Ako extrakt z Cistanche znižuje zápalovú hyperpláziu
Mar 17, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Zníženie zápalovej hyperplázie v čreve u myší so sklonom k rakovine hrubého čreva pomocou vodného extraktu z Cistanche deserticola
Yamin Jia, 1,2 a kol
Cistanchedeserticola sa bežne používa v tradičnej čínskej medicíne na liečbu mnohých zdravotných problémov vrátane syndrómu dráždivého čreva alebo zápchy. Táto štúdia bola navrhnutá na testovanie účinnosti vodného extraktu C. deserticola pri prevencii kolorektálneho karcinómu na myšom modeli. Vodný extrakt C. deserticola bohatý na polysacharidy bol pripravený varením prášku z jeho stonky v destilovanej vode. Ako experimentálny model sa použili myši bez Tgfb1Rag2. Tu sme ukázali, že podávanie vodného extraktu C. deserticola výrazne znížilo počet slizníchyperpláziaa črevnej infekcie Helicobacter u myší. Tento priaznivý účinok koreloval s výraznou stimuláciou imunitného systému, o čom svedčí zväčšenie slezín so zvýšeným počtom slezinných makrofágov a prirodzených zabíjačských buniek a so silnejšou cytotoxicitou splenocytov. In vitro vodný extrakt C. deserticola zvýšil cytotoxicitu naivných splenocytov proti bunkovej línii ľudskej rakoviny hrubého čreva av makrofágových kultúrach zvýšil expresiu syntázy II oxidu dusnatého a stimuloval fagocytózu. Na záver, naše údaje naznačujú, že perorálne podávanie extraktu C. deserticola sa znižujezápalovéhyperplastickýpolypy a infekciu helicobacterom u myší svojou imunostimulačnou aktivitou, čo naznačuje, že extrakt z C. deserticola môže mať potenciál pri prevencii črevných zápalových porúch vrátane kolorektálneho karcinómu. Copyright © 2011 John Wiley & Sons, Ltd.
Kľúčové slová: bylinná imunomodulácia;Cistancheextrakt; polysacharidy; helicobacter;zápalovéhyperplázia; kolorektálny karcinóm.
Cistancheextraktmôže znížiťZápalovéhyperplázia
ÚVOD
Kolorektálny karcinóm je celosvetovo tretím najčastejším karcinómom u mužov a druhým u žien a je štvrtou najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu (8 percent všetkých úmrtí na rakovinu; Ferlay et al., 2010). Epidemiologické štúdie naznačujú, že mnohé rizikové faktory spojené s týmto ochorením, vrátane genetických (napr. rodinná anamnéza rakoviny hrubého čreva) (Strate a Syngal, 2005) a dietetických faktorov (napr. červené mäso a nízky obsah vlákniny; Chao a kol., 2005; Park a kol. al., 2005) azápalovéochorenia čriev (IBD; Eaden a kol., 2001; von Roon a kol., 2007; Lukas, 2010). K dnešnému dňu, napriek mnohým novým cytotoxickým liekom a zlepšeným chirurgickým a rádioterapeutickým technikám, ktoré sa používajú na liečbu tohto ochorenia (Cunningham et al., 2010), veľká časť pacientov s kolorektálnym karcinómom stále zostáva nevyliečiteľná; v roku 2008 sa celosvetovo odhaduje približne 608 000 úmrtí na túto chorobu (Ferlay et al., 2010). Preto sú potrebné nové terapie a jedným z kandidátov je imunoterapia. Na liečbu kolorektálneho karcinómu boli hodnotené rôzne imunoterapeutické prístupy a doterajšie výsledky sú povzbudivé (Burgdorf et al., 2009). Ukázalo sa, že rastlinné polysacharidy majú špecifické imunoregulačné aktivity (Jiang et al., 2010), čo naznačuje, že tieto rastlinné produkty by sa mohli použiť ako špecifické imunostimulačné adjuvans proti kolorektálnemu karcinómu.
