Objasnenie úlohy syntézy proteínov v konsolidácii pamäte závislej od hipokampu počas dňa a noci

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Abstraktné

Všeobecne sa uznáva, že de novo syntéza proteínov je rozhodujúca pre tvorbu a konsolidáciu dlhodobých spomienok. Zatiaľ čo bazálna aktivita mnohých signálnych kaskád, ktoré modulujú syntézu proteínov, kolíše cirkadiánnym spôsobom, nie je jasné, či sa časová dynamika konsolidácie pamäte závislej od syntézy proteínov líši v závislosti od dennej doby. Presnejšie povedané, nie je jasné, či inhibícia syntézy proteínov ovplyvňuje konsolidáciu pamäte závislú od hipokampu u hlodavcov rozdielne počas dňa (tj neaktívna fáza s množstvom spánku) a noci (tj aktívna fáza s malým spánkom). Na vyriešenie tejto otázky boli samce a samice myší C57Bl6/J trénované v kontextovej úlohe podmieňovania strachu na začiatku konca fázy svetla. Zvieratá dostali jednu systémovú injekciu s inhibítorom proteínovej syntézy anisomycínom alebo vehikulom priamo, 4, 8 hodín alebo 11,5 hodín po tréningu, a pamäť sa hodnotila po 24 hodinách. Tu ukazujeme, že inhibícia syntézy proteínov narušila konsolidáciu spomienok na kontext a strach selektívne, keď bol inhibítor syntézy proteínov podaný v prvých troch bodoch, bez ohľadu na načasovanie tréningu. Aj keď bazálna aktivita signálnych dráh regulujúcich syntézu proteínov de novo môže kolísať počas 24-hodinového cyklu, tieto výsledky naznačujú, že časová dynamika konsolidácie pamäte závislej od syntézy proteínov je podobná pre denné a nočné učenie .

KĽÚČOVÉ SLOVÁ anizomycín, hipokampus, pamäť, myši, syntéza bielkovín

doplnok desertliving cistanche: zlepšenie pamäti

1. ÚVOD

Schopnosť vytvárať nové spomienky je rozhodujúca pre adaptáciu zvierat na zložité a často sa meniace prostredie (Bruel-Jungerman, Davis a Laroche, 2007). Tvorba nových spomienok zahŕňa široké spektrum molekulárnych a bunkových procesov (Asok, Leroy, Rayman, & Kandel, 2019; Nadel, Hupbach, Gomez, & Newman-Smith, 2012). Pamäťové procesy možno rozdeliť do rôznych fáz a zahŕňajú nasledovné: (a) získavanie nových informácií, (b) konsolidácia krátkodobých do dlhodobých pamätí a (c) získavanie uložených informácií (Abel & Lattal, 2001). Tieto procesy sa vyskytujú v rôznych časových rámcoch a závisia od rôznych molekulárnych mechanizmov, hoci niektoré základné mechanizmy sa môžu prekrývať (Abel & Lattal, 2001; Akkerman, Blokland a Prickaerts, 2016).

Počiatočné získavanie zmyslového vstupu prebieha v momente, keď je prezentovaná nová informácia a zahŕňa zakódovanie týchto informácií (Abel & Lattal, 2001; Tonegawa, Pignatelli, Roy, & Ryan, 2015). Konsolidácia pamäte začína bezprostredne po akvizícii (Abel & Lattal, 2001; Havekes, Meerlo, & Abel, 2015). Počas tohto procesu sa počiatočná labilná pamäť stabilizuje na dlhodobú pamäť a tento proces je citlivý na narušenie (Abel & Lattal, 2001; Havekes et al., 2015). Následne, keď je to potrebné, možno k uloženým informáciám pristupovať a vyvolať ich počas vyhľadávania (Abel & Lattal, 2001; Havekes et al., 2015).

Hipokampus kriticky prispieva k vytváraniu deklaratívnych a epizodických spomienok vrátane priestorových a kontextových spomienok (Daumas, Halley, Frances a Lassalle, 2005; Eichenbaum & Cohen, 2014; Morris, Garrud, Rawlins a O'Keefe, 1982; Moser & Moser, 1998; Nadel a Moscovitch, 1997; Oliveira, Hawk, Abel a Havekes, 2010; Phillips & LeDoux, 1992; Scoville a Milner, 1957; Squire, 1992). Často používanou paradigmou na objasnenie molekulárnych základov kontextovo špecifických spomienok je úloha kontextového podmieňovania strachu (CFC), ktorá sa opiera o hipokampus aj amygdalu (Daumas a kol., 2005; Havekes, Park, Tolentino a kol. , 2016a; Kochi, Thompson, Fricke, Postle a Quinn, 2015; Parsons, Gafford, Baruch, Riedner a Helmstetter, 2006; Phillips & LeDoux, 1992; Rudy, Barrientos a O'Reilly, 2002). Tréning v tejto paradigme vedie k asociácii kontextu a strachu kondičného boxu (podmienený stimul, CS) s neočakávaným nepriaznivým stimulom, často miernym šokom do nohy (nepodmienený stimul, US).

