Cistanche zlepšuje infekciu obličiek v dôsledku systémového lupus erythematosus

CD4 reaktívny na jadrový antigén^plusbunky expandujú v aktívnom systémovom lupus erythematosus, produkujú efektorové cytokíny a infikujú obličky

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Dimas Abdirama, Sebastian Tesch atď

Systémovélupuserythematosusje systémové a chronické autoimunitné ochorenie charakterizované stratou tolerancie voči jadrovým antigénom s autoreaktívnym CD4^plusT bunky zapojené do patogenézy ochorenia. Od detekcie ľudského autoantigén-špecifického CD4 je však známe len veľmi málo o ich receptorovej špecifickosti^plusT bunky boli mimoriadne náročné. Tu uvádzame analýzu CD4^plus T bunky reaktívne na jadrové antigény s použitím dvoch komplementárnych metód: knižnice T buniek a obohatenie T buniek reaktívnych na antigén. Frekvencie CD4 špecifického pre jadrový antigén^plus T bunky korelovali so závažnosťou ochorenia. Tieto autoreaktívne T bunky produkujú efektorové cytokíny, ako je interferón-g, interleukín-17 a interleukín-10. V porovnaní s krvou boli tieto bunky obohatené v moči pacientov s aktívnou lupusovou nefritídou, čo naznačuje infiltráciu infikovanýchobličky. Tieto predtým nerozpoznané charakteristiky teda podporujú úlohu A CD4 špecifického pre jadrový antigén^plusT bunky vsystémovýlupuserythematosus.

Copyright ª 2020, International Society of Nefrology. Vydal Elsevier Inc. Toto je článok s otvoreným prístupom pod licenciou CC BY-NC-ND

KĽÚČOVÉ SLOVÁ: lupuserythematosus, obličky,

Systémovélupuserythematosusje systémové a chronické autoimunitné ochorenie charakterizované stratou tolerancie voči jadrovým antigénom v dôsledku chybnej likvidácie biologického odpadu, ako je apoptotický materiál obsahujúci ribonukleoproteíny a nukleozómy.1 Autoprotilátka namierená proti jadrovým antigénom je charakteristická presystémovýlupuserythematosusa zvyčajne sa vyskytuje pred zjavným ochorením. Okrem toho autoreaktívne CD4^plusT bunky sa podieľajú na patogenézesystémovýlupuserythematosuspodporovaním produkcie autoprotilátok B bunkami a priamou propagáciou poškodenia orgánov v infikovaných cieľových orgánoch. Hoci detekcia T-buniek reaktívnych na jadrový antigén bola hlásená už skôr, dôkazy o ich existencii zostávajú doteraz obvodové a v súčasnosti nie je jasné, ako sa vzájomne ovplyvňujú v patogenéze. Pochopenie toho, ako sa tieto bunky podieľajú na autoimunite, bude rozhodujúce pre návrh účinnej liečby.

Detekcii autoantigén-špecifických T buniek bránia ich mimoriadne nízke frekvencie v cirkulujúcej krvi. Predchádzajúce štúdie ľudského naivného CD4^plusRepertoáre T-buniek využívajú technológiu založenú na tetramére na efektívne poskytovanie presných informácií o odpovediach T-buniek na špecifické epitopy antigénu; táto metóda však vyžaduje predchádzajúce znalosti o typoch ľudských leukocytových antigénov darcu. Alternatívne techniky na súčasnú detekciu a výpočet vzácnych populácií T-buniek s reaktivitou na rôzne antigény bez predchádzajúcej znalosti typov ľudských leukocytových antigénov boli vyvinuté pomocou knižníc amplifikovaných polyklonálnych T-buniek a obohatením T-buniek exprimujúcich CD154- po stimulácii s antigénom nazývaným ARTE (antigén-reaktívne obohatenie T-buniek).

Systémovélupuserythematosusje škodlivé preobličky, ale cistanche sa môže zlepšiťobličkyfunkcie.

