Kalpastatín zabraňuje poraneniu podocytov sprostredkovanému angiotenzínom II prostredníctvom udržiavania autofágie
Mar 17, 2022
pre viac informácií:{0}}
Imane Bensaada1,3, Blaise Robin1,3, Joe¨lle Perez2, Yann Salemkour1, Anna Chipontová1, Marine Camus1,Mathilde Lemoine1, Lea Guyonnet1,He'le`ne Lazareth1, Emmanuel Letavernier2, Carole He´nique1Pierre-Louis Tharaux1a Olivia Lenoir1
1Université de Paris, PARCC, Inserm, Paríž, Francúzsko; a2Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité, Paríž, Francúzsko
Silná prediktívna hodnota proteinúrie pri chronických glomerulárnych patológiách je pevne stanovená, rovnako ako patogénna úloha angiotenzínu II podporujúca progresiu glomerulárnej choroby so zmenenou glomerulárnou fi-filtračnou bariérou, poranením podocytov a zjazvením glomerulov. Tu sme zistili, že chronická hypertenzia indukovaná angiotenzínom II bola inhibovanáautofágiaeflux v myších glomerulách. Delécia Atg5 (gén kódujúci proteín zapojený do autofágie) špecificky v podocyte viedla k zrýchlenej podocytopatii indukovanej dangio tensínom II, zvýraznenej albuminúrii a glomeruloskleróze. To naznačuje, že autofágia je kľúčovým ochranným mechanizmom v podocyte v tomto stave. Aktivita calpainu v podocytoch indukovaná angiotenzínom II inhibujeautofágiaodtok. Podocyty z myší s transgénnou expresiou endogénneho inhibítora calpainucalpastatinvykazoval vyšší podocytautofágiana začiatku, ktorý bol odolný voči inhibícii závislej od angiotenzínu II. Tiež trvalá autofágia scalpastatinobmedzené poškodenie podocytov a albuminúria. Tieto zistenia naznačujú, že hypertenzia má patogénne účinky na glomerulárnu štruktúru a funkciu, čiastočne prostredníctvom aktivácie calpaínov, čo vedie k blokáde autofágie podocytov. Tieto zistenia odhaľujú originálny mechanizmus, ktorým hypertenzia sprostredkovaná angiotenzínom II inhibuje autofágiu prostredníctvom vápnikom indukovaného náboru calpainu s patogénnymi následkami v prípade nerovnováhycalpastatinčinnosť. Tým sa zabráni poklesu sprostredkovanému calpaínomautofágiamôže byť sľubnou novou terapeutickou stratégiou pre nefropatie spojené s vysokou aktivitou renín-angiotenzínového systému.
KĽÚČOVÉ SLOVÁ: angiotenzín II;autofágia; calpastatin; hypertenzia; podocyt
Prekladové vyhlásenie
Vzhľadom na kľúčovú úlohu autofágie vo vývojiobličkyochorenia, farmakologická moduláciaautofágiamôže byť sľubnou stratégiou na prevenciu a liečbu niekoľkýchobličkychoroby. Paralelne sa zistilo, že nadmerná aktivácia aktivity calpainu v podocytoch má škodlivé účinky na funkciu podocytov, zatiaľ čo jeho škodlivé mechanizmy účinku neboli identifikované. Tu uvádzame dôkaz, že calpain spája škodlivý účinok angiotenzínu II so škodlivou blokádouautofágiav podocytoch a naznačujú, že inhibícia calpaínu by mohla byť sľubným terapeutickým cieľom pre ochorenia podocytov čiastočne prostredníctvom udržiavania autofágie podocytov.
Kliknite naCistanche deserticola ma na chronické ochorenie obličiek
Hypertenzia je na druhom mieste po cukrovke ako hlavná príčina progresívnej chronickej chorobyobličkychoroba1–3 a dokonca aj mierne zvýšenie krvného tlaku je nezávislým rizikovým faktorom pre konečné štádium ochorenia obličiek.4 Rastúci počet experimentálnych štúdií zdôraznil význam podocytov pri vývojiobličkyzranenie. Progresívna strata podocytov a mikrovaskulárne zmeny sa objavujú skoro s funkčným poklesom obličiek pri experimentálnej hypertenznej nefropatii.5 U pacientov sa ukázalo, že vylučovanie životaschopných podocytov močom je citlivým a špecifickým markerom preeklampsie,6,7 a pacienti s nefrosklerózou mali signifikantne nižšia hustota glomerulárnych podocytov ako malaobličkydarcov.8,9 Okrem toho je dobre preukázaná patogénna úloha angiotenzínu II (AngII), ktorý podporuje progresiu glomerulárnej choroby, a to nielen pri hypertenzných stavoch, ale aj pri niekoľkých ochoreniach glomerulov.10–21
Glomerulárna hypertenzia má za následok naťahovanie glomerulárnych kapilár, poškodenie endotelu a zvýšenú filtráciu glomerulárnych proteínov, čo spôsobuje glomerulárny kolaps a glomerulosklerózu. Pôsobí tiež priamo na glomerulárne štruktúry, čo spôsobuje signálne regulačné reakcie zamerané na kompenzáciu. Aktivovaný systémový a lokálny renín-angiotenzín-aldosterónový systém (RAAS) podporuje mezangiálnu hyperpláziu a syntézu faktorov vaskulárnej permeability. Súčasne podocyty vykazujú vápnikovú signalizáciu22,23 a modifikujú svoj tvar na základe stimulácie závislej od receptora AngII typu 1 (AT1).24–28 Tieto adaptívne mechanizmy sa z dlhodobého hľadiska stávajú maladaptívnymi, čo nakoniec vedie k glomeruloskleróze. AT1 sprostredkuje výrazné zapojenie RAAS do krvného tlaku a homeostázy soli a vody. Inhibítory angiotenzín-konvertujúceho enzýmu a blokátory AT1 sa klinicky používajú na liečbu hypertenzie a srdcového zlyhania u pacientov. Zaujímavé je, že oba blokátory tiež vykazujú ochranný účinok naobličkyfunkciu.
Ukázalo sa, že autofágia je nevyhnutná pre udržanie bunkovej homeostázy, najmä v postmitotických bunkách29,30 a najmä v podocytoch.31–34Autofágiaje lyzozomálny degradačný systém pre cytoplazmatické proteíny a dysfunkčné organely s dlhou životnosťou35,36 a zahŕňa sekvestráciu proteínov a organel v autofagozómoch. Tvorba autofagozómov závisí od indukcie niekoľkých génov vrátane Map1lc3a/b, Beclin 1 a Tags. 37 Pribúda dôkazov, že dysregulácia autofagickej dráhy sa podieľa na patogenéze starnutia obličiek a niekoľkýchobličkychoroby ako akútne poškodenie obličiek, polycystické ochorenie obličiek, starnutie a diabetická nefropatia.31,32,38–41
Reguláciaautofágiav podocytoch, fyziologický a predovšetkým v patologickom kontexte, nie je dobre známy. Nedávno sme demonštrovali, že autofágia podocytov je nezávislá od mechanického cieľa regulácie rapamycínu (mTOR) vo fyziologických podmienkach, vďaka čomu je tento typ buniek výnimkou.42 Aktivácia AT1 stimuluje syntézu proteínov a premenu proteínov v bunkách. Preto sme usúdili, že aktivácia RAAS môže tiež ovplyvniť stimuláciu obratu proteínov a proteostázu.
V tejto štúdii sme sa zamerali na úlohu AngII signalizácie v podocytochautofágiaregulácia. Identifikovali sme vápnikom aktivované proteázy calpaíny sprostredkujúce chronický blokujúci účinok AngII na podocytyautofágia. Ďalej sme zistili, že endogénny inhibítor calpainucalpastatinbol schopný zabrániť inhibícii autofágie závislej od AngII a poškodeniu podocytov počas hypertenzie.
Tieto zistenia odhaľujú originálny mechanizmus, ktorým AngII-sprostredkovaná hypertenzia inhibujeautofágiaprostredníctvom vápnikom indukovaného náboru calpainu s patogénnymi následkami v prípade nerovnováhy aktivity kalpastatínu.
METÓDY
Zvieratá
calpastatintransgénne (CSTTg) myši láskavo poskytol Dr. E. Letavernier.43 Myši s podocytovo špecifickým prerušením génu Atg5 (Nphs2.cre Atg5lox/lox) sa vytvorili, ako už bolo opísané31 krížením myší Nphs2.cre44 s Atg5lox/lox myši45 na pozadí C57BL6/J. V tejto štúdii sa použili myši Nphs2.cre Atg5lox/lox a kontrolné samce súrodencov vo veku 10 až 12 týždňov. Hypertenzný model bol indukovaný sc infúziou AngII (Sigma-Aldrich, A9525) v dávke 1 mg/kg/min počas 4 až 6 týždňov pomocou osmotických minipúmp (Alzet Corp, model 2006). Pumpy boli implantované sc na chrbát medzi lopatky a boky. Myši dostávali suplementáciu soli (3 percentá NaCl) v potrave. Myši Atg5lox/lox (divokého typu [WT]) sa použili ako kontroly vo všetkých štúdiách. V prípade soli deoxykortikosterónacetátu (DOCA) s modelom redukcie nefrónov dospelí samci myší podstúpili jednostrannú ľavú nefrektómiu. Dva týždne po nefrektómii dostali pelety DOC s implantovaným 21-dňovým uvoľňovaním (Innovative Research of America) sc. Druhá peleta bola implantovaná 3 týždne po prvom implantáte. Všetky myši dostávali 0,9 percenta NaCl v pitnej vode ad libitum a boli usmrtené po 6 týždňoch podávania DOC.46 Pokusy sa uskutočňovali podľa francúzskych veterinárnych smerníc a smerníc formulovaných Európskym spoločenstvom na použitie na pokusných zvieratách (L358-86/ 609EEC) a boli schválené francúzskym ministerstvom výskumu a miestnou univerzitnou etickou komisiou pre výskum (APAFIS-7646 a -22373).
Primárny experiment s kultiváciou podocytov
Diferencované primárne podocyty sa kultivovali tak, ako už bolo opísané.47,48 Stručne povedané, čerstvo izolovaný obličkový kortex bol zmiešaný a štiepený kolagenázou I (Gibco, 17100-017) v Roswell Park Memorial Institute 1640 (Life Technologies, 61870-044). Tkanivá potom prešli cez 70 mm a 40 mm bunkové sitá (BD Falcon, 352340 a 352350). Glomeruli, ktoré priľnuli k 40 mm bunkovému sitku, sa odstránili fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom (PBS; Life Technologies, 10010023) + 0,5 percenta hovädzieho sérového albumínu (Eurobio, HALALB{14}}) vstreknutým pod tlakom a potom sa dvakrát premyli v PBS. Čerstvo izolované glomeruly sa umiestnili do 6-jamkových misiek v Roswell Park Memorial Institute 1640 (Gibco, 61870036) doplnených 10 percentami fetálneho teľacieho séra a 1 percentom penicilínu/streptomycínu (Life Technologies, 15140122), aby sa umožnilo podocytom opustiť glomeruly. a rastú. Obohatenie podocytov sa overilo analýzou Western blot, ako už bolo opísané31, 48, 49 (doplnkový obrázok S1). Podocyty sa kultivovali v neprítomnosti alebo prítomnosti bafilomycínu Al (100 nmol/l, Sigma-Aldrich, B1793) počas 4 hodín. Na imunofluorescenčné experimenty boli primárne podocyty nanesené na 4 misky so štítkami (Dutcher, 055071). Podocyty sa potom fixovali v paraformaldehyde 4 percentá počas 10 minút a spracovali sa na imunofluorescenciu.
