skJazyk
Domov / Vedomosti / Obsah

Vedomosti

Chimérické častice podobné vírusu ľudského papilomavírusu-16 prezentujúce peptidy P18I10 a T20 z HIV-1 obálka indukujúca HPV16 a HIV-1-špecifickú humorálnu a T bunkami sprostredkovanú imunitu u myší BALB/c

Dec 07, 2023

Abstrakt:

V tejto štúdii sa HIV{0}} P18I10 CTL peptid odvodený od V3 slučky HIV-1 gp120 a T20 antifúzny peptid HIV-1 gp41 vložili do kapsidového proteínu HPV16 L1 na konštrukciu chimérických HPV: HIV (L1:P18I10 a L1:T20) VLPs použitím expresného systému cicavčích buniek. HPV: HIV VLP boli purifikované chromatografiou. Ukázali sme, že inzercia peptidov P18I10 alebo T20 do DE slučky kapsidových proteínov HPV16 L1 neovplyvnila in vitro stabilitu, samozostavenie a morfológiu chimérických HPV: HIV VLP. Dôležité je, že neinterferoval ani s reaktivitou protilátok HIV{23}} zameraných na sekvenčné a konformačné peptidy P18I10 a T20 prezentované na chimérických HPV: HIV VLP, ani s indukciou protilátok špecifických pre HPV16 L{28}} in vivo. Zistili sme, že chimérické vakcíny L1:P18I10/L1:T20 VLPs môžu vyvolať HPV16-, ale slabé HIV-1-špecifické protilátkové reakcie a vyvolať HPV16- a HIV-1-špecifické T- bunkové odpovede u BALB/c myší. Okrem toho by mohol byť potenciálnym posilňovačom na zvýšenie HIV-špecifických bunkových reakcií pri heterológnej imunizácii po primárnej imunizácii vakcínou BCG.HIVA. Táto výskumná práca by prispela k vývoju novej chimérickej HPV: HIV VLP-based vakcínovej platformy na kontrolu HPV16 a HIV-1 infekcie, ktorá je naliehavo potrebná v rozvojových a industrializovaných krajinách.

Desert ginseng-Improve immunity (12)

cistanche výhody pre mužov - posilnenie imunitného systému

Kliknite sem pre zobrazenie produktov Cistanche Enhance Immunity

【Požiadať o viac】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Kľúčové slová:

HIV-1; HPV16; vakcína; častice podobné vírusom; P18I10; T20 enfuvirtid; BCG.HIVA; humorálna imunita; Imunita sprostredkovaná T bunkami

1. Úvod

Vírus ľudskej imunodeficiencie-1 (HIV{1}}), ktorý spôsobuje syndróm získanej imunodeficiencie (AIDS), bol objavený začiatkom 80. rokov minulého storočia a odvtedy sa stal globálnou epidémiou [1]. Hoci vysoko aktívna antiretrovírusová liečba (HAART) spolu s preexpozičnou profylaxiou (PrEP) môže mať skutočný vplyv na kontrolu infekcie HIV-1, očkovanie je stále základným prístupom pre verejný prospech a presadzovanie koniec globálnej epidémie HIV-1 [2]. Napriek viac ako trom desaťročiam dôkladného výskumu HIV-1 a početným klinickým skúškam vakcín je doteraz licencovaná vakcína proti HIV{10}} stále nedosiahnuteľná. Štúdia RV144 uskutočnená v Thajsku bola prvým prípadom, ktorý odhalil miernu účinnosť 31,2 % proti získaniu infekcie HIV-1 [3]. Väčšina ďalších kandidátov na vakcínu proti HIV{16}}, ktoré prešli klinickými skúškami, bola založená najmä na modeloch DNA, rekombinantných vírusových vektorov alebo podjednotkových proteínových modelov [4,5]. V ideálnom prípade je účinná vakcína proti HIV-1 schopná vyvolať vrodené imunitné reakcie, neutralizovať protilátky, aby sa zabránilo vírusovej infekcii [6], ako aj reakcie cytotoxických T lymfocytov (CTL) na elimináciu infikovaných buniek [7]. Vyvolanie každej odpovede si však môže vyžadovať rôzne stratégie vakcín, čo si vyžaduje samostatné, ale paralelné vývojové úsilie. Výber imunogénov a transportných vektorov bude mať významný vplyv na funkciu a špecifickosť HIV-1 vakcín [8,9]. Opakované zlyhania pri použití štandardných prístupov pre vývoj vakcíny proti HIV{25}} viedli k uznaniu dôležitosti výberu vektora na podávanie, režimov prime-boost a špecifickosti imunogénu v humorálnych aj bunkových odpovediach. Je už známych viac ako 100 typov ľudského papilomavírusu (HPV) a HPV genotypy 16 a 18 sa považujú za zodpovedné za približne 70 % karcinómov krčka maternice na celom svete [10]. Častice podobné vírusu HPV L1 (VLP), klasifikované ako typ podjednotkových vakcín, by mohli prevažne indukovať porovnateľné L1- špecifické humorálne odpovede na virión divokého typu a tiež odpovede sprostredkované T bunkami [11–13]. V súčasnosti sú na trhu licencované tri preventívne vakcíny proti HPV a všetky sú založené na VLP kapsidového proteínu HPV L1. Dva z nich, Gardasil (Merck, Rahway, NJ, USA) a Gardasil{40}} (Merck), sú produkované kvasinkovým expresným systémom (Saccharomyces cerevisiae), zatiaľ čo druhý, Cervarix (GSK, Brentford, UK), je produkovaný bakulovírusovým expresným vektorom/systémom hmyzích buniek (BEVS/IC) [14]. Až doteraz neboli optimálne podmienky produkcie proteínov HPV16 L1 v cicavčom expresnom systéme dobre stanovené. Vývoj kombinovanej vakcíny, ktorá by chránila pred infekciami HPV a HIV, je teda logickým úsilím v boji proti týmto dvom hlavným globálnym patogénom.

V našej predchádzajúcej prehľadovej publikácii týkajúcej sa návrhových koncepcií vakcín proti HIV-1 na báze vírusových častíc (VLP) sme spomenuli, že neobalené VLP, ako sú napríklad papilomavírusové VLP, by mohli hrať funkčnú úlohu ako transportné vektory. HIV-1 CTL alebo epitopy neutralizujúcich protilátok [15,16]. Táto hypotéza bola potvrdená v niekoľkých chimérických bovinných papilomavírusoch (BPV) L1 VLP prezentujúcich P18I10 CTL epitop z V3 slučky gp120 HIV{12}} obalového proteínu (Env) a 2F5 epitop alebo MPER oblasť gp41 HIV{16}} Env [17 – 22]. Štrukturálny znak kapsidových proteínov L1 ľudského papilomavírusu typu-16 (HPV16) je podobný ako pri BPV a mohol by sa samozostavovať do jednovrstvových L1 VLP [23]. Päť z HPV16 L1 proteínov tvorí pentamér a 72 z pentamérov sa samozostaví do HPV16 VLP [24]. Stále však neexistuje jasný dôkaz, že chimérické kapsidové proteíny HPV16:HIV by mohli byť stabilné in vitro a samozostavovať sa do morfologicky integrálnych VLP. Na druhej strane sa ukázalo, že HPV16 L1 VLP sú vysoko imunogénne a sú schopné indukovať antigén-špecifické imunitné reakcie T a B-buniek [11–13]. Stále sa uvidí, či prezentácia epitopov HIV{40}} prostredníctvom HPV: HIV VLP môže byť imunogénna. V tejto štúdii sme sa zamerali na vývoj chimérickej vakcíny HPV: HIV na báze VLP s použitím ľudských buniek 293F, dobre zavedeného systému expresie cicavčích buniek. Proteín HPV 16 L1 pôsobil ako štrukturálny skelet vakcíny a peptidy P18I10 a T20 boli vybrané ako HIV-1 imunogény a vložené do DE slučky proteínu HPV 16 L1. Imunodominantný epitop P18I10 CTL obsahujúci 10 aminokyselín (zvyšky 311–320: RGP GRAFVTI) je odvodený z tretej variabilnej domény (V3) obalového glykoproteínu HIV-1 gp120. Peptid P18I10 bol identifikovaný ako molekula MHC I. triedy obmedzená na H-2Dd na indukciu reakcií cytotoxických T lymfocytov (CTL) [25,26]. Peptid T20, známy ako Enfuvirtid a navrhnutý ako antiretrovírusový multimérny fúzny peptid, pozostáva z 36 aminokyselinovej sekvencie (YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQ ELLELDKWASLWNWF) napodobňujúcej C-koncovú sekvenciu heptádovej špirály blízko membrány0 s proximálnou vonkajšou oblasťou (MPER) obalového glykoproteínu HIV-1 41 (gp41) [27]. Tieto dva epitopy na báze HIV-1 T (P18I10) a B (T20) buniek boli vybrané ako východiskový bod a dôkaz koncepčného experimentu pre chimérickú VLP založenú platformu HPV: HIV vakcínu.

Počas posledného desaťročia bolo testovaných mnoho rôznych primárnych formátov vakcíny proti HIV na báze VLP-1 [15]. Hoci väčšina predchádzajúcich HIV-1 VLP [28] alebo chimérických BPV: HIV VLP [17–22] očkovacích stratégií bola zameraná na vyvolanie imunitných odpovedí pomocou homológneho prime-boost režimu, dve predchádzajúce štúdie naznačili, že heterológna imunizácia pozostávajúce z rekombinantnýchMycobacterium bovisBacillus Calmette-Guérin (rBCG) exprimujúci HIV-1 Gag prime a HIV-1 Gag VLP boost môže prispieť k zvýšeniu imunity T-buniek [29,30]. V našej výskumnej skupine sme preukázali primárnu aktiváciu s rBCG exprimujúcim HIVA imunogén a boosting s rekombinantným vírusovým vektorom MVA. HIVA bol bezpečný a vyvolal HIV-1- špecifické imunitné reakcie T-buniek u BALB/c myší [31–33]. Imunogén HIV, ktorý navrhol Dr. Tomas Hanke, sa skladá z kompletného HIV-1 Gag proteínu kombinovaného s viacerými CTL epitopmi vrátane P18I10 epitopov na C-konci [34]. Preto sme sa zamerali na vyhodnotenie, či BCG.HIVA môže posilniť imunitné reakcie T-buniek indukované HIV: HPV (L1:P18I10) VLP u BALB/c myší.

V tejto štúdii boli chimérické imunogény HPV: HIV (L1:P18I10 a L1:T20) navrhnuté a vyrobené s použitím expresného systému 293F. Expresia chimérického proteínu L1:P18I10 a L1:T20 bola potvrdená imunofarbením. HPV: HIV VLP boli následne purifikované 3-krokovou chromatografickou metódou, vrátane katiónovej (CEC), veľkostnej vylučovacej (SEC) a heparínovej afinitnej (H-AC) chromatografie. Potom sa stabilita in vitro, samousporiadanie in vitro a morfológia purifikovaných HPV: HIV VLP potvrdili pomocou neredukujúcej SDS-PAGE, testu molekulovej hmotnosti a transmisnej elektrónovej mikroskopie (TEM). Sekvenčné a konformačné peptidy P18I10 a T20 prezentované na chimérických HPV: HIV VLP boli ďalej charakterizované anti-HIV-1 gp120 V3 a 2F5 monoklonálnymi protilátkami in vitro pomocou Western blotu a nepriameho testu ELISA. Nakoniec sa imunogenicita HPV:HIV VLP hodnotila na myšom modeli BALB/c. Ukázali sme, že chimérické vakcíny na báze VLP L1:P18I10 a L1:T20 môžu indukovať HPV16- a HIV-1-špecifické protilátkové reakcie a chimérické L1:P18I10 VLP môžu indukovať HPV16- a HIV{ {37}}špecifické reakcie T-buniek u BALB/c myší. Pretože vývoj a výroba imunogénnej vakcíny proti HPV: HIV je stále nedosiahnuteľná, táto štúdia poskytla základnú stratégiu, ktorá môže byť užitočná pri podpore globálneho úsilia o vývoj nových chimérických vakcín na báze VLP na kontrolu infekcií HPV a HIV{40}}.

2. Materiály a metódy

2.1. Konštrukcia očkovacieho kmeňa BCG.HIVA2auxo.int

Rekombinantný BCG exprimujúci HIVA imunogén bol predtým skonštruovaný s použitím E. coli-mykobakteriálneho integračného kyvadlového vektora p2auxo.int. Konštrukcia E. coli/mykobakteriálneho vektora exprimujúceho HIVA antigén už bola opísaná [31–33]. BCG.HIVA2auxo.int sa zriedil v PBS-Tween20 na 2 x 107 cfu/ml, sonikoval na rozrušenie bakteriálnych zhlukov a naočkoval sa do zadnej potravnej podložky alebo BALB/c myší (50 ul, 106 cfu/myš).

Desert ginseng-Improve immunity (23)

cistanche tubulosa - zlepšenie imunitného systému

2.2. Bakteriálne kultúry a transformácia

Bunky glycínového auxotrofného kmeňa E. coli, M151GlyA (Invitrogen, Waltham, MA, USA), ktorý poskytol Dr. Pau Ferrer, boli kultivované v minimálnom M9-deriváčnom médiu (M9-D: Na2HPO4, 6,78 g/l; KH2PO4, 3 g/l; NaCl, {{10}},5 g/l; NH4Cl, 1 g/l, glukóza, 1{{20 }} g/l; MgS04, 2 mmol/l; CaCl2, 0,1 mmol/l; tiamín, 0,1 g/l; FeCl3, 0.{{56 }} 25 g/l; AlCl3.6H2O, 0,13 mg/l; ZnSO4.7H2O, 2,6 mg/l; CoCl2.6H2O, 0,47 mg/l; CuSO4.H2O, 4,6 mg/l; H3BO3, 0.03 mg/l; MnCl2·4H2O, 4,2 mg/l; NiCl2·6H2O, 0,02 mg/l; Na2MoO4·2H2O, 0,06 mg/l) doplnený glycínom (70 ug/ml). Bunky E. coli M151Gly boli transformované plazmidmi p2auxo.HIVA elektroporáciou. Na tento účel boli kultúry E. coli pestované na optickú hustotu 0,9 pri 600 nm a transformované s použitím Bio-Rad génového pulzného elektroporátora pri 2,5 kV, 25 uF a 200 Ω. Transformované bunky sa následne kultivovali na M9-D agarových platniach (komponenty, ako bolo opísané vyššie, s pridaným 1,5 % baktoagaru) bez suplementácie glycínom na selekciu alebo s doplnením glycínu ako kontroly. Lyzínový auxotrofný kmeň BCG, BCG∆lys, láskavo poskytnutý WR Jacobs Jr., BR Bloom a T. Hsu, bol transformovaný plazmidovou DNA p2auxo.HIVAint elektroporáciou. Mykobaktérie boli kultivované v médiu Middlebrook 7H9 alebo na médiu Middlebrook agar 7H10 doplnenom albumín-dextróza-katalázou (ADC; Difco) obsahujúcou 0,05 % Tween 80. L-lyzín monohydrochlorid (Sigma, Kawasaki, Japonsko) bol rozpustený v destilovanej vode a používa sa ako doplnok v konečnej koncentrácii 40 ug/ml. Na transformáciu sa BCG kultivoval na optickú hustotu 1,5 pri 600 nm a transformoval sa použitím Bio-Rad génového pulzného elektroporátora pri 2,5 kV, 25 uF a 1000 Ω. Transformanty sa potom kultivovali na médiu Middlebrook agar 7H10 doplnenom ADC obsahujúcom 0,05 % Tween 80 bez suplementácie lyzínu.