CD4^plus T bunky vykonávajú svoju funkciu hlavne prostredníctvom sekrécie cytokínov po aktivácii antigénu16 a šírením zápalu tkaniva, ako napr.lupuszápal obličiekčo predstavuje jednu z najzávažnejších komplikáciísystémovýlupuserythematosus. Analýza repertoáru T-buniek prítomných vobličkybiopsie od pacientov slupuszápal obličiekodhalila oligoklonalituobličky- infiltrácia CD4^plus T bunky, čo naznačuje akumuláciu antigén-špecifických T buniek v infikovanýchobličky. Naša predchádzajúca štúdia odhalila močové T bunky u pacientov s aktívnymlupus zápal obličiekako presný biomarker, ktorý sa podobá fenotypu intrarenálnych buniek. Hoci sú tieto bunky obohatené o CXC chemokínový receptor 3 a CC chemokínový receptor 5 exprimujúce T bunky, čo svedčí o populácii pomocných T buniek 1 (Th1) a obsahujú CD154^plusT bunky naznačujúce nedávne stretnutie s antigénom, ich antigénna špecifickosť voči jadrovým antigénom zostáva nejasná.

V tejto štúdii uvádzame analýzu CD4^plus T bunky reaktívne na jadrové antigény u celkovo 17 zdravých jedincov, 12 jedincov s neaktívnymisystémovýlupuserythematosus, a 20 subjektov s aktívsystémovýlupuserythematosuspomocou knižníc T-buniek a techník ARTE na analýzu frekvencií autoreaktívneho CD4^plus T bunky v periférnej krvi a moči pacientov slupuszápal obličiekako aj produkciu cytokínov.

VÝSLEDKY

CD4 reaktívny na jadrový antigén^plusT bunky sú expandované inaktívnym systémovým lupus erythematosus, ako sa určilo pomocou knižnice T buniek a ARTE

s aktívnymsystémovýlupuserythematosus. Tieto bunky boli tiež detegovateľné u 5 zo 6 pacientov s inaktivitousystémovýlupuserythematosus, zatiaľ čo iba 3 zo 6 zdravých kontrol vykazovali cirkuláciuautoreaktívnyT bunky. Zaujímavé je, že pacienti s aktívsystémovýlupuserythematosustiež vykazovali širšiu škálu autoreaktívnych T-bunkových reakcií, pričom každý pacient mal reaktívne T-bunky proti aspoň 3 jadrovým antigénom. V porovnaní s tým bolo cieľové portfólio menej variabilné u pacientov s neaktívnosťousystémovýlupuserythematosusa zdravé kontroly. Celkovo možno povedať, že cirkulujúce nukleárne antigén-reaktívne T bunky nie sú výlučnésystémovýlupuserythematosus, zatiaľ neaktívnesystémovýlupuserythematosus, ich počet je väčší a ich cieľové štruktúry variabilnejšie.

Pretože autoreaktívne T bunky hrajú úlohu pri šírení autoimunitných reakcií, porovnali sme počet autoreaktívnych T buniek so závažnosťou ochorenia, hodnotenousystémovýlupuserythematosusindex aktivity ochorenia (systémovýlupuserythematosusDAI) skóre. Iba frekvencie CD4^plusT bunky reaktívne na RNP70, Ro a La pozitívne korelovali ssystémovýlupuserythematosusDAI (RNP70: P ¼ 0.{5}}4, r ¼ 0,4865; Ro: P ¼ 0.005 r=0,6299, La: P=0,01, r=0,5651) (obrázok 1d). Na rozdiel od toho, frekvencia T buniek reaktívnych na transtyretín bola zistená na dosť podobnej úrovni vo všetkých 3 skupinách (obrázok 1e), čím sa vylúčila možná experimentálna odchýlka v dôsledku všeobecnej neaktívnej hyperreaktivity T-buniek nešpecifickej pre antigén.systémovýlupuserythematosus.