Test aktivity kalpaínu
Intracelulárna aktivita calpainu sa stanovila v primárnych podocytoch, ako bolo opísané vyššie.50–52 Celkovo 100000 buniek sa kultivovalo v 24-jamkových kultivačných miskách na tkanivové kultúry v Roswell Park Memorial Institute 1640 doplnených 10 percentami plodu teľacie sérum a 1 % penicilín/streptomycín. Po uplynutí uvedenej doby kultivácie sa médium nahradilo roztokom Krebs-Ringer HEPES bikarbonátu (KRH) (pH 7,4) obsahujúcim 4 mM CaCl2, s alebo bez 10 mM inhibítora calpainu-1, a pred pridaním sa inkubovalo 10 minút. 50 mM calpainového substrátu N-sukcinyl-Leu-Leu-Val-Tyr-7-amino-4-metylkumarínu (Sigma-Aldrich, S6510). Po 90-minútovej inkubačnej dobe sa aktivita calpainu určila ako rozdiel medzi fluorescenciou FL (meranou pri excitácii 360 nm a emisii 430 nm) s inhibítorom calpain a bez neho-1.
Western blot
Primárne podocyty boli poškriabané 8 0 ml rádioimunoprecipitačného testovacieho pufra obsahujúceho fosfatázu a inhibítor proteázy. Koncentrácia proteínu sa merala pomocou súpravy BCA Protein Assay Kit (Merck Biochemistry, 71285). Dvadsať mikrogramov proteínov bolo podrobených elektroforéze na prefabrikovanom géli Criterion XT (12 percent Bis-Tris, Bio-Rad, 3450124). Proteíny sa preniesli na polyvinylidéndifluoridovú membránu (Thermo Fischer Scientific, 88518). Po blokovaní v 5-percentnom mlieku v Tris Buffer Saline 0,1 % Tween (TBS-T) sa membrány inkubovali s králičou polyklonálnou anti-LC3 (1:1000, Cell Signaling Technology, 2575), králičou polyklonálnou anti-ATG5 (1:2000, Cell Signaling Technology, 2630), morčacia polyklonálna anti-sekvestozóm 1 (SQSTM1)/P62 (1:10 000, PROGEN, GP62), králičia polyklonálna anti-calpain 1 doména IV (1:1000, Abcam, ab3917 ), králičí polyklonálny anti-calpain 2 amino-terminálny koniec domény I (1:1000, Abcam, ab39165), myší monoklonálny IgG1 anti-calpain 4 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, sc{41}}), králik anti podocín (1:1000, Abcam, ab50339), morčacia anti-nefrín (1:500, PROGEN, GP-N2) a potkania monoklonálna anti-tubulínová (1:5000, Abcam,ab6160) protilátka. Po premytí sa membrány inkubovali s protilátkou spojenou s chrenovou peroxidázou (1:2000, Cell Signaling Technology, 7074, 7076, 7077). Detekcia špecifických signálov sa uskutočnila pomocou chemiluminiscenčnej súpravy ECL (Bio-Rad, 170-5070) na zariadení LAS 4000 (Fuji). Na kvantifikáciu bola použitá denzitometrická analýza pomocou softvéru ImageJ (National Institutes of Health).
Meranie krvného tlaku a fyziologické hodnotenie
Systolický krvný tlak myší sa zaznamenával pomocou metódy manžety na chvoste (Visitech Systems Inc., BP-2000). Od každej myši sa uskutočnilo desať meraní a potom sa určila stredná hodnota. Systolický krvný tlak sa meral na začiatku liečby (vo veku 12 týždňov) a potom každý týždeň až do konca liečebného obdobia. Všetky myši boli umiestnené do metabolických klietok s voľným prístupom k vode na 6-hodinový zber moču. Koncentrácie kreatinínu v moči a močoviny v plazme sa analyzovali spektrofotometricky použitím kolorimetrickej metódy (Olympus, AU400). Vylučovanie albumínu močom sa meralo použitím špecifického imunosorbentového testu s viazaným enzýmom na kvantitatívne stanovenie albumínu v moči myší (Crystal Chem, 80630).
Histológia
Obličkyboli zozbierané a fixované v 4 percentnom PBS-pufrovanom formalíne. Rezy zaliate do parafínu (hrúbka 3- mm) sa zafarbili Massonovým strichrómom, aby sa vyhodnotila morfológia obličiek. Abnormality v obličkách boli odstupňované na základe prítomnosti a závažnosti abnormalít komponentov, vrátane glomerulosklerózy, mezangiálnej expanzie, tubulárnej atrofie alebo odliatku a fibrózy. Podiel sklerotických glomerulov bol hodnotený slepým vyšetrením najmenej 50 glomerulov naobličkyoddiele.
Imunofluorescenčné farbenie rezov obličiek a primárnych podocytov
Fixované primárne podocyty boli blokované v TBS-T 3 percentnom hovädzom sérovom albumíne a inkubované cez noc pri 4 stupňoch s primárnymi protilátkami morčacej anti-SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62}C) a králičej anti -zelený FL fluorescenčný proteín (GFP; 1:500, Abcam, ab290). Po výplachoch TBS-T sa sekundárne protilátky konjugované s FL fluorofórom konjugovaná protilátka proti morčaciemu IgG AF594- (JacksonImmunoResearch, 706-585-148) a konjugovaná protilátka proti králičiemu IgG AF{19}} ( Invitrogen, A21206). Obrázky boli urobené pomocou fluorescenčného mikroskopu Zeiss 2 ft, AxioCam HRccamera a softvéru Axiovision 4.3.
Pre formalínom fixovaný v parafíne (FFPE)obličkyrezy (3 mm) boli zbavené parafínu a hydratované a získanie antigénu bolo uskutočnené v zahriatom citrátovom pufri (pH 6). Rezy boli potom permeabilizované Tritonom 0,1 percenta (Euromedex) a blokované v TBS-T 3 percentnom hovädzom sérovom albumíne pred inkubáciou protilátky cez noc pri 4 °C. Použili sme kozí anti-nefrín (1:100, PROGEN, GP -N2), morča anti-SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62C), králičie anti-GFP (1:1000, Abcam, ab290), kozí anti-Podokalyxín (PODXL; 1: 1000, Bio-Techne, AF-1556) a králičiu protilátku proti Wilmovmu nádoru 1 (WT1;1:100, Abcam, ab192). Sekundárnymi protilátkami boli protilátky konjugované s Alexa488 a Alexa 568 od spoločnosti Invitrogen. Jadrá boli zafarbené modrou pomocou Hoechst. Sklíčka boli pripevnené pomocou fluorescenčného upevňovacieho média (Dako, S3023). Mikrofotografie boli urobené pomocou fotomikroskopu Zeiss Axiophot a softvéru Axiovision. Poloautomatické kvantifikácie na Fidži sa použili na kvantifikáciu nefrín-pozitívnych a PODXLþ oblastí na glomerulárnu sekciu na najmenej 30 glomeruloch na myš. Počet podocytov sa spočítal ako počet jadier WT1+ na glomerulárnu sekciu na najmenej 30 glomeruloch na myš.
Postup transmisnej elektrónovej mikroskopie
Malé kúsky obličkovej kôry (1 mm3) boli fixované v 3 percentnom glutaraldehyde (Electron Microscopy Sciences) počas 1 až 3 0 dní a trikrát premyté v PBS. Vzorky boli dodatočne fixované v 1% oxide osmičelom 0,1 M (Electron Microscopy Science) v 0,1 M PBS (pH 7,4) a premyté vodou. Vzorky boli dehydratované v alkohole a 100 percentnom propylénoxide (Electron Microscopy Science). Živicová infiltrácia sa uskutočnila nasledovne: miešajte Epikote 812 a propylénoxid v pomere 1:1 počas 30 minút, potom sa zmiešajte Epikote 812 a propylénoxid v pomere 1:2 pri teplote miestnosti cez noc. Vzorky boli vložené do 4 mm želatínových kapsúl v 100 percentnom Epikote 812 a polymerizované v sušiarni vyhriatej na 60 °C. Ultratenké rezy boli narezané ultramikrotómom UFC7 (Leica MicrosystemsGmbH) a uložené na Gilder Grids 200 mesh (Electron Microscopy Science). Boli kontrastne zafarbené 7-percentným uranylacetátom (distribúcia LFG) a Reynoldovým citrátom olovnatým (LFG). Vzorky sa skúmali v transmisnom elektrónovom mikroskope JEM1011 (JEOL) s CCD kamerou Orius SC1000 (Gatan), prevádzkovanou so softvérom Digital Micrograph (Gatan) na získanie.
Cistanche-choroba obličiek
Pole kvantitatívnej polymerázovej reťazovej reakcie
Čerstvo izolované glomeruly boli zmrazené v reagencii QIAzol Lysis (Qiagen) pri -80 stupňoch . Celková extrakcia RNA metódou na báze fenolu bola spracovaná podľa odporúčaní výrobcu. cDNA boli syntetizované pomocou súpravy RT2 First Strand Kit (Qiagen, 330401) a polymerázová reťazová reakcia v reálnom čase (PCR) sa uskutočnila pomocou Custom RT2 Profiler PCR Array (Qiagen, CLAM36771C) s RT2 SYBR Green qPCR Mastermix (Qiagen, 330502) . Kvantitatívne PCR platne bežali na cykléri Applied Biosystems StepOnePlus. Každé pole obsahuje kontrolu kvality pre účinnosť reverznej transkripcie a kontamináciu genómovej DNA. Kvantitatívna analýza PCR sa uskutočnila pomocou 2-metódy DDCT s pomocou Centra analýzy údajov GeneGlobe (www. Qiagen. com/shop/genes-and-pathways/data-analysis-center-overview-page) a vyjadrila sa ako Log2 násobok zmeny génovej expresie.
In silico proteomická analýza
In silico predikcia miesta štiepenia calpainu sa uskutočnila pomocou DeepCalpain (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php), GPS-CCD (http://ccd.biocuckoo.org) a CaMPDB (http:// calpain.org/) online nástroje. Aminokyselinová sekvencia myšacieho proteínu bola získaná od Uniprot (https://www.uniprot.org). Výsledky sú zhrnuté v doplnkových tabuľkách S1 a S2.