Cistanchedeserticola Ma, známa ako Rou Cong Rong v čínskej bylinnej medicíne, bola zahrnutá do bylinných receptúr na mnohé zdravotné problémy, vrátane impotencie, chorobnej leukorey a syndrómu dráždivého čreva/zápchy (Jiang a Tu, 2009). Experimentálne štúdie odhalili rôzne biologické aktivity rôznych extraktov C. deserticola; extrakt fenyletanoidných glykozidov tejto bylinky má protiúnavovú aktivitu u myší (Cai et al., 2010) a analgetický a anti-zápalovéúčinky u hlodavcov (Lin et al., 2002), zatiaľ čo jeho polysacharidy stimulujú proliferáciu T- a B-lymfocytov v kultúrach lymfocytov (Wu et al., 2005; Dong et al., 2007). Účinnosť polysacharidového extraktu C. deserticola pri stimulácii imunitnej odpovede in vivo však zatiaľ nebola skúmaná.
Rag2-/-myšiam chýbajú zrelé T- a B-lymfocyty a na zmiešanom pozadí (~97 percent 129 S6 a ~3 percentá CF-1) sa spontánne vyvinú súvisiace so zápalomhyperpláziav čreve (Engle et al., 1999). Genetické zavedenie nulovej alely Tgfb1 (gén transformujúceho rastového faktora b1 (TGF-b1)) do tohto kmeňa myší vedie k ďalšej progresiihyperpláziana adenóm a karcinóm (Engle a kol., 2002) a patogénna kolitída závislá od mikroflóry je potrebná na rozvoj rakoviny hrubého čreva (Engle a kol., 2002), čo naznačuje, že tento kmeň myší poskytuje ideálny model pre skúmanie potenciálnej terapie pri liečbe zápalu/IBD-indukovaného kolorektálneho karcinómu. V tejto štúdii po prvýkrát demonštrujeme účinnosť vodného extraktu C. deserticola bohatého na polysacharidy pri znižovanízápalovéhyperpláziav tomto modeli.
MATERIÁLY A METÓDY
Vodný extrakt z prípravku C. deserticola bohatý na polysacharidy.
Bylinnú C. deserticola zozbieral Dr. Y. Guo (China Agricultural University) v autonómnej oblasti Vnútorné Mongolsko v Číne. Prášok celých sušených stoniek (300 g) sa dvakrát povaril v dvakrát destilovanej vode: najprv 1 hodinu v 500 ml vody, potom nasledoval odber supernatantu a potom 45 minút v 400 ml vody. Supernatanty sa po každom vare prefiltrovali cez filtračný papier Whatman (stredne rýchly) a spojili sa. Roztok extraktu sa vysušil lyofilizáciou a udržiaval sa pri 80 °C. Konečný produkt bol asi 10 g (výťažok: -3 percentá).
Myši a bunkové kultúry. Myši s deficitom TGF-b1 (Tgfb1 plus /- Rag2-/-) na zmiešanom pozadí (~97 percent 129 S6 a ~3 percentá CF-1) boli získané z chovnej kolónie udržiavanej v podmienkach bez patogénov v zariadení pre zvieratá vo Výskumnom centre Jacka Bella (Vancouver, BC). Tieto myši pochádzajú z úložiska Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) (National Cancer Institute at Frederick, MD, USA). Myši C57BL/6 J (B6) (samci, 8-10 týždňov staré) boli zakúpené od Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). Všetky zvieratá na experimenty boli po odstavení vo veku 4 týždňov chované v konvenčnom ustajnení a strave (5001 Rodent Diet, LabDiet) a bylinná liečba a odber vzoriek sa uskutočňovali v súlade s usmerneniami Kanadskej rady pre starostlivosť o zvieratá podľa
protokoly schválené Podvýborom pre používanie zvierat na University of British Columbia.