2.3. Bunkové línie a bunková kultúra

Bunky 293F (Tibco), odvodené z buniek ľudskej embryonálnej obličky (HEK) 293, sa kultivovali v expresnom médiu FreeStyle 293 (Tibco) doplnenom 5 ml/l penicilín-streptomycínu (Tibco) a inkubovali sa v inkubátore s teplotou 37 ◦C s obsahom zvlhčenej atmosfére 5 % CO2 na orbitálnej trepačke rotujúcej rýchlosťou 125 ot./min.

2.4. Produkcia proteínov L1:P18I10 a L1:T20 pomocou expresného systému 293F

Konštrukt pCDNA3.1 obsahoval L1:P18I10 alebo L1:T20 DNA kódujúce sekvencie zodpovedajúce chimérnym L1:P18I10 a L1:T20 proteínom, v danom poradí. HIV-1 P18I10 CTL peptid (RGPGRAFVTI) alebo T20 peptid (YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQE LLELD KWASLWNWF) boli vložené do DE slučky kapsidového proteínu HPV16 L1. HPV16 L1 DE slučková sekvencia kódujúca 130-136 aminokyselín bola nahradená buď P18I10I10 alebo T20 peptidom. DNA kódujúce sekvencie L1:P18I10 alebo L1:T20 boli modifikované Kozakovou sekvenciou, optimalizované ľudským kodónom, ohraničené miestami reštrikčných enzýmov HindIII a Xbal a klonované do vektora pcDNA3.1(+) pomocou služieb génovej syntézy GeneArt ( Thermo Fisher, Waltham, MA, USA). Rekombinantná plazmidová DNA (pDNA) bola transformovaná do E. coli DH5 kompetentných buniek (Invitrogen) na amplifikáciu a extrahovaná s použitím plazmidových Maxi kitov (QIAGEN, Hilden, Nemecko). Bunky 293F boli kultivované s 30 ml expresného média FreeStyle 293 v 125 ml Erlenmeyerovej banke (Corning, New York, NY, USA) na hustotu 1,0 x 106/ml a prechodne transfekované L1:P18I10 alebo L1:T20 pomocou rozvetveného pD podľa podľa pokynov výrobcu [35]. Bunky 293F boli zozbierané 96 hodín po transfekcii. Bunky 293F môžu dosiahnuť hustotu konfluentu 3,6 x 106 buniek/ml s približne 50% životaschopnosťou.

2.5. Imunofluorescenčné farbenie

Bunky boli permeabilizované na podložnom sklíčku 100% studeným acetónom. Následne boli fixované bunky sondované s anti-HPV16 L1 protilátkou CAMVIR-1 (Abcam, Cambridge, UK) a zachytené anti-myšacím IgG-FITC (Sigma). Imunitne zafarbené bunkové monovrstvy boli dôkladne premyté PBS a pokryté montážnym médiom s DAPI (Abcam). Imunofluorescenčné obrazy boli kontrolované pod inverzným mikroskopom pri 40-násobnom zväčšení. Účinnosť transfekcie bola stanovená pomerom FITC (zelených)-pozitívnych buniek k DAPI (modrým)-zafarbeným bunkám.

2.6. Purifikácia HPV: HIV (L1:P18I10 a L1:T20) VLP

Celkom 108 transfekovaných buniek 293F v 125 ml Erlenmeyerovej banke (30 ml kultivačného média/fľaša) sa zozbieralo centrifugáciou pri 1500 otáčkach za minútu počas 5 minút a dvakrát sa premylo PBS. Bunkové pelety sa resuspendovali v lyzovacom pufri formulovanom s 1 % Triton X-100, inhibítorom proteázy (1:100) (Millipore) a benzonázou (25 U/ml) (Millipore). Bunkové lyzáty boli vyčistené pomocou 0,45 um PVDF injekčného filtra (Millipore). HPV: HIV (L1:P18I10 a L1:T20) vzorky VLP boli sériovo purifikované pomocou výmeny katiónov (Capto SP ImpRes, GE, Boston, MA, USA), vylúčenia veľkosti (Capto Core 700, GE) a afinity (HiTrap Heparin HP GE) chromatografia. Chromatografické protokoly boli opísané v našich predchádzajúcich štúdiách [36,37] a riadili sa protokolom výrobcu [38]. Proteínový signál L1 v každom purifikačnom kroku bol charakterizovaný analýzou Western blot a testovaný s anti-HPV16 L1 protilátkou CAMVIR-1 [39].

2.7. Nezmenšujúca SDS-PAGE

HPV16 L1, L1:P18I10 a L1:T20 VLP boli zmiešané s 2x Laemmliho vzorkovým pufrom (BIO-RAD) v neprítomnosti alebo prítomnosti 5 % (v/v) 2-merkaptoetanolu ({{11} }ME) a ​​reagovali pri teplote miestnosti (RT) počas 24 hodín. Vzorky boli oddelené 8–16 % proteínovými gélmi bez škvŕn TGX (BIO-RAD). Potom sa gély preniesli na PVDF membrány. Membrány sa sondovali s anti-HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb v zriedení 1:4000. Potom boli membrány inkubované s anti-myším IgG peroxidázovým konjugátom (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) pri riedení 1:4000. Signál bol vyvinutý a vizualizovaný chemiluminiscenciou s použitím substrátovej súpravy Western Blot ECL (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Snímky blotu sa získali pomocou zobrazovacieho systému Odyssey Fc.

2.8. Analýza molekulovej hmotnosti

HPV16 L1, L1:P18I10 a L1:T20 VLP bez ošetrenia 2-ME boli odfiltrované cez ultrafiltračné zariadenia s medzou molekulovej hmotnosti (MWCO) 1000 kDa (SARTORIUS). HPV16 L1, L1:P18I10 a L1:T20 VLP s 2-ME ošetrením prešli cez 100 kDa MWCO ultrafiltračné zariadenia (Amicon). Retentáty sa rekonštituovali na pôvodný objem a zbierali sa zo zásobníka vzorky filtračného zariadenia, zatiaľ čo filtráty sa zbierali na dne centrifugačnej skúmavky. Signál L1 sa meral pomocou dot blot sondovanej s anti-HPV16 Ll mAb a detegoval sa konjugátom anti-myšacieho IgG-peroxidáza (Sigma-Aldrich). Obrázky sa získali pomocou systému Odyssey Fc Imaging System na chemiluminiscenčnom kanáli.

Desert ginseng-Improve immunity

Výhody cistanche tubulosa-posilnenie imunitného systému

2.9. Negatívne farbenie a transmisná elektrónová mikroskopia

Po nabití medených mriežok potiahnutých uhlíkom (Sigma-Aldrich) pod ultrafialovým svetlom počas 5 minút, komerčné HPV16 L1 (Abcam), purifikované L1:P18I10 a L1:T20 VLPs ekvilibrované 20 mM Tris-HCl (pH 7,4, 137 mM NaCl ) boli absorbované na mriežkach počas 1 minúty a trikrát opláchnuté miliQ vodou. HPV: HIV VLP boli negatívne zafarbené 2% uranylacetátom pri pH 4,5 (Sigma-Aldrich) počas 1 minúty. Nadbytočné farbiace činidlá sa odstránili kvalitatívnym filtračným papierom Whatman (Sigma-Aldrich). Mriežky sa umiestnili do komory odvlhčovača aspoň 2 hodiny pred pozorovaním. Obrázky sa získali pomocou transmisného elektrónového mikroskopu (Tecnai Spirit 120 kV) pri zväčšení SA135K (100 nm) a SA59000 (200 nm).

2.10. Elektroforéza na dodecylsulfát-polyakrylamidovom géli a analýza Western blotting

Rovnaké množstvá (500 ng) HPV16 L1 proteínu (Abcam), purifikované L1:P18I10 a L1:T20 VLP sa zmiešali s 2x Laemmli vzorkovým pufrom obsahujúcim 5 % 2-ME a varili sa pri 95 °C počas 5 minút . Vzorky boli oddelené 8–16% proteínovými gélmi bez škvŕn TGX a potom prenesené na membránu PVDF (Millipore, Burlington, MA, USA) pomocou zariadenia na prenos Semi-Dry (Bio-Rad). Membrána bola blokovaná 5 % odstredeným mliekom v TBST. Potom sa membrány sondovali s anti-HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb v zriedení 1:4000, anti-HIV-1 gp120 V3 slučkovou mAb (NIBSC, EVA3012) v riedení 1: 40 a HIV1 gp41 (2F5) mAb (NIBSC, ARP3063) v riedení 1:4000, v tomto poradí. Potom boli membrány inkubované s anti-myším IgG peroxidázovým konjugátom (Sigma-Aldrich) v riedení 1:4000. Na vývoj signálu sa použil Western ECL substrát kit (BIO-RAD). Blot obrazy sa získali pomocou zobrazovacieho systému Odyssey Fc na chemiluminiscenčnom kanáli.

2.11. Imunizácia myší, odber séra a izolácia splenocytov

Toto je predbežná štúdia na preukázanie koncepcie na preukázanie imunogenicity HPV: HIV VLP (L1:P18I10 a L1:T20 VLPs). Dávka, spôsob podania a interval prime-boost našich HPV: HIV VLP odkazovali na predchádzajúce štúdie, ktoré imunizovali myši bovinným papilomavírusom (BPV): HIV VLP na vyvolanie protilátkovej odpovede [20,21]. Purifikovaný HPV: HIV VLP boli emulgované s rovnakým objemom (225 µg na každú 0,5 ml dávku) hydroxyfosfát síranu hlinitého (Thermo Fisher), aby sa zabezpečila podobná formulácia ako licencovaná vakcína Gardasil-9 HPV [40]. Všetky skupiny myší mali rovnaké rozdelenie pohlavia (muži n=4 a ženy n=4 na skupinu). V skupinách A a B boli myši BALB/c imunizované intramuskulárne (im) 10 ug L1:P18I10 alebo L1:T20 VLP, v danom poradí, podľa homologického režimu prime-boost. V skupine C sa myšiam intradermálne naočkovalo 106 cfu BCG.HIVA2auxo.int (id, na podložke) a intramuskulárne sa im posilnilo 10 ug L1:P18I10 VLP. V skupine D sa myšiam s pozitívnou kontrolou naočkoval Gardasil- 9 prime nasledovaný Gardasil-9 booster intramuskulárne s 10 ug HPV16 L1 VLPs. V skupine E boli negatívne kontrolné myši imunizované dvakrát PBS pufrom. Interval prime-boost bol 2 týždne. Myši sa usmrtili v deň 28. Vzorky krvi sa odobrali zo sŕdc myší. Séra boli získané centrifugáciou a skladované pri -20 °C pre test ELISA. Myšie sleziny boli odstránené a jednotlivo pretlačené cez bunkové sitko (Falcon) s 5 ml gumovým piestom injekčnej striekačky. Po odstránení červených krviniek pomocou ACK lyzačného pufra (Lonza) sa splenocyty premyli a resuspendovali v lymfocytovom médiu R10 (RPMI 1640 doplnené o 10 % fetálne teľacie sérum (FCS), penicilín-streptomycín, 20 mM HEPES a 15 mM {{ 46}}ME) v koncentrácii 2 x 107 buniek/ml.

2.12. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

Na testovanie špecifických protilátok HPV16 L1- a HIV{2}} viažucich sa na chimérický HPV: HIV VLP konštrukty in vitro, 50 µl rovnakej koncentrácie (200 ng/ml) rekombinantného proteínu HPV16 L1 (Abcam, ab119880 ), purifikované L1:P18I10 a L1:T20 VLP v 50 mM uhličitanovom bikarbonátovom pufri (pH=9,6) (Sigma) sa 2-násobne sériovo zriedili a naniesli na doštičky Maxisorb (Nunc). Platne sa inkubovali pri 4 °C cez noc. Doštičky boli blokované blokovacím pufrom (5 % odstredené mlieko v TBST) pri 37 °C počas aspoň 2 hodín. Po dvojnásobnom premytí TBST sa platne potiahnuté VLP inkubovali s anti-HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb v riedení 1:8000, 2F5 mAb (NIBSC, ARP3063) v riedení 1:8000 a anti- HIV-1 gp120 V3 slučková mAb (NIBSC, EVA3012) v zriedení 1:40 v blokovacom pufri pri teplote 37 °C počas 2 hodín. Po trojnásobnom premytí TBST boli platne inkubované s rekombinantným proteínom G peroxidázovým konjugátom (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) v zriedení 1:4000 v blokovacom pufri pri 37 °C počas 1 hodiny. TMB sa použil na vývoj signálu ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) a zastavil sa 50 ul 2M H2S04. Optická hustota (OD) každej jamky sa merala a zaznamenávala pri vlnovej dĺžke 450 nm s použitím čítačky mikrodoštičiek s absorbanciou EL x 800.

Na meranie VLP-indukovaných protilátok u BALB/c myší boli mikrotitračné platne potiahnuté 50 ul 2 ug/ml rekombinantného proteínu HPV16 L1 (Abcam, ab119880), HIV-1 P18I10 peptid (NIBSC, ARP734), T20 peptid (NIBSC, ARP984), v tomto poradí, s 50 mM uhličitanovo-bikarbonátovým pufrom (pH=9,6). Platne sa inkubovali pri 4 °C cez noc. Doštičky boli blokované blokovacím pufrom (5 % odstredené mlieko v TBST) pri 37 °C počas aspoň 2 hodín. Súčasne sa séra odobraté zo skupiny myší imunizovaných AE zriedili 5 % odstredeným mliekom v TBST v pomere 1:50. Po dvojnásobnom premytí TBST sa platne inkubovali so zriedeným sérom pri 37 °C počas 2 hodín. Po trojnásobnom premytí TBST boli doštičky pridané s konjugátom rekombinantného proteínu G HRP v zriedení 1:4000 v blokovacom pufri a inkubované pri 37 °C počas 1 hodiny. TMB sa použil na vyvinutie signálu ELISA a zastavil sa 50 ul 2M H2S04. OD každej jamky sa merala pri vlnovej dĺžke 450 nm pomocou čítačky mikrodoštičiek EL x 800 absorbancie (Biotek).

