Biochemické a histopatologické reakcie Biomphalaria Alexandrina na RIPEX (regulátor rastu rastlín)Ⅱ

3 Výsledky

3.1 Toxicita RIPEX

Výsledky toxicity lieku RIPEX pre Biomphalaria alexandrina po 1 dni ukázali, že hodnoty LC50 a LC90 boli 39.9 5 a 73,6 µL/l, v uvedenom poradí. Subletálne koncentrácie Te LC10 a LC20 boli 8 a 16 ul/l (tabuľka 1 a obr. 1).

3.2 Účinok RIPEX na markery oxidačného stresu

Expozícia RIPEX-u ovplyvnila aktivity SOD a GST a hladiny MDA v tráviacej žľaze B. Alexandriny (tabuľka 2). Slimáky vystavené RIPEX pri 8 µL/l vykazovali nevýznamné zvýšenie (p=0.6) v aktivite SOD v porovnaní s kontrolnými slimákmi. Avšak slimáky B. alexandrina vystavené 16 µL/l počas 7 dní vykazovali významné zníženie aktivity SOD (p=0.05). Aktivita GST sa významne zvýšila (p menšie alebo rovné 0,001) po vystavení obom koncentráciám. Najvyšší nárast bol zaznamenaný u slimákov vystavených 16 µl/l počas 1 dňa (39,7±3,2 U/mg) a najvyššia hodnota pri koncentrácii 8 µl/l bola (33,7±1,7 U/mg) po 7 dňoch v porovnaní s kontroly pri 17,1 ± 3,6 U/mg (po 1 dni) a 22,6 ± 1,3 U/ mg (po 7 dňoch).

Kliknutím získate cistanche benefity pre testosterón

V závislosti od časových intervalov spôsobila expozícia počas 7 dní významný nárast (p=0.0{{20}}3). Vystavenie rôznym koncentráciám RIPEX spôsobilo významné zvýšenie (p menšie alebo rovné 0,04) hladín MDA. Koncentrácia 8 ul/l zvýšila hladinu MDA (45,06±4,1) v porovnaní s kontrolou (16,4±2,1). V závislosti od času expozície boli hladiny MDA 45,06 ± 4,1 a 56,1 ± 0,7 nmol/g pri koncentráciách, 8 a 16 ul/l, v danom poradí, v porovnaní s 13,5 ± 0,7 nmol/g pre kontrolu (tabuľka 2).

3.3 Účinok RIPEXU na aktivitu steroidných hormónov

Expozícia 16 µL/l spôsobila významné zvýšenie koncentrácie testosterónu (52,6±2,5 nmol/l) (p=0,002) v porovnaní s kontrolou (34,6±2,3 nmol/l). Zatiaľ čo koncentrácia 8 µL/L RIPEX spôsobila významný nárast (p=0.005) testosterónu po 3 dňoch expozície v porovnaní s 16 µL/L. V závislosti od časových intervalov neexistuje žiadny význam okrem významného poklesu koncentrácie testosterónu, ku ktorému došlo po 7 dňoch (19,6±2 nmol/l) expozície (p=0,003) v porovnaní s 3 dňami (47,3± 6 nmol/l). Čo sa týka estradiolu, došlo k významnému zvýšeniu (p=0,003) koncentrácie hormónu po 3 dňoch expozície 16 µl/l (73,6±3,5 pg/ml v porovnaní s kontrolou (43,3 pg/ml) a 7 dní expozície 8 ul/l (56,3 ± 1,5 pg/ml v porovnaní s kontrolou (50,3 ± 5,6 pg/ml) (obr. 2, b).

