Aktivita komplementu je pri C3 glomerulopatii regulovaná fúznymi proteínmi IgG-faktor H s a bez správnych zacielených domén

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Alyssa C. Gilmore, Yuchun Zhang, H. Terence Cook', Deborah P. Lavin, Suresh Katti, YiWang2, Krista K. Johnson, SungKwon Kim² a Matthew C. Pickering

„Centrum pre zápalové choroby, Imperial College London, Spojené kráľovstvo; a²Alexion Pharmaceuticals, New Haven, Connecticut, USA

C3 glomerulopatiouje charakterizovaná akumuláciou komplementu C3 v glomeruloch. Príčiny zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na abnormality faktora H, hlavného negatívneho regulátora alternatívnej dráhy komplementu. U myší s deficitom faktora H (Cfh-/-) sa vyvinie C3glomerulopatiouspolu so znížením plazmatických hladín C3. Pomocou tohto modelu sme hodnotili účinnosť dvoch fúznych proteínov obsahujúcich regulačné domény alternatívnej dráhy faktora H (FH1-5)

spojené buď s necieleným myšacím imunoglobulínom (IgG-FH1-5) alebo s protilátkou proti myšaciemu properdínu (Anti-P-FH1-5). Obidva proteíny zvýšili plazmatický C3 a znížili glomerulárnu depozíciu C3 v ekvivalentnom rozsahu, čo naznačuje, že správne zacielenie sa nevyžadovalo pre FH1-5 na zmenu aktivácie C3 v plazme alebo v glomeruloch. Po podaní IgG-FH1-5 plazmatické hladiny C3 dočasne korelovali so zmenami hladín faktora B, zatiaľ čo plazmatické hladiny C5 korelovali so zmenami plazmatických hladín properdínu. Najmä zvýšenie plazmy

Hladiny C5 a properdínu pretrvávali dlhšie ako zvýšenia C3 a faktora B. U Cfh-/- myší IgG-FH1-5 znížil poškodenie obličiek počas zrýchlenej sérovej nefrotoxickej nefritídy. Naše údaje teda ukazujú, že IgG-FH1-5 obnovil aktivitu cirkulujúcej alternatívnej dráhy a znížil glomerulárnu depozíciu C3 u Cfh-/- myší a že hladiny properdínu v plazme sú citlivým markerom aktivity C5 konvertázy pri nedostatku faktora H. Imunoglobulínový konjugovaný FH1-5 proteín môže byť vďaka svojmu pomerne dlhému plazmatickému polčasu potenciálnou terapiou C3glomerulopatiou.

Cistanche môže pomôcť s glomerulopatiou

Prekladové vyhlásenie

C3 glomerulopatiou(C3G) je ochorenie obličiek charakterizované abnormálnou akumuláciou komplementu C3 v glomerulách a poškodením glomerulov. Je to spôsobené nekontrolovanou aktiváciou alternatívnej dráhy komplementu. Fúzne proteíny pozostávajúce z funkčných domén regulátora alternatívnej dráhy, faktora H (FH), spojené s protilátkou, obnovili reguláciu komplementu a redukovali glomerulárny C3 v myšom modeli C3G. Necieľová protilátková konjugácia viedla k pomerne dlhému plazmatickému polčasu fúzneho proteínu a tento alebo podobné konjugačné metódy sa mohli použiť na zvýšenie funkcie FH pri terapii C3G.

C3 glomerulopatiou(C3G) je porucha obličiek sprostredkovaná komplementom charakterizovaná abnormálnym množstvom C3 v glomeruloch.1 Môže progredovať do zlyhania obličiek a nemá žiadnu definitívnu liečbu.2 C3G je spojená s abnormálnou aktiváciou alternatívnej dráhy komplementu (AP). Aktivácia AP vedie k produkcii C3bBb (C3 konvertáza), enzýmu, ktorý štiepi C3. Po pridaní ďalšej molekuly C3b môže výsledný komplex C3bBbC3b (C5 konvertáza) štiepiť komplement C5. Nekontrolovane

Aktivácia AP v C3G môže byť spojená so znížením cirkulujúcich C3, C5, faktora B (FB) a properdínu. Medzi príčiny nekontrolovanej aktivácie AP patrí strata funkčných zmien v regulátoroch komplementu a zisk funkčných zmien v aktivátoroch komplementu.2 Kľúčovým negatívnym regulátorom AP je faktor H (FH) a nedostatok FH u ľudí, ošípaných a myší je spojený s C3G. 3 C3 nefritický faktor, protilátka, ktorá stabilizuje AP C3 konvertázu je častá v C3G.4 C3 nefritický faktor môže viesť k zníženiu samotného C3 (nefritický faktor C3 nezávislý od správneho C3) alebo k zníženiu C3 aj C5 (správny závislý nefritický faktor C3).5,6

Hoci nedostatok properdínu nezlepšil plazmatické hladiny C3, hladiny C5 sa zvýšili, čo naznačuje, že properdín bol nevyhnutný pre aktivitu C5, ale nie C3 konvertázy.8,9

Podávanie myšieho10 alebo ľudského FH11,12 myšiam Cfh–/– znížilo farbenie glomerulov C3 a zvýšilo hladiny cirkulujúceho C3. V tomto modeli sú tiež účinné konštrukty, ktoré obsahujú iba regulačné a cieľové domény FH (mini-FH molekuly).13 Ďalšie prístupy zahŕňajú proteíny, ktoré sa zameriavajú na miesta aktivácie komplementu. Patria sem TT30,14 proteín obsahujúci komplementové regulačné domény FH (FH1-5) spojené s komplement viažucimi doménami komplementového receptora 2 a homodimérne FH molekuly,15 mini-FH molekuly, ktoré obsahujú komplement viažuce domény proteínu 1 súvisiaceho s faktorom H.