2.13. IFN-ELISpot test

Enzýmovo viazaný imunoabsorbčný bodový test (ELISpot) sa uskutočňoval s použitím komerčnej súpravy pre myšie IFN-ELISpot (Mabtech, Nacka Strand, Švédsko), podľa pokynov výrobcu. Doštičky ELISpot (MSISP4510, 96-jamkové doštičky s polyvinylidéndifluoridovými membránami, Millipore, Middlesex County, MA, USA) boli ošetrené 70 % EtOH a potiahnuté purifikovanou monoklonálnou protilátkou zachytávajúcou myšací interferón (IFN-) zriedenou v fosfátom pufrovaný fyziologický roztok (PBS) na konečnú koncentráciu 5 ug/ml pri 4 °C cez noc. Potom sa do každej jamky pridalo 2,5 x 105 čerstvých splenocytov. Následne boli bunky zo skupín A a B stimulované 2 ug/ml HPV16 L1 VLP a HIV-1 P18I10 peptidov, v danom poradí. Všetky vzorky a kontroly sa umiestnili do duplikátov jamiek. Testy ELISpot sa inkubovali 16 hodín pri 37 °C, 5 % CO2. Doštičky sa následne premyli 5x PBS, inkubovali sa 2 hodiny s biotinylovanou anti-IFN-monoklonálnou protilátkou (mAb) zriedenou v PBS 2% fetálnom teľacom sére (FCS) na konečnú koncentráciu 2 ug/ml, premyli sa 5x v PBS a inkubované s konjugátom streptavidín-alkalická fosfatáza v PBS 2% FCS. Potom sa platne 5-krát premyli PBS a potom sa inkubovali so 100 ul roztoku substrátu 5-bróm-4-chlór-3-indolylfosfátu (BCIP)/nitrotetrazoliovej modrej (NBT) (Sigma-Aldrich Louis, MO, USA). Po 5 až 10 minútach sa platne premyli vodou z vodovodu, vysušili a výsledné škvrny sa spočítali pomocou čítačky ELISPOT (AID, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasberg, Nemecko). Pre každé zviera sa priemer odoziev pozadia odčítal individuálne zo všetkých jamiek, aby sa umožnilo porovnanie IFN-spototvorných buniek (SFC)/106 medzi skupinami. Na definovanie pozitívnych reakcií bol prah definovaný ako aspoň päť škvŕn na jamku a reakcie presahujúce priemerný počet škvŕn v jamkách s negatívnou kontrolou plus tri štandardné odchýlky jamiek s negatívnou kontrolou.

2.14. Štatistická analýza

Všetky štatistické analýzy sa uskutočnili pomocou softvéru Prism 6 GraphPad (CA, USA). Použili sme údaje z experimentov uskutočnených s 5 rôznymi koncentráciami povlaku ELISA platne (0, 50, 100, 150, 200 ng/ml) rekombinantného proteínu HPV16 L1 (Abcam, ab119880) a HPV: HIV VLP. Zhromaždili sme údaje od 2 skupín (HPV16 L1 a HPV: HIV VLP) a zhromaždili sme tri replikáty pre každú koncentráciu povlaku. Graf v Prism ukázal dáta ako bodový graf ukazujúci koncentráciu povlaku (ng/ml) na osi X a OD450 na osi Y. Keďže sme predpokladali, že naše údaje ELISA in vitro súvisia lineárne, vykonali sme lineárnu regresnú analýzu a porovnali sme sklony dvoch línií, aby sme potvrdili, že súbor údajov-1 a súbor údajov-2 (protilátka reaktivita medzi HPV16 L1 a HPV: HIV VLP) sa líšia svojimi účinkami. Vybrali sme 95 % intervaly spoľahlivosti popri najvhodnejšej línii. Prism automaticky prekryl lineárnu regresnú čiaru na oboch našich súboroch údajov a vykreslil bodkovanú čiaru predstavujúcu 95% intervaly spoľahlivosti. Počas lineárnej regresnej analýzy softvér vypočítal iba strednú hodnotu Y nášho súboru údajov, ktoré naznačujú, že sú dobre prispôsobené. Prism nám navyše poskytol komentár, takže môžeme usúdiť, že rozdiely medzi oboma svahmi sú mimoriadne výrazné.

Mali sme 5 súborov (ELISA) a 4 súbory (ELISPOT) údajov zozbieraných z experimentov imunizácie myší. Tieto súbory údajov mali rovnaký počet (muži n=4 a ženy n=4) v každej skupine. Myši imunizované Gardasil{4}} sme použili ako pozitívnu kontrolnú skupinu a myši imunizované PBS ako negatívnu kontrolnú skupinu. Údaje z našich navrhnutých experimentov sa nezhodovali ani nepárovali. Vykonali sme jednosmernú analýzu rozptylu (ANOVA), aby sme zistili, či sú tieto priemery odlišné. Najprv sme skontrolovali, či naše údaje zodpovedajú Gaussovmu normálnemu rozdeleniu. Zistili sme, že niektoré skupiny údajov v teste ELISA neprešli testom Gaussovej normálnej distribúcie. Preto sme vykonali neparametrickú štatistickú analýzu týchto údajov. Naproti tomu všetky skupiny údajov v teste ELISPOT prešli testom Gaussovej normálnej distribúcie. Preto sme vykonali parametrickú štatistickú analýzu týchto údajov. Prah významnosti a úroveň spoľahlivosti boli nastavené na 0,05 (ekvivalent 95 % intervalu spoľahlivosti). p hodnota, ktorá vo všeobecnosti vyjadruje pravdepodobnosť, že medzi skupinami existujú rozdiely. Keďže naším hlavným záujmom pri tomto experimente je, aké sú rozdiely medzi našimi skupinami, viacnásobné porovnania v Prism nám poskytli výsledok porovnania vo všetkých skupinách s každou ďalšou skupinou.

2.15. Etické vyhlásenia

Šesť až osemtýždňové myši BALB/c boli zakúpené od spoločnosti Envigo (spoločnosť Inotiv, Chicago, IL, USA) a schválené miestnymi úradmi (Generalitat de Catalunya, číslo projektu 11157) a Etickým výborom Universitat Autònoma de Barcelona. Pokusy na zvieratách boli prísne v súlade s právnymi predpismi Generalitat de Catalunya v oblasti dobrých životných podmienok zvierat. Všetky experimenty schválila miestna etická komisia pre výskum (postup 43.19, Hospital de la Vall d'Hebron, Universitat Autònoma de Barcelona).

3. Výsledky

3.1. Návrh imunogénov L1:P18I10 a L1:T20 a vyhodnotenie HPV: expresia proteínu HIV pomocou expresného systému 293F

Peptid P18I10 zo slučky tretej variabilnej domény (V3) HIV-1 Env a peptid T20 z proximálnej vonkajšej oblasti membrány HIV-1 (MPER) boli vložené do proteínu DE slučky HPV16 L1, aby sa vytvorila chimérická L1 imunogény:P18I10 a L1:T20. Chimérické L1:P18I10 a L1:T20 DNA kódujúce sekvencie boli klonované do pcDNA3.1 (+) plazmidového DNA expresného vektora na prechodnú transfekciu v 293F bunkách (obrázok 1A). Monomérne štruktúry HPV16 L1, chimérických L1:P18I10 a L1:T20 kapsidových proteínov boli predbežne predpovedané pomocou servera SWISS-model (obrázok 1B). Hlavný kapsidový proteín L1 HPV16 (7cn2.1.R) bol vybraný ako štruktúrny templát na vytvorenie modelovania homológie kapsidového proteínu HPV16 L1, L1:P18I10 a L1:T20. V porovnaní s konformáciou naviazaného peptidu P18I10 v predchádzajúcej štúdii [41] smer hlavného reťazca peptidu P18I10 od N k C na našom chimérickom proteíne L1:P18I10 prebieha sprava doľava (obrázok 1B, stredný a horný panel), a exponujúce bočné reťazce P18I10 by mohli potenciálne interagovať s receptormi T buniek (obrázok 1B, stredný a spodný panel). V porovnaní so štruktúrou peptidu inhibítora fúzie HIV{56}} v predchádzajúcom prehľadovom článku [42] je vložený peptid T20 na kapsidovom proteíne HPV16 L1 prezentovaný ako formácia podobná špirále (obrázok 1B, pravý a horný panel ) a exponujúce bočné reťazce T20 by mohli byť potenciálne rozpoznané receptormi B buniek (obrázok 1B, pravý a spodný panel). Keďže kapsidové proteíny HPV16 L1 by sa mohli homogénne zostaviť do ikozaedrickej častice T=7 so 72 pentamérnymi kapsomérmi [43], zobrazenie peptidov P18I10 alebo T20 s vysokou hustotou na vonkajšom povrchu chimérických HPV: HIV VLP je potenciálne vysoko imunostimulačné na vyvolanie epitopovo špecifických imunitných reakcií.

Figure 1. L1:P18I10 and L1:T20 immunogen design and construction of chimeric HPV: HIV VLPs by using 293F expression system. (A) The chimeric L1:P18I10 and L1:T20 DNA coding sequences were cloned into pcDNA3.1+ expression vectors, respectively, for transient transfection in 293F cells. (B) Prediction of monomer structures of HPV16 L1 and chimeric HPV: HIV capsid proteins by using the SWISS-model server. HPV16 major capsid protein L1 (7cn2.1.R) was selected as the structural template to build the HPV16 L1 (left panel), L1:P18I10 (middle panel), and L1:T20 (right panel) capsid protein homology modeling. Secondary structural elements of HPV16 L1 capsid protein are labeled, with letters h1–h5 for the 5 α-helices. Loops of HPV16 L1 capsid protein between strands are labeled BC, CD, DE, EF, FG, and HI. Secondary structural elements of HIV-1 P18I10 and T20 peptides L1 are labeled by the arrows (top panel). The part of the P18I10 and T20 peptide that protrudes above the surface of the HPV16 L1 capsid protein is indicated by the arrows (bottom panel). (C) Immunofluorescence staining of L1 protein in 293F cells. The following pDNA.L1:P18I10 (left), pDNA.L1:T20 (middle), and pDNA.without insertion (right) were transfected in 293F cells. The transfected cells were probed with anti-HPV16 L1 mAb and detected with anti-mouse IgG-FITC (green channel). Cell nuclei were stained with DAPI (blue channel). Immunofluorescence images were merged by using Adobe Photoshop


Obrázok 1. Návrh imunogénu L1:P18I10 a L1:T20 a konštrukcia chimérických HPV:HIV VLP s použitím expresného systému 293F. (A) Chimérické sekvencie kódujúce DNA L1:P18I10 a L1:T20 boli klonované do expresných vektorov pcDNA3.{13}} na prechodnú transfekciu v bunkách 293F. (B) Predikcia monomérnych štruktúr HPV16 L1 a chimérických HPV: HIV kapsidové proteíny pomocou servera SWISS-model. Hlavný kapsidový proteín L1 HPV16 (7cn2.1.R) bol vybraný ako štrukturálny templát na vytvorenie modelovania homológie kapsidového proteínu HPV16 L1 (ľavý panel), L1:P18I10 (stredný panel) a L1:T20 (pravý panel). Sekundárne štruktúrne prvky kapsidového proteínu HPV16 L1 sú označené písmenami h1–h5 pre 5 -závitnice. Slučky kapsidového proteínu HPV16 L1 medzi vláknami sú označené BC, CD, DE, EF, FG a HI. Sekundárne štruktúrne prvky HIV-1 P18I10 a T20 peptidov L1 sú označené šípkami (horný panel). Časť peptidu P18I10 a T20, ktorá vyčnieva nad povrch kapsidového proteínu HPV16 L1, je označená šípkami (spodný panel). (C) Imunofluorescenčné farbenie proteínu L1 v bunkách 293F. Nasledujúce pDNA.L1:P18I10 (vľavo), pDNA.L1:T20 (v strede) a pDNA.bez inzercie (vpravo) boli transfekované v bunkách 293F. Transfekované bunky boli testované s anti-HPV16 L1 mAb a detegované s anti-myšacím IgG-FITC (zelený kanál). Bunkové jadrá boli zafarbené pomocou DAPI (modrý kanál). Imunofluorescenčné obrázky boli zlúčené pomocou Adobe Photoshop

Keďže C terminálna sekvencia proteínu HPV16 L1 sprostredkúva mechanizmus bunkového nukleárneho importu počas infekcie [44], v predchádzajúcich štúdiách boli identifikované signály jadrovej lokalizácie (NLS) proteínu HPV16 L1 [45]. Monoklonálna protilátka CAMVIR-1 bola vybraná na rozpoznávanie epitopu HPV16 L1 (GFGAMDF, 230–236 aa) [39] a farbivo na báze fluoresceínu FITC sa použilo ako reportér na monitorovanie expresie L1:P18I10 a L1: proteíny T20. Imunofluo rpresenčné snímky jasne ukázali, že HPV16 L1 (zelená) bola lokalizovaná hlavne v jadrách (modrá) buniek 293F. V bunkách 293F transekovaných kontrolným plazmidom (plazmid pcDNA3.1 bez inzertu) sa nepozoroval žiadny signál Ll (obrázok 1C). Výsledky naznačujú, že oba chimérické kapsidové proteíny L1:P18I10 a L1:T20 by sa mohli exprimovať použitím transfekcie sprostredkovanej polyetylénimínom (PEI) a rozpoznané monoklonálnou protilátkou HPV16 L1 CAMVIR-1.

3.2. Purifikácia L1:P18I10 a L1:T20 VLP pomocou chromatografických metód

The chimeric L1:P18I10 and L1:T20 proteins were produced by using the 293F expression system. The capture, intermediate purification, and polishing (CiPP) strategy to develop our chromatographic purification protocol is shown in Figure 2A. Flowthrough (FT) in each purification step was collected and the level of L1 protein expression was detected by Western blot analysis using anti-L1 mAb to trace intermediate HPV: HIV VLPs (Figure 2B, C). A cation exchange (CEC) column was selected as a capturing step to isolate HPV: HIV VLPs from host cell proteins (HCPs). The result of CEC FT revealed that most of the L1:P18I10 and L1T20 VLPs were lost in the FT over the CEC column (Figure 2B, C, lane 2). Traditional CEC matrices we used heavily rely on diffusion-limited mass transfer [46]. Large macromolecular complexes, such as our HPV: HIV VLP samples, might be inefficient for the VLP binding to CEC matrices. In order to reach the maximum binding capacities of the CEC column (~50 mg protein/mL resin), we loaded a double amount of soluble cell lysate containing approximately 2% of HPV: HIV VLPs into the CEC column. In the intermediate purification step, HPV: HIV VLPs were purified using a layered-bead size exclusion chromatography (SEC) resin [38]. Large HPV: HIV particles (>700 kDa) were eluted while most of the small impurities were trapped in the beads (Figure 2B, C, lane 5). Due to heparin having a similar structure as DNA and possibly binding to positively charged peptides of conformational HPV16 L1 VLPs, we selected a heparin affinity chromatography (H-AC) as a polishing step to remove heterogeneous or closely related particles [47]. Analysis of densitometry from Western blot analysis and bovine serum albumin (BCA) assay confirmed that purity of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs after diafiltration step was high, over 76% (Figure 2B, C, lane 10). The purified L1:P18I10 and L1:T20 VLPs were detected as a band in size of approximately 56 kDa and 58 kDa, respectively. We found that the commercial HPV16 L1 protein and our purified chimeric HPV: HIV VLPs (L1:P18I10 and L1:T20) share a similar protein pattern (a target band >50 kDa a heterológny spodný pás<50 kDa). These heterologous lower bands could be detected, especially, when we loaded SDS-PAGE gel with a high amount of chimeric HPV: HIV VLP samples (Figure 2B, C, lane 1 to 10). It is probably caused by proteolytic degradation or heterogeneous formation of L1 proteins. A similar pattern (2 bands) was also found in many previous HPV16 L1 purification studies [23,48–51]. These data demonstrated that the 293F expression system and chromatographic purification methods are feasible approaches to engineer chimeric HPV: HIV VLPs.

Figure 2. Purification and characterization of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. (A) Schematic process flowchart of L1:P18I10 and L1:T20 VLP purification by chromatography. (B, C) Western blot analysis of L1:P18I10 and L1:T20 VLP samples from each purification step. The signal of L1 in each purification step was characterized by Western blot analysis probed with anti-HPV16 L1 mAb. The arrow indicates the molecular weight of ~56 kDa of L1:P18I10 and ~58 kDa of L1:T20 proteins. Lane 1: clarified cell lysate (CCL); Lane 2: flow-through (FT) from cation exchange chromatography (CEC) sample loading; Lane 3: CEC eluate; Lane 4: FT from CEC 2M NaCl regeneration step; Lane 5: size exclusion chromatography (SEC) FT-1; Lane 6: SEC FT-2; Lane 7: FT from heparin affinity chromatography (H-AC) sample loading; Lane 8: H-AC eluate; Lane 9: FT from H-AC 2M NaCl regeneration step; Lane 10: 10-fold diafiltration.


