Fisetín zmierňuje lipopolysacharidmi indukované zápalové reakcie v makrofágoch

Pre viac informácií kontaktujtetina.xiang@wecistanche.com

Niekoľko štúdií uvádza účinnosť a bezpečnosť polyfenolov pre ľudské zdravie; overenie ich účinnosti však zostáva nedostatočné. Cieľom tejto štúdie bolo preskúmať, či fisetín, jeden z flavonoidov prevažne prítomný v ovocí a zelenine, môže potlačiť lipopolysacharidmi (LPS-) indukovanézápalovéreakcie v makrofágoch. LPS zvýšil množstvo prozápalovej mRNA (MCP 1, IL-1ß a iNOS), ale boli potlačené fisetínom. Nárast oxidu dusnatého pomocou LPS, faktora oxidačného stresu, bol oslabený fisetínom. Okrem toho sa znížila fosforylácia mitogénom aktivovanej proteínkinázy (ERK a JNK) zosilnená LPS. Nakoniec fisetín zoslabil expresiu alebo aktivitu uPA, uP AR, MMP-2 a MMP-9, ktoré sú známe ako súvisiace faktory náboru alebo infiltrácie makrofágov. Na záver,fisetinje sľubným terapeutickým činidlom pre zápalové ochorenia súvisiace s makrofágmi, ako je sepsa a ateroskleróza.

Kliknutím sem získate ďalšie informácie.

1. Úvod

Terapeutické využitie prírodných zložiek si v posledných 2 desaťročiach získalo väčšiu pozornosť. Na základe ich vysokej účinnosti a nízkej toxicity, 40 percent terapeutických činidiel schválených FDA sú zložky na prírodnej báze alebo ich deriváty [1]. Toxicitu spojenej s inými liekmi sa úspešne predchádzalo rôznymi prírodnými produktmi [2]. Preto je veľmi dôležité a významné ďalej skúmať prírodné zlúčeniny získané z rastlín.

Polyfenolysú sekundárne metabolity rastlín a sú široko prítomné v potravinách a nápojoch rastlinného pôvodu, ovocí, zelenine, korení, čaji a víne. Hoci sa nepovažujú za základné mikroživiny, viaceré druhy literatúry dokazujú ich priaznivé účinky na ľudské zdravie, najmä pri diétach spojených s vysokou konzumáciou ovocia a zeleniny [3-5]. V priebehu desaťročí sa uskutočnilo množstvo štúdií na skúmanie farmakologických účinkov polyfenolov, čo naznačuje prínosy pre zdravie. Rastúce dôkazy ukázali, že niekoľko polyfenolov máprotizápalovévlastnosti

[6-8]. Nedávne štúdie navyše ukázali, že niekoľko druhov polyfenolov môže inhibovať regulačné enzýmy alebo transkripčné faktory, ktoré sa podieľajú na zápale [9].

Diéta ovplyvňuje rôzne štádiá zápalu a preukazuje významný vplyv na viaceré zápalové ochorenia [10,11]. Zápal hrá kľúčovú úlohu pri vzniku chorôb, ako je cukrovka, astma, kardiovaskulárne choroby a rakovina [12]. Preto kontrola zápalu môže zabrániť týmto ochoreniam. Keďže makrofágy sú hlavnými mediátormi zápalu, majú rôzne funkcie v tkanivovej homeostáze a zápale. Činidlá účinne modulujúce ich funkcie majú teda veľkú klinickú hodnotu, pretože aberantná aktivácia makrofágov môže spôsobiť škodlivé imunitné reakcie. Súčasná tendencia výskumu jasne ukazuje, že prírodné produkty sú jedným z najdôležitejších zdrojov nových liekov [13].

Jeden polyfenol, isetín (3,3',4',7-tetrahydroxyflavón), je bohato obsiahnutý v jahodách, jablkách, paradajkách, cibuli, pomaranči, broskyni, hrozne, kiwi, žeruche, čaji a víne [14] . Doteraz fisetín hlásil silné protizápalové [15-17],

antioxidačné [18], antitumorogénne [19,20, antiangiogénne [21], antidiabetické [22], neuroprotektívne [23] a kardioprotektívne účinky [24] v bunkovej kultúre aj na zvieracích modeloch relevantných pre ľudské ochorenia. Hoci má fisetín mnoho fyziologických účinkov, jeho účinok na makrofágy sa príliš neuvádza.