Pretože terapeutická užitočnosť inhibície aktivácie komplementu C3 sa skúma pri C3G2, je dôležité pochopiť kinetiku glomerulárnej depozície C3 a jej vzťah k aktivácii AP v glomerulách aj v obehu. V modeloch glomerulonefritídy sprostredkovanej imunitným komplexom sa glomerulárny C3c vyčistil do 24 hodín od zabránenia aktivácii komplementu, zatiaľ čo glomerulárny C3d pretrvával týždne.16 Podobne u Cfh–/– myší vedie exogénny FH k redukcii glomerulárneho C3c zafarbenia po 24 hodinách , pričom glomerulárny C3d zostáva nezmenený.11

V tejto štúdii sme skúmali účinnosť 2 nových fúznych proteínov s regulačnou aktivitou komplementu v Cfh–/– myšom modeli C3G. Proteíny obsahovali regulačné domény myšacieho FH (FH1-5), ktorý bol konjugovaný s myšacím Ig, aby sa predĺžil biologický polčas. Jeden z fúznych proteínov, označený ako IgG-FH1-5, bol konjugovaný s necielenou myšacou monoklonálnou protilátkou. Druhá, nazvaná anti-P-FH1-5, bola konjugovaná s monoklonálnou protilátkou k myšaciemu properdínu. Toto sa uskutočnilo na testovanie hypotézy, že zacielenie tohto fúzneho proteínu na miesta aktivácie komplementu prostredníctvom interakcie s ukladaním properdínu by zvýšilo reguláciu tkanivového komplementu. Naše údaje ukazujú, že necielené (IgG-FH1-5) aj správne zacielené (anti-P-FH1-5) proteíny obnovili plazmovú a glomerulárnu reguláciu C3 u Cfh–/– myší. Štúdie časového priebehu ukázali, že obnovenie hladín C3 a FB odrážalo hladiny fúznych proteínov v obehu. Naopak, zvýšenia plazmatického C5 pretrvávali po odstránení fúznych proteínov z obehu. Ukazujeme, že IgG-FH1-5 zlepšil glomerulárne poškodenie počas zrýchlenej sérovej nefrotoxickej nefritídy u Cfh–/– myší.

cistanche môže liečiť ochorenie obličiek zlepšiť funkciu obličiek

VÝSLEDKY

Generovanie fúznych proteínov a hodnotenie aktivity in vitro a in vivo Fúzne proteíny sa vytvorili spojením prvých 5 domén krátkeho konsenzuálneho opakovania (SCR) myšacieho FH (FH1-5) buď s protilátkou proti myšaciemu properdínu (anti -P-FH1-5) alebo protilátka s necielenou Ig doménou (IgG-FH1- 5, doplnkový obrázok S1). Aktivita proteínov bola hodnotená pomocou AP-špecifického hemolytického testu (obrázok la). Anti-P-FH1-5 a IgG-FH1-5 inhibovali hemolýzu v závislosti od dávky s vyššou účinnosťou pre anti-P-FH1-5. Anti-properdin (anti-P) tiež znižoval hemolýzu v závislosti od dávky, ale IgG kontrola nemala žiadny účinok. Po ekvimolárnych injekciách proteínov do Cfh–/– myší bol IgG-FH1-5 proteín detegovateľný až 11 dní po injekcii, zatiaľ čo anti-P-FH1-5 bol detekovateľný až 4 dni po injekcia (doplnkový obrázok S2). Aby sme určili, či IgG-FH1-5 a anti-P-FH1-5 môžu obnoviť plazmatickú reguláciu AP u Cfh–/– myší, najprv sme zmerali hladiny C3 v plazme po injekcii fúznych proteínov (obrázok 1b) . Podanie buď IgG-FH1-5 alebo anti-P-FH1-5 signifikantne zvýšilo C3 v plazme po 24 hodinách a v menšom rozsahu po 96 hodinách po injekcii (obrázok 1b). Tieto údaje ukázali, že IgG-FH1-5 aj anti-P-FH1-5 by mohli dočasne obnoviť plazmatickú reguláciu AP u Cfh–/– myší. Ďalej sme vykonali podrobnú analýzu týchto zmien charakterizovaním časového priebehu zmien nielen plazmatického C3, ale aj plazmatického C5 a proteínov alternatívnej dráhy FB a properdínu. Zvýšenie hladín C5 a properdínu v obehu pretrváva dlhšie ako zvýšenie hladín C3 a FB po podaní IgG-FH1-5 a anti-P-FH1-5 u Cfh–/– myší

Porovnali sme kinetiku zmien v C3, C5, FB a properdíne meraním proteínov v intervaloch až 27 dní po jednej injekcii buď IgG-FH1-5 alebo anti-P-FH1-5 ( Obrázok 2). Po podaní IgG-FH1-5 došlo k najvyššiemu zvýšeniu C3, C5, FB a properdínu v deň 1 po injekcii. Čas, kedy tieto zmeny klesnú na úroveň pred liečbou, sa líšil. Návrat k hladinám pred liečbou nastal medzi 1. a 4. dňom pre FB, medzi 7. a 11. dňom pre C3 a medzi 14. a 21. dňom pre properdín aj C5 (obrázok 2a, c, e a g). Po podaní anti-P-FH1-5 sa maximálne hladiny C3 vyskytli v deň 1, ale medzi 4. a 7. dňom klesli na úroveň pred liečbou (obrázok 2b). Maximálne hladiny C5 sa vyskytli v deň 4 a vrátili sa na úrovne pred liečbou medzi dňami 7 a 11 (obrázok 2d). Maximálny nárast FB nastal v deň 1 a medzi 1. a 4. dňom klesol na úroveň pred liečbou (obrázok 2f). Ako sa očakávalo, voľný plazmatický properdín bol vyčerpaný po injekcii buď anti-P-FH1-5 alebo anti-P (obrázok 2h). Hladiny voľného plazmatického properdínu zostali nízke až 7 dní po anti-P-FH1-5 a až 14 dní po anti-P (obrázok 2h). Hoci oba fúzne proteíny dočasne obnovili reguláciu AP v plazme, trvanie zlepšenia hladín C3, FB a C5 odrážalo trvanie ich detekcie v plazme, ktoré bolo kratšie pre anti-P-FH1-5 (doplnkový obrázok S2) . Stručne povedané, zmeny hladín C3 a FB po injekcii ktoréhokoľvek proteínu boli kratšie ako zmeny v hladinách C5 a properdínu. Tieto údaje naznačujú, že plazmatický FB je v tomto nastavení citlivým markerom aktivity C3 konvertázy, zatiaľ čo properdin je markerom aktivity C5 konvertázy. Najmä po injekcii anti-P došlo k zvýšeniu C5 o 24 a 96 hodinách a v deň 7

Obrázok 1| (a) Doplňte alternatívny test hemolýzy závislý od dráhy. Protilátky sa titrovali v 2-násobných riedeniach od 60 nM do 0,5 nM. Činidlá IgG-FH1-5, anti-P-FH1-5 a anti-P znižovali hemolýzu králičích erytrocytov spôsobom závislým od dávky. Nebola použitá žiadna inhibícia IgG-kontrolného proteínu. Vodorovné stĺpce označujú stredné hodnoty a chybové stĺpce predstavujú SD. (b) Plazmatický doplnok C3 u myší Cfh–/– po injekcii fúznych proteínov. C3 v plazme sa meral pred a 24 hodín a 96 hodín po podaní IgG-FH1-5 (červené trojuholníky, n ¼ 5) Anti–P–FH1-5 (fialové trojuholníky, n ¼ 6), Anti -P (zelené bodky, n ¼ 5) a IgG kontrola (modré bodky, n ¼ 5). Vodorovné pruhy označujú stredné hodnoty a fúzy označujú SD. ***P # 0,001 oproti hodnote pred liečbou a odvodené z 2-way ANOVA s Bonferroniho viacnásobným porovnávacím testom. FH, faktor H; P, správnedin.