Štatistické analýzy
Všetky grafy predstavujú jednotlivé hodnoty a priemer ± SEM. Štatistické analýzy sa uskutočňovali pomocou softvéru GraphPad Prism, verzia 9. Porovnanie medzi týmito 2 skupinami sa uskutočňovalo pomocou parametrického Studentovho t-testu, keď vzorky prešli Andersonovým-Darlingovým a D'Agostino testom normality a F testom na rovnosť rozptylu. Inak bol použitý neparametrický Mann-Whitney test. Porovnanie medzi viacerými skupinami sa uskutočnilo pomocou 1-smernej alebo 2-analýzy rozptylu, po ktorej nasledoval viacnásobný porovnávací test so Simakovou korekciou. Hodnoty P < 0.05="" sa="" považovali="" za="" významné.*p="">< 0.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p=""><>
Obrázok 1|Hypertenzia indukovaná angiotenzínom II (AngII) D s vysokým obsahom soli (HSD) inhibuje glomerulárnuautofágia. (a–c) Imunofluorescencia podokalyxínu (PODXL; červená) a P62 (zelená) v glomeruloch (a,a0 ) z myší divokého typu (WT), (b,b0 ) z Myši WT po 6 týždňoch AngII þ HSD a (c,c{5}}) od myší Nphs2.cre Atg5lox/lox vykazujúce akumuláciu P62 v podocytoch počas hypertenzie a v ATG špecifických pre podocyty{{1{{12 }}}}deficientné myši. Šípky označujú P62þ bodky vo WT v (a0 ). Jadrá sa kontrastne zafarbili s Hoechst (modrá). Časti obrázku s prvočíslom označujú väčšie zväčšenie. Pruhy=50 mm. (d) Súvisiaca kvantifikácia oblasti P62þ vyjadrená ako percento glomerulárnej oblasti. n=4 myší WT a n=5 WT s AngII þ HSD a myši Nphs2.cre Atg5lox/lox. Hodnoty sú prezentované ako jednotlivé grafy a priemer ± SEM. Mann-Whitney test: *P=0.0159. Ak chcete optimalizovať zobrazenie tohto obrázka, pozrite si online verziu tohto článku na adrese www.obličky-international.org.
VÝSLEDKY
Hypertenzia indukovaná diétou s vysokým obsahom soli AngII D inhibovala autofágiu podocytov
Podocyty predstavujú vysokú hladinuautofágiain vivo, ako ukazuje silná expresia GFP u transgénnych myší s fúziou GFP s LC3 (myši GFP-LC3), kľúčovým markerom autofágie (doplnkový obrázok S2A). Autofágia je dynamický proces s neustálou tvorbou autofagozómov a degradáciou autofagolyzozómov. Blokovanie autofagozomálnej degradácie chlorochínom viedlo k akumulácii GFP bodov, čo naznačuje vysoký autofagický eflux v podocytoch (doplnkové obrázky S2A a B). Potvrdenie, že bodky GFPþ boli autofagozómy, bolo preukázané dvojitou imuno-FL fluorescenciou pre GFP a SQSTM1/P62, chaperónový proteín degradovanýautofágia(Doplnkový obrázok S2C a D). Liečba chlorochínom opäť vyvolala akumuláciu bodov GFPþ P62þ, čo dokazuje dôležitý autofagický eflux v podocytoch. Nakoniec sa in vitro zachoval vysoký autofagický eflux, ako ukazuje expresia GFP a P62 v primárnych podocytoch izolovaných z myší GFP-LC3 a silná akumulácia bodov GFPþ a P62þ pri liečbe bafilomycínom A1, ďalším blokátorom autofagozomálnej degradácie (doplnkový obrázok S2E – H) .
Schopnosť hypertenzie modulovať autofagické reakcie podocytov sa potom hodnotila u myší s infúziou AngII s diétou s vysokým obsahom soli (HSD) počas 6 týždňov a u nehypertenzných kontrol. Ako je znázornené na obrázku 1, AngII + HSD indukoval akumuláciu P62 v glomerulách so silnou akumuláciou v podocytoch, čo naznačuje, že AngII + HSD bol zodpovedný za podocytyautofágiablokáda (obrázok 1a–d). Je zaujímavé, že akumulácia P62 v podocytoch bola podobná akumulácii pozorovanej u myší s nedostatkom autofágie podocytov (myši Nphs2.cre Atg5lox/lox). V inom modeli hypertenzie, modeli DOC-soľ, sme tiež pozorovali progresívnu akumuláciu P62 v podocytoch v priebehu ochorenia (doplnkový obrázok S3).
Delécia Atg5 špecificky v podocytoch vedie k zvýšenej albuminúrii, strate podocytov a glomerulárnemu poškodeniu v modeli AngII D HSD
Potom sme skúmali, čiautofágiablokáda len v podocytoch (myši Nphs2.cre Atg5lox/lox) ovplyvňuje glomerulárne poškodenie v modeli AngII þ HSD. Najprv sme potvrdili, že Nphs2. cre Atg5lox/lox myši mali normálny krvný tlak, normálnyobličkyfunkcie a žiadne glomerulárne histologické lézie až do veku 10 mesiacov, ako už bolo uvedené (doplnkový obrázok S4).32 Potom Atg5lox/lox (WT) a Nphs2. Myšiam cre Atg5lox/lox sa podávala infúzia AngII s HSD počas 6 týždňov. Dôležité je, že systolický krvný tlak bol podobný v 2 skupinách po infúzii AngII v priebehu štúdie (obrázok 2a), hoci metóda manžety na chvoste použitá na meranie krvného tlaku nemusí mať schopnosť vyriešiť malé rozdiely v krvnom tlaku. Infúzia AngII s HSD výrazne zvýšila pomer albumínu ku kreatinínu v moči u myší WT a tento účinok sa ďalej významne zvýšil u myší Nphs2.cre Atg5lox/lox (obrázok 2b). Hypertenzívne myši Nphs2.cre Atg5lox/lox tiež vykazovali významne zvýšenú glomerulárnu sklerózu v porovnaní s WT súrodencami (obrázok 2c–e). V súlade s nameranou proteinúriou boli proteínové odliatky a tubulárna dilatácia významne častejšie u myší s nedostatkom podocytov v ATG5 (obrázok 2f–h).
Obrázok 2|Delécia Atg5 špecificky v podocytoch vedie k významnému zvýšeniu albuminúrie,obličkyporanenia a straty podocytov po 6 týždňoch infúzie angiotenzínu II (AngII) D diétou s vysokým obsahom soli (HSD). (a) Systolický krvný tlak u myší Atg5lox/lox a Nphs2.cre Atg5lox/lox počas 36 dní AngII + HSD. n=9 myší na genotyp. Hodnoty sú prezentované ako priemer ± SEM. Dvojcestná analýza rozptylu (ANOVA): ns. U (b–m) n=10 myší na genotyp. V (b,g,h,k) sú hodnoty prezentované ako jednotlivé grafy a priemer ± SEM. b) AngII þ HSD (pokračovanie)
Obrázok 2|(pokračovanie) viedlo k dramatickému zvýšeniu albuminúrie v Nphs2. cre Atg5lox/lox myši v porovnaní s Atg5lox/lox kontrolnými myšami. Dvojcestná ANOVA: genotyp, P=0.013; čas, P=0.0018. (c – f) Reprezentatívne obrázky Massonových trichrómom zafarbených rezov glomerulov z kontroly Atg5lox/lox a myší Nphs2.cre Atg5lox/lox po 6 týždňoch AngII + HSD. Pruhy=50 mm in (c,d). Pruhy=100 mm in (e,f). (g,h) Porovnanie (g) podielu sklerotických glomerulov a (h) počtu tubulárnych odliatkov na mikroskopické pole. Mann-Whitney test: **P=0,0026 in (h), ***P=0,0003 in (g). (i,j) Reprezentatívne imunofluorescenčné snímky expresie Wilmovho nádoru 1 (WT1; červená) a Podokalyxínu (PODXL; zelená) v glomeruloch z kontroly Atg5lox/lox a myší Nphs2.cre Atg5lox/lox po AngII + HSD počas 6 týždňov. Jadrá boli zafarbené pomocou Hoechst (modrá). Pruhy=50 mm. k) Kvantifikácia počtu buniek WT1þ na glomerulárnu sekciu. Mann-Whitney test: **P=0,0029 in (l,m). Reprezentatívne imunofluorescenčné obrázky expresie CD44 (zelené) v glomeruloch z kontroly Atg5lox/lox a myší Nphs2.cre Atg5lox/lox po AngII + HSD počas 6 týždňov. Jadrá boli zafarbené pomocou Hoechst (modrá). Pruhy=50 mm. (n, o) Reprezentatívne mikrofotografie rezov glomerulov z kontroly Atg5lox/lox a myší Nphs2.cre Atg5lox/lox z transmisnej elektrónovej mikroskopie po AngII + HSD počas 6 týždňov, ktoré ukazujú vyhladenie procesu chodidla podocytov (šípky) u hypertenzných Nphs2. cre Atg5lox/lox myši. Pruhy=1 mm. n=3 myší na genotyp. Ak chcete optimalizovať zobrazovanie tohto obrázka, pozrite si online verziu tohto článku na adrese www.kidney-international.org.
Obrázok 3|Expresia a aktivita kalpaínu v podocytoch. (a) Western blot analýza expresie calpaínu-1, calpaínu-2 a calpaínu-4 v primárnych podocytoch. Expresia tubulínu slúži ako normalizácia. (b) Aktivita kalpaínu sa merala na primárnych podocytoch ošetrených alebo neošetrených angiotenzínom II (AngII; 100 nM) počas 24 hodín s alebo bez kalpeptínu (10 mM). n=5 nezávislých experimentov. Hodnoty sú prezentované ako jednotlivé grafy a priemer ± SEM. Jednosmerná analýza rozptylu (ANOVA): liečba, P=0.0035. Sidakov viacnásobný porovnávací test: *P=0.0128 pre AngII oproti východiskovej hodnote, ##P=0.0056 pre AngII + kalpeptín oproti AngII. (c) Aktivita calpainu sa merala na primárnych podocytoch divokého typu (WT) alebocalpastatintransgénne (CSTTg) myši liečené alebo neliečené AngII (100 nM) počas 24 hodín. n =7 nezávislých experimentov. Hodnoty sú prezentované ako jednotlivé grafy a priemer ± SEM. Dvojcestná ANOVA spárovaná na liečbu: genotyp, P=0.0483. Sidakov viacnásobný porovnávací test: ***P=0,0009 pre WT AngII verzus základná hodnota, *P=0,0420 pre CSTTg AngII verzus základná hodnota, #P=0,0424 pre WT verzus CSTTg AngII. Ak chcete optimalizovať zobrazenie tohto obrázka, pozrite si online verziu tohto článku na adrese www.obličky-international.org.
