Aktivita xantín oxidoreduktázy v plazme chudobnej a bohatej na krvné doštičky ako indikátor oxidačného stresu u pacientov, ktorí potrebujú substitučnú terapiu obličiek

Abstraktné pozadie: Xantín oxidoreduktáza(XOR) je enzým hydroxyláza zapojený do metabolizmu purínov. Aktivita XOR sa môže meniť: homodimérny proteín sa môže premeniť na dve rôzne izoformy XD (antioxidant) a XO (prooxidant). Oxidačný stres a zápaly, ktoré sprevádzajúchronické ochorenie obličiek(CKD), dialýza a transplantácia obličky viedli k aktivácii krvných doštičiek. Cieľom tejto štúdie bolo zistiť vplyv aplikovanej renálnej substitučnej terapie na xantínoxidoreduktázu a jej izoformnú aktivitu.

Materiál a metódy: Študijnú skupinu tvorilo 117 pacientov rozdelených do 4 skupín: hemodialyzovaní - 30 pacienti, peritoneálni dialyzovaní - 30 pacienti, pacienti po transplantácii obličky - 27 a konzervatívna liečba {{5} } pacientov. Kontrolnú skupinu tvorilo 30 zdravých dobrovoľníkov. Výsledky: V rámci sledovaných skupín boli zistené signifikantné rozdiely v aktivite XOR v plazme chudobnej na doštičky (PPP) (p=0.001). Existuje vzťah medzi typom renálnej substitučnej terapie všetkých izoforiem oxidoreduktázy v PPP (s<0.001 all isoforms) and XD (p=0.008), XO (p<0.001) in platelet-rich plasma (PRP). A relationship was observed between the activity of all oxidoreductase isoforms in PPP and PRP, the type of renal replacement therapy the duration of dialysis, and the age of patients. Thepríčinou chronického ochorenia obličieksa prejavilo aj v rozdieloch v aktivite XD a XO v PPP.

Záver: Typ renálnej substitučnej terapie používanej u pacientov s CKD, vek pacientov, dĺžka dialýzy, príčiny CKD a štádium progresie významne ovplyvňujú aktivitu XOR a jej izoforiem.

Kľúčové slová: Xantín oxidoreduktáza, Krvné doštičky, Renálna substitučná liečba,Chronické ochorenie obličiek, Antioxidačné enzýmy

AKO DLHO TRVÁ, KÝM CISTANCHE PÔSOBÍ?

Pozadie

Xantín oxidoreduktáza (XOR) je hydroxylázový enzým, ktorý sa podieľa na metabolizme purínov. Katalyzuje oxidáciu hypoxantínu na xantín a xantínu na kyselinu močovú (UA). Aktivita XOR sa môže meniť: homodimérny proteín sa môže premeniť na dve rôzne izoformy. Xantíndehydrogenáza (XD) je exprimovaná prevažne v zdravom tkanive a xantínoxidáza (XO) je generovaná posttranslačnou modifikáciou XD, oxidáciou cysteínových zvyškov, ako aj obmedzenou proteolýzou, ktorá hrá dominantnú úlohu v bunkách a tkanivách počas poranení [1–3 ]. Aktivity spomínaných izoforiem stoja proti sebe [4]. XOR pôsobí v prítomnosti NAD+ ako dehydrogenáza a s molekulárnym kyslíkom ako oxidáza. Schopnosť XOR rýchlo sa konvertovať z antioxidantu na oxidant pri rôznych typoch poškodenia tkaniva je základným prvkom pre rýchlu vrodenú imunitnú odpoveď, prospešnú napríklad pri bakteriálnej alebo plesňovej infekcii [5].

Reakčné medziprodukty xantíndehydrogenázy (XDO) a kyslíka môžu reagovať s NAD+ aj s O2, ale vykazujú vyššiu afinitu k NAD+ [6]. Táto medziproduktová izoforma nebola izolovaná, ale stanovenie jej aktivity uľahčuje sledovanie transformácie XD na XO [7].