3.4 Účinok RIPEXu na imunitne potenciálne enzýmy

Vystavenie B. Alexandrina dvom koncentráciám RIPEX spôsobilo významné zvýšenie aktivity enzýmu MPO (obr. 3a) v závislosti od času expozície po 3 dňoch (p=0.0{ {35}}4) a 7 dní (p=0.01). Expozícia 8 µL/L RIPEX významne zvýšila aktivitu MPO (55,3±4,8 mU/mg proteínu (p=0,004) v porovnaní s 15,4±1,2 mU/mg pre kontrolu. Zatiaľ čo 16 µL/l vystavených u slimákov bola aktivita (53,03 ± 2,3 mU/mg proteínu a 73,9 ± 2,8 mU/mg proteínu, p menšie alebo rovné 0,05). Tiež koncentrácia 16 µl/l spôsobila významný nárast (p=0 0,05) v aktivite v porovnaní s 8 µl. Obe koncentrácie (8 a 16 µl/l) významne zvýšili (p menšie alebo rovné 0,009) aktivitu ADA v porovnaní s kontrolou (obr. 3b) po celú dobu bodov. Nárast aktivity pri koncentrácii 16 µL/L. V závislosti od časových intervalov zaznamenala expozícia počas 7 dní významný nárast v porovnaní s 1 dňom a 3 dňami (p menšie alebo rovné 0,05). aktivita po 7 dňoch bola 27,03±14 a 74,3±1,9 U/mg proteínu

3.5 Diferenciálny počet hemocytov

Vyšetrenie vzoriek hemolymfy zo slimákov B. alexandrina poukázalo na tri morfologicky odlišné typy hemocytov; hyalinocyty, okrúhle malé a rozširujúce sa hemocyty. Hyalinocyty sú charakteristické svojim kruhovým tvarom, čírou, hustou bunkovou membránou a veľkým pomerom jadra k cytoplazme. Predstavuje to vysoký počet v kontrolnej skupine (56,3±0,5, 1 deň). Malé okrúhle bunky sú stredné bunky s malým počtom cytoplazmatických granúl a bez pseudopódií. Rozširujúce sa hemocyty majú rôzne veľkosti, s malým jadrom a veľkými cytoplazmatickými granulami. Sú to fagocytárne bunky, pretože môžu vytvárať málo a krátko sa šíriace pseudopódie. Expozícia dvom koncentráciám RIPEX zvýšila počet hemocytov a významné zvýšenie bolo pozorované v granulocytoch slimákov vystavených koncentrácii 8 µL/L (p=0.02) a 16 µL/L (p{{12 }}.006) počas 1, 3 a 7 dní v porovnaní s kontrolou. (Tabuľka 3). Liečba spôsobila niektoré morfologické abnormality v hemocytoch, ako sú hyalinocyty s predĺžením filopódií, deformované granulocyty s vakuolami a šíriace sa filopódie (obr. 4).

3.6 Účinok RIPEXu na histopatológiu tráviacich žliaz a ovotestes

Tráviace žľazy B. Alexandrina sú zložené z tubulov a každý tubul pozostáva z jednej vrstvy stĺpcových epitelových buniek diferencovaných na tráviace a sekrečné bunky, ktoré sú usporiadané okolo centrálneho lúmenu (obr. 5a). Te tubuly sú navzájom spojené spojivovým tkanivom. Expozícia lieku RIPEX spôsobila určité zmeny, ako je degenerácia spojivového tkaniva. Slimáky vystavené 8 ul/l vykazovali prítomnosť bunkových bublín, ktoré indikujú smrť buniek a upchanie lúmenu. Pozorovala sa nestrávená potrava (obr. 5b–d). Slimáky vystavené 16 ul/l vykazovali degeneráciu vystlaných buniek s niektorými patologickými znakmi, ako je vakuolizácia a dilatácia lúmenu. Tubul sa poškodil, zdeformoval a nekrotizoval (obr. 5e, f).

Ovotestis kontrolných slimákov B. alexandrina pozostáva z niekoľkých acini spojených spojivovým tkanivom. Každý acinus je lemovaný zárodočným epitelom zloženým z rôznych štádií spermatogónie a oogónie. Tey sa diferencuje na primárne, sekundárne a jeden alebo dva zrelé oocyty (oogónia). Zrelé spermie sa nachádzajú v skupinách vo vnútri acinusu (obr. 6a). Histologická štruktúra ovotestis exponovaných slimákov sa zmenila po 7 dňoch expozície RIPEXu. U slimákov vystavených 8 µl/l sa pozoroval zvyšujúci sa počet spermií, nekrotické spermie a atrofia. Deformácia mužských alebo ženských gametocytov a degenerácia acini boli tiež hojné. Tiež expozícia 16 µL/l spôsobila, že acini viac degenerovali a zvýšila sa nekróza (obr. 6b–e).