(Obrázok 2d). Ako bolo uvedené, 8, 9 naznačuje, že C5 konvertáza je závislá od properdínu u Cfh–/– myší.

IgG-FH1-5 a anti-P-FH1-5 znížili glomerulárny C3c, ale nezmenili farbenie C3d u Cfh–/– myší

Ďalej sme hodnotili vplyv IgG-FH1-5 a anti-P-FH1-5 na glomerulárne C3b/iC3b/C3c, C3d, properdín a proteíny súvisiace s FH (FHR). 96 hodín po injekcii IgG-FH1-5 sa glomerulárne farbenie C3b/iC3b/C3c znížilo, ale farbenie glomerulov C3d (obrázok 3a) a FHR (obrázok 3b) nie. Glomerulárne C3b/iC3b/C3c zostali nezmenené buď s IgG-kontrolou, alebo anti-P. Abnormálny lineárny vzor farbenia glomerulárneho properdínu u neliečených myší Cfh–/–9 zostal 96 hodín po kontrole IgG. U Cfh–/– myší s injekciou buď anti-P alebo IgG-FH1-5 bola hladina glomerulárneho properdínu takmer nedetegovateľná po 96 hodinách (obrázok 3b). Injekcia anti-P-FH1-5 neočakávane viedla ku granulárnemu glomerulárnemu sfarbeniu s použitím protilátok anti-properdin, anti-FH/FHR a anti-IgG (obrázok 3b). Toto zistenie naznačuje, že anti-P-FH1-5 proteín sa ukladá v glomeruloch. Injekcia anti-P-FH1-5 proteínu myšiam divokého typu viedla k glomerulárnemu zafarbeniu protilátkami anti-properdin, anti-FH/FHR a anti-IgG po 96 hodinách (doplnkový obrázok S3), čo naznačuje, že toto činidlo interaguje s normálnymi glomerulami. Predpokladali sme však, že anti-P-FH1-5 proteín by mohol tiež interagovať s už existujúcim glomerulárnym properdínom u Cfh–/– myší. Keď sme injikovali činidlo do Cfh–/– myší, ktoré boli vopred ošetrené anti-P na odstránenie glomerulárneho properdínu, došlo k redukcii granulárneho zafarbenia pomocou anti-properdinu, anti-FH/FHR a anti-IgG protilátok ( Doplnkový obrázok S4). Tieto pozorovania naznačujú, že glomerulárna interakcia anti-P-FH1-5 proteínu u Cfh–/– myší je čiastočne závislá od glomerulárneho properdínu.

IgG-FH1-5 zlepšilo poškodenie obličiek počas akcelerovanej sérovej nefrotoxickej nefritídy u Cfh–/– myší

U pacientov s C3G sa môže vyvinúť akútne poškodenie obličiek v kontexte interkurentných infekcií. Napríklad strata funkcie obličiek pri nefropatii FHR5 je spojená s epizódami synfaryngitickej makroskopickej hematúrie.17 Základná dysregulácia C3 u pacientov s C3G pravdepodobne vedie k zvýšenému poškodeniu obličiek sprostredkovanému komplementom po spustení, ktoré vedie k zápalu obličiek. Aby sme to mohli modelovať, vyvolali sme zrýchlenú sérovú nefrotoxickú nefritídu, imunitný komplex

Obrázok 2| Časový priebeh profilu plazmatického komplementu u Cfh–/– myší s injekciou IgG-FH1-5 a anti-P-FH1-5. Plazma C3 (a,b), C5 (c,d), FB (e,f) a properdín (P; g,h) od začiatku experimentu do 27 dní po jednej injekcii IgG-FH{{1{{21 }}}} (a,c,e,g; červené trojuholníky, n ¼ 5) alebo anti-P-FH1-5 (b,d,f,h; fialové trojuholníky, n ¼ 6). Kontroly zahŕňali anti-P (zelené bodky, n ¼ 5) a izotypovo zhodnú monoklonálnu protilátku (IgG-kontrola; modré bodky, n ¼ 5). Vodorovné pruhy označujú stredné hodnoty a fúzy označujú SD. *P # 0.05, **P # 0,01, ***P # 0,001 oproti hodnote pred liečbou a odvodené z 2-analýzy rozptylu s Bonferroniho viacnásobným porovnávacím testom. FB, faktor B; FH, faktor H.

model glomerulonefritídy, ktorý zahŕňa dráhy sprostredkované komplementom a Fc receptorom,18,19 u Cfh–/– myší. Predtým sme ukázali, že myši Cfh–/– sú v tomto prostredí precitlivené na poškodenie obličiek7 a predpokladali sme, že proteín FH1-5 by mohol v tomto modeli zlepšiť poškodenie obličiek sprostredkované komplementom zvýšením regulácie AP. Pretože naše údaje ukázali, že proteín anti-P-FH1-5 bol uložený v normálnych glomeruloch, použili sme IgG-FH1-5 počas zrýchlenej sérovej nefrotoxickej nefritídy. Dvadsaťštyri hodín pred injekciou ovčieho nefrotoxického séra dostali myši ip injekciu buď IgG-kontroly (n ¼ 7) alebo IgG-FH 1-5 (n ¼ 8). Experimentálny protokol je znázornený na obrázku 4a. Myši boli usmrtené 6 dní po podaní ovčieho nefrotoxického séra. Všetky 3 histologické merania glomerulárnej patológie (skóre závažnosti, celkový počet buniek a počet makrofágov) boli významne nižšie v skupine IgG-FH1-5 (obrázok 4b). Tubulointersticiálne poškodenie bolo tiež nižšie v skupine IgG-FH1-5 (obrázok 4b). Sérová močovina bola signifikantne zvýšená v