Počet podocytov na glomerulus bol významne znížený v Nphs2. cre Atg5lox/lox myši liečené AngII + HSD (obrázok 2i–k). Poškodenie podocytov u myší Nphs2.cre Atg5lox/lox s infúziou AngII + HSD dokonca progredovalo do fokálnej a segmentálnej glomerulosklerózy, ako ukazuje expresia aktivačného markera parietálnych epitelových buniek (PEC) CD44 v glomeruloch (obrázok 2l a m). Analýza elektrónovou mikroskopiou identifikovala významné zmeny spojené s deficitom ATG5 po chronickej infúzii AngII s HSD, vrátane vymazania chodidiel pri hypertenzných Nphs2. cre Atg5lox/lox myši. Na rozdiel od toho sa v podocytoch z myší WT našlo niekoľko ultraštrukturálnych defektov aj po 10 týždňoch infúzie AngII s HSD (obrázok 2n a o), čo naznačuje, že autofagická aktivita podocytov je potrebná na ich odolnosť voči poškodeniu vyvolanému AngII + HSD. Celkovo naše výsledky ukázali, že v modeli AngII þ HSD,autofágiainhibícia zhoršuje poškodenie a stratu podocytov a vyvoláva následnú fokálnu a segmentálnu glomerulosklerózu.
AngII D HSD aktivuje aktivitu calpainu v podocytoch, čo prispieva k autofágovej blokáde
Keďže sa zistilo, že aktivita calpainu (i) je aktivovaná AngII v niekoľkých typoch buniek a (ii) štiepi niekoľkoautofágias proteínmi súvisiacimi s 53, zaujímalo nás, či blokádu autofágie sprostredkovanú AngII + HSD možno pripísať zvýšenej aktivite calpainu indukovanej AngII. Najprv sme zistili, že primárne podocyty exprimovali 3 všadeprítomné formy calpaínov (obrázok 3a). Potom sme ukázali, že AngII stimuloval aktivitu calpainu v primárnych podocytoch. Toto zvýšenie aktivity calpainu bolo blokované selektívnym inhibítorom calpainu (obrázok 3b). Použili sme vyklepávaciu myš s prídavnýmicalpastatinexpresia transgénu (čo vedie k zníženiu aktivity calpainu)43 na posúdenie úlohy calpainov v AngII þ sprostredkovanom HSDobličkyporanenia a blokády autofágie. Primárne podocyty z myší CSTTg vykazovali zníženú aktivitu calpainu v reakcii na AngII v porovnaní s podocytmi z kontrolných myší (obrázok 3c). tedacalpastatinnadmerná expresia v podocytoch znížila aktiváciu calpainu sprostredkovanú AngII.
Ďalej sme hodnotiliautofágiahladiny v podocytoch od CSTTg myší. Vytvorili sme myši CSTTg s transgénom GFP-LC3. Reportér LC3-GFP umožnil počítanie autofagozómov ako bodov GFPþ/P62þ. P62 sa bude akumulovať v agregátoch v bunkách, keď je autofagický eflux blokovaný. V bazálnom stave sme v podocytoch myší CSTTg GFP-LC3 spočítali menej bodov GFPþ P62þ (obrázok 4a, b a e) a menšiu akumuláciu P62 (obrázok 4c, d a f) ako v podocytoch normálnych myší GFP-LC3. , čo naznačuje zvýšený autofagický eflux v podocytoch myší s vysokým výskytom kalpastatínu.
Obrázok 4|Hodnotenie autofagického efluxu v podocytochcalpastatintransgénne (CSTTg) myši. (a, b) Reprezentatívne imunofluorescenčné snímky expresie zeleného fluorescenčného proteínu FL (GFP) (zelená) a P62 (červená) v glomeruloch od 12-týždňových myší GFP-LC3 a CSTTg GFP-LC3. Šípky označujú autofagozómy GFPþ P62þ. (c, d) Reprezentatívne imunofluorescenčné obrázky expresie P62 (zelená) a Podokalyxínu (PODXL; červená) v glomeruloch od 12- týždňov starých myší GFP-LC3 a CSTTg GFP-LC3. Časti obrázku s prvočíslom označujú väčšie zväčšenie. Jadrá boli zafarbené pomocou Hoechst (modrá). Pruhy=50 mm. (e) Kvantifikácia počtu LC3þ P62þ bodiek na podocyt. Mann-Whitney test: **P= 0.0065. (f) Kvantifikácia plochy P62þ na glomerulárnu sekciu. Mann-Whitney test: *P=0.0420. U (e,f) n=5 myší GFP-LC3 a n=8 myší CSTTg GFP-LC3. Hodnoty sú prezentované ako jednotlivé grafy a priemer ± SEM. Ak chcete optimalizovať zobrazenie tohto obrázka, pozrite si online verziu tohto článku na adrese www.obličky-international.org.
Autofagický eflux možno monitorovať meraním konverzie cytoplazmatickej formy LC3, LC3-I, na autofagozomálne štiepenú a fosfatidyletanolamínom spojenú formu LC3, LC3-II, na Western blote . Podocyty z myší CSTTg vykazovali zvýšenú konverziu LC3-I na LC{5}}II a zníženú expresiu P62, v prítomnosti aj v neprítomnosti bafilomycínu A1 (obrázok 5a a b), čo naznačuje zvýšený autofagický eflux v podocyty s nadmernou expresiou kalpastatínu. Nakoniec akumulácia bodov GFPþ P62þ v podocytoch po podaní chlorochínu bola dôležitejšia u myší CSTTg GFP-LC3 ako u myší GFP-LC3, čo potvrdzuje, žecalpastatinnadmerná expresia indukuje autofagický eflux v podocytoch in vivo (obrázok 5c–e). Celkovo naše údaje naznačujú, že AngII stimuluje aktivitu calpaínu v podocytoch, žeautofágiaje inhibovaný calpainom v podocytoch a že inhibícia endogénnej aktivity calpainu nadmernou expresiou calpastatínu je dostatočná na stimuláciu autofagického efluxu v podocytoch.
Myši CSTTg sú chránené pred poškodením podocytov vyvolaným AngII D HSD
CSTTg myši nevykazovali žiadneobličkyzmena do veku najmenej 12 mesiacov (doplnkový obrázok S5). Analyzovali sme poškodenie podocytov u myší CSTTg počas liečby AngII + HSD. Aj keď sa u myší WT po 4 týždňoch hypertenzie vyvinula mierna glomeruloskleróza a poškodenie podocytov, čo dokazuje abnormálna expresia podokalyxínu a nefrínu, myši CSTTg vykazovali menej sklerotických glomerulárnych lézií (obrázok 6a a b) a zachovali expresiu podokalyxínu a nefrínu (obrázok 6c–h) . Takéto rozdiely vo fenotype podocytov sa pozorovali v štádiu, keď sa hustota jadier podocytov nelíšila medzi myšami WT a hypertenznými CSTTg (obrázok 6i–k).
Obrázok 5|Blokovanie autofagozomálnej degradácie potvrdilo zvýšený autofagický eflux podocytovcalpastatintransgénne (CSTTg) myši. ( a ) Western blot analýza expresie LC3, sekvestozómu 1 (SQSTM1) / P62 a ATG5 v primárnych podocytoch od myší divokého typu (WT) alebo CSTTg. Expresia tubulínu slúži ako normalizácia. Podocyty boli alebo neboli ošetrené bafilomycínom A1 (BafA1; 100 nM) počas 4 hodín pred zastavením kultivácie. (b) Kvantifikácia pomerov LC{{10}}II/tubulín a P62/tubulín. n=10 myší WT a n{13}} myší CSTTg. Hodnoty sú prezentované ako jednotlivé grafy a priemer ± SEM. Obojsmerná analýza rozptylu spárovaného na liečbu: pre LC3-II/tubulín: genotyp, P=0.{{30}}008; ošetrenie, P < 0,0001;="" pre="" p62/tubulín:="" genotyp,="" p="0.0884;" ošetrenie,="" p="">< 0,0001.="" sidakov="" viacnásobný="" porovnávací="" test:="" pre="" lc3-ii/tubulín:="" ***p="">< 0,0001="" pre="" wt="" plus="" bafa1="" verzus="" wt="" þ="" bafa1,="" ***p="">< 0,0001="" pre="" csttg="" plus="" bafa1="" verzus="" csttg="" þ="" bafa1,="" ##p{="" {34}}.0028="" pre="" wt="" þ="" bafa1="" verzus="" csttg="" þ="" bafa1;="" pre="" p62/tubulín:="" ***p="">< 0,0001="" pre="" wt="" plus="" bafa1="" verzus="" wt="" þ="" bafa1,="" ***p="">< 0,0001="" pre="" csttg="" plus="" bafa1="" verzus="" csttg="" þ="" bafa1.="" (c,="" d)="" reprezentatívne="" imunofluorescenčné="" obrázky="" expresie="" zeleného="" fluorescenčného="" proteínu="" fl="" (gfp;="" zelená)="" a="" p62="" (červená)="" v="" glomeruloch="" od="" 12-="" týždňov="" starých="" myší="" gfp-lc3="" a="" csttg="" gfp-lc3.="" časti="" obrázku="" s="" prvočíslom="" označujú="" väčšie="" zväčšenie.="" jadrá="" boli="" zafarbené="" pomocou="" hoechst="" (modrá).="" pruhy="50" mm.="" myši="" boli="" ošetrené="" chlorochínom="" (cq;="" 80="" mg/kg)="" 4="" hodiny="" pred="" usmrtením.="" šípky="" označujú="" autofagozómy="" gfpþ="" p62þ.="" (e)="" kvantifikácia="" počtu="" lc3þ="" p62þ="" bodiek="" na="" podocyt.="" n="5" myší="" na="" genotyp.="" hodnoty="" sú="" prezentované="" ako="" jednotlivé="" grafy="" a="">±SEM. Nespárovaný t-test s rovnakou SD: *P=0.0302. Ak chcete optimalizovať zobrazenie tohto obrázka, pozrite si online verziu tohto článku na adrese www.obličky-international.org.
Obrázok 6 |calpastatinnadmerná expresia zabraňuje poškodeniu podocytov sprostredkovanému angiotenzínom II (AngII) D diétou s vysokým obsahom soli (HSD). ( a, b ) Reprezentatívne obrázky Massonových trichrómom zafarbených rezov glomerulov z myší divokého typu (WT) a calpastatínových transgénnych (CSTTg) myší po 6 týždňoch AngII + HSD. Pruhy=50 mm. (c,d,f,g) Reprezentatívne imunofluorescenčné snímky expresie (c,d) podokalyxínu (PODXL) a (f,g) nefrínu (NPHS1) u myší WT a CSTTg po 6 týždňoch AngII + HSD a (e ,h) súvisiace kvantifikácie. Pruhy=50 mm. (i,j) Reprezentatívne imunofluorescenčné snímky expresie Wilmovho nádoru 1 (WT1; zelená) a PODXL (červená) v glomeruloch od myší WT a CSTTg po 6 týždňoch AngII + HSD a (k) súvisiacej kvantifikácie počtu WT1þ buniek na glomerulárnu sekciu. Jadrá boli zafarbené pomocou Hoechst (modrá). Pruhy=50 mm. V (e,h,k) sú hodnoty prezentované ako jednotlivé grafy a priemer ± SEM. n=9 myší WT a n{13}} myší CSTTg. Nepárový t-test s rovnakou SD: **P=0,0095 in (e), *P=0,0249 in (h), P=0,7891 in (k). Ak chcete optimalizovať zobrazenie tohto obrázka, pozrite si online verziu tohto článku na adrese www.obličky-international.org.