4. Diskusia

V poľnohospodárskych postupoch sa PGR široko používajú. Tieto látky majú množstvo škodlivých účinkov na živé organizmy. Cieľom tejto štúdie bolo posúdiť toxikologické účinky RIPEXu (organofosforový pesticíd obsahujúci etefón obsahujúci 48 percent etefónu ako aktívnej zložky plus 52 percent inertných zložiek). Testy toxicity RIPEX s B. Alexandrina ukázali, že 1-deň hodnoty LC50 a -LC90 boli 39,95 a 73,6 µl/l, v danom poradí.

Tieto výsledky podporili [54], ktorí preukázali hodnotu EC50 pre etefón proti embryám Daphnia magna (125 mg/l po 48 hodinách expozície). Pesticíd Tis sa zdá byť pre Biomphalaria toxickejší ako iné formulácie organofosforových zlúčenín, ako je chlórpyrifos (LC50 9,6 mg/l; [30] a profenofos (LC50 1,10 mg/l; [10]) .

Medzi tvorbou voľných kyslíkových radikálov a produkciou antioxidačných molekúl za normálnych fyziologických podmienok existuje homeostáza [23]. Nerovnováha medzi antioxidačným a oxidačným systémom je známa ako oxidačný stres [32]. V eukaryotoch aj prokaryotoch sú superoxiddismutáza (SOD) a glutatión S-transferázy kľúčové antioxidačné enzýmy, ktoré môžu odstraňovať príliš veľa kyslíka z voľných radikálov a chrániť organizmus pred oxidačným poškodením [34, 38].

Podieľajú sa aj na detoxikácii viacerých xenobiotík [8, 15]. Táto štúdia odhalila, že vystavenie slimákov B. alexandrina subletálnym koncentráciám RIPEX 48 percent EC narušilo antioxidačnú aktivitu exponovaných slimákov. Akútna expozícia (24 hodín) má tendenciu znižovať celkové aktivity SOD a GST u slimákov, po čom nasleduje zvýšenie po 3 dňoch expozície a prudká inhibícia po 7 dňoch expozície.

Hladiny MDA boli významne vyššie u exponovaných slimákov v porovnaní s kontrolami po všetkých obdobiach expozície. Tieto výsledky naznačujú stav oxidačného stresu u slimákov vyvolaný expozíciou RIPEX. U slimákov došlo k náhlemu poklesu aktivity enzýmov po 1 dni expozície a pokúsili sa kompenzovať nadprodukciou enzýmov po 3 dňoch expozície. Avšak do 7. dňa expozície slimáky neboli schopné prekonať nadmernú produkciu reaktívnych foriem kyslíka, čo sa prejavilo zvýšením hladín MDA (peroxidácia lipidov), čo viedlo k inhibícii produkcie antioxidačných enzýmov. MDA patrí medzi hlavné účinky peroxidácie lipidov a má schopnosť narušiť výmenu iónov v bunkovej membráne, modifikovať iónovú permeabilitu a ovplyvniť funkciu enzýmov [9].

Mechanizmus RIPEX 48 percent EC-indukovaného oxidačného stresu v Biomphalaria sa môže líšiť od iných organofosforových pesticídov. Spôsobil inhibíciu enzýmu až po 7 dňoch expozície. Chlorpyrifos však napríklad spôsobil zvýšenie aktivity SOD a zníženie aktivity GST u B. Alexandrina krátko po 1 dni expozície [30]. Testosterón a estradiol zohrávajú kľúčovú úlohu pri rozmnožovaní slimákov B. alexandrina [20, 45]. Zmeny v týchto hormónoch možno použiť ako koncový bod chemickej toxicity [14]. RIPEX 48 percent EC spôsobil hormonálnu poruchu u slimákov B. alexandrina.

