Ergosta-7,9(11),22-trien{4}}ol zachraňuje AD deficity moduláciou aktivácie mikroglií, ale nie oxidačného stresu

Abstraktné: Ergosta-7,9(11),22-trien{4}}ol (EK100) bol izolovaný z taiwanskej liečivej huby Antrodia camphorate, ktorá je známa svojou podporou zdravia a účinky starnutia v ľudovom liečiteľstve. Alzheimerova choroba (AD) je hlavnou chorobou spojenou so starnutím. Skúmali sme účinnosť a potenciálny mechanizmus ergosta-7,9(11),22-trien-3 -olu na symptómy AD. Drosophila s pan-neuronálnou nadmernou expresiou ľudského amyloidu- (A) sa použila ako model AD. Porovnali sme dĺžku života, motorickú funkciu, učenie, pamäť, oxidačný stres a biomarkery aktivácie mikroglií a zápalu ergosta-7,9(11),22-trién-3 -ol- liečenej skupine k neliečenej kontrolnej skupine. Ergosta-7,9(11), liečba 22-trien{26}}olom účinne zlepšila dĺžku života, motorické funkcie, učenie a pamäť modelu AD v porovnaní s neliečenou kontrolou. Biomarkery aktivácie mikroglií a zápalu boli znížené, zatiaľ čo všadeprítomná peroxidácia lipidov, aktivita katalázy a aktivita superoxiddismutázy zostali nezmenené. Na záver, ergosta-7,9(11),22-trién{31}}ol zachraňuje deficity AD moduláciou aktivácie mikroglií, ale nie oxidačného stresu.

Glykozid cistanche môže tiež zvýšiť aktivitu SOD v tkanivách srdca a pečene a výrazne znížiť obsah lipofuscínu a MDA v každom tkanive, účinne zachytáva rôzne reaktívne kyslíkové radikály (OH-, H₂O₂ atď.) a chráni pred poškodením DNA. OH-radikálmi. Cystanche fenyletanoidové glykozidy majú silnú schopnosť zachytávať voľné radikály, vyššiu redukčnú schopnosť ako vitamín C, zlepšujú aktivitu SOD v suspenzii spermií, znižujú obsah MDA a majú určitý ochranný účinok na funkciu membrány spermií. Polysacharidy Cistanche môžu zvýšiť aktivitu SOD a GSH-Px v erytrocytoch a pľúcnych tkanivách experimentálne starnúcich myší spôsobenú D-galaktózou, ako aj znížiť obsah MDA a kolagénu v pľúcach a plazme a zvýšiť obsah elastínu. dobrý čistiaci účinok na DPPH, predĺženie doby hypoxie u starnúcich myší, zlepšenie aktivity SOD v sére a oddialenie fyziologickej degenerácie pľúc u experimentálne starnúcich myší Experimenty ukázali, že pri bunkovej morfologickej degenerácii má Cistanche dobrú antioxidačnú schopnosť a má potenciál byť liekom na prevenciu a liečbu chorôb starnutia kože. Zároveň má echinakozid v Cistanche významnú schopnosť vychytávať voľné radikály DPPH a má schopnosť vychytávať reaktívne formy kyslíka a zabraňovať degradácii kolagénu vyvolanej voľnými radikálmi a tiež má dobrý reparačný účinok pri poškodení aniónom voľných radikálov tymínu.

Kliknite na Výhody tabliet Cistanche

【Ďalšie informácie:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】

Kľúčové slová: Alzheimerova choroba; Drosophila; EK100; ergosta-7,9(11),22-vyskúšal-3 -ol

1. Úvod

Antrodia camphorata je liečivá huba jedinečná pre Taiwan a bola dôležitou ekonomickou plodinou pre taiwanský zahraničný obchod v 19. storočí [1]. Prvá taiwanská historická kniha, Tâi-uân Thong-sú (doslova Všeobecné dejiny Taiwanu), zaznamenala domorodé medicínske využitie gáforátu Antrodia, vrátane eliminácie patogénov, „zlepšovania zdravia“, „osviežovania krvi“, „detoxikácie alkoholu“, „... ochrana pečene“ a „anti-aging“ [2–4]. Keďže v dôsledku starnutia čelíme globálnej výzve v oblasti zdravia populácie [5], vedecká štúdia domorodej medicíny na využitie poznatkov proti starnutiu je kľúčová.