Obrázok 3| Imunofarbenie glomerulárneho komplementu u myší Cfh–/– 96 hodín po injekcii buď IgG-FH1-5 alebo anti-P-FH1-5. (a) Reprezentatívne snímky spolu s kvantifikáciou glomerulárnych C3b/iC3b/C3c a C3d v 4 experimentálnych skupinách: IgG-FH1-5 (červené trojuholníky, n ¼ 5), anti-P-FH1-5 (fialové trojuholníky, n ¼ 6), anti-P (zelené bodky, n ¼ 5) a kontrola IgG (modré bodky, n ¼ 5). b) Dátové body predstavujú stredné hodnoty a fúzy označujú medzikvartilový rozsah. Hodnoty P odvodené z Kruskal-Wallisovho testu s Dunnovým viacnásobným porovnávacím testom. (b) Reprezentatívne snímky glomerulárnych IgG, FHR a farbenia v 4 experimentálnych skupinách. Bar ¼ 100 mm. AFU, ľubovoľné fluorescenčné jednotky; FH, faktor H; P, správnedin. Ak chcete optimalizovať zobrazenie tohto obrázka, pozrite si online verziu tohto článku na adresewww.kidney-international.org.

IgG-kontrolná skupina, ale zmeny v sérovom albumíne a pomere albumínu ku kreatinínu v moči sa nelíšili (obrázok 4b). Ako sa očakávalo, glomerulárny C3b/iC3b/C3c bol významne znížený v skupine IgG-FH1-5 (obrázok 4b), ale glomerulárny myší IgG (obrázok 4b) a ovčí IgG (údaje nie sú uvedené) sa medzi skupinami nelíšili .

Obrázok 4| Predliečba IgG-FH1-5 zlepšila poškodenie obličiek počas akcelerovanej sérovej nefrotoxickej nefritídy u Cfh–/– myší. (a) Schéma protokolu zrýchlenej sérovej nefrotoxickej nefritídy. Myši preimunizované ovčím IgG dostali buď IgG-FH1-5 (ošetrená skupina, n ¼ 8) alebo IgG-kontrola (kontrolná skupina, n ¼ 7) 24 hodín pred podaním ovčieho nefrotoxického séra. (b) Funkcia obličiek a histológia 6 dní po indukcii zrýchlenej sérovej nefrotoxickej nefritídy u myší liečených buď IgG-FH1-5 (liečba; červené trojuholníky, n ¼ 8) alebo IgG-kontrola (kontrola; modré krúžky, n ¼ 7). Vodorovné pruhy označujú stredné hodnoty a fúzy označujú medzikvartilový rozsah. *P # 0.05, **P # 0,01, ***P # 0,001 oproti kontrole a odvodené z Mann-Whitneyho testu. FH, faktor H; P, správnedin.

DISKUSIA

IgG-FH1-5 aj anti-P-FH1-5 normalizovali hladiny C3, FB a C5 u myší Cfh–/–. Toto zistenie je v súlade so skutočnosťou, že domény regulácie komplementu myšieho FH sa nachádzajú v doménach SCR 1 až 5 (miesto viazania C3b a aktivita kofaktora pre štiepenie C3b sprostredkované faktorom I).20 Povrchové rozpoznávacie domény, ktoré ovplyvňujú väzbu na heparín a endotelové bunky a zahŕňajú druhé väzbové miesto C3b, sú prítomné v doménach SCR 18 až

20 (FH18-20), a preto nie sú prítomné vo fúznych proteínoch.20 Napriek tomu oba proteíny redukovali glomerulárne iC3b/C3b/C3c, čo naznačuje, že FH18-20 nebol v tomto nastavení potrebný. Toto zistenie je v súlade s predchádzajúcimi údajmi, ktoré ukazujú, že u myší Cfh–/– exprimujúcich mutantný proteín FH pozostávajúci z domén SCR 1 až 15 (Cfh–/– .FHD16-20) sa nevyvinula abnormálna glomerulárna depozícia C3.21,22 Zvieratá Cfh–/–.FH D16-20 však neboli schopné regulovať aktiváciu C3 pozdĺž renálneho endotelu a vyvinula sa u nich trombotická mikroangiopatia. Je možné, že v dôsledku nedostatku domén FH18-20 zacielených na povrch by podávanie fúznych proteínov obsahujúcich FH1-5 pri deficite FH mohlo viesť k náchylnosti k trombotickej mikroangiopatii. Je tiež možné, že zvýšená avidita pre väzbu C3b v rámci dimérnej štruktúry fúznych proteínov je dostatočná na kompenzáciu absencie FH18-20 domén zameraných na povrch. Povrchové rozpoznávanie C3b je však ovplyvnené aj konformačnými zmenami FH. zvýšená aktivita urýchľujúca rozpad. FH20 C3d-väzbové miesto nie je exponované vo FH, ale je exponované v komplexe FH-PspCN. To by mohlo vysvetľovať, prečo FH19-20 interaguje s povrchom C3d, ale FH nie.24,25 Predpokladáme, že naše činidlá môžu prostredníctvom konformačných zmien účinne interagovať s kvapalnou fázou aj povrchovým C3b. Najmä IgG-FH1-5 aj anti-P-FH1-5 chránili erytrocyty pred lýzou v teste hemolýzy závislej od AP.

Ani jeden fúzny proteín neznížil farbenie glomerulov C3d, možno kvôli pretrvávajúcej povahe glomerulárneho C3d. Pri experimentálnej imunokomplexnej nefritíde sa glomerulárny C3c upravil do 24 hodín po ukončení aktivácie komplementu, ale C3d pretrvával týždne.16 Okrem toho glomerulárny C3d pretrváva pri lupusovej nefritíde.26 To pravdepodobne odráža jeho kovalentnú interakciu s glomerulárnymi povrchmi. Opakované injekcie ľudského FH myšiam Cfh–/– preukázali zníženie glomerulárneho C3d počas 10 dní.11 Je pravdepodobné, že opakované dávkovanie IgG-FH1-5 môže v tomto modeli znížiť glomerulárny C3d. Tiež nedošlo k žiadnej zmene vo farbení glomerulárnej FHR. O funkciách myších proteínov FHR je známe len málo, ale môžu interagovať s C3b27,28 aj C3d.27 V skutočnosti je zjavná afinita FHR-A aj FHR-B k C3d silnejšia ako afinita FH.27 Predpokladáme, že glomerulárne FHR proteíny sa pravdepodobne vylúčia z glomerulov len vtedy, keď sa odstráni C3d. V tomto kontexte je pozoruhodné, že v ľudskom C3G sa proteín 5 súvisiaci s faktorom H spája s glomerulárnym C3d.29