Aktivita XOR v sére pri rôznych ochoreniach bola široko skúmaná. Dôvodom záujmu o tento enzým je dualizmus jeho pôsobenia: schopnosť produkovať antioxidanty a na druhej strane tvorba reaktívnych foriem kyslíka. K zvýšeniu aktivity XOR dochádza pri patologických stavoch, ako je vírusová hepatitída, infekčná mononukleóza, autoimunitné ochorenia, pneumónia, schizofrénia a diabetes typu II. Zvýšenie aktivity XOR sa pozoruje aj v sére pacientov po transplantácii obličky alebo pečene [8]. Ukázalo sa, že gén kódujúci XOR môže byť zodpovedný za dozrievanie obličiek a adipogenézu v obličkách a môže brániť transformácii epitelových buniek na mezenchymálne tkanivo [9]. Avšak vzhľadom na naše najlepšie znalosti neexistujú žiadne publikované správy, ktoré by skúmali aktivitu XOR v plazme chudobnej na krvné doštičky (PPP) a plazme bohatej na krvné doštičky (PRP) u pacientov podstupujúcich terapiu náhrady obličiek. Význam aktivity XOR u tejto skupiny pacientov súvisí so zvýšenou aktiváciou krvných doštičiek, ktorá je spôsobená oxidačným stresom a zápalom, ktorý sprevádza chronické ochorenie obličiek (CKD), dialýzu a transplantáciu obličky. Okrem toho sa počas dialýzy a transplantácie orgánov poškodzujú tkanivá a krvné cievy a krvné doštičky sú prvými bunkami, ktoré sa dostanú do miesta poškodenia tkaniva, aktívne sa podieľajú na počiatočných štádiách zápalového procesu a hojenia [10].

PRP a PPP sú frakcie krvnej plazmy s rôznymi koncentráciami krvných doštičiek. Obsah krvných doštičiek v PRP a PPP je počet krvných doštičiek/ml a krvných doštičiek/ml. PPP a PRP sa získavajú opakovaným odstreďovaním a premývaním celej krvi ľudí pri rôznych rýchlostiach odstreďovania [11, 12].

PPP, ako vedľajší produkt odstreďovania antikoagulovanej krvi, má nižšiu koncentráciu krvných doštičiek ako normálna krv. Hlavnými zložkami PPP sú fibrinogén, fibronektín a trombín. Biologické účinky PPP sa zúčastňujú na hemostáze a koagulácii, pôsobia ako vektor prichytenia buniek a podporujú mitózu fibroblastov a epitelových buniek [13]. Hoci PPP nie je tak koncentrovaný v krvných doštičkách ako PRP, ukázalo sa, že PPP môže tiež udržiavať rast a prežitie buniek. PPP podporuje bunkové funkcie spojené s hojením rán a urýchľuje migráciu buniek a proliferáciu fibroblastov [14, 15]. Plazma bohatá na krvné doštičky má koncentrovanejšie krvné doštičky ako normálna plazma (približne 150–400 × 103 buniek/dl). Je to jedna z najbežnejších definícií PRP v literatúre [16]. Doteraz obmedzené štúdie charakterizovali XOR a jeho izoformnú aktivitu v plazme bohatej alebo chudobnej na krvné doštičky u pacientov trpiacich chronickým ochorením obličiek. Tan a kol. ukázali, že bunky poškodené reaktívnymi druhmi kyslíka (ROS) (v prípade chronickej renálnej substitučnej terapie) „unikajú“ izoformy XOR, čo vedie k zvýšeniu hladiny enzýmu v plazme [17]. Tento mechanizmus vysvetľuje nižšiu aktivitu XOR a jeho izoforiem v krvných doštičkách v porovnaní s PPP. Preto je aktivita oxidoreduktáz v PPP a PRP veľmi zaujímavá, pretože by mohli pomôcť odhaliť bunkové procesy, ktoré sa vyskytujú denne, sis. Takéto výskumy by tiež mohli nepriamo zdôrazniť závažnosť oxidačného stresu u tejto skupiny pacientov.