V tejto štúdii sme skúmali priaznivé účinky fisetínu na zápalovú odpoveď aktivovaných makrofágovlipopolysacharid(LPS).

2. Materiály a metódy

2.1. Izolácia rezidentných peritoneálnych makrofágov.

BALB/c myši boli získané z Inštitútu lekárskej vedy Tokijskej univerzity a udržiavané v Animal Resource Center of Okayama University. Všetky pokusy na zvieratách sa uskutočňovali v súlade s usmerneniami NIH (Príručka pre starostlivosť a používanie laboratórnych zvierat). Experimentálny protokol schválili Etické kontrolné výbory pre experimentovanie na zvieratách na Okayama University Graduate School of Medicine, Dentistry and Pharmaceutical Sciences (OKU-2018449). Všetky myši boli chované v bariérovom zariadení a kŕmené normálnou laboratórnou stravou. Samce a samice myší BALB/c vo veku 16 ± 4 týždňov boli anestetizované izofluránom a usmrtené cervikálnou dislokáciou. Makrofágy sa zozbierali peritoneálnou lavážou s použitím fyziologického roztoku (5 ml). Roztok na výplach peritonea sa 5 minút centrifugoval pri 1500 ot./min. Sediment sa suspendoval v malom množstve DMEM (SIGMA, kat. č. D6046). Červené krvinky boli lyzované pomocou roztoku chloridu amónneho. Počet makrofágov sa vypočítal pomocou hemocytometra, potom sa resuspendovali v DMEM obsahujúcom teplom inaktivovaný FBS (10 percent vv), penicilín (10 U/ml) a streptomycín (10 mg/ml) a umiestnili sa do 6-jamky platne (Corning Incorporated, kat. č. 3516) [25,26].

2.2. Podmienky bunkovej kultúry.

Po hladovaní cez noc v sére boli makrofágy inkubované s vybranými koncentráciami fisetínu (10, 30 a 100 μM; SIGMA, Kat. č. F4043) alebo vehikulum počas 3 hodín a inkubované v prítomnosti alebo neprítomnosti LPS (10 ng/ml; SIGMA, kat. č. L4391) počas vhodného času. Potom sa médium a bunky zhromaždili. Médium sa použilo na test oxidu dusnatého (NO) a želatínovú zymografiu. Bunkové lyzáty sa použili na kvantitatívnu polymerázovú reťazovú reakciu (qPCR) a western blotting.

2.3. Polymerázová reťazová reakcia v reálnom čase.

mRNA boli extrahované z makrofágov pomocou RNeasy Mini Kits (QIAGEN, kat. č. 74104). Reverzná transkripcia sa uskutočnila s použitím iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, kat. č. 1708891). qPCR sa uskutočnila pomocou ABI Step One Real-Time PCR System (Applied Biosystems, QuantStudio 3) s použitím Fast SYBR Green Real-time PCRMixture (Applied Biosystems, kat. č. 4385612)[27). Priméry pre monocytový chemotaktický proteín 1 (MCP-1) (Takara Bio Inc., kat. č. MA066003), interleukín 1 beta (IL-1 ) (Takara Bio Inc., kat. č. MA025939), indukovateľná syntáza oxidu dusnatého (iNOS) (Takara Bio Inc, kat. č. MA083369), matricová metaloproteináza-(MMP-)2 (Takara Bio Inc., kat. č. MA127110), MMP-9 (Takara Bio Inc ., kat. č. MA031311) a 18S ribozomálna RNA(18S) (Takara Bio Inc., kat. č. MA050364) boli komerčne dostupné. Každá vzorka bola normalizovaná na hodnoty pre expresiu 18S mRNA (metóda AACT) [27].