Po opätovnom vystavení rovnakému kontextu myši, ktoré sa úspešne naučili spájať CS s USA, vykazujú vysoké úrovne zmrazenia (tj úplný nedostatok pohybu s výnimkou respiračného správania), čo naznačuje pamäť z kontextu a strachu. Keďže na vytvorenie silnej kontextovej pamäte strachu je potrebný iba jeden tréning, tento test je ideálne vhodný na preskúmanie molekulárnych mechanizmov, ktoré prispievajú k rôznym štádiám pamäte. Konsolidácia stabilných, prirodzene obnoviteľných dlhodobých spomienok vrátane tých, ktoré sú závislé od správnej funkcie hipokampu, si vyžaduje de novo syntézu proteínov (Bourtchouladze a kol., 1998; Davis & Squire, 1984; Jarome & Helmstetter, 2014; Lattal, Honarvar a Abel, 2004; Ryan, Roy, Pignatelli, Arons a Tonegawa, 2015). Blokovanie syntézy proteínov pomocou inhibítorov syntézy proteínov skutočne tlmí tvorbu spomienok na objekty (Rossato a kol., 2007), priestorových spomienok (Artinian a kol., 2008) a asociácií kontext-strach (Bourtchouladze a kol., 1998). Je zaujímavé, že regulácia procesov zapojených do učenia a pamäte, ako je syntéza proteínov, sa môže meniť počas dňa a noci (Aten a kol., 2018; Frank, 2016; Gerstner & Yin, 2010; Jilg a kol., 2010; Kim a kol., 2019; Nakanishi a kol., 1997; Ramm & Smith, 1990; Rawashdeh, Jilg, Maronde, Fahrenkrug a Stehle, 2016; Snider, Sullivan a Obrietan, 2018). Napríklad hladiny hipokampálneho cAMP, ako aj fosforylácia mitogénom aktivovanej proteínkinázy (MAPK) a proteínu viažuceho prvok cAMP (CREB) vykazujú denné oscilácie, čo môže naznačovať cirkadiánnu reguláciu cAMP/MAPK/CREB dráh (Eckel- Mahan a kol., 2008; Mizuno & Giese, 2005; Rawashdeh a kol., 2016; Snider a kol., 2018; Trifilieff a kol., 2006).

Dôležité je, že regulácia signálnej dráhy cicavčieho cieľa rapamycínového komplexu 1 (mTORC1), ktorá je kľúčová pre syntézu proteínov iniciáciou translácie, tiež vykazuje denné oscilácie (Jouffe et al., 2013; Robles, Humphrey, & Mann, 2017; Saraf, Luo, Morris a Storm, 2014). Nedávno sa ukázalo, že akumulácia Per2, proteínu základných hodín, vedie k inaktivácii mTORC1, čím sa znižuje translácia proteínov (Wu et al., 2019). Preto regulácia procesov, ktoré sú dôležité pre učenie a pamäť, vykazuje oscilácie cez deň a noc. Napriek týmto pozorovaniam nie je jasné, či tieto denné oscilácie v bazálnej aktivite signálnych dráh kritických pre učenie a pamäť ovplyvňujú časovú dynamiku konsolidácie pamäte závislej od syntézy proteínov. Inými slovami, znamená denné kolísanie bazálnej aktivity týchto dráh, že spracovanie a ukladanie nových informácií, ktoré závisia od syntézy proteínov, sa tiež mení počas dňa? Aby sme odpovedali na túto otázku, hodnotili sme u myší, či inhibícia syntézy proteínov ovplyvňuje konsolidáciu pamäte podobne počas svetlej fázy (fáza pokoja) a tmavej fázy (aktívna fáza). Zvieratá boli trénované na začiatku alebo na konci svetelnej fázy a inhibítor syntézy proteínov anisomycín alebo vehikulum boli systémovo dodávané v rôznych časových bodoch po tréningu v úlohe kontextového podmieňovania strachu závislej od hippocampu.

extrakt z cistanche: zlepšuje pamäť

2. MATERIÁLY A METÓDY

Subjekty Celkovo 64 samcov a 64 samíc myší C57BL/6J sa získalo vo veku 6 týždňov (Janvier Labs) a počas experimentu boli umiestnené v pároch rovnakého pohlavia. Klietky obsahovali kartónovú rolku, štandardnú podstielku a materiál na hniezdenie. Potrava a voda boli dostupné ad libitum. Počas experimentu boli myši umiestnené pri konštantnej teplote (21 stupňov) a v režime 12-h svetlo/12-h tma so zapnutými svetlami o 10:00 pre zvieratá, ktoré boli trénované na začiatku svetelná fáza a svetlá sa rozsvietia o 22:00 pre zvieratá trénované na konci svetelnej fázy (pozri nasledujúci odsek). Experimenty sa uskutočňovali, keď mali zvieratá 12 až 16 týždňov. Všetky opísané postupy boli schválené národným ústredným orgánom pre vedecké postupy na zvieratách (CCD) a inštitucionálnym orgánom pre dobré životné podmienky zvierat (IvD, University of Groningen, Holandsko).