Knižnice T-buniek ponúkajú rad výhod vrátane vysokej citlivosti na detekciu veľmi vzácnych buniek v rámci nízkeho počtu vstupných buniek. Táto technika sa však spolieha na expanziu buniek, ktorá môže zmeniť zloženie buniek a poskytuje len obmedzenú možnosť fenotypovej charakterizácie reaktívnych buniek. Preto sme naše pozorovania potvrdili metódou ARTE. Protokol ARTE vyžaduje väčšie množstvo vstupných buniek, čo je obzvlášť náročné u pacientov ssystémovýlupuserythematosusktorí sa často prejavujú lymfopéniou a anémiou. Kvôli tomuto obmedzeniu a tiež kvôli zvýšeniu očakávaného počtu reaktívnych buniek sme spojili všetkých 5 kanonických jadrových antigénov a použili sme tento súbor na stimuláciu mononukleárnych buniek periférnej krvi (PBMC) pred obohatením buniek exprimujúcich CD154- (n ¼ 15 pacientov ssystémovýlupuserythematosus; n ¼ 6 zdravých kontrol). Použitím kombinácie povrchových markerov CD154 a CD69 T bunky reagujú nasystémovýlupuserythematosus-asociované jadrové antigény bolo možné identifikovať v základnej populácii (obrázok 1f). Aj keď bola expresia CD154 a CD69 v pozadí hojne pozorovaná u všetkých jedincov, pacientov s aktívnousystémovýlupuserythematosusmali významne zvýšené frekvencie CD154 plus CD69 plus T buniek, keď boli stimulované jadrovými antigénmi v porovnaní so stimuláciou pozadia (P ¼ 0,008), zatiaľ čo zdraví jedinci a pacienti s neaktívnousystémovýlupuserythematosusmali podobné frekvencie medzi antigénom stimulovanými a nestimulovanými bunkami (zdraví jedinci: P ¼ 0.44; pacienti s neaktívnymisystémovýlupuserythematosus: P ¼ {{0}}.56) (obrázok 1g). Okrem toho, po odpočítaní frekvencií pozadia boli frekvencie T buniek reaktívnych na jadrový antigén vyššie u pacientov s aktívnym ochorením ako u zdravých jedincov a pacientov s neaktívnym ochorením (P ¼ 0.02 a P ¼ 0.11) (obrázok 1h). Frekvencia T-buniek reaktívnych na jadrový antigén s odčítaným pozadím teda pozitívne korelovala s aktivitou ochorenia (P ¼ 0,004, r ¼ 0,5978), čo naznačuje ich potenciálnu úlohu vsystémovýlupuserythematosus.

