinku zmesi peptidov proti biogenéze, prenosu a degradácii melanozómov je znázornený na obr. 7. V melanocytoch zmes peptidov inhibuje fosforyláciu CREB, čo vedie k zníženiu expresie MITF a indukuje fosforyláciu ERK1/2, čo vedie k fosforylácii MITF a degradácii proteazómov . V dôsledku toho je znížená expresia melanozómovej biogenézy a proteínov súvisiacich s transportom, vrátane tyrozinázy, TYRP1, TYRP2, Rab27A, melanofilínu a MYO5A. V keratinocytoch znižuje zmes peptidov expresiu PAR-2, ktorá sprostredkováva fagocytárnu schopnosť keratinocytov korelovanú s reorganizáciou aktínového vlákna. Okrem toho zmes peptidov aktivuje autofagický tok a prenesené melanozómy sa degradujú v autofagolyzozóme.

Peptidy boli rozsiahle skúmané ako aktívne zložky kozmetiky kvôli ich vysokej biokompatibilite a aktivite napodobňujúcej proteíny [43]. Majú však aj určité nevýhody v tom, že môžu byť ľahko degradované proteázami prítomnými v koži a nemôžu ľahko preniknúť do epidermy zloženej z lipidov kvôli ich hydrofilite [44]. Štúdie na zvýšenie stability peptidu navrhli metódy substitúcie aminokyselín na predpovedaných miestach štiepenia, acetyláciu N-konca a amidáciu C-konca [45]. Okrem toho existuje mnoho štúdií na zlepšenie transdermálnej penetrácie peptidov: metódy zahŕňajúce použitie induktorov penetrácie, ako sú alkoholy, azóny, hexanoáty a nenasýtené mastné kyseliny; spôsoby zahŕňajúce použitie špecifických peptidových sekvencií, ktoré uľahčujú permeáciu; spôsoby kombinovania lipofilných derivátov; a spôsoby zapuzdrenia peptidov, ako sú lipozómy, transferzómy, niozómy a etozómy [46-48]. V tomto ohľade sme pripravili lipozómy zapuzdrujúce zmes peptidov, aby sme otestovali jej bieliaci účinok na modeli ekvivalentného pokožke topickou liečbou a v skupine s testovanou lipozómovou liečbou sa preukázalo významné zníženie obsahu melanínu v epidermálnych vrstvách (obr. 6C).

Na záver, zmes peptidov z tejto štúdie vykazovala bieliaci účinok prostredníctvom rôznych účinkov, vrátane inhibície syntézy a migrácie melanínu, ako aj inhibície vychytávania melanozómov keratinocytmi a podpory degradácie melanozómov. Peptidová zmes z tejto štúdie by sa mohla použiť ako nový bieliaci materiál a lipozóm, ktorý uľahčuje stabilitu a penetráciu peptidov pokožkou, by sa mohol použiť na vývoj účinných bieliacich produktov.

POĎAKOVANIE

Táto štúdia bola vykonaná s podporou projektu World Class 300 R&D Project Ministerstva obchodu, priemyslu a energetiky (číslo projektu: S2641452).

KONFLIKT ZÁUJMOV

Autori nedeklarujú žiadny konflikt záujmov.

LITERATÚRA

1. Hirobe T. Keratinocyty regulujú funkciu melanocytov. Dermatol Sin. 2014; 32:200-204.

2. Hachiya A, Kobayashi A, Ohuchi A, Takema Y, Imokawa G. Parakrinná úloha signalizácie faktora kmeňových buniek/c-kitu pri aktivácii ľudských melanocytov pri pigmentácii indukovanej ultrafialovým žiarením B. J Invest Dermatol. 2001;116:578-586.

3. Hirobe T, Hasegawa K, Furuya R, Fujiwara R, Sato K. Účinky faktorov odvodených od fibroblastov na proliferáciu a diferenciáciu ľudských melanocytov v kultúre. J Dermatol Sci. 2013;71:45-57.