2.2 Experimentálny dizajn

Táto štúdia pozostávala zo 16 skupín myší, z ktorých každá mala celkovo 7 až 8 zvierat (rovnakí samci a samice) a zvieratá boli náhodne rozdelené do skupín. Polovica skupín bola trénovaná v úlohe CFC na začiatku svetelnej fázy, to znamená na začiatku ich cirkadiánnej pokojovej fázy, a polovica zvierat bola trénovaná v poslednej hodine svetelnej fázy, teda práve pred začiatkom ich aktívnej fázy. Druhý časový bod bol vybraný, aby sa zabránilo vystavovaniu týchto zvierat svetlu, keď by normálne nevnímali, čo by bol prípad, ak by zvieratá boli trénované na začiatku v tme. Obom skupinám myší bol injekčne podaný inhibítor syntézy proteínov (pozri nižšie) alebo roztok vehikula buď priamo („T0“), 4 hodiny po tréningu („T4“), 8 hodín po tréningu („T8“) alebo 11,5 hodiny po tréningu ("T11.5"). Vo všetkých prípadoch sa test CFC uskutočnil 24 hodín po úvodnom tréningu. Prehľad experimentálneho dizajnu nájdete na obrázku 1.

2.3 Privykanie a podmieňovanie strachu

Tri po sebe nasledujúce dni pred úlohou CFC boli zvieratá transportované do experimentálnej miestnosti a experimentátor s nimi manipuloval 2 minúty denne. V posledný deň privykania sa zvieratá odvážili a dostali značku na chvoste čiernym permanentným značkovačom na identifikáciu. Okrem toho, deň pred tréningom CFC myši tiež dostali subkutánnu falošnú injekciu 50 ul 0,9 percenta fyziologického roztoku, aby si zvykli na tento postup. Zvieratá boli trénované v úlohe CFC pomocou protokolu kondicionovania popredia (Havekes a kol., 2012; Havekes, Park, Tolentino a kol., 2016a). V deň tréningu boli myši umiestnené do boxu na kondicionovanie strachu (Ugo Basile). Po 2,5 minútach boli myši vystavené jedinému 2- s šoku do nohy 0,75 mA. Tridsať sekúnd po šoku boli myši vrátené do ustajňovacej komory a dostali subkutánnu injekciu anisomycínu alebo vehikula v špecifickom časovom bode, ako je znázornené na obrázku 1. Dvadsaťštyri hodín po tréningu boli zvieratá znovu vystavené kondicionovaciemu boxu. 5 po sebe nasledujúcich minút, bez výboja. Pred tréningom a testovaním každej novej myši bol box na úpravu strachu vyčistený 70 percentným etanolom. Kondicionovanie strachu bolo hodnotené hodnotením mrazivého správania, definovaného ako úplný nedostatok pohybu s výnimkou respiračného správania, ktoré bolo stanovené pomocou softvéru EthoVision XT (Noldus Information Technology). Tento softvér poskytuje spoľahlivé merania správania pri mrazení (Pham, Cabrera, Sanchis-Segura a Wood, 2009).

2.4 Medikamentózna liečba

Zvieratám bol subkutánne podaný anisomycín (150 mg/kg; A&E Scientific, Marcq, Belgicko) na dočasnú inhibíciu proteínovej syntézy alebo ekvivalentný objem roztoku vehikula (0,9 % fyziologického roztoku). Anisomycín sa rozpustil v 0,9 % fyziologickom roztoku s použitím 3,7 % HCI, potom sa pH upravilo na 7,4 pomocou 4 % NaOH. V použitej koncentrácii anisomycín inhibuje syntézu mozgových proteínov u myší počas 15–45 minút (Davis & Squire, 1984). Injekcie boli vykonávané v miestnosti na ustajnenie experimentátorom odlišným od toho, ktorý vykonával behaviorálnu úlohu.

2.5 Štatistika

Úrovne zmrazovania delta sa získali normalizáciou chovania zvierat pri zmrazovaní počas testu na základnú úroveň (= pred šokom) úrovne zmrazovania. Rozdiely v správaní normalizovaného zmrazenia medzi myšami s injekciou anisomycínu a kontrolnými myšami na fázu a časový bod sa vypočítali pomocou ANOVA. Jednosmerná ANOVA sa použila na výpočet rozdielov medzi časovými bodmi pre zvieratá s injekciou vehikula na fázu. Na testovanie účinku pohlavia sa použila jednosmerná ANCOVA medzi subjektmi. Okrem toho, na výpočet relatívnych rozdielov medzi zvieratami s injekciou anizomycínu a vehikula sme najprv spriemerovali myši, ktorým sa injikovalo vehikulum na časový bod, na fázu. Potom sme odčítali všetky jednotlivé dátové body anisomycínu od ich zodpovedajúceho priemeru vehikula. Vykonala sa dvojcestná ANOVA s použitím časového bodu a fázy ako nezávislých a anizomycínu normalizovaného na hladiny zmrazenia vehikula ako závislého, aby sa zistilo, či účinok anizomycínu na zmrazenie závisí od časového bodu injekcie, (2) svetlej alebo tmavej fázy. a (3) či existoval interakčný účinok časového bodu a fázy.