Medzi hlavnými chorobami súvisiacimi so starnutím, ako je makulárna degenerácia, ateroskleróza, rakovina a mŕtvica, je Alzheimerova choroba (AD) ťažkým orieškom kvôli jej nepolapiteľnému patologickému mechanizmu. Účinná liečba AD, ktorá modifikuje ochorenie, stále nie je dostupná [6]. Súčasné patologické hypotézy AD zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na, zníženie cholínacetyltransferázy, glutamátovú excitotoxicitu, agregáciu beta amyloidu (A), fosforyláciu tau, inzulínovú rezistenciu mozgu [7] a zmeny črevného mikrobiómu [8]. Napriek tomu, bez ohľadu na druh príčin, ktoré iniciujú AD, oxidačný stres a aktivácia zápalových mikroglií sú bežnými znakmi sprevádzajúcimi neurodegeneráciu AD [9,10]. Je zaujímavé, že neurozápal a oxidačný stres sú vzájomne súvisiace udalosti, ktoré sa pozorujú pri AD a predpokladajú sa pri patológii AD. Na jednej strane, senilné plaky ukladané A spúšťajú zápalové reakcie, aktiváciu mikroglií, uvoľňovanie cytokínov a astrocytózu, čo vedie k nežiaducim následkom, ako je progresívne poškodenie neurónov a nakoniec kognitívne dysfunkcie. Aktivácia imunitných reakcií môže spočiatku bojovať proti inváznym patogénom s A alebo eliminovať nadmerné depozity A; proces však nevyhnutne produkuje reaktívne formy kyslíka (ROS), ktoré môžu spôsobiť poškodenie neurónov v mikroprostredí. Na druhej strane by A mohla spôsobiť ROS spôsobom nezávislým od zápalu. Napríklad A bol nájdený v mitochondriálnych membránach AD postmortem a mohol vstúpiť do mitochondrií, čo spôsobilo narušenie elektrónového transportného reťazca (ETC) a viedlo k tvorbe ROS. Zvýšené ROS môžu naopak spustiť uvoľňovanie cytokínov a iniciovať zápal [7,9,10]. Preto antioxidačné a protizápalové molekuly môžu byť potenciálnymi terapeutikami pre AD.

Antrodia camphorate, najmä jedna z jeho ponorených zlúčenín ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (tiež známy ako EK100), izolovaných z celého vývaru, vykazoval silné antioxidačné a antioxidačné účinky. -zápalové aktivity [11–13]. Okrem toho Chang a kol. [14] ukázali, že antrochinonol, ďalšia zlúčenina izolovaná z fermentovaného mycélia Antrodia camphorate, zlepšuje učenie a pamäť v modeli AD myší so zníženou astrogliózou a oxidačným stresom. Kauzálny vzťah medzi zníženou astrogliózou a oxidačným stresom pri liečbe antrochinonolmi však nebolo možné potvrdiť a ako sprostredkujúci faktor sa predpokladá zníženie oxidačného stresu [14]. Bezpečnosť EK100 bola predtým testovaná podľa usmernenia 407 Organizácie pre hospodársku spoluprácu a rozvoj (OECD) na myšom modeli 10 a 20 mg/kg/deň [15]. Preto sme v tejto štúdii prijali približne ekvivalentné koncentrácie voľného kŕmenia pre ovocné mušky.

Model ovocnej mušky (Drosophila melanogaster) nadmernej expresie A 42 je dobre zavedený zvierací model AD [16] s charakteristickými symptómami AD vrátane skrátenej dĺžky života, deficitu učenia a motoriky [17], oxidačného stresu [18] a aktivácie mikroglií. [19]. Výzvy modelovania AD u Drosophila melanogaster nezahŕňajú žiadnu aktivitu BACE u Drosophila a rozdiely medzi pohlaviami, ktoré vykazujú závažnejšie symptómy u mužských súborov. Tieto nie sú pozorované pri ľudskej AD [20]. Preto sme prijali ľudský peptid A42 exprimujúci muchy do modelu AD, kde produkcia A42 nevyžaduje žiadnu aktivitu BACE. V tejto štúdii sme testovali, či EK100 zlepšuje symptómy AD, a čo je dôležitejšie, či sú modulácie oxidačného stresu a astrogliózy nevyhnutné na zlepšenie AD.

2. Výsledky

2.1. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol Zachránené prežitie a výstup na AD Drosophila

Diagnóza AD je spojená so skrátením strednej dĺžky života [21] a takmer polovica pacientov s AD trpí poruchami aktivity [22]. Preto sme testovali, či extrakt Antrodia camphorata ergosta-7,9(11),22-trien{6}}ol (EK100) zlepšuje prežitie a schopnosť šplhania AD Drosophila model. Zistili sme, že liečba ergosta-7,9(11),22-trién-3 -olom v dávke 125 alebo 250 µg/ml významne zlepšila prežitie AD Drosophila (p < 0,01) (obrázok 1A a doplnková tabuľka S1), ale iba vysoká dávka (250 ug / ml) zlepšila šplhanie AD Drosophila (obrázok 1B). Pretože deficity prežitia a mobility sú klinickými symptómami AD, v nasledujúcich výskumoch sa použila koncentrácia 250 ug/ml, ktorá zlepšila oba symptómy.

2.2. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol Zachránené učenie a hodinová pamäť AD Drosophila

Ďalej sme testovali, či liečba ergosta{{0}},9(11),22-trién-3 -olom zlepšuje poruchy učenia a pamäte, čo je charakteristický príznak AD. AD muchy boli liečené ergostou- 7,9(11),22-trien-3 -olom v množstve 250 ug/ml počas 14 dní a podrobené testom učenia a pamäte pomocou T-bludisko. Ako je znázornené na obrázku 2A, v porovnaní s kontrolou divokého typu (AD(-)/EK(-)), schopnosť učenia sa kontroly AD (AD(plus)/EK(-)) významne klesla (p < 0,01), zatiaľ čo Liečba ergosta-7,9(11),22-trien{22}}ol významne zlepšila schopnosť učiť sa AD (p < 0,05). Okrem toho, ergosta-7,9(11), liečba 22-trien{29}}olom, tiež zlepšila zníženú hodinovú pamäť AD (obrázok 2B).