Podobne po 6 týždňoch hypertenzie myši GFP-LC3 a CSTTg GFP-LC3 vykazovali poškodenie podocytov, ale lézie boli výraznejšie u myší GFP-LC3 (obrázok 7). Pomer albumínu a kreatinínu v moči bol vyšší u myší GFP-LC3 po 4 týždňoch AngII + HSD (obrázok 7a). Počet podocytov sa medzi týmito 2 genotypmi nelíšil, ale expresia nefrínu bola výrazne znížená u myší GFP-LC3 (kontrola) (obrázok 7b–e). Korelujúce scalpastatin-sprostredkovaná ochrana, ultraštrukturálna analýza ukázala mierne a fokálne vymazanie chodidiel podocytov u myší GFP-LC3 liečených AngII + HSD s lepším zachovaním vymazania chodidiel u CSTTg myší, hoci globálna kvantifikácia počtu procesov chodidla na glomerulárny bazál dĺžka membrány (GBM) nebola štatisticky odlišná, s najväčšou pravdepodobnosťou preto, že poškodenie podocytov je v našom modeli fokálne a segmentové (obrázok 7f–h). Za zmienku stojí makrofágy a infiltrácia T-lymfocytov vobličkysa medzi skupinami nelíšili (doplnkový obrázok S6). Celkovo to tieto výsledky ukázalicalpastatinzabránili AngII þ HSD-indukovanému poškodeniu podocytov.
Nadmerná expresia kalpastatínu obnovuje autofagický eflux v podocytoch z myší po liečbe AngII D HSD
Nakoniec nás zaujímalo, čicalpastatin-sprostredkovaná glomerulárna ochrana v modeli AngII + HSD implikovala udržanie autofágie v podocytoch. Je zaujímavé, že akumulácii P62 indukovanej AngII + HSD v podocytoch sa zabránilo u myší CSTTg a GFP-LC3 CSTTg (obrázok 8a–d), čo naznačuje, že kalpastatín zabránil blokáde podocytovautofágia. Je potrebné poznamenať, že počet bodov označovania autofagozómov GFPþ P62þ bol podobný v podocytoch z hypertenzných myší GFP-LC3 a GFP-LC3 CSTTg, čo naznačuje, že AngII þ HSD vyvolal skôr spomalenie autofagického odtoku podocytov než úplné zastavenie (obrázok 8e– g).
In silico predikcia calpainového štiepneho miesta v podocytových proteínoch
Použili sme niekoľko nástrojov in silico na predpovedanie potenciálnych cieľov calpainu v podocytoch (doplnkové tabuľky S1 a S2). Porovnali sa tri online databázy: GPS-CCD,54 CaMPDB,55 a DeepCalpain.56 Analýza In silico identifikovala niekoľko podocytových proteínov, medzi nimi nefrín a podocín, ktoré by mohli byť štiepené kalpaínmi. tedacalpastatin-sprostredkovaná glomerulárna ochrana by mohla byť spojená so znížením enzymatickej aktivity calpainu, čo vedie k zníženej degradácii niektorých proteínov podocytov.
Okrem toho aspoň 3autofágiapríbuzné proteíny sú priamymi cieľmi calpaínov. ATG5 je štiepený calpainmi, čo vedie k poruche tvorby komplexu ATG12-ATG5.57,58 Podávanie inhibítorov calpainu in vivo tiež zabránilo štiepeniu autofagického proteínu Beclin-1.59 In silico analýza predpokladané miesto štiepenia na proteínoch súvisiacich s autofágiou podporuje hypotézu, že calpain by mohol regulovať autofágiu prostredníctvom enzymatického štiepenia autofágových proteínov.
Cistanche-funkcia obličiek
Expresia mRNA endoplazmatického retikula (ER) a markerov oxidačného stresu v glomerulách z myší liečených AngII plus HSD
Hodnotili sme stres endoplazmatického retikula (ER) a oxidačný stres pomocou kvantitatívnej PCR v glomeruloch počas liečby AngII + HSD (tabuľka 1). Na začiatku sme nepozorovali žiadnu zmenu v expresii mRNA analyzovaných génov v glomeruloch z myší WT a Nphs2.cre Atg5lox / lox (doplnkový obrázok S7). Po 6 týždňoch hypertenzie sa glomeruly z Nphs2. Myši cre Atg5lox / lox vykazovali odlišný profil mRNA génov ER stresu a dráh oxidačného stresu so zvýšenou expresiou Sod1, Prdx1, Atf4, Gpx1 a Hsp90b1 v porovnaní s glomerulami WT, čo naznačuje, žeautofágiadeplécia v podocytoch uprednostňovala AngII þ HSD-indukovaný ER stres a oxidačný stres. Naopak, glomeruly z myší CSTTg vykazovali downreguláciu niekoľkých génov ER stresu a dráh oxidačného stresu, ako aj zníženú expresiu niektorých proapoptotických génov (obrázok 9).
Celkovo to tieto výsledky naznačujúcalpastatinnadmerná expresia by mohla zabrániť glomerulárnemu poškodeniu znížením ER a oxidačného stresu indukovaného AngII + HSD.
DISKUSIA
V tejto štúdii sme demonštrovali, že pri hypertenzii indukovanej AngII + HSD je autofágia podocytov výrazne znížená. Okrem toho myši s deléciou Atg5 špecifickou pre podocyty boli náchylnejšie na glomerulosklerózu indukovanú HSD a stratu podocytov, čo ukazuje, žeautofágiav podocytoch zabraňuje rozvoju hypertenznej nefropatie, čo zdôrazňuje kritickú úlohu autofágie pri poškodení podocytov indukovanom AngII + HSD. O extracelulárnych stimuloch, ktoré regulujú bunkovú autofágiu, je známe len málo a tieto výsledky vrhajú svetlo na patofyziologickú reguláciu autofágie podocytov pomocou AngII.
Pri väčšine ľudských glomerulopatií je vymazanie výbežku podocytov na nohách charakteristickým znakom glomerulárneho poškodenia vedúceho k proteinúrii. Autofágia bude pravdepodobne hrať zásadnú úlohu pri udržiavaní funkcie podocytov, pretože tieto terminálne diferencované bunky vykazujú vysokú mieruautofágiaaj pri absencii stresu. Predchádzajúca štúdia ukázala, že AngII podporuje autofágiu prostredníctvom vytvárania reaktívnych foriem kyslíka v podmienene imortalizovanej bunkovej línii myších podocytov.60 Produkcia reaktívnych foriem kyslíka je skutočne všeobecným induktorom autofágie v mnohých typoch buniek a dôvody takéhoto rozporu s našimi zisteniami sú nejasné. Na rozdiel od tejto poslednej štúdie sme použili myšacie primárne kultivované podocyty, ktoré si zachovali expresiu podocínu a nefrínu a in vivo prístupy, a nie myšacie bunkové línie. Potvrdzujeme predchádzajúce správy, že postmitotické podocyty vykazujú nezvyčajne vysokú úroveň konštitúcieautofágia. Meranie zvýšeného množstva LC3-II po stimulácii AngII v prítomnosti alebo neprítomnosti lyzozomálnych inhibítorov je nevyhnutné na určenie, či je autofagický eflux zvýšený alebo blokovaný. Predchádzajúce štúdie tento fenomén zanedbávali.60
Obrázok 7 |calpastatinnadmerná expresia zabraňuje poškodeniu podocytov sprostredkovanému diétou s vysokým obsahom soli (HSD) angiotenzínom II (AngII) u myší so zeleným FL fluorescenčným proteínom (GFP) – LC3. ( a ) AngII + HSD viedli k dramatickému zvýšeniu albuminúrie u myší GFP-LC3 v porovnaní s myšami GFP-LC3 CSTTg (transgénne pre kalpastatín). n=8 až 13 myší na genotyp. Hodnoty sú prezentované ako jednotlivé grafy a priemer ± SEM. Obojsmerná analýza rozptylu: genotyp, P=0.0429; čas, P=0.0165. Sidakov viacnásobný porovnávací test: *P=0.0453 pre GFP-LC3 oproti CSTTg GFP-LC3 myši na 28. deň. (b,c) Reprezentatívne imunofluorescenčné snímky expresie Wilmovho nádoru 1 (WT1; zelená) a nefrínu (NPHS1) (červená) v glomeruloch od 18-týždňových myší GFP-LC3 a CSTTg GFP-LC3 po 6 týždňoch infúzie AngII + HSD. Jadrá boli zafarbené pomocou Hoechst (modrá). Pruhy=50 mm. Kvantifikácia (d) plochy NPHS1þ na glomerulárnu sekciu a (e) počtu buniek WT1þ na glomerulárnu sekciu u 18-týždňových myší GFP-LC3 a CSTTg GFP-LC3 po 6 týždňoch infúzie AngII þ HSD. n=19 myší GFP-LC3 a n{43}} myší CSTTg GFP-LC3. Hodnoty sú prezentované ako jednotlivé grafy a priemer ± SEM. Nepárový t-test s rovnakou SD: **P=0.0010 v (d), P= 0.1158 v (e). (f, g) Obrazy glomerulov z transmisnej elektrónovej mikroskopie z myší GFP-LC3 a CSTTg GFP-LC3 po 6 týždňoch AngII + HSD. Šípky označujú proces vymazania chodidiel. Pruhy=1 mm. h) Kvantifikácia počtu procesov chodidiel na mikrometer glomerulárnej bazálnej membrány (GBM). n=3 myší na genotyp. Hodnoty sú prezentované ako jednotlivé grafy a priemerná SEM. Každý graf predstavuje priemerný počet podocytov na mikrometer GBM na 1 súvislú dĺžku GBM. Nepárový t-test s rovnakou SD: P=0.7512. Ak chcete optimalizovať zobrazenie tohto obrázka, pozrite si online verziu tohto článku na adrese www.obličky-international.org.
Tu sme použili hypertenzný model založený na AngII perfúzii a HSD. Podocyty vykazujú receptory AT1 a sú vystavené voľne filtrovaným peptidom, ako je AngII.13,16,26,61–65 Predpokladá sa, že pozorované renoprotektívne účinky inhibície RAAS by mohli byť – aspoň čiastočne – spôsobené blokádou tohto podocytu. špecifické RAAS. Podobne štúdie in vivo potvrdili účinok AngII na poškodenie podocytov a génové zacielenie AT1 špecifické pre podocyty preukázali, že aktivácia receptorov AT1 v glomeruloch pri experimentálnej lupusovej nefritíde je dostatočná na urýchlenieobličkyporanenia pri absencii hypertenzie.66,67 sprostredkované Calpaínomautofágiadysregulácia v našom modeli by mohla byť spojená s priamou signalizáciou AngII-AT1 na podocytoch alebo by mohla byť dôsledkom hypertenzie. Na túto otázku môžeme poskytnúť skorú odpoveď. V modeli DOC-soľ sme skutočne našli akumuláciu P62 v podocytoch z hypertenzných myší (doplnkový obrázok S3). To naznačuje, že autofagická blokáda sa vyskytuje v podocytoch v tomto modeli, o ktorom sa predpokladá, že je nezávislý od AngII.68 Ďalšie štúdie hodnotiace poškodenie podocytov súvisiace s aktivitou calpainu a autofagickým efluxom u myší s deficitom AT1 v podocytoch selektívne by bolo potrebné vymedziť, či takáto regulácia autofágia podocytov závisí od priamych alebo nepriamych účinkov AngII.