Knižnice T-buniek ponúkajú rad výhod vrátane vysokej citlivosti na detekciu veľmi vzácnych buniek v rámci nízkeho počtu vstupných buniek. Táto technika sa však spolieha na expanziu buniek, ktorá môže zmeniť zloženie buniek a poskytuje len obmedzenú možnosť fenotypovej charakterizácie reaktívnych buniek. Preto sme naše pozorovania potvrdili metódou ARTE. Protokol ARTE vyžaduje väčšie množstvo vstupných buniek, čo je obzvlášť náročné u pacientov so systémovými ochoreniamilupuserythematosusktorí sa často prejavujú lymfopéniou a anémiou. Kvôli tomuto obmedzeniu a tiež kvôli zvýšeniu očakávaného počtu reaktívnych buniek sme spojili všetkých 5 kanonických jadrových antigénov a použili sme tento súbor na stimuláciu mononukleárnych buniek periférnej krvi (PBMC) pred obohatením buniek exprimujúcich CD154- (n ¼ 15 pacientov ssystémovýlupuserythematosus; n ¼ 6 zdravých kontrol). Použitím kombinácie povrchových markerov CD154 a CD69 T bunky reagujú nasystémovýlupuserythematosus-asociované jadrové antigény bolo možné identifikovať v základnej populácii (obrázok 1f). Aj keď bola expresia CD154 a CD69 v pozadí hojne pozorovaná u všetkých jedincov, pacientov s aktívnousystémovýlupuserythematosusmali významne zvýšené frekvencie CD154^plusCD69^plusT bunky pri stimulácii jadrovými antigénmi v porovnaní so stimuláciou pozadia (P ¼ 0,008), zatiaľ čo zdraví jedinci a pacienti s neaktívnousystémovýlupuserythematosusmali podobné frekvencie medzi antigénom stimulovanými a nestimulovanými bunkami (zdraví jedinci: P ¼ 0.44; pacienti s neaktívnymisystémovýlupuserythematosus: P ¼ {{0}}.56) (obrázok 1g). Okrem toho, po odpočítaní frekvencií pozadia boli frekvencie T buniek reaktívnych na jadrový antigén vyššie u pacientov s aktívnym ochorením ako u zdravých jedincov a pacientov s neaktívnym ochorením (P ¼ 0.02 a P ¼ 0.11) (obrázok 1h). Frekvencia T-buniek reaktívnych na jadrový antigén s odčítaným pozadím teda pozitívne korelovala s aktivitou ochorenia (P ¼ 0,004, r ¼ 0,5978), čo naznačuje ich potenciálnu úlohu vsystémovýlupuserythematosuspatogenézy (obrázok 1i). Navyše CD4^plusT bunky reaktívne na vyvolávací antigén Candida albicans MP65 vykazovali podobné frekvencie medzi darcami (obrázok 1j), s vylúčením možnosti všeobecnej zaujatosti smerom k vyšším frekvenciám antigén-reaktívnych T buniek u pacientov s aktívnymsystémovýlupuserythematosus.

Súhrnne naše údaje generované pomocou knižnice T-buniek a metód ARTE ukazujú expanziu CD4 špecifického pre autoantigén^plusT bunky u pacientov s aktívsystémovýlupuserythematosus. Obidve techniky sú porovnateľné, ako ukazujú podobné hodnoty mediánu stimulačného indexu medzi antigénom stimulovanými a nestimulovanými odpoveďami T-buniek (stredný index stimulácie-T-bunková knižnica: 1,857; ARTE: 1,614; P ¼ 0 0,33), hoci technika ARTE odhalila vyššie frekvencie CD4 reaktívneho na jadrový antigén^plus T-bunky ako technika knižnice T-buniek (obrázok 1k).

Cistanchemôže zlepšiť infekciuobličky.

Jadrový antigén-reaktívne T bunky u zdravých jedincov sú bona fife autoreaktívne CD4^plusT bunky

Knižnica T-buniek aj techniky ARTE demonštrovali detekciuautoreaktívnyT bunkyu zdravých jedincov, ktoré predstavujú možný pôvod pre rozvoj ľudskej autoimunity. Ich počet sa však významne nelíšil od frekvencií pozadia, takže nie je isté, či zdravé subjekty skutočne musia cirkulovať CD4 reagujúce na jadrový antigén^plusT bunky. Aby sme odhalili antigénovú špecifickosť autoreaktívnych T buniek u zdravých jedincov, vytvorili sme jednotlivé klony T buniek z CD154^plusCD69^plusCD4^plusPrekurzory T-buniek izolované od zdravých jedincov po stimulácii PBMC jednotlivými jadrovými antigénmi a kontrolným antigénom odvodeným z lyzátu Aspergillus fumigatus. Značný početsystémovýlupuserythematosus-Asociované autoantigén-špecifické T-bunkové klony reagovali na svoje zodpovedajúce antigény po restimulácii antigénu, ako je zvýraznené koexpresiou IFN-g s CD154 (počet špecifických klonov – Aspergillus fumigatus: 5 z 5; SmD1: 4 z 8; RNP70: 3 z 11; histón: 5 z 5; Ro: 4 z 9; La: 5 zo 7) (doplnkový obrázok S2A a B). Okrem toho bola antigénna odpoveď (reprezentatívne znázornená pre SmD1) závislá od dávky, pričom sa zdôraznilo, že T bunky reaktívne na jadrový antigén u zdravých jedincov sú bona fife autoreaktívne CD4^plusT bunky (doplnkový obrázok S2C). Potvrdili sme teda existenciu jadrových antigén-reaktívnych T buniek u zdravých jedincov v rámci signálu pozadia aplikovaných detekčných metód.