2.3. Ergosta-7,9(11),22-vyskúšaná-3 -modulovaná mikrogliálna aktivácia v AD Drosophila

Ďalej sme testovali, či liečba ergosta-7,9(11),22-trien-3 -olom znižuje mikrogliálnu aktiváciu pri AD. Pri AD sú aktivované mikroglie sprevádzané fagocytózou a neurodegeneráciou [23]. U Drosophila je markerom pohltenia buniek mikroglie, a teda markerom mikrogliálnej aktivácie, expresia drapera (Drpr) a downstream CED [24]. Po ošetrení ergostou-7,9(11),22-trién{11}}olom boli AD muchy vyradené a RNA bola extrahovaná z hlavy muchy pre RT-qPCR. Ako je znázornené na obrázku 3A, oba Drpr boli významne znížené u AD Drosophila liečených ergosta-7,9(11),22-trién-3 -olom v porovnaní s neliečenou AD. To znamená, že ergosta-7,9(11),22-trién-3 -ol znížil mikrogliálnu aktiváciu u AD Drosophila. Okrem toho, ergosta-7,9(11), liečba 22-trién{30}}olom, tiež znížila zápal CNS, ako sa ukázalo pri down-regulácii génov súvisiacich so zápalom (obrázok 3B) .

2.4. Ergosta-7,9(11),22-vyskúšaný-3 -ol nemoduloval všadeprítomný oxidačný stres u AD Drosophila

Ďalej sme testovali, či je modulácia všadeprítomného – teda celého tela – oxidačného stresu potrebná na to, aby ergosta-7,9(11),22-trién-3 -ol zachránil AD. Ergosta-7,9(11),22-vyskúšané- 3 -ošetrenie nezmenilo peroxidáciu lipidov (obrázok 4A), aktivitu katalázy (obrázok 4B), aktivitu superoxiddismutázy (obrázok 4C) alebo expresia génov súvisiacich s oxidačným stresom (obr

3. Diskusia

Táto štúdia uvádza účinnosť a možný základný mechanizmus ergosta{0}},9(11),22-try-3 -olu, extraktu z Antrodia camphorate, na modifikáciu symptómov AD pomocou Drosophila model s nadmernou expresiou človeka-A. Ergosta-7,9(11),22-trien{10}}ol účinne zlepšil učenie a pamäť a predĺžil dĺžku života pacientov s AD. Okrem toho sa znížili biomarkery aktivácie mikroglií a zápalu, zatiaľ čo všadeprítomný oxidačný stres zostal nezmenený.

Existuje mnoho zdrojov oxidačného stresu pri AD, vrátane, ale nie výlučne, aktivácie vrodenej imunity – napríklad akumulácia A, narušenie mitochondrií A, hyperfosforylovaný tau a malmetabolizmus kovov sú tiež zdroje [25]. Aj keď sa zápal a oxidačný stres môžu navzájom indukovať, môžeme predpokladať, že k ich synchrónnym zmenám dochádza len za okolností, keď ostatné zdroje oxidačného stresu zostávajú konštantné. V tejto štúdii to však neplatí. Zníženie vrodenej imunity, najmä aktivácia mikroglie, súčasne oslabuje jej príspevok k odstraňovaniu A, čo môže viesť k akumulácii A. Je zaujímavé, že samotná akumulácia spúšťa produkciu oxidačného stresu viacerými spôsobmi. Zníženie mikrogliálnej aktivácie a zápalových reakcií pomocou EK1000 teda môže čiastočne chrániť neuróny pred imunitnými útokmi mimo cieľa, ale zaplatí cenu za zoslabenie klírensu A. Výsledok tejto štúdie teda môže odrážať obmedzenie stratégie zacielenia na mikroglie, aspoň v modeli AD Drosophila.

Vrodený imunitný systém sprostredkovaný mikrogliami je opísaný ako dvojsečná zbraň pri neurodegeneratívnych ochoreniach, najmä AD [26,27]. Aktivované mikroglie sa pokúšajú odstrániť toxické patogény, ako je A , ale nevyhnutne spôsobujú poškodenie neurónov v mikroprostredí. Nadradenosť 250 ug/ml EK100 v priebehu 35 dní môže znamenať, že stratégia znižovania aktivácie mikroglií je obmedzená na patologické štádium, aspoň v prípade modelu AD vrtule. Okrem toho sa významné zníženie biomarkerov pre mikrogliálnu aktiváciu a zápalovú odpoveď nepodarilo premietnuť do podobne významného zlepšenia prežitia a funkciu CNS možno čiastočne vysvetliť znakom mikroglie s dvojitým ostrím meča. To znamená, že aktivácia mikroglií nie je jediným ani dominantným faktorom progresie AD. Znížená mikrogliálna aktivácia tiež naznačuje, že degradácia nadmerne exprimovaného A bola čiastočne vypnutá v modeli ovocných mušiek, čo môže tiež vysvetliť vyššiu mortalitu pre vyššiu koncentráciu EK100 vo veku 35 až 52 dní.

Antrochinonol, ďalší extrakt z Antrodia camphorate, bol hlásený pre svoju účinnosť pri liečbe AD myší, u ktorých sa ako sprostredkujúci faktor predpokladalo zníženie oxidačného stresu [14]. Preto to môže znamenať, že antrochinonol a ergosta-7,9(11),22-trién{5}}ol zlepšujú symptómy AD prostredníctvom nezávislých ciest, či už sprostredkúvajú oxidačný stres alebo nie. Preto by bolo zaujímavé otestovať, či by spoločná liečba antrochinololom a ergosta-7,9(11),22-trien-3 -olom mala synergický účinok na zlepšenie AD.