4. Schauer E, Trautinger F, Köck A, Schwarz A, Bhardwaj R, Simon M, Ansel JC, Schwarz T, Luger TA. Peptidy odvodené od proopiomelanokortínu sú syntetizované a uvoľňované ľudskými keratinocytmi. J Clin Invest. 1994; 93:2258-2262.

5. Chakraborty AK, Funasaka Y, Slominski A, Ermak G, Hwang J, Pawelek JM, Ichihashi M. Produkcia a uvoľňovanie peptidov odvodených od proopiomelanokortínu (POMC) ľudskými melanocytmi a keratinocytmi v kultúre: regulácia ultrafialovým žiarením B. Biochim Biophys Acta. 1996;1313:130-138.

6. Wakamatsu K, Graham A, Cook D, Thody AJ. Charakterizácia ACTH peptidov v ľudskej koži a ich aktivácia melanokortín-1 receptora. Pigment Cell Res. 1997; 10:288-297.

7. Imokawa G. Autokrinná a parakrinná regulácia melanocytov v ľudskej koži a pigmentové poruchy. Pigment Cell Res. 2004;17:96-110.

8. Chakraborty A, Slominski A, Ermak G, Hwang J, Pawelek J. Ultrafialové žiarenie B a hormón stimulujúci melanocyty (MSH) stimulujú produkciu mRNA pre alfa MSH receptory a peptidy odvodené od proopiomelanokortínu v myších melanómových bunkách a transformovaných keratinocytoch. J Invest Dermatol. 1995;105:655-659.

9. Khaled M, Larribere L, Bille K, Aberdam E, Ortonne JP, Ballotti R, Bertolotto C. Glykogénsyntáza kináza 3beta je aktivovaná cAMP a hrá aktívnu úlohu v regulácii melanogenézy. J Biol Chem. 2002;277:33690-33697.

10. Kim YM, Cho SE, Seo YK. Aktivácia melanogenézy pomocou signalizácie p CREB a MITF s extrémne nízkofrekvenčnými elektromagnetickými poľami na melanóme B16F10. Life Sci. 2016;162:25-32.

11. Kameyama K, Sakai C, Kuge S, Nishiyama S, Tomita Y, Ito S, Wakamatsu K, Hearing VJ. Expresia tyrozinázy, proteínov 1 a 2 súvisiacich s tyrozinázou (TRP1 a TRP2), proteínu striebra a melanogénneho inhibítora v ľudských melanómových bunkách s rôznymi melanogénnymi aktivitami. Pigment Cell Res. 1995; 8:97-104.

12. Van Gele M, Geusens B, Schmitt AM, Aguilar L, Lambert J. Knockdown izoforiem myozínu Va pomocou RNAi ako nástroj na blokovanie transportu melanozómov v primárnych ľudských melanocytoch. J Invest Dermatol. 2008;128:2474-2484.

13. Ohbayashi N, Fukuda M. Úloha GTPáz rodiny Rab a ich efektorov v melanozomálnej logistike. J Biochem. 2012;151:343-351.

14. Park JI, Lee HY, Lee JE, Myung CH, Hwang JS. Inhibičný účinok 2-metyl-nafto[1,2,3-de]chinolín-8-on na transport melanozómov a pigmentáciu kože. Sci Rep. 2016;6:29189.

15. Oberhofer A, Spieler P, Rosenfeld Y, Stepp WL, Cleetus A, Hume AN, Mueller-Planitz F, Ökten Z. Adaptérový proteín melanofilínu Myosin Va presadzuje výber stôp na mikrotubulových a aktínových sieťach in vitro. Proc Natl Acad Sci USA A. 2017;114:E4714-E4723.

16. Provance DW, James TL, Mercer JA. Melanofilín, produkt olovnatého lokusu, je potrebný na zacielenie myozínu-Va na melanozómy. Doprava. 2002;3:124-132.

17. Strom M, Hume AN, Tarafder AK, Barkagianni E, Seabra MC. Rodina Rab27-viažucich proteínov. Melanofilín spája funkciu Rab27a a myozínu Va pri transporte melanozómov. J Biol Chem. 2002;277:25423-25430.