Bunková línia SW480 ľudského adenokarcinómu hrubého čreva aj myšacia leukemická makrofágová bunková línia RAW 246.7 sa pestovali v Dulbeccovom modifikovanom Eagleovom médiu (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) obsahujúcom 1{{13} percent fetálneho hovädzieho dobytka sérum (FBS) (kompletné médium DMEM) pri 37-C vo zvlhčenom 5% CO2/95% vzduchovom inkubátore. Splenocyty sa izolovali jemným rozdrvením fragmentov sleziny vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátom (PBS), po čom nasledovalo odstránenie erytrocytov pomocou lyzačného pufra (0,15 M NH4CI, 1,0 mM KHC03, 0,1 mM EDTA, pH 6,8). Po opätovnom premytí PBS sa splenocyty suspendovali v médiu RPMI 1640 doplnenom 10 percentami FBS (kompletné médium RPMI).
Cistancheextraktmôže znížiťZápalovéhyperplázia
Liečba extraktom.
Bylinný extrakt, tzvCistancheextraktv tejto štúdii bol nakoniec pripravený rekonštitúciou sušeného prášku sterilizovanou dvakrát destilovanou vodou a obsahoval 2–3 percentá (hmot.) fenyletanoidov, 65–70 percent (hmot.) polysacharidov a 0.6–1 percento (w/w) proteínu na základe nasledujúcich testov: počet fenyletanoidov bol stanovený absorbanciou pri 332 nm s použitím skôr opísanej spektrofotometrie (Ouyang et al., 2005); obsah polysacharidov sa meral pomocou štandardnej metódy fenolsírovej kyseliny (Dubois et al., 1956) po vyzrážaní etanolom; a proteín bol stanovený proteínovým testom Bio-Rad podľa protokolu výrobcu (Bio-Rad Lab, Hercules, CA, USA). Na základe našej pilotnej štúdie bola dávka extraktu Cistanche 0,4 g/kg/deň. Priemerný príjem vody na dospelú myš za deň bol približne 4 ml, a ak 1 ml pitnej vody obsahoval 3 mgCistancheextraktkaždá myš dostala orálne podanie 12 mg extraktu denne. Na základe skutočnosti, že priemerná telesná hmotnosť dospelej myši bola 30 g, pitná voda s obsahom 3 mg/mlCistancheextraktpodávali myšiam dávku 0,4 g/kg/deň. Myši boli liečené podávaním pitnej vody ad labium obsahujúcej 3 mg/mlCistancheextraktktorý sa dopĺňal najmenej raz za dva dni, od veku dvoch mesiacov počas troch mesiacov v klasickej miestnosti zariadenia starostlivosti o zvieratá.
Histologické hodnotenie kolorektálneho karcinómu.
Na konci trojmesačnej liečby sa odobrali tkanivá tenkého aj hrubého čreva a pozdĺžne sa otvorili, po čom nasledovalo jemné vypláchnutie obsahu PBS. Z každej myši bolo odobraných celkom šesť kusov (každý 2 cm dlhý) črevného tkaniva: tri z tenkého čreva v proximálnej, strednej a distálnej polohe; dva z hrubého čreva v proximálnej a distálnej polohe a jeden zo slepého čreva. Všetky tkanivá boli fixované v 10 percentnom formalíne a zaliate do parafínu. Každý rez bol zafarbený hematoxylínom a eozínom (HE) na histologické hodnotenie kolorektálneho karcinómu. Klasifikácia ochorenia bola vykonaná podľa patologických znakovhyperpláziaadenóm alebo karcinóm v každej vzorke, ako už bolo opísané (Engle a kol., 1999) spôsobom slepého testu. Celkový počet každej patologickej zmeny (hyperplázia, adenóm a karcinóm) sa počítali v dvoch rezoch črevného tkaniva pre každú myš.
Cistancheextraktmôže znížiťZápalovéhyperplázia
Detekcia Helicobacter hepaticus (H. hepaticus) vo výkaloch myší.