Slimáky vystavené 16 µL/l vykazovali významné zvýšenie testosterónu po 3 dňoch expozície. RIPEX však znížil hladiny hormónov u slimákov vystavených 8 µl/l po 1 a 3 dňoch expozície. Čo sa týka estradiolu, hormón má tendenciu zvyšovať sa u exponovaných slimákov. Najvýraznejší nárast bol však pozorovaný u slimákov vystavených 16 µl/l po 3 dňoch expozície. RIPEX preto môže mať účinok narúšajúci endokrinný systém na slimáky B. alexandrina. Podobné zistenia zaznamenali aj Ibrahim a Hussein [30], ktorí uviedli významné zvýšenie hladín testosterónu aj estradiolu po vystavení B. Alexandrina subletálnym koncentráciám chlórpyrifosu 48 percent EC. Iné agrochemikálie, ako napríklad herbicíd oxyfluorfen (24 percent EC), však znížili hladiny testosterónu a 17-estradiolu v B. Alexandrina po dvoch týždňoch expozície [31]. Myeloperoxidáza (MPO), ktorá premieňa H2O2 na kyselinu chlórnu (HOCl), silné antibiotikum, sa často považuje za základný kameň cytotoxicity sprostredkovanej ROS a existuje silný dôkaz, že hemocyty mäkkýšov majú aktivitu MPO porovnateľnú s aktivitou fagocytov cicavcov [22 44, 49]. Adenozíndeamináza (ADA) hrá dôležitú úlohu v imunitnom systéme stavovcov a bezstavovcov, vrátane slimákov Biomphalaria [51].

Jeho nedostatok je spojený s kombinovanou imunodeficienciou [25]. Expozícia B. Alexandrina 8 a 16 µL/L RIPEX spôsobila významné zvýšenie aktivít enzýmov MPO a ADA v tráviacich žľazách slimákov po 3 a 7 dňoch expozície. Zdá sa, že zvýšenie aktivity enzýmu závisí od času a súladu. Tráviace žľazy sú primárnym miestom pre metabolizmus chemických kontaminantov u ulitníkov [46]. Nárast týchto enzýmov naznačuje imunologickú odpoveď B. Alexandrina na toxicitu RIPEX, pretože napríklad MPO môže konvertovať znečisťujúce látky na voľné radikály prostredníctvom jednoelektrónových abstrakcií [41], čo môže viesť k redoxným cyklom, ktoré produkujú oxyradikály a môžu iniciovať peroxidácia lipidov [36].

Slimáky sa primárne spoliehajú na bunkami sprostredkovanú cytotoxicitu, aby sa zbavili napadajúcich predmetov [5, 53]. Najviac dobre preštudovanými obrannými bunkami u slimákov sú hemocyty. Hemocyty postupujú z malých, zaoblených, agranulárnych buniek k veľkým, granulárnym, šíriacim sa bunkám prostredníctvom intermediárnych fáz [6, 53]. Granulárne hemocyty väčšinou fagocytujú cudzorodé látky [28]. Expozícia dvom koncentráciám RIPEX 48 percent EC zvýšila počet hemocytov. Vo vzorkách odobratých z exponovaných slimákov sa objavili hyalinocyty s vakuolami. Významné zvýšenie bolo zaznamenané v granulocytoch, čo naznačuje zvýšenie bunkovej imunitnej odpovede slimáka na napadnutie toxicity RIPEX. Ibrahim a Hussein [30] ukázali, že expozícia B. Alexandrina chlórpyrifosu mala negatívny vplyv na morfológiu a celkový počet hemocytov exponovaných slimákov.