Päť zvierat vykazovalo veľmi vysoké hladiny mrazu počas tréningového intervalu pred šokom, to znamená viac ako 2 SD nad priemerom skupiny, a preto boli vylúčené z analýzy (analýza extrémnych hodnôt SPSS). Týchto päť zvierat patrilo do skupín: svetelná fáza, T0, anisomycín; tmavá fáza, T4, anisomycín; Tmavá fáza, T8, Vozidlo; tmavá fáza, T8, anisomycín; a tmavá fáza, T11.5, anisomycín. Dáta sú prezentované ako priemer ± SEM, vrátane pirátskeho grafu ukazujúceho rozptyl jednotlivých dátových bodov. Štatistické analýzy sa uskutočnili pomocou softvéru SPSS 25.0 (IBM Corp). Údaje boli vytvorené v R (Boston, MA, USA) pomocou yardového balíka (Phillips, 2017). Rozdiely sa považovali za štatisticky významné, keď p <>

cistanche doplnok: zlepšenie pamäte

3 VÝSLEDKY

Najprv sme skúmali, v ktorých časových bodoch inhibícia syntézy proteínov narušila konsolidáciu pamäte závislú od hipokampu, keď boli zvieratá trénované na začiatku svetelnej fázy (obrázok 1). Zvieratá dostali subkutánne vehikulum alebo injekcie anizomycínu po kontextovom podmieňovaní strachu a 24 hodín po tréningu sa zvieratá znovu vystavili CFC komore a zmerali sa úrovne zmrazenia. Nezistili sa žiadne rozdiely v úrovniach zmrazenia pred šokom počas tréningu na začiatku fázy svetla (T0: kontrola 0,9 ± 0,3 percenta (n {{1 0}}), anisomycín 0,7 ± 0,3 percent (n=7), ANOVA F < 1;="" t4:="" kontrola="" {{2{{25}="" }}},7="" ±="" 0,2="" percent="" (n="8)," anisomycín="" 1,7="" ±="" 0,7="" percent="" (n="8)," anova="" f="1" 0,7;="" t8:="" kontrola="" 1,3="" ±="" 0,3="" percenta="" (n="8)," anisomycín="" 1,2="" ±="" 0,4="" percenta="" (n="" {{40}}),="" anova="" f="">< 1;="" t11.5:="" kontrola="" 1,6="" ±="" 0,4="" percenta="" (n="8)," anisomycín="" 0,8="" ±="" 0,2="" percenta="" (n="8)," anova="" f="2,9;" pozri="" tiež="" obrázok="" s1a).="" následne="" sme="" vypočítali="" hladiny="" delta="" zmrazovania="" normalizáciou="" chovania="" zvierat="" pri="" zmrazovaní="" počas="" testu="" na="" základnú="" úroveň="" (pred="" šokom)="">

Ako je znázornené na obrázku 2, anisomycín úspešne inhiboval konsolidáciu pamäte CFC, keď sa vstrekol priamo, 4 hodiny a 8 hodín po tréningu (F1,14=24.6, p <.001; f1,15="6.4" ,="" p="">< 0,05;="" f1,="" 15="11" 0,2,="" p="">< 0,01;="" obrázok="" 2a).="" anisomycín="" však="" nezhoršil="" konsolidáciu="" pamäte,="" keď="" sa="" vstrekol="" 11,5="" hodiny="" po="" tréningu="" (f1,="" 15="0.1," p=""> 0,5; obrázok 2a). Dôležité je, že medzi rôznymi časovými bodmi pre zvieratá, ktorým bolo podané vehikulum, nebol žiadny rozdiel v úrovni zmrazovania (F3, 31=0 0,9, p > 0,1; obrázok 2a). Inhibícia syntézy bielkovín priamo po tréningu alebo 4 a 8 hodín po tréningu teda účinne narušila konsolidáciu pamäte v ľahkej fáze. Na rozdiel od toho dodanie inhibítora syntézy proteínov 11,5 hodiny po tréningu neovplyvnilo konsolidáciu spomienok na kontext a strach.

V ďalšom súbore štúdií sme skúmali, či inhibícia syntézy proteínov narušila konsolidáciu pamäte v rovnakých časových bodoch po tréningu, keď sa tréning vykonával tesne pred začiatkom fázy tmy, teda aktívnej fázy zvierat (obrázok 1). Zvieratá sa opäť nelíšili v úrovniach zmrazenia pred šokom počas tréningu na konci fázy svetla (T0: kontrola 2,4 ± 0,6 percent (n=8), Anisomycín 2,3 ± {{10}},6 percent (n=8), ANOVA F < 1;="" t4:="" kontrola="" 2,7="" ±="" 0,8="" percent="" (n="8" ),="" anisomycín="" 4,6="" ±="" 0,7="" percent="" (n="7)," anova="" f="2,9;" t8:="" kontrola="" {{30}},8="" ±="" {{="" 44}},2="" percenta="" (n="7)," anisomycín="" 1,6="" ±="" 0,5="" percenta="" (n="7)," anova="" f="1,5;" t11,5:="" kontrola="" 1,1="" ±="" 0,3="" percenta="" (n="8)," anisomycín="" 0,8="" ±="" 0,2="" percenta="" (n="7)," anova="" f="">< 1;="" pozri="" tiež="" obrázok="" s1b).="" ako="" je="" možné="" vidieť="" na="" obrázku="" 2b,="" podávanie="" anizomycínu="" priamo,="" 4="" a="" 8="" hodín="" po="" tréningu="" počas="" tmavej="" fázy,="" inhibovalo="" konsolidáciu="" pamäte="" cfc,="" v="" tomto="" poradí="" (f1,15="14.8," p="">< 0,01;="" f1,{{62="" }},4,="" p="">< 0,05;="" f1,="" 13="23" 0,9,="" p="">< 0,001;="" obrázok="" 2b).="" keď="" sa="" však="" anizomycín="" vstrekol="" 11,5="" hodiny="" po="" tréningu,="" nespôsobil="" deficit="" pamäti="" (f1,="" 15="1" 0,0,="" p=""> 0,1; obrázok 2b).