Obrázok 2. Purifikácia a charakterizácia L1:P18I10 a L1:T20 VLP. (A) Schematický vývojový diagram procesu čistenia L1:P18I10 a L1:T20 VLP chromatografiou. (B, C) Western blot analýza vzoriek L1:P18I10 a L1:T20 VLP z každého kroku čistenia. Signál L1 v každom purifikačnom kroku bol charakterizovaný analýzou Western blot sondovanou s anti-HPV16 L1 mAb. Šípka označuje molekulovú hmotnosť ~56 kDa proteínov L1:P18I10 a ~58 kDa proteínov L1:T20. Dráha 1: vyčírený bunkový lyzát (CCL); Dráha 2: prietok (FT) z katexovej chromatografie (CEC) nanášania vzorky; Dráha 3: CEC eluát; Dráha 4: FT z regeneračného kroku CEC 2M NaCI; Dráha 5: vylučovacia chromatografia (SEC) FT-1; Dráha 6: SEC FT-2; Dráha 7: FT z heparínovej afinitnej chromatografie (H-AC) nanesenia vzorky; Dráha 8: H-AC eluát; Dráha 9: FT z regeneračného kroku H-AC 2M NaCI; Dráha 10: 10-násobná diafiltrácia.

3.3. Stabilita in vitro a samozostavenie L1:P18I10 a L1:T20 VLP

Aby sme potvrdili, že purifikované HPV: HIV VLP vykazovali podobnú stabilitu in vitro ako HPV16 L1 VLP, uskutočnili sme neredukčnú SDS-PAGE na vyhodnotenie disulfidového zosieťovania kapsidových proteínov HPV: HIV (obrázok 3A). Je známe, že pH, iónová sila, teplota [52] a redoxné prostredie korelujú s disulfidovými väzbami kapsidových proteínov HPV16 L1 [53]. HPV L1 VLP majú tendenciu sa samozostavovať pri nízkom pH a vysokej iónovej sile. Maximálna demontáž VLP zvyčajne vyžaduje vystavenie vysokej koncentrácii redukčného činidla, ako je 5 % 2-merkaptoetanol (2-ME) na relatívne dlhú dobu [54]. V neprítomnosti redukčných činidiel 2-ME migrovala iba malá časť proteínu HPV-16 L1, L1:P18I10 a L1:T20 na monoméry so zdanlivou molekulovou hmotnosťou (MW) 55 kDa . Približne 70 % proteínov L1 bolo naviazaných disulfidovou väzbou na väčšie diméry alebo pentaméry s predpokladanou molekulovou hmotnosťou 110 kDa a 280 kDa (obrázok 3A, dráhy 2, 4 a 6). Na rozdiel od toho takmer všetky proteíny HPV-16 L1, L1:P18I10 a L1:T20 v rozkladovom pufri sa javili ako monomérne štruktúry v neredukujúcej SDS-PAGE (obrázok 3A, dráha 3, 5 a 7). Tieto výsledky ukázali, že in vitro stabilita purifikovaných L1:P18I10 a L1:T20 VLP vykazovala podobné vzory disulfidového zosieťovania ako HPV16 L1 VLP pri rovnakom pH, iónovej sile a tepelných podmienkach. Zdá sa, že purifikované VLP sú rozložené na úroveň pentamérov, trimérov a dimérov po dlhodobom vystavení vysokým koncentráciám redukčných činidiel. Tieto údaje sú v súlade s predchádzajúcimi štúdiami [53,54] Demontáž HPV: HIV VLP však ešte zďaleka nebola dokončená (monoméry).

Figure 3. In vitro stability of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. (A) Disulfide cross-linking of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs in non-reducing SDS-PAGE. The HPV16 L1 VLPs, purified L1:P18I10, and L1:T20 VLPs were mixed with Laemmli sample buffer in the absence or presence of 2-mercaptoethanol (2-ME), respectively, and analyzed by non-reducing SDS-PAGE. The position of the L1 monomer (55 kDa), L1 dimer (110 kDa), and L1 pentamer (280 kDa) are indicated by the arrow. Lane 1: protein molecular weight marker; Lane 2: HPV16 L1 VLP; Lane 3: HPV16 L1 VLP treated with 2-ME; Lane 4: L1:P18I10 VLP; Lane 5: L1:P18I10 VLP treated with 2-ME; Lane 6: L1:T20 VLP; Lane 7: L1:T20 VLP treated with 2-ME. (B) Molecular mass analysis of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. Assembled VLPs untreated with 2-ME (lanes 2, 4, and 6) were filtered out through 1000kDa molecular weight cutoff (MWCO) diafiltration devices (upper panel). Disassembled VLPs treated with 2-ME (lanes 3, 5, and 7) were filtered out through 100kDa MWCO centrifugal filter devices (lower panel). Retentates (R) were collected from filter device sample reservoirs, while the filtrates (F) were collected at the bottom of centrifuge tubes. The L1 protein signal was detected by using a dot blot probed with anti-HPV16 L1 mAb.


Obrázok 3. In vitro stabilita L1:P18I10 a L1:T20 VLP. (A) Disulfidové zosieťovanie L1:P18I10 a L1:T20 VLP v neredukujúcej SDS-PAGE. HPV16 L1 VLP, purifikované L1:P18I10 a L1:T20 VLP sa zmiešali s Laemmliho vzorkovým pufrom v neprítomnosti alebo prítomnosti 2-merkaptoetanolu (2-ME), v danom poradí, a analyzovali sa neredukčným SDS-PAGE. Poloha L1 monoméru (55 kDa), L1 diméru (110 kDa) a L1 pentaméru (280 kDa) je označená šípkou. Dráha 1: marker molekulovej hmotnosti proteínu; Dráha 2: HPV16 L1 VLP; Dráha 3: HPV16 L1 VLP ošetrená 2-ME; Dráha 4: L1:P18I10 VLP; Dráha 5: L1:P18I10 VLP ošetrená 2-ME; Dráha 6: L1:T20 VLP; Dráha 7: L1:T20 VLP ošetrené 2-ME. (B) Analýza molekulovej hmotnosti L1:P18I10 a L1:T20 VLP. Zostavené VLP neošetrené 2-ME (dráhy 2, 4 a 6) sa odfiltrovali cez diafiltračné zariadenia s medzou molekulovej hmotnosti (MWCO) 1000 kDa (horný panel). Rozložené VLP ošetrené 2-ME (dráhy 3, 5 a 7) boli odfiltrované cez 100 kDa MWCO odstredivé filtračné zariadenia (spodný panel). Retentáty (R) sa zbierali zo zásobníkov vzoriek filtračného zariadenia, zatiaľ čo filtráty (F) sa zbierali na dne centrifugačných skúmaviek. Signál proteínu L1 sa detegoval pomocou dot blotu sondovaného s anti-HPV16 L1 mAb.

To demonstrate that purified HPV: HIV proteins by chromatography are able to self-assemble to icosahedral particles, we further performed molecular mass analysis under the same reducing condition (5% 2-ME). The commercial HPV16 L1, purified L1:P18I10, and L1T20 proteins without reducing agent treatment were filtered out through 1000 kDa molecular weight cut-off (MWCO) diafiltration devices individually (Figure 3B, top panel). The L1 monomers (55 kDa), oligomers (110~200 kDa), or pentameric capsomers (280 kDa) were expected to pass through an ultrafiltration membrane retaining the integral VLPs (MW~20,000 kDa). The L1 signal of commercial HPV16 L1 proteins was detected in both retentates and filtrates. Most of the purified L1:P18I10 and L1T20 proteins formed large particles (>1000 kDa) a boli konzervované v retentátoch. Vzor bol v zhode s údajmi, ktoré boli pozorované pri neredukujúcej SDS-PAGE. Hoci všetky skupiny VLP ošetrené 2-ME boli zobrazené v monomérnom páse (~55 kDa) na neredukujúcej SDS-PAGE (obrázok 3A, pruh 3, 5 a 7). Zodpovedajúce redukované VLP však neboli odfiltrované cez 100 kDa ultrafiltračné membrány (obrázok 3B, spodný panel). Tieto výsledky naznačujú, že chimérické proteíny HPV: HIV boli schopné samozostavenia sa na väčšie častice, ale maximálne rozloženie VLP na monoméry si vyžadovalo nielen redukciu disulfidových väzieb, ale aj iné denaturačné faktory, ako je pH alebo iónová sila.

3.4. Morfologická charakterizácia L1:P18I10 a L1:T20 VLP

Transmisná elektrónová mikroskopia (TEM) sa použila na skúmanie morfologickej konformácie HPV16 L1 a HPV: HIV VLP. HIV-1 P18I10 a T20 peptidy boli vložené do DE slučiek proteínu HPV16 L1. Tieto komerčné HPV16 L1 a chimérické HPV: HIV kapsidové proteíny sa môžu spontánne zložiť in vitro do integrálnych VLP s priemerom približne 50–60 nm (obrázok 4A–C, pravý panel). V porovnaní s elektrónovými mikrofotografiemi HPV16 L1 VLP publikovanými v predchádzajúcich štúdiách [55,56] bola ikosaedrická štruktúra HPV16 L1, L1:P18I10 a L1:T20 VLP menej kontrastná a vágna. Dalo by sa to pripísať negatívnemu farbiacemu činidlu, ktoré sme použili v tejto štúdii. V našej nedávnej štúdii publikovanej v predchádzajúcej štúdii [37] a ďalšom prebiehajúcom článku, ktorý je predmetom partnerského hodnotenia (údaje nie sú uvedené), sme získali dobrú kvalitu a rozlíšenie elektrónových mikrosnímok, keď VLPs L1:P18I10 pochádzajúce z kvasiniek a bakulovírusov (rovnaké chimérické konštrukt) boli ekvilibrované v PBS a negatívne zafarbené kyselinou fosfowolfrámovou (PTA). Pretože sme v tejto štúdii použili rôzne systémy produkcie a purifikácie VLP, L1:P18I10 a L1:T20 VLP odvodené od cicavčích buniek boli ekvilibrované Tris-HCl a negatívne zafarbené uranylacetátom. Hoci elektrónové mikrofotografie by sa dali vylepšiť, stále sme mohli pozorovať jasný vzor, ​​že väčšina kapsidového proteínu HPV16 L1, L1: P18I10 a L1: T20 by sa mohla sama zostaviť do morfologických VLP pod TEM obrazovkou (obrázok 4A–C, ľavý panel ). HPV VLP sú v podstate chránené proti agregácii v podmienkach s vysokým obsahom soli [57]. Niektoré z detegovateľných agregácií HPV16 L1 a HPV: HIV VLP v pufri Tris-HCl s nízkym obsahom soli bolo možné vidieť pod menším zväčšením (obrázok 4A–C, ľavý panel). Z týchto výsledkov sme usúdili, že modifikácia čiastočnej sekvencie L1 DE slučky inzerciou HIV-1 P18I10 alebo T20 peptidov významne neovplyvnila morfológiu HPV: HIV VLP.

Figure 4. Electron micrographs of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. (A) Morphology of HPV16 VLPs. (B) Morphology of L1:P18I10 VLPs. (C) Morphology of L1:T20 VLPs. Purified VLPs were absorbed on UV-charged carbon-coated copper grids, and negatively stained with 2% uranyl acetate. Images were acquired under transmission electron microscopy. The bar represents 200 nm at magnification 59,000 (left panel) and 100 nm at magnification 135K (right panels), respectively


Obrázok 4. Elektrónové mikrofotografie L1:P18I10 a L1:T20 VLP. (A) Morfológia HPV16 VLP. (B) Morfológia L1:P18I10 VLP. (C) Morfológia L1:T20 VLP. Purifikované VLP boli absorbované na UV nabitých uhlíkom potiahnutých medených mriežkach a negatívne zafarbené 2% uranylacetátom. Obrázky sa získali pod transmisnou elektrónovou mikroskopiou. Stĺpec predstavuje 200 nm pri zväčšení 59, 000 (ľavý panel) a 100 nm pri zväčšení 135 K (pravé panely).

3.5. Prezentácia a reaktivita epitopov HPV-16 a HIV-1 

Aby sa potvrdilo, že sekvenčné epitopy HIV{0}} P18I10 alebo 2F5 boli prezentované v chromatograficky purifikovaných L1:P18I10 alebo L1:T20 VLPs, bola vykonaná analýza Western blot a nepriama ELISA s použitím epitopovo špecifických mAb. Vybrali sme dobre známu monoklonálnu protilátku (mAb), označenú ako CAMVIR-1, na rozpoznanie vysoko konzervovaného epitopu (GFGAMDF, aa 230–236) proteínu HPV16 L1 [39,58]. Na detekciu sekvenčných epitopov P18I10 (RGPGRAFVTI, aa311–320) sa vybrala predtým publikovaná mAb zacielená na epitop slučky HIV{20}} gp120 V3 (RIQRGPGRAFVTIGK, aa308–322) [59]. Na druhej strane, široká neutralizačná protilátka (bnAb) rozpoznávajúca epitop HIV-1 gp41 2F5 (ELDKWA) proti širokej škále laboratórnych kmeňov HIV-1 bola vybraná na charakterizáciu peptidu T20 [ 60,61]. Western blot test testovaný s HPV16 L1 mAb ukázal pásy 55, 56 a 58 kDa zodpovedajúce proteínu HPV16 L1, L1:P18I10 a L1:T20 (obrázok 5A, B, vľavo). Molekulová hmotnosť (MW) proteínu L1:P18I10 bola podobná proteínu HPV16 L1 (obrázok 5A, vľavo). Pás zodpovedajúci proteínu L1:T20 bol pozorovaný mierne vyšší ako proteín L1 HPV16, ako sa predpokladalo z ďalšej aminokyselinovej sekvencie (obrázok 5B, vľavo). Pásy s veľkosťou približne 56 a 58 kDa, ktoré zodpovedajú proteínu L1:P18I10 a L1:T20, boli detegované v teste Western blot sondou s anti-HIV-1gp120 V3 a 2F5 mAb, v tomto poradí (obrázok 5A, B, vpravo ). Mysleli sme si, že molekulová hmotnosť (MW) anti-2F5-zafarbeného proteínu L1:T20 je správna a zodpovedá očakávanej 58 kDa (obrázok 5B, vpravo). Avšak molekulová hmotnosť anti-HIV-1gp120 V3-zafarbeného proteínu L1:P18I10 je o niečo nižšia (obrázok 5A, vpravo). To možno pripísať heterogénnej štruktúre chimérických proteínov L1:P18I10. Pretože konformácia sekvenčného epitopu sa môže stratiť za podmienok denaturácie v SDS-PAGE. Preto sme ďalej vykonali nepriamu ELISA, aby sme demonštrovali konformačný peptid P18I10 správne prezentovaný na našich chimérických L1:P18I10 VLP (obrázok 5E). Na druhej strane, protilátka anti-HIV{100} gp120 V3 slučky, ktorú sme použili, rozpoznávala celú slučku HIV{103} V3 a nie epitop P18I10. V dôsledku toho bol celkový signál anti-V3 nižší (obrázok 5A, B, pravé panely). Napriek tomu tieto výsledky ukázali, že sekvenčné HIV{110}} P18I10 a T20 peptidy sú prítomné vo VLP HPV: HIV.