Proteín anti-P-FH1-5 znížil hladiny voľného properdínu v plazme, ako sa očakávalo, pretože anti-správna časť tohto fúzneho proteínu môže blokovať aktivitu AP (v dôsledku vyčerpania properdínu) na 8 dní po jednej injekcii.30 naše údaje ukázali, že účinnosť FH1-5 pri zvyšovaní hladín C3 v plazme a znižovaní farbenia glomerulov C3b/iC3b/C3c bola porovnateľná medzi 2 fúznymi proteínmi (tj bola nezávislá od zacielenia properdínu). Okrem toho sa abnormálne zafarbenie glomerulárneho properdínu významne znížilo po podaní anti-P alebo IgG-FH1-5. Je zrejmé, že na rozdiel od proteínov C3d a FHR sa glomerulárny properdín po obnovení regulácie C3 ľahko odstráni. Glomerulárny properdín sa po podaní anti-P-FH1-5 proteínu zmenil, ale bolo to komplikované pozorovaním, že sme detegovali ukladanie tohto fúzneho proteínu v Cfh–/– aj v glomeruloch divokého typu. Bolo to čiastočne spôsobené interakciou s glomerulárnym properdínom, ale ukladanie v glomeruloch divokého typu naznačilo, že je tiež čiastočne úplne nezávislé od glomerulárneho komplementu a pravdepodobne súvisí s fyzikálno-chemickými vlastnosťami fúzneho proteínu.

Naše kinetické údaje preukázali nové zistenia týkajúce sa časových zmien v FB, C5 a properdíne, ktoré sprevádzajú zvýšenie C3 u Cfh–/– myší po injekcii fúznych proteínov. Hladiny FB po injekcii rýchlo stúpli

a vrátili sa na východiskové hladiny v čase, keď hladiny C5 aj properdínu zostali zvýšené. Hladiny properdínu u myší Cfh–/– boli znížené na začiatku a zvýšené na normálne hladiny (20 mg/ml30) po injekcii IgG-FH1-5 a zostali na týchto hladinách najmenej 14 dní. Podobný časový priebeh bol pozorovaný pre zvýšenie plazmatických hladín C5. Zarážajúce je, že IgG-FH1-5 väčšinou chýbal v obehu po 11 dňoch, čo naznačuje, že tvorba C5 konvertázy u Cfh–/– myší je pomalšia ako tvorba C3 konvertázy (pretože hladiny C3 sa vrátili na základnú hodnotu medzi 7 a 11 dní). C5 v plazme sa zvýšilo po liečbe anti-P a ďalej sa zvýšilo s proteínom anti-P-FH1-5. Zacielenie na properdín aj účinky FH1-5 teda prispievali k zvýšeným hladinám C5 a naznačujú, že konvertáza C5 je čiastočne závislá u myší Cfh–/–. Toto zistenie je v súlade so zlepšením dysregulácie C5 u myší s kombinovaným nedostatkom FH a properdínu.8,9 Hladiny cirkulujúceho properdínu môžu byť znížené v C3G a zdá sa, že korelujú s aktivitou povrchovej C5 konvertázy na rozdiel od plazmatického C5 alebo rozpustného C5b{ {30}}.31,32 Naše údaje podporujú úzku súvislosť medzi hladinami properdínu a aktivitou C5 konvertázy a podporujú použitie hladín properdínu ako biomarkeru prebiehajúcej glomerulárnej aktivácie C5.

Je pozoruhodné, že proteín IgG-FH1-5 bol stále detegovateľný v obehu až 11 dní po jednej injekcii. To je oveľa dlhšie ako to, čo sme predtým uviedli pre nekonjugovaný myšací FH1-5 proteín, ktorý bol odstránený z obehu do 24 hodín.14 Toto zistenie naznačuje, že dlhší plazmatický polčas IgG-FH{ {9}} proteín je odvodený z konjugácie protilátky. Plazmatický polčas IgG-FH1-5 proteínu bol tiež dlhší ako to, čo sme predtým pozorovali pre FH plnej dĺžky.10,11 Napríklad ľudský FH bol odstránený z obehu do 96 hodín po jednej injekcii u Cfh–/– myší.11 V kombinácii s našimi údajmi demonštrujúcimi účinnosť proteínu IgG-FH1-5 pri regulácii komplementu sa domnievame, že konjugácia proteínu FH1-5 na predĺženie jeho farmakokinetického profilu má potenciálny terapeutický užitočnosť v C3G.

V súhrne sme ukázali, že napriek chýbajúcim doménam rozpoznávania povrchu boli fúzne proteíny FH{0}} účinné pri znižovaní glomerulárnej aktivácie C3 a pri obnove regulácie plazmatického komplementu pri nedostatku FH. Pri konjugácii domén FH1-5 k anti-properdínu nebola zjavná žiadna výhoda a proteín IgG-FH1-5 redukoval poškodenie obličiek pri experimentálnej nefritíde. Na rozdiel od problémov pri výrobe prípravkov FH vo veľkom meradle na terapeutické použitie je výroba terapií na báze protilátok vo veľkom meradle dobre zavedená, vďaka čomu je IgG-FH1-5 atraktívnym potenciálnym terapeutikom pre C3G.

METÓDY

Fúzne proteíny

IgG-FH1-5. Prvých 5 myšacích FH SCR domén (mFH1-5) spojených

na necielený IgG1 myšací Ig (antiidiotypická protilátka vytvorená proti myšacej monoklonálnej protilátke).

Anti-P-FH1-5. Myšia FH1-5 spojená s myšacou anti-properdínovou protilátkou (anti-P),30 ktorú Alexionovi poskytol W. Song, University of Pennsylvania).

Ovládacie prvky. Kontroly boli izotypovo zhodné necielené myšacie Ig (IgG-kontrola) a myšací anti-properdin (anti-P) (doplnkový obrázok S1). Proteíny boli generované pomocou pVEK vektorov a buniek Expi293 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), purifikovaných pomocou proteínu A (MabSelect SuRe, Cytiva, Marlborough, MA).