Okrem toho zvieratá, ktorým bolo podané vehikulum, nevykazovali žiadny rozdiel v hladinách zmrazenia medzi rôznymi časovými bodmi injekcie (F3, 30=1.1, p > 0.1; obrázok 2b). Preto tieto údaje naznačujú, že inhibícia syntézy proteínov priamo po tréningu, ako aj 4 a 8 hodín po tréningu oslabuje konsolidáciu pamäte v tmavej a svetlej fáze podobným spôsobom. Okrem toho sme vypočítali relatívne rozdiely medzi zvieratami s injekciou anisomycínu a vehikula tak, že sme najprv spriemerovali myši, ktorým sa injikovalo vehikulum, za časový bod, na fázu.

Potom sme odpočítali všetky jednotlivé dátové body anizomycínu od ich zodpovedajúceho priemeru vehikula a vyniesli sme to pre svetlú aj tmavú fázu (obrázok 2c). V súlade s predchádzajúcimi zisteniami existuje významný vplyv časového bodu podania injekcie, čo naznačuje, že účinok anisomycínu na hladiny zmrazenia závisí od času podania (F3, 52=10 0,1, p < 0,001;="" obrázok="">

Okrem toho neexistuje žiadny všeobecný účinok fázy, čo naznačuje, že úrovne delta zmrazenia sa medzi svetlými a tmavými fázami nelíšia (F1,52=3.2, p > .05; obrázok 2c) . Okrem toho neexistuje žiadny interakčný účinok medzi fázou a časovým bodom injekcie (F3, 52=1 0,0, p < 0,1;="" obrázok="" 2c).="" celkovo="" tieto="" dodatočné="" analýzy="" naznačujú,="" že="" účinok="" anisomycínu="" na="" hladiny="" delta="" zmrazenia="" závisí="" iba="" od="" časového="" bodu="" injekcie,="" bez="" ohľadu="" na="" fázu,="" čo="" je="" v="" súlade="" s="" naším="" záverom="" založeným="" na="" vyššie="" uvedených="">

Nakoniec sme zhodnotili, či rozdiely medzi pohlaviami ovplyvnili hladiny zmrazenia a reakciu na inhibíciu syntézy proteínov. Najprv sme vykonali jednosmernú ANCOVA medzi subjektmi, aby sme preskúmali účinok inhibície proteínov na hladiny zmrazenia počas testovacej fázy (tj 24 hodín po tréningu), ktorá kontrolovala účinok pohlavia. Analýza ukázala, že pohlavie významne nesúviselo s úrovňami zmrazenia (F1, 120=2 0,7, p > 0,1; údaje oddelené pre pohlavia nie sú uvedené). Celkovo inhibícia syntézy proteínov znížila hladiny zmrazenia v oboch fázach podobným spôsobom nezávisle od pohlavia.

cistanche

4. DISKUSIA

Cieľom tejto štúdie bolo získať prehľad o úlohe syntézy proteínov pri konsolidácii spomienok závislých od hipokampu v rôznych fázach 24-hodinového cyklu. Na tento účel sme trénovali myši v úlohe CFC buď na začiatku alebo na konci svetelnej fázy a inhibovali syntézu proteínov v rôznych časových bodoch po tréningu. Zistili sme, že inhibícia syntézy proteínov narušila konsolidáciu pamäte CFC nezávisle od načasovania tréningu, priamo, 4 a 8 hodín po tréningu. Tieto údaje podčiarkujú dôležitosť de novo syntézy proteínov pre konsolidáciu kontextových spomienok na strach a naznačujú, že časová dynamika konsolidácie kontextových spomienok na strach v závislosti od syntézy proteínov je podobná vo svetlej a tmavej fáze.

Je zaujímavé, že sme zistili, že blokovanie syntézy proteínov 8 hodín po tréningu CFC na začiatku ľahkej fázy narušilo konsolidáciu pamäte. Toto zistenie je trochu prekvapujúce, pretože predchádzajúca práca odhalila, že pamäť CFC je selektívne ovplyvnená inhibíciou syntézy proteínov buď priamo, alebo 4 hodiny, ale nie 8 hodín po tréningu (Bourtchouladze et al., 1998). Pokiaľ ide o túto nezrovnalosť, treba poznamenať, že Bourtchouladze a kolegovia použili skôr kondicionovanie na pozadí než protokol kondicionovania popredia. Počas kondicionovania na pozadí je US spárovaný s tónom, ktorý okrem tréningového kontextu funguje ako druhý CS.