Pre skoré štádium AD je hlavným zameraním návrhu liekov eliminácia usadzovania A (ako napríklad v nedávno schválenej monoklonálnej protilátke aducanumab [28], napriek jej sporu o minimálnych klinických prínosoch a neúčinnosti v jednej z dvoch klinických štúdií fázy III [29]), alebo pokusy o zvýšenie mikrogliálneho vychytávania A [30–32]. Avšak pre stredne pokročilé alebo pokročilé štádiá AD nadmerná aktivácia mikroglií naopak zhoršuje neurodegeneráciu [33], a preto sú potrebné alternatívne terapeutické stratégie.

4. Materiály a metódy

4.1. Údržba lietajúcich zásob a meranie životnosti

A transgénny kmeň Drosophila H29.3/CyO bol získaný z [16] a bol krížený s w(CS10) počas šiestich generácií. Línia pan-neurálneho ovládača elav-GAL4c155 bola krížená s w(CS10) počas šiestich generácií. Ako štandardná zásoba bola použitá línia w1118 s bielym okom (Bloomington Drosophila Stock Center #3605) prekrížená s líniou Canton S (Bloomington Drosophila Stock Center #64349) 10-krát (w (CS10)). Panneurálna línia elav-GAL4c155 bola získaná z Bloomington Drosophila Stock Center (#458). Genotyp experimentálnych múch – tj AD model – bol [elav; H29.3/ plus], ktorý bol vybraný z F1 potomstva bez CyO markera. Muchy boli udržiavané v štandardnom médiu kukuričnej múčky pri 25 °C v 12-hodinovom cykle svetlo-tma. Pre T-labyrint, vznikajúci [elav; H29.3/plus] muchy boli zozbierané (obe pohlavia zmiešané a nie panenské) a kultivované s alebo bez ošetrenia EK100 až do d14 po vzídení. Na prežitie, lezenie a RT-qPCR sa použili iba samce múch. Vzorky RNA sa odobrali v d30 po objavení sa, keď krivky dĺžky života aj stúpania vykazovali významné oddelenie v porovnaní s neošetreným modelom AD.

Pri analýze dĺžky života bolo dvadsať až tridsať múch chovaných v potravinovej fľaštičke s alebo bez CS; pre každé ošetrenie boli pripravené aspoň štyri fľaštičky. Fľaštičky s jedlom sa vymieňali každé 2 až 3 dni a v tom čase sa počítali mŕtve muchy. Na pokus sa uskutočnili aspoň tri replikáty. Percento prežitia je definované ako počet živých múch vydelený celkovým počtom múch na začiatku testu.

4.2. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (Ek100)

Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol bol extrahovaný z láskavého daru od Antrodia camphorata, ako už bolo opísané [34]. Ergosta-7,9(11),22-trien{10}}ol tvorí pri izbovej teplote prášok svetložltej farby. Zásobný roztok bol pripravený v koncentrácii 6,25 mg/ml v EtOH tesne pred použitím. Pre testy životnosti a anti-getaxe boli konečné koncentrácie 125 a 250 ug/ml. Pre testy učiacej sa pamäte a génovej expresie bola konečná koncentrácia 250 ug/ml. Molekulová hmotnosť EK100 je 396,65. Takže zodpovedajúce molárne koncentrácie sú 315 alebo 630 uM. Muchy boli ošetrené dvoma dávkami EK100 s konečnými koncentráciami 125 a 250 ug/ml primiešanými do krmiva kŕmením Ad libitum. Kontrolná potrava obsahovala rovnaké množstvo rozpúšťadla EtOH ako experimentálne skupiny s konečnou koncentráciou EtOH 3 % v/v. Ošetrenie začalo od objavenia sa až po časový bod zberu údajov každého testu. Na test prežitia a šplhania sa liečba podávala počas celého života. Počet múch pre každú replikáciu bol opísaný v časti metódy každého testu. Testovali sme aj testy životnosti s ošetrenými/neliečenými muchami divokého typu, aby sme zaistili bezpečnosť ergosta-7,9(11),22-trien-3 -olu v modeloch múch (doplnkový obrázok S1 ).

4.3. Antigeotaxické testy

Tento protokol je založený na predtým publikovanej metóde [35] s určitými modifikáciami. Stručne povedané, ako geotaxický prístroj bola použitá priehľadná valcová plastová liekovka s priemerom 2,5 cm a výškou 9,5 cm (dlhšia bude v poriadku, ale bude sa s ňou ťažšie manipulovať). Dno fľaštičky bolo potiahnuté jednou vrstvou potravy pre muchy ako vankúšom. Na vonkajší povrch liekovky bola pripevnená značka 5 cm nad vankúšom. Druhý koniec fľaštičky bol otvorený a odtiaľ sa nakladali muchy. Keďže test sa uskutočňoval súčasne s testom prežitia, počet naložených múch bol identický s počtom múch, ktoré v danom momente prežili. Muchy boli naložené do liekovky; vrchná časť bola utesnená uzáverom a dno injekčnej liekovky bolo opakovane (na dve sekundy) udierané o tvrdý povrch, na ktorom stála (v tomto prípade laboratórna lavica). Klopanie bolo dosť silné na to, aby muchy vyľakalo a prinútilo ich liezť po stenách liekovky, ale nie také silné, aby im fyzicky ublížilo. Celý proces sa zaznamenával na video po dobu 18 sekúnd, pričom sa zaznamenal počet múch vyšplhajúcich sa nad značku 5 cm a vyjadril sa v percentách pre každú skupinu. Počítal sa počet múch, ktoré preliezli hranicu 5 cm. Pre každú skupinu sa uskutočnili štyri replikácie. Percento lezeckých schopností je definované ako počet lezúcich múch vydelený celkovým počtom múch na začiatku testu. Schopnosť šplhania sa testovala aj na ošetrených/neliečených muchách divokého typu, aby sa zaistila bezpečnosť ergosta-7, 9 (11), 22-trien-3 -ol v modeloch mušiek (doplnkový obrázok S2) .