18. Wu XS, Rao K, Zhang H, Wang F, Sellers JR, Matesic LE, Copeland NG, Jenkins NA, Hammer JA 3. Identifikácia organelového receptora pre myozín-Va. Nat Cell Biol. 2002;4:271-278.

19. Kuroda TS, Ariga H, Fukuda M. Aktín viažuca doména Slac2-a/melanofilínu je potrebná na distribúciu melanozómov v melanocytoch. Mol Cell Biol. 2003;23:5245-5255.

20. Cardinali G, Ceccarelli S, Kovacs D, Aspite N, Lotti LV, Torrisi MR, Picardo M. Keratinocytový rastový faktor podporuje prenos melanozómov do keratinocytov. J Invest Dermatol. 2005;125:1190-1199.

21. Epstein JH. Fotokarcinogenéza, rakovina kože a starnutie. J Am Acad Dermatol. 1983; 9:487-502.

22. Speeckaert R, Van Gele M, Speeckaert MM, Lambert J, van Geel N. Biológia hyperpigmentačných syndrómov. Pigment Cell Melanoma Res. 2014; 27:512-524.

23. Maymone MBC, Neamah HH, Secemsky EA, Vashi NA. Korelácia Dermatologického indexu kvality života a Dotazníka na hodnotenie vplyvu zmeny farby kože pri poruchách hyperpigmentácie. J Dermatol. 2018; 45:361-362.

24. Pillaiyar T, Manickam M, Namasivayam V. Činidlá na bielenie kože: perspektíva inhibítorov tyrozinázy z lekárskej chémie. J Enzyme Inhib Med Chem. 2017; 32:403-425.

25. Juhasz MLW, Levin MK. Úloha systémovej liečby na zosvetlenie pokožky. J Cosmet Dermatol. 2018; 17:1144-1157.

26. Zhang L, Falla TJ. Kozmeceutiká a peptidy. Clin Dermatol. 2009; 27:485-494.

27. Reddy B, Jow T, Hantash BM. Bioaktívne oligopeptidy v dermatológii: časť I. Exp Dermatol. 2012; 21:563-568.

28. Chiaverini C, Beuret L, Flori E, Busca R, Abbe P, Bille K, Bahadoran P, Ortonne JP, Bertolotto C, Ballotti R. Transkripčný faktor spojený s mikroftalmiou reguluje expresiu génu RAB27A a riadi transport melanozómov. J Biol Chem. 2008;283:12635-12642.

29. Alves CP, Yokoyama S, Goedert L, Pontes CLS, Sousa JF, Fisher DE, Espreafico EM. Gén MYO5A je cieľom MITF v melanocytoch. J Invest Dermatol. 2017;137:985-989.

30. Hartman ML, Czyz M. MITF pri melanóme: mechanizmy jeho expresie a aktivity. Cell Mol Life Sci. 2015;72:1249-1260.

31. Lajis AFB, Ariff AB. Objav nových depigmentačných zlúčenín a ich účinnosť pri liečbe hyperpigmentácie: dôkazy zo štúdie in vitro. J Cosmet Dermatol. 2019; 18:703-727.

32. Garcia-Jimenez A, Teruel-Puche JA, Berna J, Rodriguez-Lopez JN, Tudela J, Garcia-Canovas F. Účinok tyrozinázy na alfa a beta arbutín: kinetická štúdia. PLoS One. 2017;12:e0177330.

33. Yu JS, Kim AK. Účinok kombinácie taurínu a kyseliny azelaovej na antimelanogenézu v bunkách myšacieho melanómu. J Biomed Sci. 2010;17(Suppl 1):S45.

34. Lee CS, Jang WH, Park M, Jung K, Baek HS, Joo YH, Park YH, Lim KM. Nový adamantylbenzylbenzamidový derivát, AP736, potláča melanogenézu prostredníctvom inhibície cAMP-PKA CREB-aktivovaného transkripčného faktora spojeného s mikroftalmiou a expresie tyrozinázy. Exp Dermatol. 2013; 22:762-764.