Jemné rozdiely v tréningovom protokole CFC (v tomto prípade prítomnosť alebo nedostatok tónu počas výboja) teda môžu zmeniť časovú dynamiku konsolidácie pamäte závislej od syntézy proteínov. Použitie robustnejšieho protokolu kondičného tréningu na pozadí (tj s viacerými šokmi) skutočne vedie ku konsolidácii spomienok na kontext a strach, ktoré sú narušené liečbou anisomycínom bezprostredne po tréningu, ale nie v časovom bode štyroch hodín (Bourtchouladze et al., 1998). Avšak v súlade s našimi pozorovaniami Trifilieff et al. ukázali, že CFC tréning vedie k aktivácii ERK/CREB dráhy v oblasti CA1 hipokampu približne deväť hodín po tréningu (Trifilieff et al., 2006).

Táto aktivácia môže prispieť k de novo syntéze proteínov, ktoré sú kľúčové pre konsolidáciu kontextových spomienok na strach. V budúcich štúdiách by bolo zaujímavé preskúmať, ako jemné zmeny v CFC tréningových protokoloch ovplyvňujú dočasnú dynamiku konsolidácie pamäte závislej od syntézy proteínov a aktivačných vzorcov súvisiacich signálnych dráh.

Ako už bolo uvedené, aktivita signálnych dráh zahŕňajúcich MAPK, cAMP a PKA je rozhodujúca pre učenie a pamäť a mení sa v rámci cirkadiánneho cyklu (Eckel-Mahan et al., 2008). Zatiaľ čo niektoré štúdie skúmali základné cirkadiánne rytmy signálnych dráh, iné štúdie sa zamerali na plasticitu vyvolanú učením. Kondicionovanie pozadia je napríklad spojené s jedinou fázou aktivácie dráhy ERK/CREB v oblasti CA1 hipokampu priamo po tréningu. Zrušenie párovania tónu a USA – to znamená, keď je tón daný pseudonáhodne, nie spolu s výbojmi – vedie k paradigme, ktorá je porovnateľnejšia s kondicionovaním popredia a protokolom, ktorý bol použitý v tejto štúdii.

Výsledkom sú dve odlišné vlny aktivácie ERK/CREB v oblasti CA1: jedna priamo po tréningu a druhá približne deväť hodín po tréningu (Trifilieff et al., 2006). Inhibícia ERK / CREB počas ktorejkoľvek z týchto fáz bola dostatočná na to, aby narušila tvorbu pamäte po nespárovanom podmieňovaní strachu. Ako je uvedené v predchádzajúcom odseku, načasovanie týchto dvoch vĺn aktivácie ERK/CREB sa zdá byť porovnateľné s časovými bodmi priamo a osem hodín po kontextovom tréningu strachu v tejto štúdii, pri ktorej konsolidácia kontextových spomienok strachu závisí od de novo syntéza bielkovín.

Signalizácia ERK/CREB teda môže prispieť k de novo syntéze proteínov, ktoré sú kľúčové pre konsolidáciu kontextových spomienok na strach priamo alebo 8–9 hodín po tréningu. Syntéza proteínov v časovom bode 4-h môže byť riadená inými mechanizmami nezávislými od ERK, ako je dráha PKA-CREB. Intrahippokampálna injekcia s Rp-cAMP (inhibítor PKA) 4 hodiny po kondicionovaní strachu skutočne zhoršuje konsolidáciu spomienok na kontext a strach (Bourtchouladze et al., 1998). Predstavu dvoch vĺn proteínovej syntézy podporuje ďalšia štúdia, ktorá využívala paradigmu motorického učenia (Peng & Li, 2009).

Je dôležité poznamenať, že je náročné oddeliť cirkadiánne a/alebo denné účinky na konsolidáciu pamäte od zmien v cykle spánku/bdenia (Snider et al., 2018). Spánok má silný vplyv na pamäťové procesy a spomienky závislé od hipokampu sú náchylné na stratu spánku (Graves, Heller, Pack a Abel, 2003; Havekes a kol., 2014; Havekes, Park, Tudor a kol., 2016b; Raven, Zee, Meerlo a Havekes, 2017; Vecsey a kol., 2009). Napríklad 5–6 hodín spánkovej deprivácie (SD) priamo po tréningu CFC zhoršuje konsolidáciu pamäte u myší aj potkanov (Graves a kol., 2003; Hagewoud a kol., 2010; Kreutzmann, Havekes, Abel a Meerlo, 2015 Vecsey a kol., 2009). Dôležité je, že tieto štúdie sa uskutočnili v ľahkej fáze, ktorá je hlavnou pokojovou fázou spánkovej fázy laboratórnych potkanov a myší.