Produkcia cytokínov jadrových antigén-reaktívnych CD4 plus T buniek

Ďalej sme skúmali produkciu cytokínov CD4 reaktívneho na jadrový antigén^plusT bunky. CD154-exprimujúce bunky sa intracelulárne zafarbili na efektorové cytokíny, ako je IFN-g, interleukín (IL)-17, IL-4 a IL-10 po stimulácii zmesousystémovýlupuserythematosus-asociované jadrové antigény (obrázok 2a). Frekvencie IFN-g–, IL-17– a IL-10–produkujúcich CD154^plusCD4^plusT bunky boli významne zvýšené u pacientov s aktívnymsystémovýlupuserythematosus(všetky cytokíny: P ¼ {{0}} 0,004), pričom frekvencia autoreaktívnych T buniek produkujúcich IL-4 zostala nerozoznateľná od frekvencie pozadia (P ¼ 0,125) (obrázok 2b). Navyše absolútne počty autoreaktívnych T buniek produkujúcich IFN-g a IL-10 boli vyššie u pacientov s aktívnymsystémovýlupuserythematosusako u zdravých jedincov a pacientov s neaktívsystémovýlupuserythematosus(Obrázok 2b). Odčítaním frekvencií pozadia sa pacienti s aktívnymisystémovýlupus erythematosusmali významne vyššie frekvencie IFN-g– a IL-10–produkujúcich autoreaktívne T bunky ako zdraví jedinci (IFN-g: P ¼ 0.003; IL{{5} }: P ¼ 0,004), ako aj IFN-g–, IL-17– a IL-10–produkujúcich autoreaktívne T bunky ako pacienti s neaktívnymisystémovýlupuserythematosus(IFN-g: P ¼ 0.002; IL-17: P ¼ 0.00 2; IL-10: P ¼ 0.005) (obrázok 2c). Okrem toho frekvencia IFN-g– a IL-10– ale nie IL-17– a IL-4–produkujúcich jadrový antigén – reaktívnych T buniek korelovala s aktivitou ochorenia. Iba frekvencia buniek produkujúcich IL-4 však vykazovala menšiu koreláciu s aktivitou ochorenia (IFN-g: P < 0.0001,="" r="" ¼="" 0,7574;="" il{{20}="" }:="" p="" ¼="" 0,005,="" r="" ¼="" 0,5889;="" il-4:="" p="" ¼="" 0,14,="" r="" ¼="" 0,3717;="" il{30}}:="" p="" ¼="" 0,0004,="" r="" ¼="" 0,6927)="" (obrázok).="" posúdené="" podľa="" frekvencie="" producentov="" ifn-g,="" antigén-reaktívny="">^plusT bunky boli hlavne z línie Th1. Naopak, IL-17, ako aj IL{2}} producenti, boli detegovaní len pri nižších frekvenciách.26 V porovnaní s hladinami autoprotilátok, frekvencie CD4 produkujúcich cytokíny^plusT bunky nekorelovali s koncentráciou anti-dvojvláknovej DNA a so sérovým titrom antinukleárnych protilátok (doplnkový obrázok S3A a B). Žiadna iná korelácia medzi jadrovým antigénom-reaktívnym CD4^plusPozorovali sa T bunky a autoprotilátky s výnimkou La-reaktívneho CD4^plusT bunky voči autoprotilátkam La (doplnkový obrázok S3C).