Berry a kol. opisujú tiež, že xantín oxidoreduktáza je distribuovaná v pečeni, tenkom čreve, mliečnej žľaze a endotelových bunkách. Metódy subcelulárnej lokalizácie preukázali prítomnosť xantín oxidoreduktázy v cytoplazme aj na bunkových membránach. Tiež naznačujú, že plazmatická xantínoxidoreduktáza môže byť spôsobená zatienením xantínoxidoreduktázy z bunkových membrán alebo presakovaním z cytoplazmy. To je jeden z dôvodov, prečo testujeme aktivitu XOR v PPP a PRP, aby sme rozlíšili aktivitu enzýmu v krvných doštičkách a iných krvinkách obsiahnutých v plazme [18]. Na základe aktivity antioxidačných enzýmov vieme určiť aj to, pri ktorom type renálnej substitučnej terapie je menej pravdepodobné, že bude pacient vystavený oxidačnému stresu. Vzhľadom na duálny charakter XOR môže byť pochopenie vzťahu medzi typom renálnych substitučných terapií a aktivitou izoforiem XOR veľmi zaujímavé a nápomocné pri výbere typu renálnej substitučnej terapie.

Materiály a metódy

Etický súhlas a súhlas

Bioetická komisia na Pomoranskej lekárskej univerzite v Štetíne schválila uskutočnený výskum (č. KB−0012/36/11). Všetci účastníci, vrátane zdravých dobrovoľníkov v kontrolnej skupine, boli informovaní o účele a rozsahu štúdie a súhlasili s darovaním vzoriek a zverejnením výsledných údajov.

Študijná skupina

Zúčastnilo sa 147 účastníkov: kontrolná skupina 30 zdravých dobrovoľníkov (NK) a 117 pacientov s chronickým ochorením obličiek (CKD), ktorí navštevovali kliniku nefrológie, transplanetológie a interných chorôb Pomoranskej lekárskej univerzity v Štetíne. Tí pacienti boli rozdelení do 4 skupín na základe liečby, ktorú dostávali: 30 pacientov pred a po hemodialýze (HD A a HD B): 30 pacientov dostalo peritoneálnu dialýzu (PD); 27 pacientov pred a po transplantácii obličky (5–7 dní po operácii) (TE, TE A); 30 pacientov dostalo konzervatívnu liečbu (CT) (CKD štádium 2–5). Pohlavie, vek, trvanie dialýzy, príčina a štádium chronického ochorenia obličiek a koncentrácia kreatinínu v testovanej a kontrolnej skupine sú uvedené v tabuľkách 1 a 2.

Vzorky

Všetkým účastníkom štúdie sa odobrali vzorky krvi (K2EDTA (8 ml), 3,8 % citrát trisodný (9:1; v/v) a sérum (8 ml)). Hemodialyzovanému pacientovi bola odobratá krv z arteriovenóznej fistuly; u všetkých ostatných účastníkov sa použila periférna venepunkcia. Vzorky boli odobraté hemodialyzovaným pacientom pred (HD A) a asi 10 minút po zastavení pumpy (HD B). Krv transplantovaných pacientov bola odobratá pred transplantáciou (TE) a 5–7 dní po operácii (TE A). Pacienti zaradení do skupiny TE nepatrili v tejto štúdii do skupiny pacientov s hemodialýzou alebo peritoneálnou dialýzou. Boli to pacienti kvalifikovaní na transplantáciu z celého Poľska. Veľká väčšina pacientov s transplantáciou obličky mala predchádzajúcu modálnu analýzu. K2EDTA a vzorky zrazenej krvi sa centrifugovali pri 2600 ot./min. počas 10 minút pri 20 stupňoch, aby sa získala plazma a sérum. Na získanie plazmy bohatej na krvné doštičky (PRP) a plazmy chudobnej na krvné doštičky (PPP) sa krv odobratá s citrátom centrifugovala za podmienok pri 1100 ot./min. počas 10 minút pri 20 stupňoch. Výsledná PRP bola prenesená do novej skúmavky a centrifugovaná pri 6000 otáčkach za minútu počas 10 minút pri 20 stupňoch: plazma chudobná na doštičky (PPP) bola prenesená do samostatnej skúmavky; peleta krvných doštičiek sa dvakrát premyla a suspendovala v pufri Tyroda (pH 7,4). Plazma, sérum, PPP a PRP boli zmrazené na -80 stupňov, kým sa nevykonali testy. U hemodialyzovaných pacientov sa krv odoberala pred podaním heparínu a po dialýze trvajúcej v priemere 4–5 hodín (polčas heparínu - 4 h), aby sa eliminoval akýkoľvek možný vplyv heparínu na aktivitu XOR.