Obrázok 8 |calpastatinnadmerná expresia zabraňuje indukcii angiotenzínu II (AngII) D diétou s vysokým obsahom soli (HSD).autofágiadownregulácia v podocytoch. (a, b) Reprezentatívne imunofluorescenčné obrázky expresie P62 (zelená) a Podokalyxínu (PODXL; červená) v glomeruloch zo zeleného fluorescenčného proteínu FL (GFP) – LC3 a CSTTg (calpastatintransgénne) myši GFP-LC3 po 6 týždňoch AngII + HSD. Časti obrázku s prvočíslom označujú väčšie zväčšenie. Jadrá boli zafarbené pomocou Hoechst (modrá). Pruhy=50 mm. (c,d) Kvantifikácia P62þ plochy na glomerulárnu sekciu. n=9 myší divokého typu (WT) a n=7 myší CSTTg v (c) a n=16 myší GFP-LC3 a n{11}} myší CSTTg GFP-LC3 v (d). Hodnoty sú prezentované ako jednotlivé grafy a priemer ± SEM. Mann-Whitney test: **P=0,0033 v (c), **P=0,0011 v (d). (e, f) Reprezentatívne imunofluorescenčné obrazy expresie GFP (zelená) a P62 (červená) v glomeruloch z myší GFP-LC3 a CSTTg GFP-LC3 po 6 týždňoch AngII + HSD. Časti obrázku s prvočíslom označujú väčšie zväčšenie. Šípky označujú autofagozómy GFPþ P62þ. g) Kvantifikácia počtu LC3þ P62þ bodiek na podocyt. n=11 myší GFP-LC3 a n{31}} myší CSTTg GFP-LC3. Hodnoty sú prezentované ako jednotlivé grafy a priemer ± SEM. Nepárový t-test s rovnakou SD: P=0.1014. Ak chcete optimalizovať zobrazenie tohto obrázka, pozrite si online verziu tohto článku na adrese www.obličky-international.org.
Tabuľka 1|Vlastné RT2 Profiler PCR Array
Calpain{0}} a calpain{1}} sú všadeprítomné prozápalové proteázy, ktorých aktivita je riadenácalpastatin, ich špecifický inhibítor. Kalpastatín skutočne selektívne inhibuje calpaíny a doteraz žiadne iné proteázy. Aktivácia Calpainu bola nedávno spojená sobličkyporanenia v niekoľkých patologických súvislostiach.69,70 Zistilo sa, že kanál C6 prechodného potenciálu transportéra kalciového kanála aktivuje kalpaín-1 v podocytoch prostredníctvom aktivácie Ca2+/kalcineurínu. Obličky pacientov s fokálnou a segmentálnou glomerulosklerózou mali zvýšenú expresiu kanála C6 prechodného receptorového potenciálu, zvýšenú aktivitu calpainu a kalcineurínu a zníženú expresiu cieľového talínu calpainu-1, ktorý je rozhodujúci pre stabilitu cytoskeletu podocytov.71 Kanál prechodného potenciálu receptora C6 sa tiež priamo viaže na calpain-1 a calpain{10}}. Táto interakcia je kľúčová pre reguláciu štiepenia talínom{11}} a kontrolu motility podocytov.72
Nadmerná expresia transgénnych myšícalpastatinsú chránené pred vaskulárnou remodeláciou a zápalom závislým od AngII73; proti zápalu v modeloch glomerulonefritídy,43 sepsy,74 alebo odmietnutia aloštepu75; a proti zápalu súvisiacemu s vekom.76 Poškodenie podocytov u týchto myší nebolo skúmané. Peltier a kol. ukázali, že nadmerná expresiacalpastatinzabránili AngII-dependentnému perivaskulárnemu zápalu v obličkách.43 Ochrana obličiek u CSTTg myší teda mohla byť sprostredkovaná, aspoň čiastočne, protizápalovým mechanizmom. Hodnotili sme infiltráciu makrofágov a lymfocytov v našom modeli a nezistili sme žiadny významný rozdielobličkyzápal medzi CSTTg a kontrolnými myšami pri analýze globálneobličkyinfiltrácia leukocytov (doplnkový obrázok S6).
Calpain sa nedávno podieľal na regulácii autofágie (nedávno preskúmaný vo Weber et al.53) so zaujímavými a bioprotektívnymi vlastnosťami inhibície calpainu v diabetickom kontexte prostredníctvom obnovyautofágia77 Tu sme uviedli, že inhibícia calpaínu prostredníctvomcalpastatinnadmerná expresia (i) zabránila poškodeniu podocytov počas hypertenzie a (ii) obnovila autofágiu v podocytoch, čím sa zdôraznila nová škodlivá úloha aktivácie calpainu počas hypertenzie prostredníctvom inhibícieautofágia.
Ukázalo sa, že takmer všetky ATG proteíny sú štiepené kalpaínmi in vitro. 78 Tu sme to predpokladaliautofágiaudržiavanie u hypertenzných myší CSTTg bolo sprostredkované inhibíciou kalpaínu. Na podporu našej hypotézy sme ukázali, že podocyty z CSTTg majú zníženú aktivitu calpaínu, keď sú in vitro vystavené AngII (obrázok 3c). Zistili sme zvýšenú hladinu proteínu ATG5 v podocytoch z myší CSTTg, čo naznačuje, že nadmerná expresia kalpastatínu v tomto kontexte zabránila štiepeniu ATG5 sprostredkovanému kalpaínom (obrázok 5a). Naproti tomu bolo preukázané, žecalpastatin-sprostredkovaná inhibícia kalpaínu by mohla byť nezávislá od inhibície ich proteázovej aktivity79; nemohli sme teda vylúčiť reguláciu autofágie kalpastatínom nezávisle od enzymatickej aktivity kalpaínu.
Stručne povedané, tieto zistenia odhalili predtým nepoznanú úlohucalpastatinpri regulácii podocytovautofágiaa poskytli vodítko pre výskum nových terapeutických stratégií na zvýšenie prežitia podocytov počas hypertenzných nefropatií.
DISCLOSURE
Všetci autori nedeklarovali žiadne konkurenčné záujmy.
POĎAKOVANIE
Túto prácu podporil Institut National de la Santé Et de la recherche Médicale (Inserm) a Université de Paris. IB bola podporovaná absolventským štipendiom z Ministère de l'EducationNationale, de la Recherche et de la Technologie. OL bol financovaný prostredníctvom ceny Európskej nadácie pre štúdium diabetu (EFSD) podporovanej programom EFSD/Novo Nordisk pre výskum diabetu v Európe a grantom Société Francophone duDiabète (SFD). BR a CH boli financované počiatočným grantom 107037 od Európskej rady pre výskum a Európskej únie (P-LT). YS podporilo absolventské štipendium z Fondation de France.
Ďakujeme Elizabeth Huc, Nicolasovi Perezovi, Corine Suldac a tímu ERIU970 (Université de Paris, PARCC, Inserm, Paríž, Francúzsko) za pomoc pri starostlivosti a manipulácii so zvieratami, Nicolasovi Sorhaindovi za biochemické merania (ICB-IFR2, Laboratoire de Biochimie, Hôpital Bichat , Paríž, Francúzsko) a Alain Schmitt a Jean-Marc Massefor transmisná elektrónová mikroskopia (Institut Cochin, Paríž, Francúzsko). Ďakujeme Morgane Le Gall (Cochin proteomické zariadenie 3P5, Paríž, Francúzsko) za pomoc pri analýze silico. Oceňujeme administratívnu podporu od Véronique Oberweis, Bruno Pillard a Cyrille Mahieux (Université de Paris, PARCC, Inserm, Paríž, Francúzsko).
DOPLNKOVÝ MATERIÁL
Doplnkový súbor (PDF)
Obrázok S1. Primárna podocytová kultúra exprimuje podocytové markery. Western blot analýza expresie podocytových markerov NPHS1 a NPHS2 v primárnej podocytovej kultúre od WT a CSTTg myší. Tubulín (TUBA) slúži ako kontrola zaťaženia. Predstaviteľ n=4 myší na genotyp.
Obrázok S2. Vysoká bazálna hladina podocytovautofágia. (A, B) Reprezentatívne imunofluorescenčné snímky expresie GFP (zelená) a NPHS1 (červená) v glomeruloch z myší GFP-LC3 liečených alebo neliečených CQ (80mg/kg) 4 hodiny pred usmrtením. Šípky ukazujú GFPþ autofagozómy. (C, D) Reprezentatívne imunofluorescenčné obrázky expresie GFP (zelená) a P62 (červená) v glomeruloch z myší GFP-LC3 liečených alebo neliečených CQ (80 mg/kg) 4 hodiny pred usmrtením. Šípky ukazujú GFPþ P62þ autofagozómy. (A–D) (0 ) predstavujú väčšie zväčšenie. Jadrá boli zafarbené pomocou Hoechst (modrá). Tyč=50 mm. N=4 myší na stav (E–H) Reprezentatívne imunofluorescenčné snímky expresie GFP (zelená) a P62 (červená) v primárnych podocytoch z myší GFP-LC3 liečených (F, H) alebo neošetrených (E, G s Bafifilomycínom Al (100 nM) počas 4 hodín. N=5 myší na stav.
Obrázok S3. P62 sa akumuluje v podocytoch v DOC-soľnom modeli hypertenzie. (A – C) Reprezentatívne imunofluorescenčné obrázky expresie P62 (zelená) a PODXL (červená) v glomeruloch z myší WT po 2 až 6 týždňoch modelu DOC-soľ. (0 ) predstavujú väčšie zväčšenie. Jadrá boli zafarbené pomocou Hoechst (modrá). Tyč ¼ 50 mm. (D) Kvantifikácia plochy P62 na plochu podocytov (v percentách). N=5–6 myší na stav. Jednosmerná analýza rozptylu: čas P=0.0059, Sidakov viacnásobný porovnávací test: D42 verzus D14 **P=0.0055, D28 verzus D14 P=0.8590.
Obrázok S4. Podocytautofágiaje nevyhnutný pre vývoj podocytov. (A) Systolický krvný tlak, (B) pomer albumínu ku kreatinínu v moči a (C) hladiny dusíka močoviny v krvi u myší Atg5lox/lox a Nphs2.cre Atg5lox/lox. N=5–6 myší na genotyp. Hodnoty sú prezentované ako jednotlivé grafy a priemery±SEM. Mann-Whitney test: P=0.7273 (A), P=0.4286 (B) a P=0.6623 (C). (D-E) Reprezentatívne obrázky Massonových trichrómom zafarbených častí glomerulov z myší Atg5lox/lox a Nphs2.cre Atg5lox/lox. (F–G) Reprezentatívne imunofluorescenčné snímky expresie PODXL (zelená) a WT1 (červená) u myší Atg5lox/lox a Nphs2.cre Atg5lox/lox. Jadrá boli zafarbené pomocou Hoechst (modrá). (D–G) Tyč=50 mm. N ¼ 6 myší na genotyp. (H–I) Reprezentatívne mikrofotografie sekcií glomerulov z transmisnej elektrónovej mikroskopie z myší Atg5lox/lox a Nphs2.cre Atg5lox/lox. Tyč=1 mm. N=3 myší na genotyp.