4.4. Platforma učenia a pamäte Drosophila (T-Maze)

Na pozorovanie učenia a pamäte Drosophila bolo najskôr umiestnených asi 100 múch do hornej medenej komory, ktorá môže byť napájaná elektrickým napätím a môže muchám poskytnúť elektrický šok. Muchy boli najprv dodávané v zápachu 1 (MCH) spolu s elektrickými šokovými vlnami. Potom boli muchy doručené zápachu 2 (OCT) bez elektrických výbojových vĺn. Po tréningu boli muchy premiestnené do priestoru pod ním, v ktorom boli dve otvorené strany zásobované buď zápachom 1 alebo zápachom 2, resp. Pozorovaním smeru pohybu múch možno odhadnúť odchýlku vône 2 oproti vôni 1 pomocou indexu výkonnosti (PI), ktorý je definovaný ako rozdiel v počte múch medzi dvoma pachmi vydelený celkovým počtom múch. Výkonnostný index predstavuje schopnosť učenia a pamäti Drosophila [36]. Ďalšia skupina múch bola podmienená opačným párovaním zápachu tak, že každý zápach slúžil raz ako elektrický šok plus a raz ako elektrický šok -. PI týchto dvoch testov boli spriemerované ako konečné PI jedného replikátu. "1 h-pamäť" bola testovaná po 1 hodinovom odstupe od tréningu, kým "učenie" bolo naopak testované po 1,5 min odstupe od tréningu. Testovali sme tiež vyhýbanie sa MCH a OCT muchám AD s liečbou EK100 alebo bez nej, aby sme zabezpečili, že liečba spôsobí zaujatosť voči averzívnym zápachom (doplnkový obrázok S3).

4.5. Kvantitatívna PCR

Hlavy a telá boli oddelené pred extrakciou RNA. Pri jednom opakovaní boli muchy anestetizované CO2; zhromaždené, 100 naraz, do Eppendorfových skúmaviek; a potom ponorený do tekutého dusíka na 1 minútu, aby boli telá krehké. Výsledné zmrazené mŕtvoly boli potom naložené na stohy sitových trepačiek (Bunsekifurui, č. 40 a č. 25) a pretrepané. Telá sa rozlomili a rozdelili sa podľa veľkosti ôk sita na dve samostatné frakcie: „hlavy“ a „telá“. Celková RNA sa extrahovala pomocou súpravy RNeasy Mini (Qiagen, Düsseldorf, Nemecko) a potom sa použila na syntézu cDNA pomocou súpravy VersoTM cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Hladiny expresie RNA skúmaných génov boli kvantifikované pomocou PCR v reálnom čase (Applied Biosystems 7700, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) s Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Výsledky boli normalizované na relatívne množstvo Gapdh alebo Rpl32. Použité priméry sú uvedené nižšie. Gapdh: 50 -GAAAAAAGCGGCAGTCGTAAT-30 a 50 -AATTCCGATCTTCGACATGG-30 ; Drpr: 50 -TGTGATCATGGTTACGGAGGAC-30 a 50 -CAGCCGGGTGGGCAA-30 ; CED: 50 - CGTTTACAAGGAGCGACT-30 a 50 -TTCCCAGATTGAAGAGCAGG-30 ; Mačka: 50 -TGACT ACAAAAACTCCCAAACG-30 a 50 -TTGATTCCAATGGGTGCTC-30 ; PHGPx: 50 -TGACA TCGGCGAGGTGT-30 a 50 -CGGTCTGCTTGGCCTTTA-30 ; Cnc: 50 -GCCAACTATGGTGG TGGAGT-30 a 50 -ACGCTGCGATTCAGACG-30 ; SOD1: 50 -GTCGACGAGAATCGTCAC CT-30 a 50 -GGAGTCGGTGATGTTGACCT-30 ; SOD2: 50 -AAATTTCGCAAACTGCAAGG- 3 0 a 50 -GGTCGCCATTTGTTGCTATT-30 ; SOD3: 50 -TCAGCATGGGTGCTCACTAT-30 a 50 -TAATGCCCGTGGAGTTGG-30 ; mkk3: 50 -CCGCTACCCATACGACAAT-30 a 5 0 -GAATTCCGGCGAAAATGT-30 ; mekk1: 50 -TTTAACGGCAGTGGAACTGT-30 a 50 - TGCATCTGCAACTGCTCAC-30 ; imd: 50 -AGATCGACCAGGCCATAATC-30 a 50 -AATCC ACTGGAGCAACAGC-30 ; rac1: 50 -CCGTGTTCGACAACTACTCG-30 a 50 -AGTCGGTCG TAGTCCTCCTG-30 ; vychutnať si: 50 -GCCATACTCCCTTGGAATTG-30 a 50 -TCTCCCTTCTCCG GATACAC-30 ; Rpl32: 50 -CGGATCGATATGCTAAGCTGT-30 a 50 -CGACGCACTCTGTTG TCG-3.

