Expresia neuronálnej syntázy oxidu dusnatého a renínu v dysplastických obličkách mladých psov

ABSTRAKT:

Renín a neuronálna syntáza oxidu dusnatého v obličkách riadia systémy renín-angiotenzín a tubuloglomerulárne systémy spätnej väzby. Táto štúdia skúmala expresiu renínu a neuronálnej syntázy oxidu dusnatého vdysplastické obličkytroch mladých psov. Renín-imunoreaktivita, ktorá sa vyskytuje v juxtaglomerulárnych a tubulárnych bunkáchdysplastické obličky, sa nelíšil od toho v normálnych obličkách mladých psov. Bunky makuly densa v normálnych obličkách vykazovali neuronálnu imunoreaktivitu syntázy oxidu dusnatého, ale bunky v dysplastických obličkách nevykazovali žiadne zjavné signály. Toto pozorovanie môže korelovať s patologickými mechanizmamizlyhanie obličieku mladých psov.

KĽÚČOVÉ SLOVÁ: chronické ochorenie obličiek, dysplastická oblička, imunohistochémia, neuronálna syntáza oxidu dusnatého, renín

Pre viac informácií kontaktujte:joanna.jia@wecistanche.com

cistanche na zlepšenie funkcie obličiek

Zlyhanie obličiekobčas sa vyskytuje u mladých psov. V takýchto prípadoch sa často preukazuje histologické vyšetreniedysplastická obličkalézie. Avšak patofyziologické mechanizmy, ktoré sa vyskytujú vdysplastické obličkypočet psov zostáva nejasný. Nedávno sme preukázali zoslabenie cyklooxygenázy (COX)-2 vchronické ochorenia obličieku mladých psov sdysplastické obličkypomocou imunohistochemickej analýzy [19].

COX-2 je indukovateľný zápalový enzým, ktorý je nevyhnutný pre normálny vývoj obličiek vo fetálnom a neonatálnom štádiu [12, 15]. Po narodení sa COX-2 konštitutívne exprimuje v obličkách a koncentruje sa v obmedzenej oblasti macula densa (MD) hrubých vzostupných končatín [1, 4, 22]. MD je špecializovaná oblasť susediaca s vaskulárnym pólom glomerulu. Riadi sekréciu renínu a systém tubuloglomerulárnej spätnej väzby (TGF). COX-2 exprimovaný v MD bunkách reguluje tieto mechanizmy [6, 8]. Okrem COX-2 je hlavným regulátorom systému TGF neurónová syntáza oxidu dusnatého (nNOS), ktorá je tiež exprimovaná v MD bunkách [3, 18]. Je známe, že tieto dve molekuly, ktoré sú koexprimované pri MD, navzájom interagujú [2, 5, 9]. V tejto štúdii sme skúmali expresiu renínu a nNOS vdysplastické obličkyimunohistochémiou, aby sa určilo, či zoslabenie COX-2 vdysplastické obličkyindukuje narušenie systému renín-angiotenzín a TGF systému u mladých psov.

Parafínové bloky fixované formalínomdysplastické obličkyod mladých psov (n{{{{1{19}}}}}), normálne obličky od mladých psov (n=3) a normálne obličky od dospelých psov (n=4) rovnaké ako tie, ktoré boli použité v našej predchádzajúcej štúdii, v ktorej už bola klinická anamnéza a príprava tkaniva popísaná [19]. Štúdiu schválil Výbor pre experimentovanie na zvieratách Univerzity Kagoshima v Japonsku (VM15020). Rezy boli pripravené s hrúbkou 3- um a imunohistochemická analýza na renín a nNOS sa uskutočnila podľa nasledujúcich protokolov: (1) deparafinizácia; (2) získanie antigénu mikrovlnným zahrievaním v 10 mM citrátovom pufri (pH 6,0) pre nNOS; (3) inkubácia s 3 percentami H202 počas 30 minút; (4) blokovanie 3 percentným hovädzím sérovým albumínom (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) pre renín alebo 0,25 percentným kazeínom (Sigma-Aldrich) pre nNOS, zriedené vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku, počas 30 minút; (5) inkubácia cez noc pri 4 stupňoch s 1:3,000 riedením králičieho anti-rekombinantného renínového polyklonálneho antiséra (dodáva Dr. Murakami, University of Tsukuba, Japonsko) alebo 1:3,{{31 }} riedenie králičieho anti-nNOS polyklonálneho antiséra (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA), v blokovacom roztoku; (6) inkubácia počas 30 minút pri izbovej teplote s univerzálnou protilátkou konjugovanou s peroxidázou a polymérom (anti-myší imunoglobulín (Ig) G a anti-králičí IgG; jednoduché farbenie MAX-PO [MULTI]; Nichirei Biosciences, Tokio, Japonsko) ; a (7) detekcia imunosignálu pomocou 3,3'-diaminobenzidínového systému (tableta s pufrom 3,3'-diaminobenzidínu; Merck, Darmstadt, Nemecko). Pre negatívne kontrolné rezy sa namiesto primárnej protilátky použil normálny králičí IgG (Lab Vision, Fremont, CA, USA).