Obrázok S5.calpastatinnadmerná expresia neovplyvňujeobličkyfungovať na základnej úrovni. (A) hladiny močovinového dusíka v krvi a (B) hladiny plazmatického albumínu u 12-týždňových myší GFP-LC3 a CSTTg GFP-LC3. N=5 GFP-LC3 a N=6 CSTTg GFP-LC3. Hodnoty sú prezentované ako jednotlivé grafy a priemery±SEM. Mann-Whitney test: P=0.6623 (A) a P=0.9307 (B). (C, D) Reprezentatívne obrázky Massonových trichrómom zafarbených rezov glomerulov z myší GFP-LC3 a CSTTg GFP-LC3. (E–H) Reprezentatívne imunofluorescenčné snímky expresie PODXL (E, F) a NPHS1 (G, H) u myší GFP-LC3 a CSTTg GFP-LC3. (C–H) Tyč=50 mm. (I, J) Súvisiaca kvantifikácia plochy PODXL a NPHS1 na glomerulárnu sekciu. N=5 GFP-LC3 a N{19}} CSTTg GFP-LC3. Hodnoty sú prezentované ako jednotlivé grafy a priemery±SEM. Mann-Whitney test: P=0.1898 (A) a P=0.8413 (B).
Cistanche-funkcia obličiek
Obrázok S6.calpastatinnadmerná expresia neovplyvňuje globálny zápal obličiek. Reprezentatívna imunohistochémia expresie F4/80 (A, B) a CD3 (D–E) u myší GFP-LC3 a CSTTg GFP-LC3 po 6 týždňoch liečby angiotenzínom II þHSD. Pruh=200 mm. (C, F) Súvisiaca kvantifikácia plochy F4/80 a CD3 naobličkyoddiele. N=7 myší CSTTg GFP-LC3 a N=8 GFP-LC3. Hodnoty sú prezentované ako jednotlivé grafy a priemery SEM. Mann-Whitney test: P=0.3969 (C) P= 0.3357 (F).
Obrázok S7. Podocytautofágiadeficiency does not induce ER stress or oxidative stress in young adults at baseline. qPCR analysis of the mRNA expression of genes of the ER stress, oxidative stress, and apoptosis pathway by Qiagen qPCR array in glomeruli from WT and Nphs2.cre Atg5lox/lox mice (A) and WT and CSTTg mice (B). N=4 mice per genotype. For Nox3, Ct >33.
Tabuľka S1. In silico prevízia calpainových štiepnych miest. Miesta štiepenia Calpainu boli predpovedané v proteínoch súvisiacich s podocytmi a autofágiou pomocou GPS-CCD (http://ccd.biocuckoo.org), CaMPDB (HTTP:// calpain.org) a DeepCalpain Predict (http://deepcalpain. cancerbio. info/help.php). Doplnkový súbor (Excel)
Doplnková tabuľka S2. Úplný súbor in silico prehliadok miest štiepenia calpaínom. Miesta štiepenia kalpaínom boli predpovedané v podocytoch súvisiacich aautofágia-príbuzné proteíny s GPS-CCD (http://ccd. biocuckoo.org), CaMPDB (http://calpain.org) a DeepCalpain Predict (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php). Predpovedané miesta štiepenia sa obnovia pre každý proteín pre GPS-CCD a DeepCalpain Predict.
LITERATÚRA
1. Coresh J, Selvin E, Stevens LA a kol. Prevalencia chronickýchobličkychoroby v Spojených štátoch. JAMA. 2007;298:2038–2047.
2. Collins AJ, Vassalotti JA, Wang C, a kol. Na koho by sa mal zamerať skríning CKD? Vplyv cukrovky, hypertenzie a kardiovaskulárnych ochorení. Am J Kidney Dis. 2009;53:S71–S77.
3. Chang TI, Li S, Chen SC, a kol. Rizikové faktory pre ESRD u jedincov so zachovanou odhadovanou GFR s albuminúriou a bez nej: výsledky z programu Kidney Early Evaluation Program (KEEP). Am J Kidney Dis. 2013;61:S4–S11.
4. Hsu CY, McCulloch CE, Darbinian J, a kol. Zvýšený krvný tlak a riziko konečného štádia ochorenia obličiek u jedincov bez základného ochorenia obličiek. Arch Intern Med. 2005;165:923–928.
5. Nagase M, Shibata S, Yoshida S, a kol. Poškodenie podocytov je základom glomerulopatie potkanov Dahlových hypertenzných solí a je zvrátené blokátorom aldosterónu. Hypertenzia. 2006;47:1084–1093.
6. Garovič VD, Wagner SJ, Turner ST a kol. Vylučovanie podocytov močom ako marker preeklampsie. Am J Obstet Gynecol. 2007;196, 320.e321–e327.
7. Craici IM, Wagner SJ, Bailey KR, et al. Podocytúria predchádza proteinúrii a klinické znaky preeklampsie: longitudinálna prospektívna štúdia. Hypertenzia. 2013;61:1289–1296.
8. Wang G, Lai FM, Kwan BC, a kol. Strata podocytov pri ľudskej hypertenznej nefroskleróze. Am J Hypertens. 2009;22:300–306.
9. Wang G, Kwan BC, Lai FM a kol. Intrarenálna expresia miRNA u pacientov s hypertenznou nefrosklerózou. Am J Hypertens. 2010;23:78–84.
10. Ruggenenti P, Perna A, Gherardi G, a kol. Chronické proteinurické nefropatie: výsledky a odpoveď na liečbu v prospektívnej skupine 352 pacientov s rôznymi vzormi poškodenia obličiek. Am J Kidney Dis. 2000;35:1155–1165.
11. Fukuda A, Wickman LT, Venkatareddy MP a kol. Pretrvávajúca strata podocytov z destabilizovaných glomerulov závislá od angiotenzínu II spôsobuje progresiu konečného štádiaobličkychoroba. Kidney Int. 2012;81:40–55.
12. Tuncdemir M, Ozturk M. Účinky blokátorov receptora angiotenzínu-II na poškodenie podocytov a glomerulárnu apoptózu na potkanom modeli experimentálnej diabetickej nefropatie vyvolanej streptozotocínom. Acta Histochem. 2011;113:826–832.
13. Nijenhuis T, Sloan AJ, Hoenderop JG a kol. Angiotenzín II prispieva k poškodeniu podocytov zvýšením expresie TRPC6 prostredníctvom signálnej dráhy pozitívnej spätnej väzby sprostredkovanej NFAT. Am J Pathol. 2011;179:1719–1732.
14. Študijná skupina EUCLID. Randomizovaná placebom kontrolovaná štúdia lizinoprilu u normotenzných pacientov s inzulín-dependentným diabetom a normoalbuminúriou alebo mikroalbuminúriou. Lancet. 1997;349:1787–1792.
15. de Zeeuw D, Remuzzi G, Parving HH a kol. Proteinúria, cieľ renoprotekcie u pacientov s diabetickou nefropatiou 2. typu: lekcie z RENTALu. Kidney Int. 2004;65:2309–2320.
16. Benigni A, Gagliardini E, Remuzzi G. Zmeny v selektivite glomerulárnej perm indukovanej angiotenzínom II znamenajú dysfunkciu podocytov a preskupenie proteínov štrbinovej bránice. Semin Nephrol. 2004;24:131–140.
17. Wang L, Flannery PJ, Spurney RF. Charakterizácia podtypov receptora angiotenzínu II v podocytoch. J Lab Clin Med. 2003;142:313–321.
18. Langham RG, Kelly DJ, Cox AJ a kol. Proteinúria a expresia proteínu diafragmy štrbiny podocytov, nefrínu, pri diabetickej nefropatii: účinky inhibície enzýmu konvertujúceho angiotenzín. Diabetológia. 2002;45:1572–1576.
19. Nakamura T, Ushiyama C, Suzuki S, a kol. Účinky inhibítora angiotenzín-konvertujúceho enzýmu, antagonistu receptora angiotenzínu II a antagonistu vápnika na močové podocyty u pacientov s IgA nefropatiou. Am J Nephrol. 2000;20:373–379.
20. Henger A, Huber T, Fischer KG a kol. Angiotenzín II zvyšuje aktivitu cytosolického vápnika v podocytoch potkanov v kultúre. Kidney Int. 1997;52: 687–693.
21. Praga M, Hernandez E, Montoyo C, a kol. Dlhodobé priaznivé účinky inhibície enzýmu konvertujúceho angiotenzín u pacientov s nefrotickou proteinúriou. Am J Kidney Dis. 1992;20:240–248.
22. Nitschke R, Henger A, Ricken S, a kol. Angiotenzín II zvyšuje intracelulárnu aktivitu vápnika v podocytoch intaktného glomerulu.ObličkyInt. 2000;57:41–49.
23. Gloy J, Henger A, Fischer KG a kol. Angiotenzín II moduluje bunkové funkcie podocytov. Kidney Int Suppl. 1998;67:S168–S170.
24. Miceli I, Burt D, Taraba E, et al. Stretch znižuje expresiu nefrínu prostredníctvom mechanizmu závislého od angiotenzínu II-AT(1) v ľudských podocytoch: účinok rosiglitazónu. Am J Physiol Renálny Physiol. 2010;298:F381–F390.
25. Endlich N, Endlich K. Natiahnutie, napätie a adhézia – adaptačné mechanizmy aktínového cytoskeletu v podocytoch. Eur J Cell Biol. 2006;85:229–234.
26. Durvasula RV, Petermann AT, Hiromura K, a kol. Aktivácia lokálneho tkanivového angiotenzínového systému v podocytoch mechanickým namáhaním. Kidney Int. 2004;65:30–39.
27. Riser BL, Cortes P, Heilig C a kol. Cyklická napínacia sila selektívne up-reguluje transformujúce izoformy rastového faktora-beta v kultivovaných potkaních mezangiálnych bunkách. Am J Pathol. 1996;148:1915–1923.
28. Kretzler M, Koeppen-Hagemann I, Kriz W. Poškodenie podocytov je kritickým krokom vo vývoji glomerulosklerózy u uni nefrektomizovaných-desoxykortikosterónových hypertenzných potkanov. Archív Vircows. 1994;425:181–193.
29. Jung HS, Chung KW, Won Kim J a kol. Strata autofágie znižuje hmotnosť a funkciu pankreatických beta-buniek s následnou hyperglykémiou. Cell Metab. 2008;8:318–324.
30. Ebato C, Uchida T, Arakawa M, et al.Autofágiaje dôležitý pri homeostáze ostrovčekov a kompenzačnom zvýšení hmoty beta-buniek v reakcii na diétu s vysokým obsahom tukov. Cell Metab. 2008;8:325–332.