2.4. Test oxidu dusnatého.

Jednotlivé supernatanty bunkovej kultúry sa zhromaždili a centrifugovali 10 minút pri 14, 000ot./min. pri 4 stupňoch. Potom sa supernatant použil na test oxidu dusnatého (NO). Stanovenie NO sa uskutočnilo tak, ako je opísané v komerčne dostupných súpravách (BioAssay Systems, kat. č. D2NO-100). BioAssay Systems'QuantiChrom Nitric Oxide Assay Kit je kolorimetrický test na stanovenie produkcie NO po redukcii dusičnanov na dusitany pomocou vylepšenej Griessovej metódy.

2.5. Western blotting.

Celobunkové proteíny boli extrahované z makrofágov pomocou lyzačného pufra (Cell Signaling, kat. č. 9803). Každá vzorka bola aplikovaná na 10 percent SDS-PAGE a prenesená na polyvinylidénfluoridovú membránu, imunoblotovaná s primárnymi protilátkami (fosforylácia kinázy regulovanej extracelulárnym signálom (p-ERK); Cell Signaling, kat. č. 9101, fosforylácia c-Jun N-koncová kináza (p-JINK); Cell Signaling, kat. č. 9251, aktivátor plazminogénu urokinázy (uPA); Abcam, kat.

ab20789, urokinázový aktivátor plazminogénu a receptor (uPAR); R&D, kat. č. AF534, a -aktín; Sigma Cat. č. A5441)[28]. Membrány sa potom inkubovali s vhodnými sekundárnymi protilátkami a imunitné komplexy sa vizualizovali pomocou chemiluminiscencie (Merck Millipore, kat. č. WBLUF0100, kat. č. WBLUC0100) a kvantifikovali sa pomocou General Electric Imager (GE Healthcare, LAS4000 mini)[29].

2.6. Želatínová zymografia.

Supernatanty bunkových kultúr sa rozdelili za neredukujúcich podmienok pomocou SDS-PAGE (10 % hm./obj.) polymerizovanej v prítomnosti želatíny (0,1 % hm./hm.), aby sa vyhodnotili aktivity MMP{ {4}}. Gély boli dvakrát premývané Tritonom X-100 (2,5 % obj./obj.) počas 60 minút a destilovanou vodou počas 15 minút. Gély sa potom inkubovali cez noc pri 37 stupňoch Cin 50 mM Tris pufra obsahujúcom chlorid vápenatý (5 mM) pH 8,0. Po inkubácii sa gély zafarbili Coomassie Brilliant Blue R-250 (Bio-Rad, kat. č. {18}}) počas 30 minút pri izbovej teplote, potom nasledovalo odfarbenie pomocou odfarbovacieho roztoku Coomassie Brilliant Blue R-250 (Bio-Rad, kat. č.{22}}), kým sa neobjavili číre pásy. Gélové obrázky boli kvantifikované pomocou General Electric Imager (GE Healthcare, LAS 4000 mini); nezafarbené, priesvitné natrávené oblasti predstavovali oblasti aktivity MMP [30].

2.7. Štatistiky.

Všetky štatistické analýzy boli vykonané pomocou Sigma Plot v14.0(Systat Software Inc, Kalifornia, USA). Údaje sú prezentované ako priemer ± štandardná chyba priemeru. Štatistická významnosť medzi viacerými skupinami bola hodnotená jednosmernou alebo obojsmernou analýzou rozptylu, po ktorej nasledoval Holm-Sidak post hoc test alebo Student-Newman-Keuls post hoc test. pvalue<0.05 was="" considered="" statistically="">

3. Výsledky

3.1. Fisetín zoslabil mediátory zápalu v makrofágoch stimulovaných LPS.

Keďže aktivované makrofágy produkujú prozápalové cytokíny a zápalové mediátory, ako je NO[8], skúmali sme účinky fisetínu na zápalové mediátory v makrofágoch stimulovaných LPS. Po prvé, aby sme zistili, či fisetín vykazuje protizápalový účinok na transkripčnej úrovni, určili sme hladiny expresie mRNA A zápalových génov, ako sú MCP-1, IL-1 a iNOS (obrázok 1(a) ). Ako sa očakávalo, expresie týchto zápalových génov boli potlačené fisetínom spôsobom závislým od dávky. Ďalej, aby sme potvrdili, či fisetín potláča zápalovú odpoveď v makrofágoch, hodnotili sme jeho schopnosť potlačiť produkciu NO v makrofágoch ošetrených LPS (obrázok 1 (b)). Ako sa očakávalo, fisetín znížil produkciu NO spôsobom závislým od dávky.