Figure 5. Presentation of HPV-16 and HIV-1 epitopes. (A, B) Sequential epitope detection of chimeric L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. The purified L1:P18I10 and L1:T20 VLPs were analyzed by Western blot, using anti-HPV16 L1, anti-HIV-1 gp120 V3 and 2F5 mAb. The HPV16 L1 VLPs were used as a control. The molecular weight of the L1 (55 kDa), L1:P18I10 (56 kDa), and L1:T20 (58 kDa) proteins are indicated by the arrow. Lane 1: protein molecular weight marker; Lane 2: HPV16 L1 protein; Lane 3: L1:P18I10 protein; Lane 4: L1:T20 protein. (C, D) Binding of HPV16 L1 mAb to chimeric L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. (E) Binding of anti-HIV-1 gp120 V3 mAb to chimeric L1:P18I10 VLPs. (F) Binding of HIV-1 2F5 mAb to chimeric L1:T20 VLPs. The line graph of indirect ELISAs was performed to detect the conformational epitopes of recombinant HPV16 L1, L1:P18I10, and L1:T20 VLPs bound to anti-L1, anti-HIV-1 gp120 V3 or 2F5 mAbs, respectively. Data are representative of three independent experiments. A simple linear regression test was done to compare the line difference of purified L1:P18I10 and L1:T20 VLPs with the standard curve of commercial L1 VLPs; ns: not significant; ** p < 0.01.


Obrázok 5. Prezentácia epitopov HPV-16 a HIV-1. (A, B) Sekvenčná epitopová detekcia chimérických L1:P18I10 a L1:T20 VLP. Purifikované L1:P18I10 a L1:T20 VLP boli analyzované Western blotom s použitím anti-HPV16 L1, anti-HIV-1 gp120 V3 a 2F5 mAb. HPV16 L1 VLP boli použité ako kontrola. Molekulová hmotnosť L1 (55 kDa), L1:P18I10 (56 kDa) a L1:T20 (58 kDa) proteínov je označená šípkou. Dráha 1: marker molekulovej hmotnosti proteínu; Dráha 2: HPV16 L1 proteín; Dráha 3: L1:P18I10 proteín; Dráha 4: L1:T20 proteín. (C, D) Väzba HPV16 L1 mAb na chimérické L1:P18I10 a L1:T20 VLP. (E) Väzba anti-HIV-1 gp120 V3 mAb na chimérické L1:P18I10 VLP. (F) Väzba HIV-1 2F5 mAb na chimérické L1:T20 VLP. Čiarový graf nepriamych testov ELISA sa uskutočnil na detekciu konformačných epitopov rekombinantných HPV16 L1, L1:P18I10 a L1:T20 VLP naviazaných na anti-L1, anti-HIV-1gp120 V3 alebo 2F5 mAb, v danom poradí. Údaje sú reprezentatívne pre tri nezávislé experimenty. Uskutočnil sa jednoduchý lineárny regresný test na porovnanie líniového rozdielu purifikovaných L1:P18I10 a L1:T20 VLP so štandardnou krivkou komerčných L1 VLP; ns: nevýznamné; ** p < 0,01.

Okrem toho, aby sme určili, či konformačné epitopy HIV{{{5{59}}}}}} prezentované na HPV: HIV VLP môžu byť identifikované pomocou gp120 V3 a 2F5 neutralizujúcich protilátok in vitro, vykonali sme nepriamy test ELISA na kontrolu špecificitu a reaktivitu viazania epitopu. Ako je znázornené na obrázku 5C, D, HPV16 L1, L1:P18I10 a L1:T20 VLP boli rozpoznané anti-L1 mAb. Uskutočnili sme lineárnu regresnú analýzu, aby sme porovnali sklon každej čiary riedenia. Výsledky odhalili, že väzbová špecificita L1 epitopu buď L1:P18I10 alebo L1:T20 VLP sa nelíšila od HPV16 L1 VLP. Navyše anti-HIV-1 gp120 V3 mAb bola schopná viazať L1:P18I10 VLP, ale nie HPV16 L1 VLP (obrázok 5E). Okrem toho 2F5 mAb mohla rozpoznať L1:T20 VLP, ale nie HPV16 L1 VLP (obrázok 5F). Po lineárnej regresnej analýze bol rozdiel vo väzbovej špecificite gp120 V3 epitopu medzi L1:P18I10 a HPV16 L1 extrémne významný (p < 0,01 %). Špecifickosť viazania 2F5 epitopu L1:T20 VLP sa významne líšila od HPV16 L1 VLP (p < 0,01 %). Tento vzorec odhalil, že hydrofóbne bunkové lipidy neboli potrebné na naviazanie 2F5-neutralizačných protilátok na HPV: HIV VLP in vitro. Hoci reaktivita anti-HIV-1 gp120 V3 a 2F5 neutralizujúcich protilátok na HPV: HIV VLP je relatívne mierna, väzba anti-HIV-1 gp120 V3 a 2F5 mAb na HPV: HIV VLP bola významne epitopovo špecifické.

3.6. Imunogenicita L1:P18I10 a L1:T20 VLP po imunizácii myší BALB/c

Hodnotili sme HPV{0}} a HIV{1}}špecifické imunitné reakcie po imunizácii myší BALB/c pomocou L1:P18I10 a L1:T20 VLP. Schéma imunizácie je znázornená na obrázku 6A. Pretože imunogenicita indukovaná VLP po podaní na sliznicu bola vo všeobecnosti slabšia ako po systémovom podaní, myši boli imunizované intramuskulárne jednou šestinou dávky Gardasil{10}} HPV16 L1 [22,62]. Adjuvans hydroxyfosfát síranu hlinitého pre dávku (10 ug/100 ul) chimérických HPV: HIV VLP sa upravilo na rovnakú koncentráciu (1 mg/1 ml) ako Gardasil-9. Aby sa vyhodnotil rozdiel medzi pohlaviami vo výsledkoch očkovania, vyhodnotilo sa porovnanie protilátkových odpovedí medzi samcami (n=4) a samicami (n=4) myší. V skupine L1:P18I10 VLP, L1:T20 VLP a Gardasil-9 boli anti-HPV16 L1 protilátkové odpovede samíc myší v priemere vyššie ako u samcov myší (obrázok 6B). 2 zo 4 (50 %) samíc imunizovaných L1:P18I10 VLP, 3 zo 4 (75 %) samíc imunizovaných L1:T20 VLP a všetky (100 %) samice myší imunizované Gardasilom vyvolali vyšší titer protilátok anti-L1 než samce myší. Anti-L1 reakcie vyvolané samicami myší v skupine Gardasil{51}} boli významne vyššie ako u samcov myší (p=0.0041) (obrázok 6B). Veľmi nízka hladina anti-L1 protilátkových odpovedí bola detegovaná v skupine BCG.HIVA priming a L1:P18I10 VLP boosting. Tento vzorec korešponduje s predchádzajúcimi zisteniami opisujúcimi, že BCG prevažne indukuje odpovede T-buniek a nie produkciu IgG [63].

Figure 6. Induction of humoral immune responses by L1:P18I10 and L1:T20 VLPs in BALB/c mice. The immunization schedule is depicted in (A) All mouse groups had equal gender distribution (male n = 4 and female n = 4). Groups A and B: homologous prime-boost immunization with 10 µg L1:P18I10 or L1:T20 VLPs intramuscularly (i.m.); Group C: priming with 106 cfu rBCG.HIVA intradermally (i.d.) and boosting with 10 µg L1:P18I10 VLPs i.m.; Group D: homologous prime-boost vaccination with Gardasil-9 containing 10 µg of HPV16 L1 VLPs i.m.; Group E: immunization twice with PBS buffer. The prime-boost interval was 2 weeks. The endpoint of this trial was on day 28. Sera were collected and diluted at a titer of 1:50 for ELISA assay. (B) HPV L1-specific IgG in male and female mice. (C–E) Epitope-specific IgG induced by L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. ELISA was performed to analyze anti-L1, anti-P18I10, and anti-T20 IgG induced by BALB/c mice following different prime-boost combinations as described above. Data are shown as mean ± S.D. One-way ANOVA (nonparametric) test was done to compare differences between groups. OD: opticaldensity. Ns not significant; ** p < 0.01


Obrázok 6. Indukcia humorálnych imunitných odpovedí prostredníctvom L1:P18I10 a L1:T20 VLP u BALB/c myší. Schéma imunizácie je znázornená v (A) Všetky skupiny myší mali rovnaké rozdelenie pohlaví (samci n=4 a samice n=4). Skupiny A a B: homológna prime-boost imunizácia s 10 ug L1:P18I10 alebo L1:T20 VLP intramuskulárne (im); Skupina C: primárna aktivácia 106 cfu rBCG.HIVA intradermálne (id) a posilňovacia dávka 10 ug Ll:P18I10 VLPs im; Skupina D: homológna prime-boost vakcinácia Gardasilom-9 obsahujúca 10 ug HPV16 L1 VLPs im; Skupina E: imunizácia dvakrát s PBS pufrom. Interval prime-boost bol 2 týždne. Koncový bod tohto pokusu bol na 28. deň. Séra sa odobrali a zriedili na titer 1:50 pre test ELISA. (B) HPV L1-špecifický IgG u samcov a samíc myší. (C–E) Epitop-špecifický IgG indukovaný L1:P18I10 a L1:T20 VLP. ELISA sa uskutočnila na analýzu anti-L1, anti-P18I10 a anti-T20 IgG indukovaných BALB/c myšami po rôznych kombináciách prime-boost, ako je opísané vyššie. Dáta sú uvedené ako priemer ± SD Jednosmerný test ANOVA (neparametrický) sa uskutočnil na porovnanie rozdielov medzi skupinami. OD: optická hustota. Ns nevýznamné; ** p < 0,01

Hodnotili sme, či myši imunizované VLP L1: P18110 a L1: T20 môžu indukovať HPV-16 L1-špecifické a HIV-1 epitop špecifické protilátky u BALB/c myší. VLP-indukované IgG protilátky v myšacích sérach boli merané pomocou ELISA potiahnutej rekombinantným HPV16 L1 proteínom, P18I10, respektíve T20 peptidmi. Štatistický rozdiel v L1-špecifickom IgG pri sérovom titri 1:50 sa zistil v skupine Gardasil{17}} v porovnaní s kontrolnou skupinou PBS (p=0,0039). Odozvy anti-L1 medzi myšami imunizovanými VLP Gardasil-9, L1:P18I10 a L1:T20 boli podobné a významne sa nelíšili (obrázok 6C). U myší BCG.HIVA2auxo.int prime a L1:P18I10 VLP boost vyvolali veľmi nízku hladinu anti-L1 IgG. Tieto výsledky naznačujú, že myši imunizované HPV: HIV VLP produkovali rovnakú hladinu anti-L1 IgG ako myši imunizované Gardasilom (obrázok 6C). Hoci sa zdá, že skupina L1:P18I10 VLP numericky má tendenciu k vyššej hladine IgG špecifického pre epitop P18I10 ako iné imunizačné skupiny, tieto rozdiely neboli štatisticky významné (obrázok 6D). U niektorých myší imunizovaných L1:P18I10 VLP (4 z 8, 50 %) boli pozorované vyššie protilátky viažuce anti-P18I10 v porovnaní s myšami imunizovanými Gardasil{58}}. Alternatívne analýza T-testu odhalila, že rozdiel medzi skupinou L1:P18I10 VLP a Gardasil{63}} bol významný (p=0,005) (údaje nie sú uvedené). V skupine L1:T20 VLP bola detegovaná významne vyššia protilátková odpoveď proti peptidu T20 v porovnaní so skupinou Gardasil-9 (p=0.0083). Ako sa očakávalo, titre anti-T20 boli nedetegovateľné v Gardasil-9, PBS, L1:P18I10 VLP a BCG.HIVA prime v kombinácii s L1:P18I10 VLP booster skupinami (obrázok 6E). Titer protilátky špecifickej pre peptid T20 bol relatívne nízky. Je to pravdepodobne spôsobené: (1) T20 je subdominantný peptid; (2) vyvolanie MPER alebo 2F5 neutralizačných protilátok vyžaduje konjugáty peptid-lipid (obrázok 6E). Celkovo naše výsledky ukázali, že L1:P18I10 a L1:T20 VLP môžu u myší vyvolať HPV16-, ale slabé HIV-1-špecifické protilátkové reakcie.

Desert ginseng-Improve immunity (2)

cistanche tubulosa - zlepšenie imunitného systému

Na vyhodnotenie imunitných reakcií T-buniek špecifických pre HPV a HIV u myší sme postupovali podľa plánu imunizácie znázorneného na obrázku 7A. Okrem toho sa heterológna primárna aktivácia BCG.HIVA2auxo.int a zosilnenie L1:P18I10 VLP porovnalo s homológnou primárnou a zosilňovacou imunizáciou L1:P18I10 VLP, aby sa vyhodnotila frekvencia špecifických imunitných reakcií T-buniek proti HPV16 a HIV{12}}. Medzi skupinami Gardasil-9 a PBS neboli žiadne rozdiely, pokiaľ ide o sekréciu IFN- po stimulácii splenocytov pomocou HPV16 L1 VLP. Rozdiely v L1- špecifickej IFN- sekrécii tiež neboli významné medzi L1:P18I10 VLP a Gardasil{23}} skupinami. Usúdili sme, že slabú L1-špecifickú sekréciu IFN- možno pripísať nízkej koncentrácii (2 ug/ml) HPV16 L1 VLP použitých ako stimuly. Skupina BCG.HIVA2auxo.int prime a L1:P18I10 VLP boost indukovala vyššiu frekvenciu splenocytov vylučujúcich IFN a boli pozorované významné rozdiely v sekrécii IFN- v porovnaní s myšami očkovanými Gardasil-9 skupinou (p {{36} }}.0103). 3 z 8 myší (~38 %) vyvolali najvyššie L1- špecifické IFN- odpovede (obrázok 7B). Podľa našich predchádzajúcich štúdií to možno pripísať nešpecifickej adjuvancii BCG [64–66]. Evidentný primárny účinok, dokonca aj u BCG divokého typu, je v súlade so schopnosťou derivátov rBCG pôsobiť ako silné adjuvans pre následné posilňovacie vakcíny [64,65]. Pokiaľ ide o HIV-1-špecifické reakcie T-buniek, najvyššia celková veľkosť IFN-spototvorných buniek (SFC)/106 splenocytov bola pozorovaná u myší očkovaných BCG.HIVA2auxo.int v porovnaní s myšami, ktoré dostávali Gardasil{{54} } vakcíny alebo L1:P18I10 VLP. Myši primárne očkované BCG.HIVA a posilnené L1:P18I10 VLP vyvolali významne vyššiu sekréciu IFN- v porovnaní s myšami očkovanými L1:P18I10 VLP homológnym primárnym zosilnením (p=0.0268). Okrem toho bola pozorovaná výrazne vyššia sekrécia IFN- u myší očkovaných L1:P18I10 VLP v porovnaní s myšami dostávajúcimi vakcíny Gardasil-9 (p=0.0157) (obrázok 7C). Ako sa očakávalo, sekrécia IFN- bola nedetegovateľná v skupinách Gardasil{77}} a PBS. Tieto výsledky ukázali, že (1) L1:P18I10 VLP vyvolali HIV-1-špecifické imunitné reakcie T-buniek; (2) L1:P18I10 VLP vyvolali HPV-špecifické T-bunkové imunitné reakcie a (3) BCG.HIVA2auxo.int mohol posilniť HIV-1-špecifické T-bunkové imunitné reakcie vyvolané L1:P18I10 VLP.