Na preskúmanie účinkuCistancheextraktna rast patologickej mikroflóry v čreve sa H. hepaticus vo výkaloch stanovil polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) s druhovo špecifickými 16S rDNA primérmi, ako už bolo opísané (Shames et al., 1995). Približne 200 mg čerstvého trusu sa rozpustili v 1 μl PBS a inkubovali sa pri 50 stupňoch počas 30 minút, potom nasledovala centrifugácia pri 8000 ot./min. počas 10 minút. Supernatant (200 ml) sa odobral a zmiešal s rovnakým množstvom roztoku proteinázy K obsahujúceho 5 percent (obj./obj.) 18,7 mg/ml roztoku proteinázy K (Fermentas Canada, Burlington, ON, Kanada) v digestívnom pufri (50 ul. μM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 M EDTA, 0,5 percenta dodecylsulfátu sodného) a inkubovali sa pri 70 °C počas 30 minút. DNA vo výslednom roztoku sa extrahovala pomocou súpravy QIAprep Miniprep podľa protokolu výrobcu (QIAGEN, Mississauga, ON, Kanada).
Amplifikácia bakteriálnej DNA pomocou polymerázovej reťazovej reakcie sa uskutočnila v zmesi obsahujúcej {{0}},75 μl 10 pufra PCR, 0,5μL 50 mM MgCl2, 0,5 μl každého priméru (sense: 5'-GCA TTT GAA ACT GTT ACT CTG; anti-sense: 5'-GGG GAGCUUGAAAACAG, každý 100 mM), 0,5 μl Taq polymerázy, 18,75 μl H2 bez nukleázy 1 μl nekvantifikovaného roztoku DNA zo stolice. Zmes PCR sa zahrievala na 94 stupňov počas 5 minút, nasledovalo 40 cyklov denaturácie pri 94 stupňoch počas 1 minúty, žíhanie pri 55 stupňoch počas 1,25 minúty a predlžovanie pri 72 stupňoch počas 1,5 minúty. PCR bola ukončená elongačným krokom 10 minút pri 72 stupňoch. Výsledný produkt PCR (25 ul) sa podrobil elektroforéze na 1% agarózovom géli v pufri Tris-acetát-EDTA (TAE) obsahujúcom 0,5 mg/ml etídiumbromidu a vizualizoval sa pod UV svetlom.
Stanovenie makrofágov a prirodzených zabíjačov (NK) buniek.
Percento makrofágov a NK buniek v suspenzii splenocytov sa určilo analýzou triedenia buniek aktivovaného fluorescenciou (FACS). Jeden milión splenocytov v FACS pufri sa inkuboval s vhodnou kombináciou protilátok pre rôzne fenotypy buniek v ľade: anti-CD3-fluoresceín izotiokyanát (FITC) a anti-CD49b-fykoerytrín (PE) (BD Biosciences, Mississauga, ON, ON, Kanada) pre CD3 CD49b plus NK bunky a potkania anti-myšia F4/80 plus ako primárna protilátka a anti-potkania IgG-FITC ako sekundárna protilátka (eBioscience, San Diego, CA, USA) pre F4/80 plus makrofágy. Intenzita fluorescencie pre každý typ buniek bola meraná pomocou prietokovej cytometrie a analyzovaná porovnaním s kontrolami pozadia pomocou softvéru CELLQUEST (BD Biosciences).
Test cytotoxicity kalceín-acetoxymetyl (kalceín-AM).