3.2. Fisetínom redukovaná mitogénom aktivovaná proteínkináza v makrofágoch stimulovaných LPS.

Keďže sa uvádza, že fisetín inhibuje dráhy proteínkinázy aktivovanej mitogénom (MAPK) v rôznych typoch buniek [31, 32], skúmali sme účinky fisetínu na MAPK v makrofágoch. Najprv sa pozorovala aktivácia MAPK indukovaná LPS v makrofágoch (obrázok 2(a)). Zvýšenie p-ERK pomocou LPS vyvrcholilo 15 minút po stimulácii, zatiaľ čo prírastok p-JNK pomocou LPS dosiahol vrchol 30 minút. V nasledujúcich experimentoch sa teda makrofágy stimulovali LPS počas 30 minút. Súbežná liečba fisetínom významne znížila LPS-indukované zvýšenie p-ERK a p-JNK (obrázky 2(b) a 2(c)).

3.3. Fisetín Znížený uPA a uPAR v makrofágoch stimulovaných LPS.

Aktivácia makrofágov úzko súvisí s invazívnosťou buniek. Okrem toho uPA a uPAR v makrofágoch prispievajú k infiltrácii buniek. Skúmal sa teda účinok fisetínu na expresiu uPA a uPAR. LPS indukoval nadbytok proteínu uPA (obrázok 3(a)) a uPAR (obrázok 3(b)). Súbežná liečba fisetínom znížila prírastok uPA (obrázok 3(a)) a uPAR pomocou LPS (obrázok 3(b)).

3.4. Fisetín redukovaný MMP-2 a MMP-9 v makrofágoch stimulovaných LPS.

Okrem toho, aby sme objasnili účinok fise-cínu na MMP, skúmali sme expresie MMP-2 a MMP-9, následné mediátory uPA/uPAR. Pokiaľ ide o hladinu mRNA, LPS významne zvýšil expresiu mRNA MMP-2 a MMP{4}} v porovnaní s liečbou vehikulom (obrázok 4(a)). Fisetín znížil zosilnenie týchto génových expresií MMP-2 alebo MMP9 indukovaných LPS spôsobom závislým od dávky (obrázok 4(a)). Okrem toho boli proteínové aktivity MMP{10}} hodnotené zymografiou (obrázok 4(b)). Proteínové aktivity MMP-9(92 kDa) sa zvýšili stimuláciou LPS, ktorá bola znížená fisetínom (obrázok 4(b)).

4. Diskusia

Zistili sme dôležitý účinok fisetínu proti zápalu v makrofágoch. Táto štúdia preukázala, že fisetín zoslabuje indukciu zápalových zložiek, ako sú MCP-1, IL{1}}, iNOS a NO, indukovaných LPS v makrofágoch. Okrem toho fisetín potlačil aktiváciu MAPK a zoslabil LPS-indukovaný prírastok expresie uPA a uPAR. Okrem toho fisetín zoslabil zvýšenie množstva mRNA MMP-2 a MMP-9 a aktivitu MMP-9.

Pri sepse spôsobenej gramnegatívnou infekciou sa LPS bežne uznáva ako pôvodca sepsy. V mnohých štúdiách bol LPS použitý ako model sepsy, ako aj zápalu. Okrem toho chronický zápal indukuje skorú rakovinu aktiváciou zápalových buniek a nesprávnou produkciou prozápalového mediátora, ako je iNOS, a transkripčných faktorov, ako je nukleárny transkripčný faktor kappa B (NF-xB)[33]. Okrem toho sa tiež uvádza, že oxidačný stres sa znižuje znížením expresie iNOS [34]. Naša štúdia preukázala, že fisetín môže byť účinný pri prevencii a liečbe sepsy a septického šoku v dôsledku supresívneho účinku na množstvo mRNA prozápalových génov a produkciu NO. V tejto štúdii fisetín potláčal produkciu NO znížením expresie mRNA prozápalového génu (iNOS); preto bolo pravdepodobné, že fisetín zmierňuje oxidačný stres. V dôsledku toho tieto výsledky podporili protizápalové, protinádorové a antioxidačné účinky fisetínu.