4.6. Testy oxidačného stresu

Tri replikáty peroxidácie lipidov, aktivity katalázy a aktivity superoxiddismutázy boli merané pomocou BIOXYTECH LPO-586 (OxisResearch, OXIS International, Beverly Hills, CA, USA), súpravy Catalase Assay Kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI , USA) a Superoxide Dismutase Assay Kit (Cayman), v tomto poradí, podľa pokynov výrobcu. V stručnosti, aktivita SOD bola hodnotená meraním dismutácie superoxidových radikálov generovaných xantínoxidázou dodávanou v súprave a bola detegovaná transformáciou tetrazóliovej soli na formazanové farbivo, potom kvantifikovaná absorbanciou pri 440–460 nm. Aktivita CAT bola hodnotená meraním tvorby formaldehydu z metanolu v prítomnosti H2O2 katalyzovaného CAT, detegovaného chromogénnym 4-amino-3- hydrazino-5-merkapto-1 dodanou súpravou. ,2,4-triazol, potom kvantifikované pomocou absorbancie pri 540 nm. Aktivita peroxidácie lipidov sa hodnotila meraním rozkladu peroxidov polynenasýtených mastných kyselín na malónaldehyd (MDA) a 4-hydroxyalkenaly, ktoré sa detegovali chromogénnym N-metyl-2-fenylindolom dodaným v súprave a potom sa kvantifikovali pomocou absorbancie pri 586 nm. Pre testy SOD, Cat a LPO bol počet celých homogenizovaných múch v každom replikáte 50, 50 a 100.

4.7. Štatistická analýza

Významnosť rozdielu medzi krivkami prežitia a krivkami stúpania ergosta{0}},9(11),22-trien-3 -olom liečených a kontrolných skupín sa posudzovala podľa log-rank (Mantel– Cox) a Gehan-Breslow-Wilcoxonove testy. Význam rozdielu medzi výkonnostným indexom učiacej sa pamäte ergosta-7,9(11),22-trién{10}}ošetrených a kontrolných skupín bol hodnotený Studentovým t-testom.

5. Závery

Overili sme, že ergosta-7,9(11),22-trien{4}}ol (EK100) z Antrodia camphorate zlepšuje prežitie, učenie a pamäť v modeli AD Drosophila so zníženými biomarkermi aktivácie mikroglií a zápalu. Okrem toho k zmene symptómov nedošlo prostredníctvom všadeprítomného zníženia oxidačného stresu, čo znamená, že ergosta-7,9(11) a 22-trien{10}}ol zlepšujú symptómy AD rôznymi cestami k inému Antrodia gáforový extrakt, antrochinonol. EK100 účinne znížil mikrogliálnu aktiváciu a zápal, čo môže pomôcť zvrátiť typické kognitívne deficity spojené s AD, ako sú deficity učenia a pamäte.

Doplnkové materiály:Nasledujúce sú dostupné online. Obrázok S1: Prežitie múch divokého typu liečených EK100; Obrázok S2: Lezenie múch divokého typu ošetrených EK100; Obrázok S3: Averzívne vyhýbanie sa zápachu múch AD liečených EK100; Tabuľka S1: Štatistika kriviek prežitia.

Príspevky autora:H.-PL, Y.-HK a W.-YL navrhli experimenty. Y.-HK prispelo k príprave EK100. Experimenty vykonali JC, L.-ZC, M.-SC, L.-WS a T.-NC. Na príprave rukopisu sa podieľali všetci autori. Všetci autori si prečítali publikovanú verziu rukopisu a súhlasili s ňou.

Financovanie: Táto práca bola podporená grantmi Ministerstva vedy a techniky Taiwanu (MOST 108-2320-B-039-031-MY3, MOST 109-2314-B-039-030, MOST 110-2314- B-039-009), China Medical University & Hospital (CMU109-MF-85, CMU108-MF-68, CMU108-MF{{12 }}, CMU109- AWARD-02 a DMR-109-150) az programu Featured Areas Research Center Program v rámci Higher Education Sprout Project Ministerstva školstva (MOE) na Taiwane (CMRC-CHM-2-1).

Vyhlásenie inštitucionálnej revíznej rady:Nepoužiteľné.

Vyhlásenie informovaného súhlasu:Nepoužiteľné.

Vyhlásenie o dostupnosti údajov:Údaje použité na podporu zistení tejto štúdie sú zahrnuté v článku.

Konflikt záujmov:Y.-HK je jedným z vynálezcov, ale nie je nadobúdateľom patentu US-9757393-B2 s názvom „Deriváty ergostatrienu-3- -olu z aniridia gáforátu a jeho antiglykemické, antihyperlipidemické a znižujúce využitie tuku v pečeni“. Iní autori vyhlasujú, že nemajú žiadne konkurenčné záujmy. Investori nezohrávali žiadnu úlohu pri navrhovaní štúdie; pri zbere, analýzach alebo interpretácii údajov; v písaní rukopisu, alebo v rozhodnutí o zverejnení výsledkov.

Dostupnosť vzorky:Vzorky zlúčenín sú dostupné od autorov.