Figure 7. Induction of HPV16 and HIV-1 specific T cell responses by chimeric L1:P8I10 VLPs and BCG.HIVA in BALB/c mice. The immunization schedule is depicted in (A). All mouse groups had equal gender distribution (male n = 4 and female n = 4). Group A: homologous prime-boost immunization with 10 µg L1:P18I10 VLPs intramuscularly (i.m.); Group B: priming with 106 cfu rBCG.HIVA intradermally (i.d.) and boosting with 10 µg L1:P18I10 VLPs i.m.; Group C: homologous prime-boost vaccination with Gardasil-9 containing 10 µg of HPV16 L1 VLPs i.m.; Group D: immunization twice with PBS buffer. The prime-boost interval was 2 weeks. The endpoint of this trial was on day 28. Splenocytes were isolated for IFN-γ ELISpot assay. T-cell immune responses to HPV16 and HIV-1 were assessed ex vivo by IFN-γ ELISpot after splenocyte stimulation with HPV16 L1 VLP and P18I10 peptide. (B, C) HPV16 L1- and HIV-1 P8I10-specific T-cell responses elicited by L1:P8I10 VLPs and BCG.HIVA prime combined with L1:P18I10 VLP boost. Data are shown as median ± S.D. A one-way ANOVA test was done to compare differences between groups. Ns not significant; * p < 0.05.


Obrázok 7. Indukcia HPV16 a HIV-1 špecifických T bunkových reakcií chimérickými L1:P8I10 VLP a BCG.HIVA u BALB/c myší. Schéma imunizácie je znázornená v (A). Všetky skupiny myší mali rovnakú distribúciu pohlaví (muži n=4 a ženy n=4). Skupina A: homológna prime-boost imunizácia s 10 ug L1:P18I10 VLP intramuskulárne (im); Skupina B: primárna aktivácia s 106 cfu rBCG.HIVA intradermálne (id) a booster s 10 ug Ll:P18I10 VLPs im; Skupina C: homológna prime-boost vakcinácia s Gardasilom-9 obsahujúcim 10 ug HPV16 L1 VLPs im; Skupina D: imunizácia dvakrát PBS pufrom. Interval prime-boost bol 2 týždne. Koncový bod tejto štúdie bol na 28. deň. Na test IFN-ELISpot sa izolovali splenocyty. Imunitné reakcie T-buniek na HPV16 a HIV-1 boli hodnotené ex vivo pomocou IFN-ELISpot po stimulácii splenocytov s HPV16 L1 VLP a P18I10 peptidom. (B, C) HPV16 L1- a HIV-1 P8I10- špecifické T-bunkové reakcie vyvolané L1:P8I10 VLPs a BCG.HIVA primárnou reakciou v kombinácii s L1:P18I10 VLP boost. Údaje sú uvedené ako medián ± SD. Na porovnanie rozdielov medzi skupinami sa uskutočnil jednosmerný test ANOVA. Ns nevýznamné; * p < 0,05.

4. Discussion

HPV16 aj HIV-1 sú pohlavne prenosné choroby a v súčasnosti sú predmetom mnohých štúdií vakcín. Hoci boli profylaktické vakcíny proti HPV komerčne dostupné a prenos HIV-1 bol do značnej miery kontrolovaný antiretrovírusovou liečbou (ART) a PrEP, je naliehavo potrebná účinná, bezpečná a cenovo dostupná chimérická vakcína proti obom vírusom HPV: HIV. V tejto štúdii (1) sme demonštrovali, že expresný systém 293F a metóda chromatografickej purifikácie by mohli byť uskutočniteľnými prístupmi na produkciu a purifikáciu chimérických L1:P18I10 a L1:T20 VLP; (2) potvrdili sme, že inzercia peptidov P18I10 alebo T20 do DE slučky kapsidových proteínov HPV16 L1 neovplyvnila in vitro stabilitu, samousporiadanie a morfológiu chimérických HPV: HIV VLP; (3) Sekvenčné a konformačné peptidy P18I10 alebo T20 vystavené DE slučkám chimérického HPV: HIV VLPs mohli byť detegované anti-HIV-1 gp120 V3 a 2F5 neutralizujúcimi protilátkami in vitro; (4) Chimérické L1:P18I10 a L1:T20 VLP by mohli vyvolať HPV, ale slabé HIV-1-špecifické väzbové protilátky u BALB/c myší. Okrem toho inzercia HIV-1 P18I10 alebo T20 peptidov do HPV16 L1 proteínu neovplyvnila HPV16 L1-špecifickú protilátkovú indukciu in vivo; (5) L1:P18I10 VLP môžu indukovať HPV16 aj HIV-1-špecifické T-bunkové reakcie; (6) BCG.HIVA primárna aktivácia a L1:P18I10 VLP boost vyvolali u BALB/c myší najvyššiu veľkosť splenocytov produkujúcich IFN v porovnaní s L1:P18I10 VLP homológnym primárnym boostom. Tieto zistenia podporili ďalší vývoj HIV{59}} vakcín založených na rBCG a chimérických HPV: HIV VLP. Celkovo vzaté, táto štúdia poskytuje základnú stratégiu, ktorá môže byť hodná podpory globálneho úsilia o vývoj nových chimérických vakcín na báze VLP na kontrolu infekcií HPV a HIV.

V tejto štúdii by VLP L1:P18I10 a L1:T20 mohli indukovať rovnakú hladinu protilátok viažucich L1 proti HPV16 ako vakcína HPV Gardasil-9. Avšak L1:P18I10 a L1:T20 VLP vyvolávajú len nízke hladiny P18I10 a T20 epitop-špecifických HIV-väzbových protilátkových reakcií. Predpokladali sme, že to môže byť spôsobené tým, že testovacie doštičky ELISA sú potiahnuté rekombinantným proteínom HPV16 L1, peptidom HIV-1 P18I10 a peptidom HIV-1 T20. Myšie anti-L1 protilátky indukované našimi L1:P18I10 a L1:T20 VLP sa môžu zameriavať na viaceré väzbové epitopy L1 proteínu. Naproti tomu myšie anti-HIV-1 protilátky vyvolané našimi L1:P18I10 a L1:T20 VLP sa zameriavajú iba na jediný HIV peptid (P18I10 alebo T20) na HPV: HIV VLP. V dôsledku toho boli celkové maximálne hodnoty OD450 anti-HIV-1 viažucich protilátok oveľa nižšie ako anti-HPV16 L1 protilátky.

Dôvod, prečo sme vybrali HPV16 L1 kapsidový proteín DE slučku ako predbežnú oblasť inzercie HIV-1 imunogénu, sa týkal predchádzajúcej štúdie, ktorá imunizovala myši bovinným papilomavírusom (BPV): HIV VLPs na vyvolanie protilátkových reakcií [20]. Je známe, že epitopy umiestnené v povrchovo exponovaných DE a FG slučkách hlavných kapsidových proteínov HPV L1 dominantne prispievajú ku skrížene neutralizujúcim protilátkam vyvolaným vakcínou [67]. Okrem toho predchádzajúce štúdie ukázali, že inzercia HIV-1 MPER do slučky BPV L1 DE by mohla indukovať čiastočne neutralizujúce protilátky, ktoré špecificky rozpoznávajú prirodzenú konformáciu MPER v HIV{11}} Env [20]. Žiadne údaje však nepreukázali, či rekombinantný BPV L1:MPER VLP ovplyvňuje imunogenicitu a neutralizáciu proti BPV po inzercii HIV-1 MPER do proteínu BPV L1. V našej štúdii s použitím VLP HPV16 L1 ako vektora na dodávanie antigénu HIV sme pozorovali, že inzercia peptidu HIV-1 nemodifikovala štruktúru HPV L1 a že chimérické proteíny HPV:HIV si stále zachovávajú schopnosť vytvárať VLP. Okrem toho sme uskutočnili koncept imunopremostenia, aby sme demonštrovali porovnateľné imunitné reakcie medzi kandidátom HPV: HIV VLP (naším) a schválenou vakcínou proti HPV založenou na VLP (licencovaný Gardasil-9). Naše údaje odhalili, že inzercia HIV-1 P18I10 alebo T20 peptidu do chimérického HPV: HIV VLP by mohla vyvolať podobný titer HPV16 L1-špecifických väzbových protilátok v porovnaní s HPV Gardasil-9 vakcína. Typovo špecifické anti-HPV16 L1 viažuce protilátky pozorované s licencovanou vakcínou HPV Gardasil-9 VLP v porovnaní s chimérickými verziami vakcíny HPV Gardasil-9 VLP boli v súlade s našimi údajmi.

Pred imunizáciou myší by sa mala overiť dĺžka a miesto optimálneho cudzieho antigénu HIV{0}} začleneného do HPV16 L1 VLP a in vitro stabilita výsledných chimérických HPV:HIV VLP. Naša súčasná štúdia ukázala, že inzercia peptidov P18I10 alebo T20 do proteínu HPV16 L1 neovplyvnila in vitro stabilitu, samozostavenie a morfológiu chimérických HPV: HIV VLP. Tieto výsledky boli v súlade s predchádzajúcimi štúdiami naznačujúcimi, že inzercia domény HIV-1 MPER do sekvencie slučky DE BPV L1 neovplyvnila schopnosť samozostavenia sa kapsidového proteínu BPV L1 na VLP [20]. Epitopy umiestnené v povrchovo exponovaných DE a FG slučkách kapsidových proteínov HPV L1 dominantne prispievajú k indukcii L1-špecifických krížovo neutralizujúcich protilátok [67]. Tu sme demonštrovali, že inzercia HIV-1 P18I10 alebo T20 peptidov do HPV16 L1 DE slučky neovplyvnila L1-špecifickú protilátkovú indukciu chimérickými HPV: HIV VLP po imunizácii myší. Okrem toho epitopy HIV{26}} P18I10 alebo T20 na HPV16 DE slučkách chimérického HPV: HIV VLP boli detegované in vitro a boli imunogénne in vivo. HPV16 L1 VLP tvoria potenciálny skelet pre povrchové zobrazenie požadovaného epitopu HIV-1. V tejto štúdii sme vykonali nepriamu ELISA, aby sme demonštrovali konformačný peptid P18I10 a T20 prítomný na povrchu našich chimérických HPV: HIV VLP. V budúcnosti by mohla byť imuno-elektrónová mikroskopia ďalším prístupom na preukázanie štrukturálnej lokalizácie a organizácie antigénu P18I10 alebo T20 v rámci HPV: HIV VLP.

Samozostavenie je reprezentatívnym indexom stability in vitro HPV16 L1 VLP. Je známe, že pH, iónová sila, teplota [52] a redoxné prostredie korelujú s disulfidovými väzbami kapsidových proteínov HPV16 L1 [53]. Skoršie práce o VLP papilomavírusu naznačili dôležitosť disulfidových väzieb pre samozostavenie hlavnej kapsidy L1 [68,69]. Tvorba disulfidu indikovala vyšší cysteín kapsidového proteínu L1 vo vhodnej geometrii [53]. Tieto disulfidové krížové väzby spájajú zvyšky 175 a 428 (pre HPV16), ktoré stabilizujú HPV virióny a VLP [70]. V tejto štúdii sme analyzovali vzory intermolekulového disulfidového zosieťovania ako nepriamy dôkaz, aby sme dokázali, že naše kapsidové proteíny L1: P18I10 a L1: T20 majú tendenciu sa samozostavovať in vitro. Na obrázku 3A sme demonštrovali, že purifikované L1:P18I10 a L1:T20 VLP vykazovali podobné vzory intermolekulárneho disulfidového zosieťovania ako HPV16 L1 VLP pri rovnakom pH, iónovej sile a tepelných podmienkach. Na obrázku 3B sme ďalej demonštrovali, že purifikované proteíny L1:P18I10 a L1:T20 boli schopné samozostavenia sa na väčšie častice (väčšie ako L1 pentamér s molekulovou hmotnosťou 280 kDa) in vitro. Preto sme spolu s morfologickým vzorom VLP s vlastným usporiadaním (hoci ikosaedrická štruktúra nebola celkom dobrá) pozorovaným na obrázku 4 dospeli k záveru, že naše purifikované chimérické HPV: HIV VLP sú stabilné in vitro. Okrem stability VLP by sa malo brať do úvahy mnoho ďalších kritických faktorov, ktoré by mohli ovplyvniť imunogenicitu chimérického HPV: HIV VLP, ako napríklad miesto vloženia imunogénu medzi rôzne slučky VLP [71], dávka, intervaly prime-boost a spôsob podávania [22]. , atď.

Peptidy P18I10 odvodené z HIV-1 gp120 V3 slučky sú prezentované v bunkách infikovaných HIV molekulami hlavného histokompatibilného komplexu (MHC-I) triedy I [26]. CD8+, cytotoxické T lymfocyty (CTL), by mohli rozpoznať antigény P18I10 obmedzené na MHC-I a vylučovať rôzne cytokíny, ako napríklad IFN- na elimináciu buniek infikovaných HIV [72–75]. Rekombinantná vírusová alebo plazmidová DNA sú dobré vakcínové vehikulá na expresiu peptidov P18I10 v hostiteľských bunkách a indukciu P18I10-špecifických bunkových odpovedí prostredníctvom dráhy MHC-I [76–79]. Napríklad kombinovaný režim primárnej DNA a zosilnenia modifikovaného vírusu vakcínie Ankara (MVA) bol dostatočný na vyvolanie IFN- a CTL odpovedí proti epitopu P18I10 [79]. Naopak, exogénne peptidy P18I10 nie sú účinne prezentované CD8+ T-bunkám cestou MHC-I [80,81] a vyžadujú si účasť vhodných adjuvans [82–85] alebo nosičov antigénov, ako napr. VLP. Napríklad imunogenicita syntetických peptidov P18I10 doplnených adjuvans bola marginálna v dôsledku absencie determinantov T-helper [82–85]. Už skôr bolo hlásené, že HIV{42}} Gag VLP [86], VLP povrchového antigénu hepatitídy B (HBsAg) [87], parvovírus VP2 VLP [88] a papilomavírus L1 VLP [17–19] by mohli pôsobiť ako dodávacie vektory na prezentáciu CTL epitopu obmedzeného na MHC-I in vivo. Hoci mechanizmus VLP-indukovaných MHC-I-obmedzených T-bunkových reakcií je stále nejasný, partikulárna štruktúra VLP môže prospieť endocytickému vychytávaniu makrofágov alebo dendritických buniek, čím sa dostane do cytosolu a následne vstúpi do typickej MHC-I dráhy [89, 90]. Okrem toho sa pozorovalo, že determinant P18I10 obmedzený na MHC-I indukuje odpovede pomocných T-buniek CD4+ prostredníctvom dráhy MHC-II [91,92]. Hybridné BPV1 L1 VLP môžu byť použité ako nosiče antigénnych epitopov na vyvolanie terapeutických vírusovo špecifických CTL odpovedí prostredníctvom MHC-I a MHC-II dráh [17,19], čo poskytuje sľubnú stratégiu pre návrh vakcíny na kontrolu vírusovej infekcie. Niektoré skoré štúdie tiež ukázali, že BPV L1 VLP exprimujú HPV16 E7 epitop alebo P18I10 epitop HIV-1 gp120 V3 slučkou indukovaných povrchov slizníc a tiež systémovú humorálnu a T bunkovú imunitu špecifickú pre VLP epitop [18]. V súlade s predchádzajúcimi štúdiami sme predbežne preukázali, že naše chimérické HPV: HIV (L1: P18I10) VLP by mohli indukovať HIV-špecifické imunitné reakcie T-buniek u BALB/c myší po stimulácii splenocytov peptidom P18I10. Okrem toho primárna aktivácia BCG.HIVA zvýšila HIV-1-špecifické imunitné reakcie T-buniek u myší. Avšak multifunkčné imunitné reakcie T-buniek indukované L1:P18I10 VLP by potrebovali ďalšie imunologické štúdie.