Randomizovaná morfometrická analýza renínovej imunoreaktivity sa uskutočnila podľa skôr opísanej metódy [20]. Stručne, renínový index bol definovaný ako pomer celkového počtu renín-pozitívnych arteriol k celkovému počtu glomerulov a vyjadrený na 100 glomerulov. Rozdiely medzi skupinami boli analyzované použitím Bonferroniho metódy viacnásobného porovnávania s SPSS verzie 24 (IBM SPSS Statistics, Armonk, NY, USA).

Histopatologická diagnóza bola vykonaná podľa mikroskopických kritérií renálnej dysplázie psov podľa Picuta a Lewisa [14]. Histologické rezy všetkých troch prípadov predstavovali asynchrónnu diferenciáciu, čo naznačuje prítomnosť lézií s fetálnymi/nezrelými glomerulami. V zrelých obličkových tkanivách boli pozorované sekundárne zmeny rôznej závažnosti, ako je poškodenie tubulov, intersticiálna fibróza a sklerotické glomeruly.

Vdysplastické obličkySignály imunoreaktivity renínu sa pozorovali v juxtaglomerulárnych bunkách (JGC) (obr. 1A) a tubulárne bunky sa nachádzali v distálnych nefrónoch (obr. 1B). V niektorých glomeruloch niekoľko buniek vykazovalo renín-pozitívne signály v blízkosti cievnych pólov (obr. 1A). V mladých kontrolných obličkách boli renínové signály detegované aj v JGC a distálnych tubuloch, vrátane MD buniek. V kontrolných obličkách dospelých boli renín-pozitívne signály obmedzené na JGC. Štatisticky počet renín-pozitívnych oblastí v dysplastických obličkách nevykazoval žiadne významné rozdiely od tých v mladých a dospelých obličkách.

Je známe, že stimulácia produkcie renínu hrá úlohu v signalizácii COX{0}} a predchádzajúce štúdie preukázali, že aktivita a koncentrácia renínu v plazme sa znížili po podaní inhibítora COX{1}} alebo po vyradení COX -2 gén [10, 11]. Akodysplastické obličkyskúmaní v tejto štúdii nepreukázali žiadnu expresiu renálnej COX-2 [19], zníženie imunosignálov renínu v JGC bolo pôvodne podozrivé ako možná fyziologická abnormalita v dysplastických obličkách. Súčasná imunohistochemická analýza však nemohla potvrdiť túto hypotézu a v JGC nebola navrhnutá žiadna zjavná redukcia renínu. Hoci fyziologická úloha tubulárneho renínu nebola predtým objasnená, renálna manipulácia so sodíkom môže byť možnou úlohou tubulárneho renínu, pretože zvýšenie expresie renínu bolo indukované v distálnom nefróne po kŕmení potkanov diétou s nízkym obsahom soli. [16] a dysplastické obličky psov skúmaných v tejto štúdii si mohli zachovať túto tubulárnu funkciu.

COX-2 je tiež dôležitá pri regulácii systému TGF, ktorý je dôležitý na udržanie rýchlosti glomerulárnej filtrácie. Štúdia na potkanoch s použitím mikropunkčnej metódy preukázala potlačenie odpovede TGF po liečbe COX-2 inhibítorom [2]. TGF odpoveď vdysplastické obličkymôže byť oslabený v dôsledku nedostatočnej renálnej expresie COX-2. Predtým však neboli hlásené žiadne relevantné zistenia. V obličkách je nNOS exprimovaný v MD bunkách a pomáha regulovať systém TGF [18].

V súčasnej analýze nNOS neboli zistené žiadne zjavné signály v oblastiach MD vo všetkých prípadoch (obr. 2). Toto zníženie nNOS sa považovalo za etiopatogénnu udalosťdysplastické obličkyskôr ako nadobudnutý pozlyhanie obličiekprípadov. V skutočnosti naša predchádzajúca štúdia s použitím potkanov OLETF (Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty) ako modelu diabetu 2. typu preukázala, že nNOS bol nadmerne exprimovaný v MD a jeho okolí tubulárnych buniek v neskoršom štádiu diabetickej nefropatie [21]. Pri regulácii systému TGF je funkcia nNOS podobná a interaguje s funkciou COX-2. Niektoré štúdie naznačujú, že nNOS je umiestnený pred signálnou dráhou a stimuluje expresiu COX-2 [5, 9]. Na druhej strane, iné štúdie naznačujú opak, že COX-2 je umiestnená pred NOS [2, 13]. Bez ohľadu na rozdiel v signálnej dráhe môže nedostatok nNOS-imunosignálov v MD bunkách spustiť downreguláciu renálnej COX-2 expresie vdysplastické obličky.