Referencie

1. Davidson, JW Ostrov Formosa, minulosť a súčasnosť: História, ľudia, zdroje a komerčné vyhliadky. Čaj, gáfor, cukor, zlato, uhlie, síra, ekonomické závody a iné výroby; Macmillan & Company: New York, NY, USA, 1903.

2. Tsai, Z.; Liaw, S. Použitie a účinok Ganodermy; Sheng-Yun Publishers, Inc.: Taichung, Taiwan, 1985; s. 116–117.

3. Chen, C.-J. Štúdia o kultivácii a biologickej aktivite Antrodia camphorata. Fung. Sci. 2001, 16, 65–72.

4. Geethangili, M.; Tzeng, Y.-M. Prehľad farmakologických účinkov Antrodia camphorate a jeho bioaktívnych zlúčenín. Doplnok založený na dôkazoch. Altern. Med. 2011, 2011, 212641. [CrossRef] [PubMed]

5. Ogura, S.; Jakovljevic, MM Globálne starnutie populácie-zdravotná starostlivosť, sociálne a ekonomické dôsledky. Predné. Verejné zdravie 2018, 6, 335. [CrossRef] [PubMed]

6. Cummings, J.; Lee, G.; Ritter, A.; Zhong, K. Vývoj liekov na Alzheimerovu chorobu: 2018. Alzheimerova dement. Prekl. Res. Clin. Interv. 2018, 4, 195–214. [CrossRef] [PubMed]

7. Sharma, P.; Srivastava, P.; Seth, A.; Tripathi, PN; Banerjee, AG; Shrivastava, SK Komplexný prehľad mechanizmov patogenézy podieľajúcich sa na Alzheimerovej chorobe a potenciálnych terapeutických stratégií. Prog. Neurobiol. 2019, 174, 53–89. [CrossRef] [PubMed]

8. Sochočka, M.; Donskow-Łysoniewska, K.; Diniz, BS; Kurpas, D.; Brzozowska, E.; Leszek, J. Zmeny črevného mikrobiómu a zápalom riadená patogenéza Alzheimerovej choroby - kritický prehľad. Mol. Neurobiol. 2019, 56, 1841–1851. [CrossRef]

9. Agostinho, P.; A Cunha, R.; Oliveira, C. Neurozápal, oxidačný stres a patogenéza Alzheimerovej choroby. Curr. Pharm. Des. 2010, 16, 2766–2778. [CrossRef]

10. Galaško, D.; Montine, TJ Biomarkery oxidačného poškodenia a zápalu pri Alzheimerovej chorobe. Biomark. Med. 2010, 4, 27–36. [CrossRef]

11. Kuo, Y.-H.; Lin, T.-Y.; Vy, Y.-J.; Wen, K.-C.; Sung, P.-J.; Chiang, H.-M. Protizápalové účinky ergostatién-3 -olu izolovaného z Antrodia camphorata na kožu myší bez srsti. Molekuly 2016, 21, 1213. [CrossRef]

12. Chao, T.-Y.; Hsieh, C.-C.; Hsu, S.-M.; Wan, C.-H.; Lian, G.-T.; Tseng, Y.-H.; Kuo, Y.-H.; Hsieh, S.-C. Ergostatrien-3 -ol (EK100) od Antrodia camphorata zmierňuje oxidačný stres, zápaly a poranenia pečene in vitro a in vivo. Predch. Nutr. Food Sci. 2021, 26, 58. [CrossRef]

13. Tsai, T.-C.; Tung, Y.-T.; Kuo, Y.-H.; Liao, J.-W.; Tsai, H.-C.; Chong, K.-Y.; Chen, H.-L.; Chen, C.-M. Protizápalové účinky Antrodia camphorata a jej aktívnej zlúčeniny, Ergostatrien{10}}olu, v modeli ischémie kože u myší. FASEB J. 2015, 29, LB444.

14. Chang, W.-H.; Chen, MC; Cheng, IH Antroquinonol znižuje hladiny amyloidu v mozgu a zlepšuje priestorové učenie a pamäť na transgénnom myšom modeli Alzheimerovej choroby. Sci. Rep. 2015, 5, 1–12. [CrossRef] [PubMed]

15. Chen, Y.-M.; Sung, H.-C.; Kuo, Y.-H.; Hsu, Y.-J.; Huang, C.-C.; Liang, H.-L. Účinky Ergosta-7, 9 (11), 22-trien-3 -ol z Antrodia camphorate na biochemický profil a výkon pri cvičení myší. Molekuly 2019, 24, 1225. [CrossRef]

16. Finelli, A.; Kelkar, A.; Song, H.-J.; Yang, H.; Konsolaki, M. Model na štúdium toxicity vyvolanej Alzheimerovou chorobou A 42- u Drosophila melanogaster. Mol. Bunka. Neurosci. 2004, 26, 365–375. [CrossRef] [PubMed]

17. Ping, Y.; Hahm, E.-T.; Waro, G.; Song, Q.; Vo-Ba, D.-A.; Licursi, A.; Bao, H.; Ganoe, L.; Finch, K.; Tsunoda, S. Spojenie 42-vyvolanej hyperexcitability s neurodegeneráciou, poruchami učenia a motoriky a kratšou životnosťou v modeli Alzheimerovej choroby. PLoS Genet. 2015, 11, e1005025. [CrossRef] [PubMed]