Na rozdiel od toho, šesť hodín spánkovej deprivácie priamo v nasledujúcom tréningu na začiatku fázy tmy, aktívnej fázy, v ktorej hlodavce spia oveľa menej, nenarušilo konsolidáciu pamäte (Hagewoud et al., 2010). Až keď zvieratá boli zbavené spánku počas dvanástich hodín, ktoré preklenulo celé temné obdobie, bránilo to tvorbe dlhodobých CFC spomienok (Hagewoud et al., 2010). Aj keď tieto zistenia naznačujú, že časová regulácia molekulárnych procesov, ktoré sú základom konsolidácie pamäte závislej od hipokampu, sa môže líšiť v aktívnej a neaktívnej fáze v závislosti od množstva spánku v týchto fázach, vyvolávajú otázku, ako je možné, že syntéza bielkovín inhibícia ovplyvňuje konsolidáciu pamäte nezávisle od času dňa. Znamená to, že negatívne dôsledky straty spánku sú aspoň čiastočne nezávislé na syntéze bielkovín? Aby pamäť mohla existovať, musí byť počiatočná pamäťová stopa vytvorená z de novo proteínov, prípadne tvoriacich aktínové vlákna

vytváranie nových tŕňov, a teda vytváranie nových synaptických spojení. Preto inhibícia syntézy proteínov priamo bráni konsolidácii pamäte, pretože sa nedajú vytvoriť nové spomienky. Tento proces zahŕňa a je citlivý na mnoho molekulárnych konštruktérov modulujúcich tvorbu nových synapsií. Jedným príkladom takéhoto molekulárneho konštruktéra je kofilín. Kofilín je proteín destabilizujúci aktín a ak je aktivovaný, rozkladá aktínové vlákna, čo spôsobuje stratu dendritických tŕňov (Bamburg & Wiggan, 2002; Bernstein & Bamburg, 2010). Krátka perióda SD v ľahkej fáze zvyšuje aktiváciu kofilínu, čo nakoniec spôsobí stratu chrbtice (Havekes, Park, Tudor, et al., 2016b). Okrem toho SD znižuje signalizáciu aktivity mTORC1 v hipokampe, čo ovplyvňuje transláciu, čím tiež nepriamo znižuje syntézu proteínov, čo môže viesť k poruchám pamäte (Tudor et al., 2016).

SD spoločne narúša dôležité molekulárne mediátory synaptickej plasticity, čím nepriamo ovplyvňuje ukladanie pamäte. To by mohlo vysvetliť, prečo SD zhoršuje pamäť iba vo fáze svetla, keď je tlak spánku vysoký, pričom sa zameriava na konštruktérov namiesto základných stavebných blokov samotných pamätí (obrázok 3). Vzhľadom na to, že strata spánku má silný vplyv na učenie a pamäť (Havekes & Abel, 2017; Raven et al., 2017), možno sa pýtať, či účinky anisomycínu na tvorbu pamäte nie sú priamo spôsobené len inhibíciou syntézy proteínov, ale možno čiastočne nepriamo ovplyvnením spánku. Aj keď sme v našej štúdii nemerali EEG ani pohyb počas experimentu, literatúra ukazuje, že anisomycín môže mať jemné účinky na spánok. Napríklad, zatiaľ čo spánok s rýchlym pohybom očí (NREM) je častejšie uvádzaný ako neovplyvnený, injekcie anisomycínu môžu znížiť spánok s rýchlym pohybom očí (REM) (Drucker-Colin, Zamora, Bernal-Pedraza a Sosa, 1979; Gutwein , Shiromani a Fishbein, 1980; Rojas-Ramirez, Aguilar-Jimenez, Posadas-Andrews, Bernal-Pedraza a Drucker-Colin, 1977). Nie je však isté, či sú tieto účinky na spánok dostatočne silné na to, aby vysvetlili deficity pamäte v našej štúdii.

Okrem toho takýto nepriamy účinok anisomycínu na pamäť prostredníctvom zmien spánku nepodporujú výsledky injekcií na konci fázy tmy, tesne pred začiatkom hlavnej cirkadiánnej fázy spánku. Ak by mal anisomycín veľké účinky na spánok, ktorý by mohol narušiť tvorbu pamäti, dalo by sa očakávať, že k tomu došlo aj pri injekciách v tom čase, čo nebol tento prípad. Hoci, ako už bolo spomenuté, nepriame účinky anisomycínu na pamäť sú do značnej miery neznáme, zostáva jedným z najpoužívanejších nástrojov na manipuláciu syntézy proteínov s cieľom skúmať pamäťové procesy (Davis & Squire, 1984; Gold, 2008; Rudy, Biedenkapp , Moineau a Bolding, 2006). Pomocou anisomycínu vedci zistili, že syntéza bielkovín je nevyhnutná na to, aby dlhodobé spomienky pretrvávali. Uskutočnilo sa niekoľko štúdií aplikujúcich anizomycín lokálne, a teda zvýšenie priestorového rozlíšenia v kombinácii s jeho už výhodným časovým rozlíšením. Nedávno Ryan a spol. (2015) ukázali, že anizomycín narušil pamäť, ale že túto amnéziu možno obnoviť, z čoho vyplýva, že syntéza proteínov je dôležitá pre štrukturálne posilnenie synapsie, čo je nevyhnutné pri získavaní pamäte (Ryan et al., 2015). Jednou nevýhodou anisomycínu je, že je tiež schopný narušiť základné neurobiologické funkcie, napríklad spôsobením apoptózy (Iordanov et al., 1997), ktorá môže ovplyvniť pohodu neurónov a tým prispieť k poruchám pamäti.