Detekcia CD4 plus T buniek reaktívnych na jadrový antigén v moči pacientov s aktívnym systémovým lupus erythematosus a lupusovou nefritídou

Predpokladá sa, že populácia Th1 buniek reaktívnych na jadrový antigén napadneobličkytkaniva, kde sa môžu stretnúť so svojím takmer všadeprítomným príbuzným antigénom. Skúmaním repertoáru T-bunkového receptora (TCR)-b CD4^plusT bunky izolované z periférnej krvi v porovnaní s bunkami izolovanými z moču 5 pacientov ssystémovýlupuserythematosusa aktívnylupuszápal obličiekpozorovali sme oligoklonálne skreslený repertoár TCR buniek derivovaných z moču (obrázok 3a). Kumulatívna frekvencia 20 najhojnejších klonov T-buniek bola významne vyššia v moči, čo zodpovedá nižšiemu indexu diverzity (doplnkový obrázok S4A). Aby sa otestovalo, či tieto bunky tiež vykazujú reaktivitu na súborsystémovýlupuserythematosus-asociované jadrové antigény, vytvorili sme knižnice pozostávajúce z močového CD4^plusT bunky izolované od 3 pacientov ssystémovýlupuserythematosusa aktívnylupuszápal obličiek(Doplnkový obrázok S4B). Močový CD4^plus T cells were metabolically and functionally active cells indicated by the ability to proliferate upon stimulation with SEB but with signs of exhaustion shown by a reduced proliferation capacity after polyclonal activation (Supplementary Figure S4C and D). Because of these circumstances, only microcultures with a SEB stimulation index of >4 boli zahrnuté na výpočet CD4 v moči^plusT bunky špecifické pre individuálny jadrový antigén. Súbežne s močovým CD4^plusT bunky, frekvencia jadrových antigén-reaktívnych CD4^plusStanovili sa T bunky v periférnej krvi, čo umožnilo priame porovnanie príslušných frekvencií u tých istých jedincov (obrázok 3b). Zistili sme, že je to neaktívnelupuszápal obličiek, frekvencie močového nukleárneho antigén-reaktívneho CD4^plusT bunky boli vyššie ako v periférnej krvi. Na potvrdenie tohto pozorovania sme označili močové bunky izolované zo 4 aktívnychlupuszápal obličiekdarcov s karboxyfluoresceín sukcinimidylesterom a zmiešali označené bunky s PBMC zhodnými s darcom, aby sa umožnilo priame porovnanie antigén-reaktívnych buniek v 1 teste s použitím techniky ARTE. Frekvencia CD154^plusCD69^plusT bunky v stimulovaných a nestimulovaných vzorkách darcovských močových a periférnych krvných buniek sa použili na posúdenie, či sú T bunky reaktívne na jadrový antigén obohatené v moči ako náhrada zaobličkyvýpočtom stimulačného indexu (obrázok 3c). Hoci knižnica močových T-buniek a metódy ARTE sa líšili v ich strednom stimulačnom indexe od jadrových antigénov (stimulačný index – knižnica T-buniek v moči: 17; ARTE: 2,79; P ¼ 0,4) (obrázok 3d) , analýza autoreaktivity v periférnom a močovom CD4^plus T bunky z oboch metód (celkovo n ¼ 7) vykazovali zvýšený index nukleárneho antigénu špecifickej stimulácie v moči (P ¼ 0.0156) (obrázok 3e). Tieto pozorovania naznačujú, že jadrový antigén-reaktívny CD4^plusT bunky napádajú a hromadia sa vinfikovanýobličky. Teda lokálny zápal tkaniva vsystémovýlupuserythematosusmôže byť antigénovo špecifickým javom a priamo modulovaný infiltráciouautoreaktívnyT bunky.

Ak chcete pokračovať, pre časť 2 kliknite sem.