AP-špecifický hemolytický test

Dvadsať percent normálneho myšacieho séra titrovaného od 60 nM do 0,5 nM sa inkubovalo s králičími erytrocytmi (1{4}} buniek/ml) pri 37 °C počas 30 minút. Uvoľňovanie hemu sa kvantifikovalo spektrofotometricky (optická hustota 415 nm); 100 percent lýzy bolo sérum bez inhibítora.

Plazmové FB a FH

Plazma sa získala po centrifugácii krvi odobratej do skúmaviek obsahujúcich kyselinu etyléndiamíntetraoctovú (Sarstedt, Nordrhein-Westfalen, Nemecko). Proteíny sa merali kapilárnym elektroforéznym imunotestom (WES, ProteinSimple, San Jose, CA). Použité protilátky boli polyklonálna anti-myšia FH protilátka (Alexion Pharmaceuticals, Boston, MA) a anti-myšia FB protilátka (Abcam, Cambridge, UK); Použil sa modul WES na detekciu králikov (ProteinSimple, San Jose, CA). Chemiluminiscenčné signály boli analyzované softvérom Compass for SW (ProteinSimple, verzia 5.{6}}.1), kvantifikované ako plochy píkov a normalizované na kontrolu testu.

Myši

Všetky myši boli umiestnené v špecifických podmienkach bez patogénov; postupy boli vykonané v súlade s inštitucionálnymi smernicami a schválené Home Office Spojeného kráľovstva. C57BL/6 divého typu myši boli zakúpené od Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) a ​​Cfh–/– myši boli vytvorené tak, ako bolo opísané vyššie.7 Myši boli spárované podľa veku a pohlavia; ekvimolárne dávky proteínov boli podávané ip injekciou (1 mg pre anti-properdin a IgG-kontrolu; 1,4 mg pre IgG-FH1-5 a anti-P-FH1-5). Zrýchlená sérová nefrotoxická nefritída bola vyvolaná iv injekciou ovčieho nefrotoxického séra do myší vopred imunizovaných ovčím IgG.7 Podávanie fúznych proteínov sa uskutočnilo 24 hodín pred indukciou ovčieho nefrotoxického séra (obrázok 4a).

C3, C5 a voľný properdin - properdin alebo vlastný anti-myší C5 potiahnutý na MSD platniach s vysokou väzbou. Naviazaný "voľný" properdín a C5 boli detegované pomocou anti-properdinu (od W. Song) alebo biotinylovanej monoklonálnej anti-C5 (Alexion) v kombinácii so streptavidínom-SULFO (MSD, Meso Scale Diagnostics). Chemiluminiscenčný signál sa získal pomocou zobrazovača SECTOR S 6000 (MSD, Meso Scale Diagnostics) a analyzoval sa pomocou softvéru MSD Discovery Workbench (Meso Scale

Diagnostika, verzia 4.0.12.1). Rekombinantný myšací properdín a C5 sa použili ako štandardy.

Funkcia obličiek a histológia

Hematúria a proteinúria boli hodnotené pomocou Hema-Combistix (Bayer, Reading, UK); plazmatická močovina sa zmerala a obličkové tkanivo sa spracovalo tak, ako bolo opísané vyššie.9 Kreatinín v moči sa stanovil vo vzorkách bodového moču pomocou testu Creatinine Companion Protocol (č. 1012; Excell, Philadelphia, PA) a bodového moču/ plazmatický albumín sa meral pomocou enzýmovej imunoanalýzy (#E99-134; Bethyl Laboratories, Montgomery, TX). Rezy obličiek zafarbené kyselinou jodistou – Schiff sa hodnotili zaslepeným spôsobom a zoradili sa podľa závažnosti glomerulárneho a tubulointersticiálneho poškodenia (0 [žiadne], 1 [mierne], 2 [stredné]). Na stanovenie priemerného počtu glomerulárnych buniek bolo hodnotených desať glomerulov na rez. Imunofluorescenčné farbenie sa uskutočňovalo na 5- mm kryorezoch namontovaných s použitím média Vectashield s DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Použité protilátky boli polyklonálne kozie anti-myšie C3b/C3c/iC3b konjugované s fluoresceín izotiokyanátom (FITC) (1:200; #55500; MP Biomedical, Santa Ana, CA)9; Polyklonálny kozí anti-myší IgG konjugovaný s FITC špecifickým pre figový reťazec (1:400; #F5387; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); FITC-konjugovaný monoklonálny myší anti-kozí/ovčí IgG (1:100; #F5137; Sigma-Aldrich); alebo FITC-konjugovaný kozí anti-ľudský properdín (1:50; #GAHu/PPD/FITC, Nordic Immuno logic Laboratories, Kodaň, Dánsko).9 Biotinylovaný kozí anti-myšací C3d (1:10; # BAF2655; R&D Systems , Minneapolis, MN) bol použitý na biotínom blokovaných rezoch (Biotin Blocking System; Agilent Dako, Santa Clara, CA) so sekundárnou protilátkou streptavidínu AF488 (1:200; #S-32354; Thermo Fisher Scientific). FH bol vizualizovaný v purifikovaných potkaních anti-myších CD16/CD{52}} blokovaných rezoch (1:100; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) s použitím kozieho anti-humánneho FH (1:1000; #A312; Quidel, San Diego , CA) a monoklonálna anti-kozí IgG-FITC sekundárna protilátka (1:100; klon GT-34; F4891; Sigma-Aldrich). Glomerulárne makrofágy boli identifikované pomocou FITC-konjugovaného potkanieho anti-myšieho CD68 (FA-11 klon GTX43518; GeneTex, Irvine, CA). Kvantitatívna imunofluorescenčná analýza sa uskutočnila s použitím optického mikroskopu Leica DM4B spojeného s digitálnym fotoaparátom Leica DFC700T (Leica Microsystems, Wetzlar, Nemecko) a softvérom Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Rockville, MD, verzia 7). Na jeden rez bolo vyšetrených desať glomerulov a priemerná intenzita bola vyjadrená v ľubovoľných fluorescenčných jednotkách.

Štatistická analýza

Na štatistickú analýzu bol použitý GraphPad Prism, verzia 8.{1}} (GraphPad, San Diego, CA). Na analýzu časového priebehu sa použila 2-analýza variancie opakovanými meraniami s Bonferroniho viacnásobným porovnávacím testom (faktormi boli čas a liečba). Pri porovnávaní viacerých skupín sa použil Kruskal-Whitneyov test s mnohonásobným porovnaním Dunn a pre 2 skupiny sa použil Mann-Whitney test.