18. Rival, T.; Page, RM; Chandraratna, DS; Sendall, TJ; Ryder, E.; Liu, B.; Lewis, H.; Rosahl, T.; Hider, R.; Camargo, L. Fenton chémia a oxidačný stres sprostredkúvajú toxicitu -amyloidového peptidu v modeli Alzheimerovej choroby Drosophila. Eur. J. Neurosci. 2009, 29, 1335–1347. [CrossRef]

19. Ray, A.; Speese, SD; Logan, MA Glial drapák zachraňuje toxicitu v modeli Drosophila Alzheimerovej choroby. J. Neurosci. 2017, 37, 11881–11893. [CrossRef]

20. Jeibmann, A.; Paulus, W. Drosophila melanogaster ako modelový organizmus mozgových chorôb. Int. J. Mol. Sci. 2009, 10, 407-440. [CrossRef] [PubMed]

21. Brookmeyer, R.; Corrada, MM; Curriero, FC; Kawas, C. Prežitie po diagnóze Alzheimerovej choroby. Arch. Neurol. 2002, 59, 1764–1767. [CrossRef]

22. Lam, LC; Tang, W.; Leung, V.; Chiu, HF Behaviorálny profil Alzheimerovej choroby u čínskych starších ľudí – validačná štúdia čínskej verzie stupnice hodnotenia behaviorálnej patológie Alzheimerovej choroby. Int. J. Geriatr. Psych. 2001, 16, 368-373. [CrossRef] [PubMed]

23. Schwab, C.; McGeer, PL Zápalové aspekty Alzheimerovej choroby a iných neurodegeneratívnych porúch. J. Alzheimer's Dis. 2008, 13, 359–369. [CrossRef] [PubMed]

24. MacDonald, JM; Pláž, MG; Porpiglia, E.; Sheehan, AE; Watts, RJ; Freeman, MR Receptor pohlcovania mŕtvoly buniek Drosophila Draper sprostredkúva gliálny klírens oddelených axónov. Neuron 2006, 50, 869-881. [CrossRef]

25. Chen, Z.; Zhong, C. Oxidačný stres pri Alzheimerovej chorobe. Neurosci. Bull. 2014, 30, 271–281. [CrossRef]

26. Stankovič, ND; Teodorczyk, M.; Ploen, R.; Zipp, F.; Schmidt, MH Interakcie mikroglie a krvných ciev: Dvojsečný meč v mozgových patológiách. Acta Neuropathol. 2016, 131, 347–363. [CrossRef]

27. Konishi, H.; Kiyama, H. Mikrogliálna signalizácia TREM2/DAP12: Dvojsečná zbraň pri nervových ochoreniach. Predné. Bunka. Neurosci. 2018, 12, 206. [CrossRef] [PubMed]

28. Sevigny, J.; Chiao, P.; Bussière, T.; Weinreb, PH; Williams, L.; Maier, M.; Dunstan, R.; Salloway, S.; Chen, T.; Ling, Y. Protilátka aducanumab znižuje A plaky pri Alzheimerovej chorobe. Príroda 2016, 537, 50–56. [CrossRef]

29. Lalli, G.; Schott, JM; Hardy, J.; De Strooper, B. Aducanumab: Nová fáza vo vývoji liečby Alzheimerovej choroby? EMBO Mol. Med. 2021, 13, e14781.

30. Takata, K.; Kitamura, Y.; Saeki, M.; Terada, M.; Kagitani, S.; Kitamura, R.; Fujikawa, Y.; Maelicke, A.; Tomimoto, H.; Taniguchi, T. Galantamínom indukovaný klírens amyloidu sprostredkovaný stimuláciou mikrogliálnych nikotínových acetylcholínových receptorov. J. Biol. Chem. 2010, 285, 40180–40191. [CrossRef] [PubMed]

31. Mandrekar-Colucci, S.; Karlo, JC; Landreth, GE mechanizmy, ktoré sú základom rýchleho klírensu amyloidu- -sprostredkovaného peroxizómovým proliferátorom aktivovaným receptorom a zvrátením kognitívnych deficitov na myšom modeli Alzheimerovej choroby. J. Neurosci. 2012, 32, 10117–10128. [CrossRef]

32. McGeer, PL; McGeer, EG Zameranie na mikroglie na liečbu Alzheimerovej choroby. Expert Opin. Ther. Ciele 2015, 19, 497–506. [CrossRef] [PubMed]

33. Pieseň, WM; Colonna, M. Identita a funkcia mikroglií pri neurodegenerácii. Nat. Immunol. 2018, 19, 1048–1058. [CrossRef] [PubMed]

34. Kuo, Y.-H.; Lin, C.-H.; Shih, C.-C. Ergostatrién-3 -ol z Antrodia camphorata inhibuje diabetes a hyperlipidémiu u myší liečených s vysokým obsahom tukov prostredníctvom regulácie génov súvisiacich s pečeňou, transportéra glukózy 4 a fosforylácie proteínkinázy aktivovanej AMP. J. Agric. Food Chem. 2015, 63, 2479–2489. [CrossRef] [PubMed]

35. Le Bourg, E.; Lints, FA Hypergravitácia a starnutie u Drosophila melanogaster. 4. Horolezecká činnosť. Gerontológia 1992, 38, 59–64. [CrossRef]

36. Waddell, S.; Quinn, WG Muchy, gény a učenie. Ann. Neurosci. 2001, 24, 1283-1309. [CrossRef] [PubMed]

【Ďalšie informácie:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】