Okrem toho svetelná mikroskopia odhalila, že niektoré hyalinocyty mali scvrknuté jadrá, neúplné delenie buniek a tvorbu pseudopódií. Tieto účinky na počet hemocytov a morfológiu B. Alexandrina majú negatívny vplyv na imunitu slimákov, pretože tieto organizmy sú vo veľkej miere závislé od hemocytov pri ich ochrane pred cudzími stretmi. Histopatologické vyšetrenia tráviacich žliaz B. Alexandriny ukázali, že expozícia RIPEX počas 7 dní spôsobila niektoré patologické zmeny, ako je degenerácia spojivového tkaniva, bunkové krvácanie a degenerácia vystlaných buniek v lúmene. Tráviace tubuly sa poškodili, zdeformovali a nekrotizovali. Histopatológia je dôležitým koncovým bodom pri hodnotení patologických zmien u vodných živočíchov vystavených kontaminantom [33].

Vysoká citlivosť tráviacich žliaz sa priamo pripisuje ich úlohe v homeostáze, vychytávaní kontaminantov, trávení, metabolizme a procese detoxikácie [24]. Pozorované účinky môžu byť spôsobené priamou akumuláciou RIPEX v bunkách tráviacej žľazy alebo nepriamo oxidačným poškodením spôsobeným produkciou reaktívnych foriem kyslíka (ROS). Extrémny oxidačný stres je skutočne spojený s poškodením tkaniva, ktoré zahŕňa rôzne fyziologické procesy a premenné prostredia, vrátane nekrotickej a apoptotickej bunkovej smrti [19]. Okrem toho expozícia dvom rôznym koncentráciám RIPEX počas 7 dní zmenila histologickú štruktúru ovotestis so zvýšením počtu nekrotických spermií, atrofiou, deformáciou mužských alebo ženských gametocytov a degeneráciou acini. Tieto zmeny pravdepodobne znížia reprodukčný potenciál slimákov a tým aj ich zdatnosť vo vodnom systéme.

5. Záver

Subletálne koncentrácie RIPEX 48 percent EC mali mnohostranný účinok na slimáky Biomphalaria alexandrina. U slimákov chronická expozícia RIPEXu znížila produkciu antioxidačných enzýmov SOD a GST a zároveň zvýšila produkciu MDA, čo naznačuje stav oxidačného stresu. Okrem toho mal endokrinný narúšajúci účinok na slimáky, o čom svedčí celkové zvýšenie hladín steroidných hormónov. Zdá sa, že imunitný systém slimáka je zraniteľný voči expozícii RIPEX. Spôsobil významné zvýšenie aktivity enzýmov MPO a ADA v tráviacich žľazách slimákov po 3 a 7 dňoch expozície, ako aj významné zvýšenie granulocytov v exponovaných skupinách slimákov. Patologické abnormality v exponovaných tráviacich žľazách a ovotestes slimákov boli tiež príznakmi histopatologických zmien spôsobených expozíciou RIPEXu. Tieto zistenia ukazujú, že RIPEX poškodzuje vodnú faunu, vrátane B. Alexandrina. Slimáky Tus, Biomphalaria možno použiť ako bioindikátory znečistenia životného prostredia pomocou regulátorov rastu rastlín.

Mechanizmus Cistanche zvyšuje účinok testosterónu

Zistilo sa, že Cistanche zvyšuje hladinu testosterónu niekoľkými spôsobmi. Po prvé, obsahuje zlúčeniny známe ako echinakozid a akteozid, u ktorých bolo preukázané, že zvyšujú produkciu luteinizačného hormónu (LH) v hypofýze. LH stimuluje Leydigove bunky v semenníkoch k produkcii testosterónu. Cistanche tiež obsahuje polysacharidy a fenyletanoidové glykozidy, u ktorých sa preukázalo, že majú antioxidačné a protizápalové vlastnosti. To môže pomôcť znížiť oxidačný stres a zápal v semenníkoch, ktoré môžu narušiť produkciu testosterónu. Okrem toho sa zistilo, že Cistanche zvyšuje expresiu génov zapojených do syntézy testosterónu a znižuje aktivitu enzýmov, ktoré testosterón rozkladajú, ako je {{1} }alfa-reduktázy. Celkovo sa predpokladá, že kombinácia týchto mechanizmov prispieva k účinkom Cistanche na zvýšenie testosterónu.