Aktivita xantín oxidoreduktázy v plazme a krvných doštičkách chudobných na krvné doštičky

Stanovenia sa uskutočnili pomocou spektrofotometra Perkin Elmer UV/VIS Lambda 40P. Extinkčné zmeny sa zaznamenávali pri 340 nm (XD) a 302 nm (XDO, XO) počas 5 minút pri 30 stupňoch. Enzymatická aktivita bola meraná ako tvorba kyseliny močovej a NADH (zvýšenie A340 a A302) a vyjadrená v mU x ml-1 (milijednotky na mililiter). Enzymatická aktivita sa vypočítala s prihliadnutím na počiatočné rýchlosti reakcie. Tvorba kyseliny močovej sa merala pri 302 nm (izoformy XDO a XO), pretože jej absorbancia je tam stále vysoká, zatiaľ čo zmeny koncentrácie NAD+ neprispievajú. Na výpočet aktivity izoforiem xantínoxidoreduktázy NADH+ H+ sa použil extinkčný koeficient pre NADH+ H+ ε340=6,22×103 [L∙mol−1 cm−1 ]: ε302=2,30×103 [ L∙mol−1 cm−1] [7, 19–22].

Tabuľka 1 Všeobecné charakteristiky hemodialyzovaných pacientov (HD), peritoneálnej dialýzy (PD) liečených konzervatívne (CKD), transplantácie obličky (TE) a kontrolnej skupiny (C), ktorí sa zúčastnili štúdie (priemer ± SD)

P * - štatistická významnosť pre rozdiely medzi HD, PD a CKD skupinami, TE a C exaktný Fisherov test pre kvalitatívne premenné; pre kvantitatívne premenné - jednosmerná ANOVA a; P ** - štatistická významnosť pre rozdiely medzi HD, PD a CKD skupinami a TE presný Fisherov test pre kvalitatívne premenné pre kvantitatívne premenné jednosmerná ANOVA alebo; DM - diabetická nefropatia; HA - hypertenzia; GIK - glomerulárne zápal obličiek; ADPKD - polycystická choroba obličiek dedičná autozomálne dominantná; NS - žiadne štatisticky významné rozdiely.

Tabuľka 2 Všeobecná charakteristika hemodialyzovaných pacientov (B - pred HD, A - po), peritoneálnej dialýzy (PD) liečených konzervatívne (CKD) pred a po transplantácii obličky (TE B a TE A) a kontrolnej skupiny (NK) zúčastňujúcich sa na štúdia (priemer ± SD)

P * - štatistická významnosť pre rozdiely medzi HD A, HD B, PD a CKD skupinami, TE a C pre kvantitatívne premenné - Kruskal Wallis ANOVA, jednosmerná ANOVA alebo Studentov t-test P ** - štatistická významnosť pre rozdiely medzi HD A , HD B, PD a CKD a TE skupiny pre Kruskal Wallisove kvantitatívne premenné ANOVA alebo ANOVA jednosmernú analýzu Kt / V - dialyzačný index (objemová frakcia V purifikovaná klírensom K v čase t) NS neboli zistené žiadne štatisticky významné vzťahy

Štatistická analýza Na posúdenie distribúcií bol použitý KS test (Kolmogorov-Smirnov), ktorý v prípade niektorých premenných (aktivita izoforiem XD a XDO v PRP) ukázal nenormálne rozdelenie parametrov. Na analýzu kvantitatívnych údajov sa použili presné Fisherove a Chí-kvadrátové testy. Pomocou Studentovho t-testu a analýzy ANOVA pre jednorozmerné systémy boli vyhodnotené rozdiely medzi asociovanými (párovými) a nesúvisiacimi (nepárovými) premennými v prípade premenných s normálnym rozdelením. V prípade premenných s nenormálnym rozdelením bola vykonaná analýza Kruskal-Wallis ANOVA na vyhodnotenie rozdielov medzi parametrami, ako aj Mann-Whitney U neparametrický test pre nepárové dáta alebo Wilcoxon pre párové dáta. Na stanovenie viacfaktorového hodnotenia vzťahov medzi študovanými parametrami bol použitý lineárny viacnásobný regresný model. Štatistická analýza výsledkov sa uskutočnila pomocou programu Statistica 12 (StatSoft).