cistanche kapsuly: zlepšujú pamäť

OBRÁZOK 2 Inhibícia syntézy bielkovín tlmí konsolidáciu spomienok na kontext a strach v konkrétnych časových bodoch po tréningu, bez ohľadu na dennú dobu. Zvieratá boli trénované v kontextovej paradigme podmieňovania strachu buď na začiatku konca fázy svetla. Injekcie sa podávali buď priamo (T0), 4 hodiny (T4), 8 hodín (T8) alebo 11,5 hodiny (T11,5) po tréningu. Zvieratá boli znovu vystavené rovnakému kontextu 24 hodín po tréningu, počas ktorého sa merali úrovne mrazu. Potom sa vypočítali hladiny delta zmrazovania normalizáciou hladín zmrazovania počas testu na základnú líniu (pred šokom). (a) Úrovne zmrazovania delta po kontextovom tréningu strachu na začiatku fázy svetla a liečbe drogami počas fázy svetla. T0: vehikulum n=8, anisomycín n=7 (p < .001);="" t4:="" vehikulum="" n="8," anisomycín="" n="8" (p="0,024);" t8:="" vehikulum="" n="8," anisomycín="" n="8" (p="0,005);" t11.5:="" vehikulum="" n="8," anisomycín="" n="8" (p="0,912)." (b)="" úrovne="" zmrazovania="" delta="" po="" kontextovom="" tréningu="" strachu="" na="" konci="" svetlej="" fázy="" a="" liečbe="" drogami="" počas="" tmavej="" fázy.="" t0:="" vehikulum="" n="8," anisomycín="" n="8" (p="0,002);" t4:="" vehikulum="" n="8," anisomycín="" n="7" (p="0,017);" t8:="" vehikulum="" n="7," anisomycín="" n="7" (p="">< 0,001);="" t11,5;="" vehikulum="" n="8," anisomycín="" n="7" (p="0,168)." (c)="" úrovne="" zmrazovania="" delta="" u="" zvierat="" liečených="" anisomycínom="" v="" porovnaní="" so="" zvieratami="" liečenými="" vehikulom.="" t0:="" svetlá="" fáza="" n="7," tmavá="" fáza="" n="8;" t4:="" svetlá="" fáza="" n="8," tmavá="" fáza="" n="7;" t8:="" svetlá="" fáza="" n="8," tmavá="" fáza="" n="7;" t11.5:="" svetlá="" fáza="" n="8," tmavá="" fáza="" n="7." panel="" a="" &="" b:="" údaje="" sú="" vyjadrené="" ako="" priemer,="" oblasť="" (pás)="" okolo="" priemeru="" označuje="" sem,="" vyhladená="" krivka="" hustoty="" (fazuľa)="" ukazuje="" úplné="" rozdelenie="" údajov="" a="" bodky="" označujú="" jednotlivé="" údajové="" body.="" počas="" 300="" s="" bolo="" hodnotené="" mrazivé="" správanie.="" *="" p="">< 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" ako="" vypočítala="" anova.="" panel="" c:="" všetky="" údaje="" sú="" vyjadrené="" ako="" priemer="" ±="" sem.="" počas="" 300="" s="" bolo="" hodnotené="" správanie="" pri="" mrazení.="" časový="" bod="" ***p="">< 0,001,="" fáza="" p="0,081," efekt="" interakcie="" p="0,386," vypočítané="" pomocou="" dvojcestnej="" analýzy="">

Napríklad niekoľko štúdií ukázalo, že anizomycín obmedzuje základné membránové vlastnosti hipokampálnych neurónov (Scavuzzo et al., 2019; Sharma, Nargang a Dickson, 2012). Poruchy pamäti pozorované po injekciách anizomycínu by preto mohli byť ovplyvnené aj zmenami nervovej aktivity vyvolanými anizomycínom. V našej štúdii sme však v poslednom časovom bode nepozorovali žiadne účinky anisomycínu, čo naznačuje, že ak anizomycín znížil základné bunkové vlastnosti, tieto účinky sú v našej paradigme kontextovej úlohy podmieňovania strachu takmer zanedbateľné. Napriek tomu sa odporúča použitie iných špecifickejších inhibítorov, ako je rapamycín, ktorý sa špecificky zameriava na mTORC1, aby sa do značnej miery vylúčili akékoľvek účinky na základné fungovanie buniek.

Znalosť dynamiky konsolidácie pamäte počas dňa a noci je veľmi dôležitá pre všetky štúdie, ktorých cieľom je odhaliť molekulárne mechanizmy, ktoré sú základom tvorby pamäte. Budúci výskum by mal preskúmať, či iné molekulárne mechanizmy podporujúce pamäť, o ktorých je známe, že sú náchylné na SD, sú rozdielne ovplyvnené cez deň a noc. Tieto môžu zahŕňať transkripciu, transláciu, väzbu RNA a ubikvitináciu, ako sa ukázalo pri genómovej analýze (Vecsey et al., 2012). Okrem toho môžu budúce štúdie využívať nové a sofistikovanejšie techniky, ako je optogenetika na označenie neurónov spôsobom závislým od aktivity, aby sa zistilo, ako a kedy sa vytvárajú a uchovávajú určité spomienky v čase (Ryan et al., 2015; Tonegawa et al., 2015). Tieto technologické pokroky môžu viesť k lepšiemu pochopeniu molekulárnych základov konsolidácie pamäte závislej od hipokampu počas dňa a noci.