Niekoľko tubulov vykazovalo pozitívne signály pre nNOS v dvoch prípadoch. Vo zvyšnom prípade mnohé rozšírené a sploštené tubuly, pravdepodobne v distálnom nefrone, vykazovali jasné pozitívne signály (obr. 3). V tomto prípade s výraznými nNOS-pozitívnymi tubulmi,

vývoj obličkových tkanív bol najnezrelší. V mladých a dospelých normálnych obličkách boli nNOS-pozitívne signály pozorované v hrubých vzostupných končatinách, najmä v MD bunkách (obr. 4). Distribúcia nNOS sa mení v priebehu vývojového priebehu obličky. Vo vyvíjajúcich sa obličkách ošípaných sa nNOS široko distribuuje a je pozorovaný v častiach hrubej vzostupnej končatiny vedúcej k macula densa [17]. U potkanov sa s prítomnosťou nNOS vo vyvíjajúcom sa distálnom tubule stretávame už v tele v tvare S od najskorších štádií nefrogenézy [7]. Hoci distribúcia nNOS vo vyvíjajúcich sa obličkách psov nebola predtým skúmaná, existuje možnosť, že výrazné signály nNOS v tubuloch by mohli byť dôkazom vysoko nezrelých tubulov v tubuloch.dysplastická obličkaskôr ako poškodené zrelé tubuly.

Na záver, expresia renínu a nNOS vdysplastické obličkyz troch mladých psov sa v súčasnej štúdii imunohistochemicky skúmali. To demonštrovalo zhoršenie nNOS v MD bunkách s konštantnou expresiou renínu. Zníženie expresie nNOS v MD bunkách by mohlo oslabiť TGF systém obličiek, a to môže byť jeden z patologických mechanizmov, ktoré sú základomzlyhanie obličieku mladých psov sdysplastické obličky.

POTENCIÁLNY KONFLIKT ZÁUJMOV

Autori nemajú čo prezradiť.

POĎAKOVANIE

Časť tejto práce bola podporená grantom na podporu vedeckého výskumu (číslo grantu 19K06385) od Japonskej spoločnosti na podporu vedy

Autor

Akira YABUKI1,2)*, Yu FURUSAWA2), Noriaki MIYOSHI3), Kazuyuki TANIGUCHI4) a Osamu YAMATO1)

1)Laboratórium veterinárnej klinickej patológie, Spojená fakulta veterinárneho lekárstva, Univerzita Kagošima, Kagošima 890-0065, Japonsko

2) Veterinárna fakultná nemocnica Kagoshima University, Spojená fakulta veterinárneho lekárstva, Univerzita Kagoshima, 1-21-24 Korimoto, Kagoshima 890-0065, Japonsko

3) Laboratórium veterinárnej histopatológie, Spojená fakulta veterinárneho lekárstva, Univerzita Kagošima, Kagošima 890-0065, Japonsko

4) Laboratórium veterinárnej anatómie, Fakulta poľnohospodárstva, Univerzita Iwate, Morioka 020-8550, Japonsko

LITERATÚRA

1. Adegboyega, PA a Ololade, O. 2004. Imunohistochemická expresia cyklooxygenázy-2 v normálnych obličkách. Appl. Imunohistochem. Mol. Morphol. 12: 71-74. [Medline] [CrossRef]

2. Araujo, M. a Welch, WJ 2009. Inhibícia cyklooxygenázy 2 potláča tubuloglomerulárnu spätnú väzbu: úlohy tromboxánových receptorov a oxidu dusnatého. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 296: F790 – F794. [Medline] [CrossRef]

3. Blantz, RC, Deng, A., Lortie, M., Munger, K., Vallon, V., Gabbai, FB a Thomson, SC 2002. Komplexná úloha oxidu dusnatého v regulácii glomerulárnej ultrafiltrácie. Kidney Int. 61: 782-785. [Medline] [CrossRef]

4. Câmpean, V., Theilig, F., Paliege, A., Breyer, M. a Bachmann, S. 2003. Kľúčové enzýmy pre syntézu renálnych prostaglandínov: miestne špecifická expresia v obličkách hlodavcov (potkan, myš). Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285: F19–F32. [Medline] [CrossRef]

5. Cheng, HF, Zhang, MZ a Harris, RC 2006. Oxid dusnatý stimuluje cyklooxygenázu-2 v kultivovaných CTAL bunkách prostredníctvom ap38-závislej dráhy. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 290: F1391 – F1397. [Medline] [CrossRef]