Širšie odpovede CD8+ T-buniek proti viacerým konzervovaným CTL epitopom sú prospešné na prekonanie HIV-1 genetickej diverzity a úniku [7,93–100]. Racionálny dizajn HIV-1 T-bunkových imunogénov, ako je HIVA, by mal mať potenciál reagovať na viaceré CTL epitopy [34]. Imunogén HIV-1 HIVA, ktorý navrhol Dr. Tomas Hanke, sa skladá z kompletného proteínu HIV{11}} Gag kombinovaného s viacerými epitopmi CTL vrátane epitopov P18I10 na C-konci [34]. DNA, MVA a rBCG boli vybrané ako nosiče imunogénu HIV a indukovali veľkú veľkosť a šírku bunkových reakcií špecifických pre CTL epitop použitím heterológnych režimov prime-boost v modeloch myší a primátov (NHP) [34,101]. Naše predchádzajúce štúdie ukázali, že primárna BCG.HIVA v kombinácii s MVA.HIVA boost vyvolala HIV-1-špecifické IFN produkujúce CD8+ T-bunky u BALB/c myší [31–33,102]. Je zaujímavé, že VLP by mohli byť potenciálnym boosterom na zvýšenie HIV-špecifických bunkových odpovedí pri heterológnej imunizácii rBCG [29,30] alebo DNA vakcínami [103,104]. Napríklad rBCG exprimujúci HIV-1 Gag proteín by mohol účinne pripraviť imunitný systém T-buniek na posilnenie pomocou Gag VLP v modeloch NHP [29,30]. V súčasnej štúdii sme preukázali, že primárna aktivácia BCG.HIVA by mohla posilniť imunitné reakcie T-buniek vyvolané HPV: HIV (L1:P18I10) VLP. Ďalej budeme skúmať rozsah polyfunkčných reakcií CD4+, CD8+ a pamäťových T-buniek generovaných týmto režimom rBCG prime a VLP boost.

Cistanche deserticola-improve immunity -

cistanche tubulosa - zlepšenie imunitného systému

V súčasnosti sa naša výskumná skupina zameriava na vývoj sľubných rBCG: HIV vakcín exprimujúcich nové HIV{0}} T-bunkové imunogény, ako sú tHIVconsvX a HIVACAT (HTI) T-bunkový imunogén, na zlepšenie HIV-1 zhoda variantov a šírka odozvy T-buniek. Imunogény HIVconsvX 2. generácie boli navrhnuté predefinovaním konzervovaných oblastí skupiny M a využitím bivalentného mozaikového dizajnu na maximalizáciu zhody potenciálnych 9-merných T-bunkových epitopov vo vakcíne s globálnymi variantmi [64]. Imunogén HTI bol navrhnutý tak, aby pokrýval ciele T-buniek, proti ktorým sú reakcie T-buniek pozorované prevažne u jedincov infikovaných HIV-1-s nízkou vírusovou záťažou HIV{13}} [65,66]. Pretože sa ukázalo, že papilómové VLP sú viacnásobnými CTL epitopovými nosičmi [17], zamerali sme sa na skonštruovanie chimérických HPV16 L1 VLP nesúcich viaceré konzervované HIV-1 CTL epitopy v kombinácii s rBCG exprimujúcimi ThivconsvX alebo HTI T-bunkové imunogény na indukciu širšej CTL imunitné odpovede proti HIV-1. Vysoká hustota a početné kópie HIV-1 CTL epitopu prezentované na chimérických HPV: HIV VLP môžu zlepšiť dodávanie antigénu do imunitného systému a vyvolať vyššiu frekvenciu CTL odpovedí. Naopak, rekombinantný BCG pravdepodobnejšie generuje nižšiu frekvenciu CTL reakcií v dôsledku pomalej replikácie in vivo. Pretože BCG má zreteľný vplyv na diferenciáciu T buniek, čo znamená, že BCG môže indukovať pamäť CD8+ T buniek prostredníctvom účasti CD4+ T-pomocných buniek [105], táto imunogénna vlastnosť môže urobiť BCG vhodným ako primárna aktivačná látka v heterológnych režimoch prime-boost. Očakávali sme teda, že naše HPV: HIV VLP sa môžu javiť ako sľubný booster na zvýšenie veľkosti a šírky HIV-1 CTL odpovedí pri primárnej aktivácii rekombinantným BCG exprimujúcim nový HIV-1 T-bunkový imunogén .

Peptid T20 obsahuje vysoko konzervovaný lineárny epitop 2F5 (ELDKWA). Uvádza sa, že protilátka 2F5 získaná od pacientov dlhodobo infikovaných HIV má značne neutralizujúcu účinnosť [106,107]. MPER gp41 sa považuje za slabo imunogénny, možno súvisí s jeho umiestnením blízko bunkovej a vírusovej fosfolipidovej dvojvrstvy [108]. Použitie DNA vektorov prezentujúcich MPER v lipidovom prostredí je prospešné na indukciu gp41-špecifických nAb [109–111]. Napríklad DNA vakcíny kódujúce HIV{14}}T{15}}, ktoré navrhla Dr. Britta Wahren, preukázateľne vyvolávajú reakcie neutralizujúcich protilátok (nAb) skrížených kladov [109]. Na rozdiel od toho mnohé skoré pokusy o indukciu nAb zacielených na gp41 pomocou stratégií peptidovej alebo podjednotkovej vakcíny zlyhali [112–116]. Nedávno niektoré štúdie ukázali, že BPV L1 VLPs exprimujúce 2F5 epitop alebo MPER HIV-1 gp41 indukovaných 2F5-špecifických protilátok u myší viedli ku krížovej neutralizácii [20,21]. Podobný vzorec imunogenicity sa zistil, keď bol povrchový antigén hepatitídy B (HBsAg) fúzovaný s epitopom HIV-1 2F5 alebo MPER [59,117–119]. Tu sme demonštrovali, že prezentácia HIV-1 T20 a P18I10 peptidu v našej chimérickej HPV16 L1 VLP by mohla vyvolať protilátkové reakcie proti HIV{42}} a HPV16. Neutralizujúce epitopy stabilizované na konformačnom skelete, ako sú funkčné hroty HIV{44}} alebo VLP, by mohli byť hlavným prúdom návrhu imunogénu B-buniek na dosiahnutie širokých neutralizačných protilátok (bnAbs) [93]. Väčšina nových epitopov bnAb (približne 90 %) sú však nespojité a konštituované oblasti spojené v 3-rozmerných konfiguráciách [120]. Hoci prezentácia diskontinuálnych epitopov na proteínovom skafolde by sa dala predpovedať výpočtovým modelovaním [121], tieto epitopy bnAb by mohli byť napadnuté, aby boli vložené do neobaleného proteínového skeletu HPV16 L1. Naopak, menšina HIV-1 B-bunkových imunogénov, ako je MPER (2F5) HIV-1 gp41 alebo slučka V3 (P18IIB) gp120, obsahuje lineárne neutralizačné epitopy a môže byť vhodná pre HPV: HIV proteínová chrbtica. Preto sme vybrali lineárny 2F5 neutralizačný epitop, ktorý je zahrnutý v rozšírenom T20 peptide HIV-1 MPER z hľadiska priaznivej štruktúry pre tvorbu -helixu [122]. T20 peptidy by mohli byť fúzované a stabilizované na L1 kapsidových skafoldoch, aby sa vyvolali neutralizačné protilátkové reakcie, ak by mohla byť prezentovaná natívna konfigurácia 2F5 epitopu. V tejto štúdii sme zistili, že 2F5 nAb boli naviazané na chimérické HPV: HIV (L1:T20) VLP in vitro. Okrem toho môžu L1:T20 VLP tiež indukovať T20-špecifické väzbové protilátky u BALB/c myší. Pribúdalo dôkazov o tom, že protilátky inhibujúce fúzny peptid HIV{81}} (T20) majú podobné vlastnosti ako anti-HIV{85}} fúzny peptid Enfuvirtid pri naviazaní hydrofóbneho transmembránového zvyšku T20 umiestneného v MPER gp41 počas HIV-1 fúzie a prispievajú k vírusovej kontrole [109,123,124]. Podľa našich predchádzajúcich prehľadov by bolo vždy potrebné zvážiť racionálny dizajn chimérických vakcín na báze VLP na vyvolanie odoziev neutralizačných protilátok a CTL špecifických pre HPV a HIV z hľadiska selekcie imunogénu, vektorov na dodávanie antigénov a režimov prime-boost. Na záver, táto štúdia ukázala alternatívnu expresnú platformu založenú na cicavčích bunkách a škálovateľnú metódu chromatografickej purifikácie na vytvorenie chimérických HPV: HIV VLP. Domnievame sa, že naše nové purifikačné metódy pomôžu pri získavaní antigénnych HPV: HIV VLP z buniek cicavcov s cieľom znížiť čas, náklady a prácu a zároveň zvýšiť kapacitu priemyselnej výroby. Okrem toho sme preukázali, že HPV16 L1 VLP môžu fungovať ako platforma na prenášanie HIV-1 peptidového antigénu, pretože inzercia peptidov P18I10 alebo T20 do DE slučky kapsidových proteínov HPV16 L1 neovplyvnila in vitro stabilitu, samousporiadanie a morfológiu chimérických HPV: HIV VLP a áno neinterferujú s indukciou HPV16 L{107}špecifickej protilátky in vivo. Na druhej strane chimérické HPV: HIV VLP by mohli vyvolať HPV16 a HIV špecifické B a T-bunkové imunitné reakcie proti obom vírusom. Táto správa skúmala možnosť vývoja HIV{111}} vakcín založených na rekombinantných BCG exprimujúcich HIV{112}} imunogénoch a HPV: HIV VLPs, ktoré možno použiť na imunizáciu HIV{113}} detí. Keďže vývoj účinnej chimérickej vakcíny proti HPV16 a HIV{115}} je stále výzvou, táto práca prispieva k vývoju novej chimérickej vakcíny proti HPV: HIV VLP na kontrolu HPV16 a HIV{118 }} infekcia, ktorá je naliehavo potrebná v rozvojových a priemyselných krajinách.

Referencie

1. Globálna štatistika HIV a AIDS UNAIDS-2018. 2019. Dostupné na internete: http://www.unaids.org/en/resources/fact sheet (prístup 15. júna 2020).

2. Baeten, JM PrEP pre HIV: Stupeň A pre dôkazy, ale čaká sa na dopad. Nat. Rev. Urol. 2019, 16, 570–571. [CrossRef]

3. Rerks-Ngarm, S.; Pitisuttithum, P.; Nitayaphan, S.; Kaewkungwal, J.; Chiu, J.; Paris, R.; Premsri, N.; Namwat, C.; De Souza, M.; Adams, E.; a kol. Očkovanie pomocou ALVAC a AIDSVAX na prevenciu infekcie HIV-1 v Thajsku. N. Engl. J. Med. 2009, 361, 2209–2220. [CrossRef]

4. Ng'uni, T.; Chasara, C.; Ndhlovu, ZM Hlavné vedecké prekážky vo vývoji vakcíny proti HIV: Historická perspektíva a budúce smerovanie. Predné. Immunol. 2020, 11, 590780. [CrossRef]

5. Robinson, HL vakcíny proti HIV/AIDS: 2018. Clin. Pharmacol. Ther. 2018, 104, 1062–1073. [CrossRef]

6. Wang, Q.; Zhang, L. Široko neutralizujúce protilátky a návrh vakcíny proti infekcii HIV-1. Predné. Med. 2020, 14, 30–42. [CrossRef]

7. Collins, DR; Gaiha, GD; Walker, BD CD8+ T bunky pri kontrole, liečbe a prevencii HIV. Nat. Rev. Immunol. 2020, 20, 471–482. [CrossRef] [PubMed]

8. Pollard, AJ; Bijker, EM Sprievodca vakcinológiou: Od základných princípov k novému vývoju. Nat. Rev. Immunol. 2021, 21, 83–100. [CrossRef]

9. Shapiro, SZ Poučenie pre všeobecný výskum vakcinológie z pokusov vyvinúť vakcínu proti HIV. Vaccine 2019, 37, 3400–3408. [CrossRef]

10. Ahmed, HG; Bensumaidea, SH; Alshammari, FD; Alenazi, FSH; ALmutlaq, BA; Alturkstani, MZ; Aladani, IA Prevalencia ľudského papilomavírusu podtypov 16 a 18 medzi jemenskými pacientkami s rakovinou krčka maternice. Asian Pacific J. Cancer Predch. 2017, 18, 1543–1548. [CrossRef]

11. Olcese, VA; Chen, Y.; Schlegel, R.; Yuan, H. Charakterizácia domén slučky HPV16 L1 pri tvorbe typovo špecifického, konformačného epitopu. BMC Microbiol. 2004, 4, 29. [CrossRef]

12. Dupuy, C.; Buzoni-Gate, D.; Touze, A.; Le Cann, P.; Bout, D.; Coursaget, P. Bunkami sprostredkovaná imunita vyvolaná u myší časticami podobnými vírusu HPV 16 L1. Microb. Patog. 1997, 22, 219-225. [CrossRef] [PubMed]

13. Schiller, J.; Lowy, D. Vysvetlenia vysokej účinnosti profylaktických vakcín proti HPV. Vaccine 2018, 36, 4768–4773. [CrossRef] [PubMed]

14. Markowitz, LE; Schiller, JT vakcíny proti ľudskému papilomavírusu. J. Infect. Dis. 2021, 224, S367 – S378. [CrossRef] [PubMed]

15. Chen, CW; Saubi, N.; Joseph-Munné, J. Dizajnové koncepcie vakcín proti HIV-1 na báze vírusových častíc. Predné. Immunol. 2020, 11, 573157. [CrossRef] [PubMed]

16. Eto, Y.; Saubi, N.; Ferrer, P.; Joseph, J. Navrhovanie vakcín na báze chimérických vírusových častíc pre ľudský papilomavírus a HIV: Poučenie. AIDS Rev. 2019, 21, 218–232. [CrossRef]

17. Liu, WJ; Liu, XS; Zhao, KN; Leggatt, GR; Frazer, IH častice podobné vírusu papilomavírusu na dodávanie viacerých cytotoxických T bunkových epitopov. Virology 2000, 273, 374-382. [CrossRef]

18. Liu, XS; Abdul-Jabbar, I.; Qi, YM; Frazer, IH; Zhou, J. Slizničná imunizácia časticami podobnými vírusu papilomavírusu vyvoláva u myší systémovú a slizničnú imunitu. Virology 1998, 252, 39-45. [CrossRef]

19. Peng, S.; Frazer, IH; Fernando, GJ; Zhou, J. Častice podobné vírusu papilomavírusu môžu dodávať definované CTL epitopy do dráhy MHC I. triedy. Virológia 1998, 240, 147–157. [CrossRef]