DISCLOSURE

MCP získala poplatky za poradenstvo od spoločností Alexion, ChemoCentryx, Novartis, Gyroscope a Achillion Pharmaceuticals. HTC dostalo poplatky za poradenstvo od spoločností Alexion, Novartis, Aurinia a Achillion Pharmaceuticals. YZ, YW, KKJ a SK-K sú zamestnancami spoločnosti Alexion Pharmaceuticals. SK je bývalým zamestnancom spoločnosti Alexion Pharmaceuticals av súčasnosti je zamestnaná v spoločnosti Gemini Pharmaceuticals. Všetci ostatní autori nedeklarovali žiadne konkurenčné záujmy.

POĎAKOVANIE

MCP je Senior Fellow Wellcome Trust v klinickej vede (referencia grantu 212252/Z/18/Z) a ACG a DPL sú podporované týmto štipendiom. YZ, SK, YW, KKJ a SK-K boli financované spoločnosťou Alexion Pharmaceuticals.

DOPLNKOVÝ MATERIÁL

Doplnkový súbor (PDF)

Obrázok S1. Fúzne proteíny použité v tejto štúdii. IgG-FH1-5 obsahuje prvých 5 domén myšacieho faktora H (FH1-5) spojených s necieleným myšacím Ig. Anti-P-FH1-5 pozostáva z mFH1-5 naviazaného na neutralizačnú myšaciu protilátku proti myšaciemu properdínu (anti-P; pozri Miwa et al.30). Kontrolné proteíny zahŕňali izotypovo zhodný necielený myšací Ig (IgG-kontrola) a neutralizačnú myšaciu anti-myšaciu properdínovú protilátku (Anti-P). Obrázok S2. Analýza WES blot na detekciu FH1-5 vo vzorkách plazmy od myší s deficitom FH, ktorým bol injekčne podaný buď (A) IgG-FH1-5 alebo (B) Anti-P-FH1-5. 94-kDaIgheavychainlinkedtomouseFH1-5 (HC-FH1-5) je možné zistiť až 11 dní po injekcii IgG-FH1-5 a až 4 dni po injekcii proteínu anti-P-FH1-5 (červené políčka Kontroly vrátane plazmy od myší divokého typu, kde sa detegoval proteín faktora H plnej dĺžky (FH, čierne skrinky, dráha C1) a myší bez injekcie s deficitom FH, kde nie je zrejmý žiadny FH (čierne skrinky, dráha C2). Ako sa očakávalo, ani FHnorFH1-5 nie je detekovateľný vo vzorkách plazmy od myší, ktorým bola injekčne podaná kontrola Anti-P alebo IgG.

Obrázok S3. Glomerulárne komplementové imunofarbenie 96 hodín po injekcii IgG-kontroly alebo anti-P-FH1-5 u myší divokého typu. Sú znázornené reprezentatívne snímky glomerulov (stĺpec ¼ 100 mm).

Obrázok S4. Úloha properdínu pri ukladaní anti-P-FH1-5 v glomeruloch myší s deficitom FH. Cfh–/– myšiam bola injikovaná buď IgG-kontrola alebo anti-P (liečba 1), po 24-hodinách neskôr buď IgG-kontrola alebo anti-P-FH1-5 (liečba 2). Zvieratá boli zabité 120 hodín po ošetrení a bolo hodnotené glomerulárne farbenie na IgG, properdín a FH/FHR. Sú zobrazené reprezentatívne obrázky. Injekcia anti-P výrazne znížila zafarbenie properdínu (riadok 1, stĺpec 2), ale nie FH/FHR (zostáva nezmenené) alebo IgG (zostáva neprítomné). Podávanie anti-P-FH1-5 24- hodín po kontrole IgG viedlo k objaveniu sa granulárneho zafarbenia protilátkami anti-IgG, anti-FH/FHR a anti-P, ako bolo pozorované po injekcii anti-P-FH 1-5 samostatne (pozri obrázok 3b). Toto granulárne zafarbenie sa znížilo, keď injekcii anti-P-FH1-5 predchádzala injekcia anti-P, ktorá vyčerpáva cirkulujúci (pozri obrázok 1h) aj glomerulárne (pozri obrázok 3b). Glomerulárne farbenie anti-IgG bolo evidentné iba u myší, ktorým bola injikovaná anti-P-FH1-5 (riadok 3, stĺpce 3 a 4) a bolo výrazne nižšie u myší, ktoré dostávali anti-P-FH1-5 predchádza anti-P. Dospeli sme k záveru, že ukladanie anti-P-FH1-5 v glomeruloch Cfh–/– myší bolo čiastočne závislé od properdínu. Vodorovné pruhy označujú stredné hodnoty a fúzy označujú medzikvartilový rozsah. P-hodnota bola odvodená z Mann-Whitneyho testu. Tyč ¼ 100 mm.

LITERATÚRA

1.FakhouriF, Frémeaux-Bacchi V, Noöl LH a kol. C glomerulopatia∶ nová klasifikácia. Nat Rev Nephrol.20106:494-499.

2 SmithRH.AppeG8.BlomAMet aLC3gkomeripatia—pochopenie zriedkavého skutočného ochorenia vyvolaného komplementom. Nat ReyNephrol.{4}}

3. Pickering MC, Cook HT. Translačná mini-prehľadová séria o faktore komplementu H: obličkové choroby spojené s faktorom komplementu H, nové poznatky od ľudí a zvierat. Cin Exp Immunol.2008;151:210-230.

4. Daha MR Fearon DT Austen KF, C3nechritický faktor （C3NeF）∶stabilizácia tekutej fázy a konvertáza alternatívnej dráhy viazaná na bunky. J Immunol 1976; 116:1-7.

5. Mollnes TE, Ng YC, Peters DK, et al účinok nefritického faktora na C3 a na terminálnu dráhu komplementu in vivo a in vitro. Oin Exp Immunol. 1986; 65:73-79.

6. Nq YC, Peters DK. G3 nefritický faktor (C3NeF): disociácia bunkovej a tekutej fázy stabilizácie alternatívnej dráhy C3 konvertázy. Cn Exp Imunol.19865:450-457.

7. Pickering MC, Cook HT, Warren J a kol. Nekontrolovaná aktivácia C3 spôsobuje membranoproliferatívnu glomerulonefritídu u myší s nedostatkom komplementového faktora H. Nat Genert.2002:31;424-428.