6. Deng, A., Wead, LM a Blantz, RC 2004. Časová adaptácia tubuloglomerulárnej spätnej väzby: účinky COX-2. Kidney Int. 66: 2348–2353.[Medline] [CrossRef]

7. Fischer, E., Schnermann, J., Briggs, JP, Kriz, W., Ronco, PM a Bachmann, S. 1995. Ontogenéza NO syntázy a renínu v juxtaglomerulárnom aparáte obličiek potkana. Am. J. Physiol. 268: F1164 – F1176. [Medline]

8. Hao, CM a Breyer, MD 2008. Fyziologická regulácia prostaglandínov v obličkách. Annu. Physiol. 70: 357-377. [Medline] [CrossRef]

9. Ichihara, A., Imig, JD, Inscho, EW a Navar, LG 1998. Cyklooxygenáza-2 sa zúčastňuje aferentného arteriolárneho tonusu závislého na tubulárnom prietoku: interakcia s neurónovým NOS. Am. J. Physiol. 275: F605 – F612. [Medline]

10. Kim, SM, Chen, L., Mizel, D., Huang, YG, Briggs, JP a Schnermann, J. 2007. Nízky plazmatický renín a znížené sekrečné reakcie renínu na akútne stimuly pri vedomom deficite COX-2- myši. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 292: F415 F422. [Medline] [CrossRef]

11. Matzdorf, C., Kurtz, A. a Höcherl, K. 2007. Aktivita COX-2 určuje úroveň expresie renínu, ale je nevyhnutná pre akútnu upreguláciu expresie renínu v obličkách potkanov. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 292: F1782 – F1790. [Medline] [CrossRef]

12. Norwood, VF, Morham, SG a Smithies, O. 2000. Postnatálny vývoj a progresia renálnej dysplázie u myší s nulovou cyklooxygenázou-2. Kidney Int. 58: 2291-2300. [Medline] [CrossRef]

13. Paliege, A., Mizel, D., Medina, C., Pasumarthy, A., Huang, YG, Bachmann, S., Briggs, JP, Schnermann, JB a Yang, T. 2004. Inhibícia expresie nNOS v r. macula densa podľa COX-2-odvodil prostaglandín E2. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287: F152 – F159. [Medline] [CrossRef]

14. Picut, CA a Lewis, RM 1987. Mikroskopické znaky dysplázie obličiek u psov. Vet. Pathol. 24: 156-163. [Medline] [CrossRef]

15. Seta, F., Chung, AD, Turner, PV, Mewburn, JD, Yu, Y a Funk, CD 2009. Renálna a kardiovaskulárna charakterizácia COX-2 knockdown myší. Am. J. Physiol. Regul. Celé číslo. Comp. Physiol. 296: R1751 – R1760. [Medline] [CrossRef]

16. Shao, W., Seth, DM, Prieto, MC, Kobori, H. a Navar, LG 2013. Aktivácia renín-angiotenzínového systému diétou s nízkym obsahom soli nezvyšuje intratubulárny angiotenzinogén a angiotenzín II u potkanov. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 304: F505 F514. [Medline] [CrossRef]

17. Solhaug, MJ, Ballèvre, LD, Guignard, JP, Granger, JP a Adelman, RD 1996. Oxid dusnatý vo vyvíjajúcej sa obličke. Pediatr. Nephrol. 10: 529-539. [Medline] [CrossRef]

18. Wilcox, CS 1998. Úloha macula densa NOS v tubuloglomerulárnej spätnej väzbe. Curr. Opin. Nephrol. Hypertenzia. 7: 443-449. [Medline] [CrossRef]

19. Yabuki, A., Miyazaki, A., Ichii, O., Kohyama, M., Sawa, M. a Yamato, O. 2016. Nízka expresia cyklooxygenázy-2 pri chronickom ochorení obličiek u mladých psov. Res. Vet. Sci. 109: 71-73. [Medline] [CrossRef]

20. Yabuki, A., Suzuki, S., Matsumoto, M., Taniguchi, K. a Nishinakagawa, H. 2002. Jednoduchá metóda na špecifickú detekciu Ren-1 renínu. Kidney Int. 62: 2294-2299. [Medline] [CrossRef]

21. Yabuki, A., Tahara, T., Taniguchi, K., Matsumoto, M. a Suzuki, S. 2006. Neurónová syntáza oxidu dusnatého a cyklooxygenáza-2 pri diabetickej nefropatii diabetických potkanov OLETF 2. typu. Exp. Anim. 55: 17–25 [CrossRef]. [Medline]

22. Zhang, MZ, Wang, JL, Cheng, HF, Harris, RC a McKanna, JA 1997. Cyklooxygenáza-2 vo vývoji nefrónov u potkanov. Am. J. Physiol.

23: F994–F1002. [Medline]