Niekoľko štúdií uvádza, že LPS indukuje fosforyláciu MAPK, vrátane ERK a JNK [35]. Okrem toho sa uvádza, že fisetín inhibuje migráciu a inváziu ľudských cervikálnych buniek znížením expresie uPA prostredníctvom potlačenia MAPK[36]. -fágov, je dostupných len málo správ týkajúcich sa účinku fisetínu na expresiu a aktivitu uPA a uPAR. Naša štúdia prvýkrát preukázala, že fisetín potláča expresiu uPA a uPAR indukovanú LPS prostredníctvom potlačenia signalizácie MAPK v makrofágoch, ako už bolo uvedené v rakovinových bunkách.

MMP sú rodinou proteáz, ktorých expresia súvisí s určitými procesmi, ako je vývoj, fyziológia a patológia. Všeobecne sa MMP-9 uznáva ako marker rôznych zápalových ochorení, ako je ateroskleróza, artritída a systémový lupus erythematosus [37]. Okrem toho MMP-9 bola úzko spojená s migráciou buniek [38,39]. Niekoľko štúdií uvádza najmä to, že MMP-2 a MMP-9 sa podieľajú na aterogenéze a zohrávajú dôležitú úlohu pri stabilizácii aterosklerotických plakov 40-42]. V tomto bode naše výsledky naznačujú, že inhibítory MMP-9 môže byť prísľubom ako terapeutický prístup na stabilizáciu zraniteľných plakov. Nedávne výskumy navyše ukázali, že hojenie rán na koži je narušené nadmernou aktiváciou MMP-9 [43]. Preto bolo navrhnuté, že fisetín má tiež potenciál ako terapeutický prístup na hojenie kože. Budú potrebné budúce štúdie na objasnenie podrobností o molekulárnych mechanizmoch.

Nedávnym trendom vo farmaceutickom priemysle je objavovanie stratégií na vývoj samotnej prírodnej rastliny ako nového lieku. Dve nedávne štúdie na zvieratách skutočne preukázali, že LPS-indukovaný akútny zápal pľúc a kolagénom indukovaná artritída sa zlepšili liečbou fisetínom |32,44. Ďalšia štúdia ex vivo tiež preukázala, že fisetín bol schopný zmierniť uvoľňovanie cytokínov indukované LPS z leukocytov pacientov s chronickou obštrukčnou chorobou pľúc alebo diabetom 2. typu (45). Na zmiernenie zápalových a autoimunitných ochorení bolo vyvinutých mnoho imunosupresívnych liekov[46-50]; napriek tomu väčšina zlúčenín vykazuje významné vedľajšie účinky. Keďže polyfenoly sú bežne prítomné v potravinovom ovocí a zelenine, pravdepodobne môžu byť bezpečnejšími imunosupresívami [51, 52]. Ovocie a zelenina obsahujú širokú škálu fytochemikálií vrátane seskviterpénových laktónov, terpenoidov, polysacharidov a fenolových zlúčenín. Naše výsledky, ktoré demonštrujú protizápalové, protinádorové a antioxidačné účinky fisetínu, silne naznačujú, že sa môže vyvinúť ako nový liek. Hoci je fisetín sľubným kandidátom na imunoterapiu, potenciál prírodných produktov obsahujúcich fisetín ako terapeutického činidla pre určité ochorenie je potrebné ďalej overovať v klinickom prostredí.

5. Závery

Táto štúdia preukázala, že fisetín zmiernil prírastkyzápalovégény (MCP-1, IL-1b a iNOS), produkciu NO a fosforyláciu MAPK, uPA, uPAR a MMP, indukovanú LPS v makrofágoch. Tieto výsledky naznačujú, že fisetín môže byť terapeutickým činidlom pre niekoľko chorôb súvisiacich s makrofágmi.