Lytická aktivita efektorových splenocytov proti cieľovým bunkám SW480 sa hodnotila testom cytotoxicity kalceín-AM s použitím systému spoločnej kultivácie, ako je opísané vyššie (Neri et al., 2001). Stručne povedané, bunky SW480 boli označené fluorescenčným farbivom kalceín-AM nasledovne: 1 x 106bunky/ml buniek SW480 v kompletnom médiu DMEM sa inkubovali s 15 uM kalceínu-AM pri 37 stupňoch za občasného pretrepávania. Po 30 minútach inkubácie sa bunky dôkladne premyli kompletným médiom DMEM, aby sa odstránilo extracelulárne farbivo. Fluorescenčným farbivom značené bunky SW480 v kompletnom médiu DMEM (0,2 x 106bunky/{{0}}.25 ml/jamka) sa naočkovali na 24-jamkové platne. Na základe rôznych pomerov (12:1, 6:1, 3:1 a 1,5:1) E (efektor): T (cieľ), splenocyty v 0,25 ml kompletného média RPMI na jamku sa pridali do jamiek s cieľovými bunkami v troch vyhotoveniach. Kokultúry boli inkubované pri 37 stupňoch v 5 percentách CO2 počas 24 hodín. Supernatanty sa zbierali po odstreďovaní platne pri 2000 otáčkach za minútu počas 5 minút. Uvoľňovanie kalceínu-AM do supernatantu sa stanovilo pomocou mikrodoštičkového spektrofluorimetra (Fluoroskan Ascent FL, Thermo Labsystems) pri emisii 527 nm pri excitácii pri 485 nm. Cieľové bunky, inkubované so zmesou 0,25 ml kompletného média DMEM a 0,25 ml kompletného média RPMI, sa použili ako kontrola pozadia alebo spontánneho uvoľňovania a v prítomnosti 2 percent sa použil Triton X-100 ako kontrola. ovládacie prvky maximálneho uvoľnenia. Cytotoxicita splenocytov sa vypočítala takto:
Meranie oxidu dusnatého (NO). Oxid dusnatý vylučovaný z buniek sa v kultivačnom médiu rýchlo oxidoval na dusitany. Preto boli koncentrácie dusičnanov v médiu stanovené pomocou Griessovej metódy ako meranie produkcie NO. bunky RAW264.7 (0,25 x 106
buniek/jamku v 0,5 ml kompletného média DMEM) v 24-jamkových doštičkách sa stimulovalo pomocouCistancheextrakt(50–200 mg/ml) a lipopolysacharid (LPS) (10 ng/ml) ako pozitívna kontrola. Po 24 hodinách pôsobenia sa 50 ml kultivačného supernatantu najskôr zmiešalo s 50 ml 1%
sulfanilamid v 5% kyseline fosforečnej v 96-jamkových platniach v troch vyhotoveniach a inkubovali sa 10 min, potom sa do každej jamky pridalo 50 ml 0,1% naftyletyléndiamíndihydrochloridu v destilovanej vode. Absorbancia sa odčítala pri 550 nm po inkubácii počas 10 minút a hladina NO/dusitanu sa vypočítala pomocou štandardnej krivky so známymi koncentráciami dusitanu sodného.
Cistancheextraktmôže znížiťZápalovéhyperplázia
Western blot.
Bunkové hladiny syntázy oxidu dusnatého II (NOS 2 alebo iNOS) sa skúmali pomocou Western blotu, ako už bolo opísané (Du et al., 2006). Stručne, vzorky proteínov (približne 100 mg/vzorka) sa frakcionovali 7 % SDS-PAGE a preniesli sa na nitrocelulózovú membránu. Proteínové pásy NOS II boli identifikované primárnou králičou polyklonálnou anti-NOS II protilátkou (N-20) (riedenie 1:500; Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA, USA) a sekundárnou kozou anti-králičou IgG protilátkou ( riedenie 1:10000, Vector Laboratory, Burlingame, CA, USA). Komplex NOS II proteín-protilátka bol vizualizovaný vylepšeným chemiluminiscenčným testom (ECL, Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Anglicko). Bloty boli znovu testované s použitím anti-b-aktín IgG (Sigma-Aldrich Canada, Oakville, ON, Kanada) na potvrdenie naneseného proteínu v každej vzorke.