31. Lenoir O, Jasiek M, Henique C, a kol. Autofágia endotelových buniek a podocytov synergicky chránia pred glomerulosklerózou vyvolanou cukrovkou. Autofágia. 2015;11:1130–1145.
32. Hartleben B, Godel M, Meyer-Schwesinger C, a kol. Autofágia ovplyvňuje náchylnosť na glomerulárnu chorobu a udržiava homeostázu podocytov u starnúcich myší. J Clin Invest. 2010;120:1084–1096.
33. Sato S, Kitamura H, Adachi A, a kol. Dva typy autofágie v podocytoch vo vzorkách renálnej biopsie: ultraštrukturálna štúdia. J Submikrosc Cytol Pathol. 2006;38:167–174.
34. Asanuma K, Tanida I, Shirato I, et al. MAP-LC3, sľubný autofagozomálny marker, sa spracováva počas diferenciácie a obnovy podocytov z nefrózy PAN. FASEB J. 2003;17:1165–1167.
35. Mizushima N, Levine B, Cuervo AM, a kol.Autofágiabojuje proti chorobe prostredníctvom bunkového samotrávenia. Príroda. 2008;451:1069–1075.
36. Yang L, Li P, Fu S, a kol. Defektná autofágia pečene pri obezite podporuje ER stres a spôsobuje inzulínovú rezistenciu. Cell Metab. 2010;11:467–478.
37. Xie Z, Klionsky DJ. Tvorba autofagozómov: jadrové mechanizmy a adaptácie. Nat Cell Biol. 2007;9:1102–1109.
38. Kume S, Thomas MC, Koya D. Snímanie živín, autofágia a diabetická nefropatia. Diabetes. 2012;61:23–29.
39. Kume S, Uzu T, Maegawa H, a kol. Autofágia: nový terapeutický cieľ preobličkychoroby. Clin Exp Nephrol. 2012;16:827–832.
40. Huber TB, Edelstein CL, Hartleben B, a kol. Vznikajúca úlohaautofágiapri funkcii obličiek, chorobách a starnutí. Autofágia. 2012;8:1009–1031.
41. Weide T, Huber TB. Dôsledky autofágie na glomerulárne starnutie a ochorenie. Cell Tissue Res. 2011;343:467–473.
42. Bork T, Liang W, Yamahara K a kol. Podocyty si udržiavajú vysoké bazálne hladiny autofágie nezávisle od signalizácie mtor. Autofágia. 2020;16:1932–1948.
43. Peltier J, Bellocq A, Perez J, a kol. Aktivácia a sekrécia kalpaínu podporujú poškodenie glomerulov pri experimentálnej glomerulonefritíde: dôkaz zcalpastatin- transgénne myši. J Am Soc Nephrol. 2006;17:3415–3423.
44. Moeller MJ, Sanden SK, Soofifi A, et al. Podocytovo špecifická expresia Cre rekombinázy u transgénnych myší. Genesis. 2003;35:39–42.
45. Hara T, Nakamura K, Matsui M, et al. Potlačenie bazálnej autofágie v nervových bunkách spôsobuje neurodegeneratívne ochorenie u myší. Príroda. 2006;441: 885–889.
46. Lazareth H, Henique C, Lenoir O, a kol. Tetraspanín CD9 riadi migráciu a proliferáciu parietálnych epitelových buniek a progresiu glomerulárnej choroby. Nat Commun. 2019;10:3303.
47. Bollee G, Flamant M, Schordan S, a kol. Receptor epidermálneho rastového faktora podporuje glomerulárne poškodenie a zlyhanie obličiek pri rýchlo progresívnej crescentickej glomerulonefritíde. Nat Med. 2011;17:1242–1250.
48. Lenoir O, Milon M, Virsolvy A, a kol. Priame pôsobenie endotelínu-1 na podocyty podporuje diabetickú glomerulosklerózu. J Am Soc Nephrol. 2014;25:1050–1062.
49. Henique C, Bollee G, Lenoir O, a kol. Faktor 2 súvisiaci s erytroidným faktorom nukleárneho faktora 2- riadi podocytovo špecifickú expresiu receptora g aktivovaného peroxizómovým proliferátorom, ktorý je nevyhnutný pre rezistenciu na crescentic GN. J Am Soc Nephrol. 2016;27:172–188.
50. Perez J, Dansou B, Herve R, a kol. Kalpaíny uvoľňované T lymfocytmi štiepia TLR2, aby kontrolovali expresiu IL-17. J Immunol. 2016;196:168–181.
51. Raimbourg Q, Perez J, Vandermeersch S, a kol. calpain/calpastatinsystém má protichodné úlohy v raste a metastatickom šírení melanómu. PLoS One. 2013;8:e60469.
52. Letavernier B, Zafrani L, Nassar D, a kol. Kalpaíny prispievajú k vaskulárnej oprave pri rýchlo progresívnej forme glomerulonefritídy: potenciálna úloha ich externalizácie. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2012;32:335–342.
53. Weber JJ, Pereira Sena P, Singer E, a kol. Zabitie dvoch nahnevaných vtákov jednou ranou:autofágiaaktivácia inhibíciou calpaínov pri neurodegeneratívnych ochoreniach a mimo nich. Biomed Res Int. 2019;2019:4741252.
54. Liu Z, Cao J, Gao X, a kol. GPS-CCD: nový výpočtový program na predpovedanie miest štiepenia calpaínom. PLoS One. 2011;6:e19001.
55. duVerle D, Takigawa I, Ono Y, a kol. CaMPDB: zdroj pre calpain a modulačnú proteolýzu. Genome Inform. 2010;22:202–213.
56. Liu ZX, Yu K, Dong J, a kol. Presná predpoveď calpainových štiepnych miest a ich odchýlky spôsobené mutáciami pri rakovine. Predná Genet. 2019; 10: 715.
57. Yousefifi S, Perozzo R, Schmid I, a kol. Calpainom sprostredkované štiepenie Atg5 prepína autofágiu na apoptózu. Nat Cell Biol. 2006;8:1124–1132.
58. Xia HG, Zhang L, Chen G, a kol. Kontrola bazálnej autofágie štiepením ATG5 sprostredkovaným calpainom1.Autofágia. 2010;6:61–66.
59. Russo R, Berliocchi L, Adornetto A, a kol. Calpaínom sprostredkované štiepenie Beclin{2}} a autofágová deregulácia po ischemickom poškodení sietnice in vivo. Cell Death Dis. 2011;2:e144.
60. Yadav A, Vallabu S, Arora S, a kol. ANG II podporujeautofágiav podocytoch. Am J Physiol Cell Physiol. 2010;299:C488–C496.
61. Flannery PJ, Spurney RF. Transaktivácia receptora epidermálneho rastového faktora angiotenzínom II v glomerulárnych podocytoch. Nephron Exp Nephrol. 2006;103:e109–e118.
62. Harrison-Bernard LM, Navar LG, Ho MM a kol. Imunohistochemická lokalizácia receptora ANG II AT1 u dospelých potkanovobličkypoužitím monoklonálnej protilátky. Am J Physiol. 1997;273:F170–F177.
63. Liebau MC, Lang D, Bohm J, a kol. Funkčná expresia renín-angiotenzínového systému v ľudských podocytoch. Am J Physiol Renálny Physiol. 2006;290:F710–F719.
64. Cena Pavenstadta H. Franza Volharda 2000: signalizácia angiotenzínu II v podocyte. Kidney Blood Press Res. 2000;23:156–158.
65. Wennmann DO, Hsu HH, Pavenstadt H. Systém renín-angiotenzín aldosterón v podocytoch. Semin Nephrol. 2012;32:377–384.
66. Jia J, Ding G, Zhu J a kol. Infúzia angiotenzínu II indukuje zmeny expresie nefrínu a apoptózu podocytov. Am J Nephrol. 2008;28:500–507.
67. Crowley SD, Vasievich MP, Ruiz P a kol. Glomerulárne receptory angiotenzínu typu 1 zvyšujú poškodenie obličiek a zápal pri myšacej autoimunitnej nefritíde. J Clin Invest. 2009;119:943–953.
68. Song K, Stuart D, Abraham N, a kol. Renín zberných kanálikov nesprostredkováva hypertenziu DOCA-soľ alebo poškodenie obličiek. PLoS One. 2016;11: e0159872.
69. Liu Z, Ji J, Zheng D, a kol. Ochranná úloha endoteliálneho knockoutu calpainu pri akútnych stavoch vyvolaných lipopolysacharidmiobličkyporanenia prostredníctvom útlmu p38-iNOS dráhy a produkcie NO/ROS. Exp Mol Med. 2020;52:702–712.
70. Seremwe M, Schnellmann RG, Bollag WB. Aktivita kalpaínu{1}} je základom produkcie aldosterónu indukovanej angiotenzínom II v bunkovom modeli rulosa nadobličiek. Endokrinológia. 2015;156:2138–2149.
71. Verheijden KAT, Sonneveld R, Bakker-van Bebber M, et al. Na vápniku závislá proteáza calpain-1 spája aktivitu TRPC6 s poškodením podocytov. J Am Soc Nephrol. 2018;29:2099–2109.
72. Farmer LK, Rollason R, Whitcomb DJ a kol. TRPC6 sa viaže na kalpaín a aktivuje ho, nezávisle od aktivity jeho kanála, a reguluje cytoskelet podocytov, bunkovú adhéziu a motilitu. J Am Soc Nephrol. 2019;30: 1910–1924.
73. Letavernier E, Perez J, Bellocq A, a kol. Zacielenie na systém calpain/calpastatin ako nová stratégia na prevenciu kardiovaskulárnej remodelácie pri hypertenzii indukovanej angiotenzínom II. Circ Res. 2008;102:720–728.
74. Zafrani L, Gerotziafas G, Byrnes C, a kol.calpastatinkontroluje polymikrobiálnu sepsu obmedzením uvoľňovania prokoagulačných mikročastíc. Am J Respir Crit Care Med. 2012;185:744–755.
75. Letavernier E, Dansou B, Lochner M, et al. Kritická úloha rovnováhy calpain/kalpastatín pri akútnom odmietnutí aloštepu. Eur J Immunol. 2011;41: 473–484.
76. Hanouna G, Mesnard L, Vandermeersch S, a kol. Špecifická inhibícia kalpaínu chrániobličkyproti zápalom. Sci Rep. 2017;7:8016.
77. Ong SB, Lee WH, Shao NY a kol. Obnovuje sa inhibícia kalpaínuautofágiaa zabraňuje mitochondriálnej fragmentácii v ľudskom iPSC modeli diabetickej endo liopatie. Rep. kmeňových buniek 2019;12:597–610.
78. Norman JM, Cohen GM, Bampton ET. In vitro štiepenie vysokých proteínov proteázami bunkovej smrti. Autofágia. 2010;6:1042–1056.
79. De Tullio R., Averna M., Pedrazzi M. a kol. Diferenciálna regulácia komplexu calpain-kalpastatín L-doménoucalpastatin. Biochim Biophys Acta. 2014;1843:2583–2591.