20. Zhai, Y.; Zhong, Z.; Zariffard, M.; Oštep, GT; Qiao, L. Častice podobné bovinnému papilomavírusu predstavujúce konzervované epitopy z membránovo proximálnej vonkajšej oblasti mukóznych a systémových protilátok indukovaných HIV-1 gp41. Vaccine 2013, 31, 5422–5429. [CrossRef]

21. Zhang, H.; Huang, Y.; Fayad, R.; Oštep, GT; Qiao, L. Indukcia slizničných a systémových neutralizačných protilátok proti vírusu ľudskej imunodeficiencie typu 1 (HIV-1) orálnou imunizáciou s bovinným papilomavírusom-HIV-1 časticami podobnými chimérickému vírusu gp41. J. Virol. 2004, 78, 8342-8348. [CrossRef]

22. Xiao, SL; Wen, JL; Kong, NZ; Yue, HL; Leggatt, G.; Frazer, IH Spôsob podávania chimérického BPV1 VLP určuje charakter indukovaných imunitných reakcií. Immunol. Cell Biol. 2002, 80, 21-29. [CrossRef]

23. Kirnbauer, R.; Taub, JANET; Greenstone, HEATHER; Roden, RICHARD; Dürst, M.; Gissmann, L.; Lowy, DR; Schiller, JT Efficient Self-Assembly of Human Papillomavirus Type 16 LI and L1-L2 into Virus-like Particles. J. Virol. 1993, 67, 6929-6936. [CrossRef] [PubMed]

24. Zhao, Q.; Potter, CS; Carragher, B.; Lander, G.; Sworen, J.; Towne, V.; Abrahám, D.; Duncan, P.; Washabaugh, MW; Sitrin, RD Charakterizácia častíc podobných vírusom v GARDASIL® pomocou kryotransmisnej elektrónovej mikroskopie. Hum. Vakcíny Immunother. 2014, 10, 734–739. [CrossRef] [PubMed]

25. Achour, A.; Lemhammedi, S.; Picard, O.; M'bika, JP; Zagury, JF; Moukrím, Z.; Willer, A.; Beix, F.; Burny, A.; Zagury, D. Cytotoxické T lymfocyty špecifické pre HIV-1 antigén gp160 a syntetický peptid P18IIIB u jedinca imunizovaného HLA-A11-. AIDS Res. Hum. Retrovírusy 1994, 10, 19–25. [CrossRef]

26. Nakagawa, Y.; Kikuchi, H.; Takahashi, H. Molekulárna analýza TCR a interakcie peptid/MHC s použitím peptidov odvodených od P18-I10- s jednou substitúciou D-aminokyseliny. Biophys. J. 2007, 92, 2570-2582. [CrossRef]

27. Qiu, Z.; Chong, H.; Yao, X.; Su, Y.; Cui, S.; He, Y. Identifikácia a charakterizácia vrecúška na N-triméri HIV-1 Gp41: Dôsledok pre vstup vírusu a cieľ lieku. Pomôcky 2015, 29, 1015–1024. [CrossRef]

28. Peters, BS; Cheingsong-Popov, R.; Callow, D.; Foxall, R.; Patou, G.; Hodgkin, K.; Weber, JN Pilotná štúdia fázy II bezpečnosti a imunogenicity HIV p17/p24:VLP (p24-VLP) u asymptomatických HIV séropozitívnych jedincov. J. Infect. 1997, 35, 231-235. [CrossRef]

29. Chege, GK; Burgers, WA; Stutz, H.; Meyers, AE; Chapman, R.; Kiravu, A.; Bunjun, R.; Shephard, EG; Jacobs, WR; Rybicki, EP; a kol. Robustná imunita voči auxotrofnej Mycobacterium bovis BCG-VLP Prime-Boost kandidáta na vakcínu proti HIV v modeli primátov (okrem človeka). J. Virol. 2013, 87, 5151–5160. [CrossRef]

30. Chege, GK; Thomas, R.; Shephard, EG; Meyers, A.; Bourn, W.; Williamson, C.; Maclean, J.; šedá, CM; Rybicki, EP; Williamson, AL Režim primárnej imunizácie s použitím rekombinantných BCG a Pr55gag vírusových častíc podobných vakcín založených na HIV typu 1 subtypu C úspešne vyvoláva Gag-špecifické reakcie u paviánov. Vaccine 2009, 27, 4857-4866. [CrossRef]

31. Jozef, J.; Saubi, N.; Im, EJ; Fernández-Lloris, R.; Gil, O.; Cardona, PJ; Gatell, JM; Hanke, T. Vakcinácia novorodených myší pomocou BCG.HIVA222 + MVA.HIVA zvyšuje HIV-1-špecifické imunitné reakcie: Vplyv veku a imunizačných ciest. Clin. Dev. Immunol. 2011, 2011, 516219. [CrossRef]

32. Saubi, N.; Gea-Mallorquí, E.; Ferrer, P.; Hurtado, C.; Sánchez-Úbeda, S.; Eto, Y.; Gatell, JM; Hanke, T.; Joseph, J. Vytvorenie nového dizajnu mykobakteriálnej vakcíny pre detskú vakcínu HIV-TB vektorovanú lyzínovým auxotrofom BCG. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2014, 1, 14017. [CrossRef]

33. Mahant, A.; Saubi, N.; Eto, Y.; Guitart, N.; Gatell, JM; Hanke, T.; Joseph, J. Predklinický vývoj BCG.HIVA2auxo.int, ktorý obsahuje integratívny expresný vektor, pre detskú vakcínu proti HIV-TB. Zvýšenie stability a špecifickej HIV-1 T-bunkovej imunity. Hum. Vakcíny Immunother. 2017, 13, 1798–1810. [CrossRef] [PubMed]

34. Hanke, T.; McMichael, AJ Návrh a konštrukcia experimentálnej vakcíny proti HIV-1 na jednoročné{2}} klinické skúšanie v Keni. Nat. Med. 2000, 6, 951-955. [CrossRef] [PubMed]

35. Durocher, Y.; Perret, S.; Kamen, A. Vysokoúrovňová a vysokovýkonná produkcia rekombinantného proteínu prechodnou transfekciou ľudských 293-EBNA1 buniek rastúcich v suspenzii. Nucleic Acids Res. 2002, 30, E9. [CrossRef] [PubMed]

36. Kim, HJ; Kim, SY; Lim, SJ; Kim, JY; Lee, SJ; Kim, HJ Jednokroková chromatografická purifikácia proteínu L1 ľudského papilomavírusu typu 16 zo Saccharomyces cerevisiae. Proteín Expr. Purif. 2010, 70, 68–74. [CrossRef] [PubMed]

37. Eto, Y.; Saubi, N.; Ferrer, P.; Joseph-Munné, J. Expresia chimérického HPV-HIV proteínu L1P18 v pichia pastoris; purifikácia a charakterizácia vírusom podobných častíc. Pharmaceutics 2021, 13, 1967. [CrossRef]

38. GE. Použitie CaptoTM Core 700 a Capto Q ImpRes pri čistení častíc podobných ľudským papilomavírusom. J. Asia's Pharm. Biopharm. Ind. 2014, 1.–4.

39. McLean, CS; Churcher, MJ; Meinke, J.; Smith, GL; Higgins, G.; Stanley, M.; Minson, AC Výroba a charakterizácia monoklonálnej protilátky proti ľudskému papilomavírusu typu 16 s použitím rekombinantného vírusu vakcínie. J. Clin. Pathol. 1990, 43, 488-492. [CrossRef]

40. Merck Canada Inc. Produktová monografia Gardasil®. Prod. Monogr. Monopril Prod. Monogr. 2015, 1–71.

41. Achour, A.; Persson, K.; Harris, RA; Sundbäck, J.; Sentman, CL; Lindqvist, Y.; Schneides, G.; Kärre, K. Kryštalická štruktúra H-2D(d) MHC triedy I v komplexe s HIV-1- odvodeným peptidom P18-110 pri rozlíšení 2,4 Á: Dôsledky pre T bunku a NK bunku uznanie. Imunita 1998, 9, 199-208. [CrossRef]

42. Pang, W.; Tom, SC; Zheng, YT Súčasné inhibítory fúzie peptidu HIV typu-1. Antivir. Chem. Chemother. 2009, 20. [CrossRef]

43. Chen, XS; Garcea, RL; Goldberg, I.; Casini, G.; Harrison, SC Štruktúra malých častíc podobných vírusu zostavených z L1 proteínu ľudského papilomavírusu 16. Mol. Cell 2000, 5, 557-567. [CrossRef] [PubMed]

44. deň, PM; Weisberg, AS; Thompson, CD; Hughes, MM; Pang, YY; Lowy, DR; Schiller, JT Ľudský papilomavírus 16 kapsidov sprostredkúva jadrový vstup počas infekcie. J. Virol. 2019, 93, e00454-19. [CrossRef]

45. Zhou, J.; Doorbar, J.; Slnko, XY; Crawford, LV; McLean, CS; Frazer, IH Identifikácia signálu jadrovej lokalizácie proteínu L1 ľudského papilomavírusu typu 16. Virológia 1991, 185, 625–632. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Vlps, A.; Middelberg, APJ; Lua, LHL Vírusové biologické spracovanie častíc: výzvy a príležitosti. Pharm. Bioprocess. 2013, 1, 407–409.

47. Bousarghin, L.; Touzé, A.; Combita-Rojas, AL; Coursaget, P. Pozitívne nabité sekvencie kapsidových proteínov ľudského papilomavírusu typu 16 sú dostatočné na sprostredkovanie prenosu génov do cieľových buniek prostredníctvom receptora heparansulfátu. J. Gen. Virol. 2003, 84, 157–164. [CrossRef]

48. Sasagawa, T.; Puško, P.; Steers, G.; Gschmeissner, SE; Nasser Hajibagheri, MA; Finch, J.; Crawford, L.; Tommasino, M. Syntéza a zostavenie vírusom podobných častíc ľudských papilomavírusov typu 6 a typu 16 v štiepnej kvasinke Schizosaccharomyces pombe. Virológia 1995, 206, 126–135. [CrossRef]

49. Biemelt, S.; Sonnewald, U.; Galmbacher, P.; Willmitzer, L.; Müller, M. Produkcia častíc podobných vírusu ľudského papilomavírusu typu 16 v transgénnych rastlinách. J. Virol. 2003, 77, 9211-9220. [CrossRef]

50. Zahin, M.; Joh, J.; Khanal, S.; Husk, A.; Mason, H.; Warzecha, H.; Ghim, SJ; Miller, DM; Matoba, N.; Jenson, AB Škálovateľná produkcia proteínu HPV16 L1 a VLP z listov tabaku. PLoS ONE 2016, 11, e0160995. [CrossRef]

51. Aires, KA; Cianciarullo, AM; Carneiro, SM; Villa, LL; Boccardo, E.; Pérez-Martinez, C.; Perez-Arellano, I.; Oliveira, MLS; Ho, PL Produkcia častíc podobných vírusu L1 ľudského papilomavírusu typu 16 pomocou rekombinantných buniek Lactobacillus casei. Appl. Environ. Microbiol. 2006, 72, 745-752. [CrossRef]

52. Shank-Retzlaff, ML; Zhao, Q.; Anderson, C.; Hamm, M.; Vysoká, K.; Nguyen, M.; Wang, F.; Wang, N.; Wang, B.; Wang, Y.; a kol. Hodnotenie tepelnej stability Gardasil®. Hum. Vakcína. 2006, 2, 147–154. [CrossRef] [PubMed]

53. Mukherjee, S.; Thorsteinsson, MV; Johnston, LB; DePhillips, PA; Zlotnick, A. Kvantitatívny opis in vitro zostavenia vírusu podobných častíc ľudského papilomavírusu 16. J. Mol. Biol. 2008, 381, 229–237. [CrossRef] [PubMed]

54. McCarthy, poslanec; biela, WI; Palmer-Hill, F.; Koenig, S.; Suzich, JA. Kvantitatívna demontáž a opätovné zostavenie častíc vírusu typu 11 ľudského papilomavírusu in vitro. J. Virol. 1998, 72, 32-41. [CrossRef] [PubMed]

55. Kirnbauer, R.; Booy, F.; Cheng, N.; Lowy, DR; Schiller, JT Hlavný kapsidový proteín papilomavírusu L1 sa sám zostavuje do častíc podobných vírusu, ktoré sú vysoko imunogénne. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 1992, 88, 12180–12184. [CrossRef]

56. Patel, MC; Paťkár, KK; Basu, A.; Mohandas, KM; Mukhopadhyaya, R. Produkcia vírusových častíc odvodených od hlavného kapsidového proteínu-16 imunogénneho ľudského papilomavírusu. Indian J. Med. Res. 2009, 130, 213–218.

57. Shi, L.; Sanyal, G.; Ni, A.; Luo, Z.; Doshna, S.; Wang, B.; Graham, TL; Wang, N.; Volkin, DB Stabilizácia častíc podobných vírusu ľudského papilomavírusu neiónovými povrchovo aktívnymi látkami. J. Pharm. Sci. 2005, 94, 1538–1551. [CrossRef]

58. Carter, JJ; Wipf, GC; Benki, SF; Christensen, ND; Galloway, DA Identifikácia ľudského papilomavírusu typu 16-špecifického epitopu na C-terminálnom ramene hlavného kapsidového proteínu L1. J. Virol. 2003, 77, 11625–11632. [CrossRef]

59. Von Brunn, A.; Brand, M.; Reichhuber, C.; Morys-Wortmann, C.; Deinhardt, F.; Schdelt, F. Hlavná neutralizačná doména HIV-I je vysoko imunogénna, keď je exprimovaná na povrchu častíc jadra hepatitídy B. Vaccine 1993, 11, 817-824. [CrossRef]

60. Dennison, SM; Anasti, K.; Scarce, RM; Sutherland, L.; Parks, R.; Xia, S.-M.; Liao, H.-X.; Gorny, MK; Zolla-Pazner, S.; Haynes, BF; a kol. Ľudské monoklonálne protilátky neneutralizujúce HIV-1 gp41 Obálka klastra II vykazujú polyreaktivitu pri väzbe na fosfolipidy a proteínové autoantigény. J. Virol. 2011, 85, 1340–1347. [CrossRef]

61. Trkola, A.; Kuster, H.; Rusert, P.; Joos, B.; Fischer, M.; Leemann, C.; Manrique, A.; Huber, M.; Rehr, M.; Oxenius, A.; a kol. Oneskorenie návratu HIV-1 po ukončení antiretrovírusovej liečby prostredníctvom pasívneho prenosu ľudských neutralizačných protilátok. Nat. Med. 2005, 11, 615-622. [CrossRef]

62. Shank-Retzlaff, M.; Wang, F.; Morley, T.; Anderson, C.; Hamm, M.; Brown, M.; Rowland, K.; Pancari, G.; Zorman, J.; Lowe, R.; a kol. Korelácia medzi myšou účinnosťou a in vitro relatívnou účinnosťou pre častice podobné vírusu ľudského papilomavírusu typu 16 a vzorky vakcíny Gardasil. Hum. Vakcína. 2005, 1, 191–197. [CrossRef] [PubMed]

63. Kilpeläinen, A.; Maya-Hoyos, M.; Saubí, N.; Soto, CY; Joseph Munne, J. Pokroky a výzvy vo vývoji vakcíny proti HIV založenej na BCG rekombinantnej Mycobacterium bovis: Získané poznatky. Expert Rev. Vaccines 2018, 17, 1005–1020. [CrossRef] [PubMed]




Tiež sa vám môže páčiť