Test fagocytózy. Fagocytóza sa merala množstvom fluorescenčne značených latexových guľôčok (SigmaAldrich Canada, L-3030, modifikované karboxylátom, priemerná veľkosť 2 mm) pohltených bunkami RAW264.7, ako je opísané vyššie (Wu et al., 2{{ 9}}07). Stručne povedané, bunky RAW264.7 (0,1 106 buniek/0,5 ml/jamka) v kompletnom médiu DMEM sa naočkovali na 24-jamkové platne a stimulovali sa 100 mg/mlCistancheextraktalebo kompletné médium DMEM len ako kontrola. Po stimulácii cez noc sa ku kultúram makrofágov pridalo 2,5 ml fluorescenčných latexových guľôčok na jamku a inkubovalo sa 2 hodiny. Na analýzu prietokovou cytometriou boli bunky oddelené pipetovaním po premytí v PBS a intenzita fluorescencie fagocytujúcich buniek bola meraná prietokovým cytometrom a analyzovaná porovnaním s kontrolami pozadia (bez guľôčok) pomocou softvéru CELLQUEST (BD Biosciences).
Štatistická analýza.
Údaje boli prezentované ako priemer plus štandardná odchýlka (SD). Analýza rozptylu (ANOVA) alebo Studentov t-test sa uskutočnili podľa potreby na porovnanie údajov medzi skupinami. Hodnota p < 0,05="" sa="" považovala="" za="">
VÝSLEDKY
Liečba sCistancheextraktznižuje frekvenciuhyperpláziaa infekcia čreva H. hepaticus Počas obdobia liečby (3 mesiace) sa telesná hmotnosť a príjem pitnej vody monitorovali raz za 2 dni u myší v skupine liečenej extraktom oproti skupine liečenej vehikulom, nebol žiadny významný rozdiel zaznamenané (údaje nie sú uvedené). Histologická analýza však ukázala, že perorálne podanieCistancheextraktyvýrazne znížil početzápalovéhyperpláziav čreve (obr. 1), o čom svedčí fakt, že myši prijímajúce vodu s extraktom ich mali menejhyperplázia(5.00 plus -2,83/myš, n=15), ako tí, ktorí pijú čistú vodu alebo vozidlo (7,53 plus -3,09/myš, n {{9 }}) (extrakt vs. vehikulum: p=0.0133, t-test). Rozdiel v počte adenómov a karcinómov medzi myšami liečenými extraktom a vehikulom nebol štatisticky významný, pretože len niekoľko myší malo tieto štádiá patologických zmien (údaje nie sú uvedené).
Obrázok 1. Zníženie výskytu hyperplázie ošetrením vodným extraktom C. deserticola (Cistancheextrakt). Tgfb1 plus /-Rag2-/- myši boli kŕmenéCistancheextraktv pitnej vode (skupina extraktov) v porovnaní s vodami s čistou pitnou vodou (skupina vozidiel). Rakovinové lézie v čreve boli vyšetrené histológiou s farbením H&E. (A) Typický obraz rezu zdravého tkaniva. (B) Typický obraz hyperplázie v reze označený šípkou. (C) Počet hyperplázií v čreve každého zvieraťa sa spočítal histológiou (p=0,0133, extrakt verzus vehikulum, n=15). Tento obrázok je dostupný vo farbe online na wileyonlinelibrary.com/journal/ptr
Ukázalo sa, že črevný mikrobiálny obsah, najmä infekcia H. hepaticus, je potrebný na rozvoj všetkých štádií rakoviny hrubého čreva vrátane hyperplázie u Rag2-/- myši (Engle a kol., 2002; Erdman a kol., 2003). Ak chcete zistiť, či liečba sCistancheextraktyznížená patologická mikroflóra v čreve, prítomnosť H. hepaticus vo výkaloch myší liečenýchCistancheextraktsa stanovila pomocou PCR v porovnaní s kontrolami s vehikulom. V každom experimente boli tri myši na klietku ošetrené extraktom Cistanche alebo vehikulom. Vzorky stolice sa odobrali na konci 14-h cez noc po vyčistení klietky. Ako je znázornené na obr. 2, 16S rDNA H. hepaticus vo výkaloch bola účinne detekovaná technikou PCR. V troch samostatných experimentoch (tabuľka 1) len 20–40 percent vzoriek zCistanche-extrakt-liečené myši boli detegované ako PCR pozitívne, zatiaľ čo 60–80 percent kontrolných skupín s vehikulom bolo pozitívnych (extrakt vs. vehikulum: p=0.0189, t-test, n=3), čo naznačuje, že liečba Extrakt z cistanche redukoval črevnú infekciu H. hepaticus u myší.