35. Huang HC, Chang SJ, Wu CY, Ke HJ, Chang TM. [6]-Shogaol inhibuje melanogenézu indukovanú -MSH prostredníctvom zrýchlenia degradácie MITF sprostredkovanej ERK a PI3K/Akt. Biomed Res Int. 2014;2014:842569.

36. Kim B, Lee JY, Lee HY, Nam KY, Park J, Lee SM, Kim JE, Lee JD, Hwang JS. Hesperidín potláča transport melanozómov blokovaním interakcie Rab27A-melanofilín. Biomol Ther (Soul). 2013; 21:343-348.

37. Chang H, Choi H, Joo KM, Kim D, Lee TR. Manassantin B inhibuje transport melanozómov v melanocytoch narušením interakcie melanofilín-myozín Va. Pigment Cell Melanoma Res. 2012; 25:765-772.

38. Makino-Okamura C, Niki Y, Takeuchi S, Nishigori C, Declercq L, Yaroch DB, Saito N. Heparín inhibuje vychytávanie melanozómov a zápalovú odpoveď spojenú s fagocytózou prostredníctvom blokovania signálnych dráh PI3k/Akt a MEK/ERK v ľudských epidermálnych keratinocytoch . Pigment Cell Melanoma Res. 2014; 27:1063-1074.

39. Seiberg M, Paine C, Sharlow E, Andrade-Gordon P, Costanzo M, Eisinger M, Shapiro SS. Proteázou aktivovaný receptor 2 reguluje pigmentáciu prostredníctvom interakcií keratinocyt-melanocyt. Exp Cell Res. 2000;254:25-32.

40. Murase D, Hachiya A, Takano K, Hicks R, Visscher MO, Kitahara T, Hase T, Takema Y, Yoshimori T. Autofágia má významnú úlohu pri určovaní farby kože reguláciou degradácie melanozómov v keratinocytoch. J Invest Dermatol. 2013;133:2416-2424.

41. Kim ES, Shin JH, Seok SH, Kim JB, Chang H, Park SJ, Jo YK, Choi ES, Park JS, Yeom MH, Lim CS, Cho DH. Autofágia sprostredkováva antimelanogénnu aktivitu 3'-ODI v bunkách melanómu B16F1. Biochem Biophys Res Commun. 2013;442:165-170.

42. Li L, Chen X, Gu H. Signalizácia zapojená do autofagického aparátu v keratinocytoch a terapeutické prístupy pre kožné ochorenia. Oncotarget. 2016; 7:50682-50697.

43. Schagen SK. Lokálne peptidové ošetrenia s účinnými výsledkami proti starnutiu. Kozmetika. 2017;4:16.

44. Reddy BY, Jow T, Hantash BM. Bioaktívne oligopeptidy v dermatológii: časť II. Exp Dermatol. 2012; 21:569-575.

45. Strömstedt AA, Pasupuleti M, Schmidtchen A, Malmsten M. Hodnotenie stratégií na zlepšenie proteolytickej rezistencie antimikrobiálnych peptidov pomocou variantov EFK17, vnútorného segmentu LL- 37. Antimikrobiálne látky Chemother. 2009;53:593-602.

46. ​​Pai VV, Bhandari P, Shukla P. Topické peptidy ako kozmeceutiká. Indian J Dermatol Venereol Leprol. 2017; 83:9-18.

47. Marepally S, Boakye CH, Shah PP, Etukala JR, Vemuri A, Singh M. Návrh, syntéza nových lipidov ako zosilňovačov chemickej permeácie a vývoj systému nanočastíc na transdermálne podávanie liečiv. PLoS One. 2013;8:e82581.

48. Kalluri H, Banga AK. Transdermálne podávanie proteínov. AAPS PharmSciTech. 2011;12:431-441.

Požiadajte o viac: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501