8. Lesher AM, Zhou L, Kimura Y, a kol. Kombinácia mutácie faktora H a deficitu properdinu spôsobuje závažnú C3 glomerulonefritídu. J Am Soc Nephrol. 2013;24:53–65.

9. Ruseva MM, Veron KA, Lesher AM, a kol. Strata properdínu zhoršuje glomerulopatiu C3 v dôsledku nedostatku faktora H. J Am Soc Nephrol. 2013; 24:43-52.

10. Paixao-Cavalcante D, Hanson S, Botto M, a kol. Faktor H uľahčuje odstraňovanie iC3b naviazaného na GBM riadením aktivácie C3 v tekutej fáze. Mol Immunol.2009;46:1942-1950.

11Fakhouri F, de Jorge EG. Brune F, et al. Liečba ľudským komplementovým faktorom H rýchlo zvráti ukladanie komplementu v obličkách u myší s deficitom faktora H. Kidney Int.2010:78:279-286.

12. Michelfelder S, Parsons J, Bohlender Ll, et al. Mossom produkovaný, glykozyláciou optimalizovaný ľudský faktor H na terapeutickú aplikáciu pri poruchách komplementu. JAm Soc Nephrol.201728:1462-1474.

13. Nichols EM, Barbour TD, Pappworth Y a kol. Rozšírená molekula mini-komplementu faktora H zlepšuje experimentálnu glomerulopatiu C3. Kidney Int. 201588:1314-1322.

14. Ruseva MM, Peng T, Laser MA a kol. Účinnosť cielenej inhibície komplementu pri experimentálnej glomerulopatii C3. J Am Soc Nephrol. 2016; 27:405-416.

15. Yang Y, Denton H, Davies OR a kol. Skonštruovaný konštrukt komplementového faktora H na liečbu glomerulopatie C3. J Am Soc Nephrol. 2018; 29:1649-1661.

16. Schulze M, Pruchno CJ, Burns M, et al. Glomerulárna C3clokalizácia indikuje prebiehajúcu tvorbu imunitných depozitov a aktiváciu komplementu pri experimentálnej glomerulonefritíde. Am J PatholL. 1993:142179-187.

17. Athanasiou Y, Voskarides K Gale DP, et al. Familiárna glomerulopatia C3 spojená s klinickými charakteristikami mutácií CFHRS u 91 pacientov v 16 rodokmeňoch. CTn JAm Soc Nephrol.20116:1436-1446.

18. Kaneko Y, Nimmer动hn F, Madaio MP a kol. Patológia a ochrana pri nefrotoxickej nefritíde je určená selektívnym zapojením špecifických Fc receptorov. J Exp Med.2006;203:789-797.

19. Sheerin NS, Springall T, Carroll MC a kol. Ochrana proti anti-glomerulárnej bazálnej membráne (nefritída sprostredkovaná GBM u myší s deficitom C3-a C{4}}. C Exp Immunol. 1997;110:403-409.

20. Cheng ZZ Hellwae J, Seeberger H a kol. Porovnanie povrchového rozpoznávania a C3b väzbových vlastností myšieho a ľudského komplementového faktora H.Mol Immunol.2006;43.972-979.

21dp ikry EG. Macor P.Paixao-Caakante D. et al Vývoj typického hemolytického uremického syndrómu závisí od komplementu C5.J Am Soc Nephrol.2011;22:137-145.

22. Pdkering MC, de Jorge EG. Martinez-Barricarte Ry a kol. Spontánny hemolytický uremický syndróm spustený komplementovým faktorom H, ktorému chýbajú povrchové rozpoznávacie domény. J Exp Med.2007;204:1249-1256.

23 Herbert AP. Mike E, Chen ZAet al. Vyhýbanie sa komplementu sprostredkované zvýšením zachyteného faktora H: dôsledky pre ochranu vlastných povrchov pred komplementom.J Immunol. 2015;195:4986-4998.

24. Goicoechea de Jorge E Caesar JJ, Malik TH, et al. Dimerizácia proteínov súvisiacich s faktorom komplementu H moduluje aktiváciu komplementu v. Proc Natl Acad Sci US A.2013;110:4685-4690.

25. Schmidt CQ, Bai H Lin Z, et al. Racionálne inžinierstvo minimalizovaného imunitného inhibítora s jedinečnými vlastnosťami trojitého zacielenia. J Immunol. 2013;190:5712-5721.

26. Wilson HR, Medjera-Thomas NR, Gilmore AC, a kol. Komplex ataku glomerulárnej membrány nie je spoľahlivým markerom prebiehajúcej aktivácie C5 pri lupusovej nefritíde. Kidney Int. 2019.95655-665.

27. Antonioli AH White J, Crawford F, et al. Modulácia alternatívnej dráhy komplementu proteínmi súvisiacimi s myšacím faktorom H. J Immunol. 2018; 200:316-326.

28. Cserhalmi M, CsincsiALMezei Z, a kol. Proteín FHR-B súvisiaci s myšacím faktorom H podporuje aktiváciu komplementu. Front Immunol.20178:1145.

29. Medjeral-Thomas NR, Moffett H, Lomax-Browne HJ et al Proteín 5 súvisiaci s glomerulárnym faktorom H komplementu (FHR5) je vysoko rozšírený pri glomerulopatii C3 a je spojený s poruchou funkcie obličiekKdney Int Ren. 2019; 4:1387-1400.

30. Miwa T, Sato S, Gullipalli D, et al. Blokovanie properdínu, alternatívnej dráhy a anafylatoxínových receptorov zlepšuje renálne ischemicko-reperfúzne poškodenie u myší s faktorom urýchľujúcim rozpad a CD59 s dvojitým knockoutom. J Immunol. 2013; 190:3552-3559.

31. Corillo F, Bravo Garcia-Morato M, Nozal P a kol. Spotreba séra properdínu ako biomarker dysregulácie C5 konvertázy pri C3 glomerulopatii. Clin Exp Immunol.2016;184:118-125.8. Lesher AM, Zhou L Kimura Y, a kol. Kombinácia mutácie faktora H a deficitu properdínu spôsobuje závažnú glomerulonefritídu C3. JAm Soc Nephrol.2013;2453-65.

32. zhang Y, Nester OM Martin B. et al Definovanie profilu komplementového biomarkeru glomerulopatie C3. Clin J Am Soc Nephvol.20149:186-1882.