Liečba extraktom z Cistanche zvyšuje počet slezinných makrofágov a NK buniek
Imunitná odpoveď zohráva kľúčovú úlohu pri eliminácii infekcie helikobakterom. Ak chcete preskúmať, akCistanche extraktliečba ovplyvnila imunitný systém u týchto myší so sklonom k rakovine hrubého čreva, na konci liečby sa určila veľkosť slezín (12 myší v každej skupine) a počet splenocytov (šesť myší náhodne vybraných z každej skupiny). Sleziny 12 myší v každej skupine boli odvážené, ostatné tri myši v počiatočnom experimente neboli zahrnuté. Ako je znázornené v tabuľke 2,Cistanche-extrakt-liečené myši (0.055 plus -0,022 g/slezina) boli ťažšie ako v skupine s vehikulom (0,038 plus -0,01 g/slezina; extrakt vs. vozidlo: p=0.04, t-test). Tieto údaje boli ďalej podporené zvýšením počtu splenocytov u myší liečených sCistancheextrakt, označené ako 7,095 plus -1,353 (x106 bunky/slezina) v porovnaní s 2,941 plus -1,492 (x106bunky/slezina) kontrolné myši vo vehikule (extrakt vs. vehikulum: p=0.002, t-test).
Pre ďalšie vyhodnotenie čiCistancheextraktliečba ovplyvnila konkrétny podtyp splenocytov u myší, počet slezinných NK buniek (CD3-CD49bplusbunky) a makrofágy (FT/80plusbunky) sa spočítali pomocou FACS analýzy. Percento CD3-CD49bplusbunky v splenocytochCistanche-extrakt-u myší (32,06 plus -2,13 percent ) sa významne nelíšili od myší liečených vehikulom (28,47 plus -2,74 percent ; extrakt vs. vehikulum: p=0). 3741, t-test, n=6), ale celkový počet NK buniek v slezineCistanche-extrakt-liečené myši (2,22 plus - 0,44x106/slezina) bola vyššia ako kontrolná skupina vo vozidle (0,83 plus -0,17x106/slezina; extrakt vs. vehikulum: p=0.01, t-test, n=6; Obr. 3B). Podobné výsledky boli pozorované pri skúmaní buniek FT/80 plus v slezine; ako v populácii NK buniek v slezine, rozdiel v percentách slezinných buniek FT/80 plus medzi myšami ošetrenými extraktom (35,25 plus -7,28 percent) a kontrolnými myšami s vehikulom (31,74 plus -5). 07 percent ) nebolo významné (extrakt vs. vehikulum: p=0.407, n=6), ale celkový počet slezinových makrofágov v skupine liečenej extraktom (2,439 plus -0 0,452 x 106buniek/slezina) bola vyššia ako v kontrolných skupinách (1,114 plus -0,685x106bunky/slezina; extrakt vs. vehikulum: p=0.001, t-test, n=6; Obr. 3D). Celkovo tieto údaje naznačujú, že liečba sCistancheextraktmôže zvýšiť celkový počet, ale nie percento alebo podiel, podtypov efektorových splenocytov, NK buniek a makrofágov v slezinách.
Obrázok 3. Zvýšenie počtu slezinových NK buniek a makrofágov ošetrením sCistancheextrakt. NK bunky alebo makrofágy v suspenzii splenocytov boli stanovené analýzou FACS s kombinovaným farbením FITC-anti-CD3e protilátky a APC-anti-CD49b/Pan-NK bunkového markera (pre NK bunky) alebo s jediným farbením FITC-anti-CD3e. FT/80 (pre makrofágy). (A) Reprezentatívny graf percenta slezinných NK buniek (CD3-CD49bplus) v splenocytoch myší liečených sCistancheextraktoproti vozidlu. (B) Celkový počet NK buniek na slezinu. Údaje sú prezentované ako priemer plus -SD v každej skupine (p= 0.01, n= 6). (C) Reprezentatívny graf percenta slezinových makrofágov (FT/80 plus) v splenocytoch myší liečenýchCistancheextraktoproti vozidlu. (D) Celkový počet makrofágov na slezinu. Údaje sú prezentované ako priemer plus -SD v každej skupine (p= 0,001, n=6).
Liečba extraktom z Cistanche stimuluje cytotoxicitu splenocytov in vivo a in vitro
Imunitná odpoveď nezávisela len od počtu splenocytov, ale aj od ich funkcie, ako je napríklad cytotoxicita. ÚčinokCistancheextraktliečba na funkciu splenocytov (tj cytotoxicita) bola skúmaná v spoločných kultúrach s bunkami SW480. Ako je znázornené na obr. 4A, cytotoxicita splenocytov z myší liečených sCistancheextraktbola vyššia ako u buniek z myší ošetrených vehikulom, čo naznačuje 39,38 plus -2,64 percent uvoľnenia kalceínu-AM v kokultúrach splenocytov ošetrených extraktom s bunkami SW480 pri 6 pomer :1, 51,11 plus -2,6 percent pri pomere 3:1 a 57,33 plus -2,53 percent pri pomere 1,5:1 v porovnaní s 27.{25}},18 percent v kokultúrach splenocytov ošetrených vehikulom s bunkami SW480 v pomere 6:1, 40.97 =-2,85 percent v pomere 3:1 a 45,16 plus -0,18 percent v pomere pomer 1,5:1 (extrakt vs. vehikulum: p < 0,0001,="" dvojcestná="" anova).="" na="" ďalšie="" potvrdenie="" stimulačného="">Cistancheextraktna cytotoxicitu splenocytov, cytotoxicitu zCistanche-extraktNaivné splenocyty z myší B6, obsahujúce funkčné T a B bunky, sa skúmali v kokultúrach s bunkami SW480. Ako je znázornené na obr. 4B, pridanieCistancheextrakt(100 mg/ml) významne zvýšilo uvoľňovanie kalceínu-AM v kokultúrach spôsobom závislým od splenocytov: 57,64 plus -3,41 percent v pomere 12:1, 52,25 plus { {11}},77 percenta pri pomere 6:1 a 45,72 plus -2,43 percenta pri pomere 3:1 v porovnaní s 14,36 plus -0,05 percenta pri pomere 12:1 , 20,67 plus -2,03 percenta pri pomere 6:1 a 23,1 plus -3,73 percenta pri pomere 3:1 v nestimulovaných kokultúrach (extrakt vs. vehikulum: p < 0,0001,="" dva="" -spôsob="" anova).="" tieto="" výsledky="" tomu="">Cistancheextraktstimuluje lytickú aktivitu splenocytov. Dôvod, prečo bola pozorovaná menšia cytotoxicita, keď sa pridalo viac efektorových splenocytov, nie je známy. Jednou z možností bolo, že hladina uvoľňovania kalceínu-AM v tomto kokultivačnom systéme nemusí presne odrážať smrť cieľových buniek, pretože kalceín-AM by mohol byť po dlhej dobe inkubácie reabsorbovaný efektorovými splenocytmi.
Extrakt z cistanche aktivuje makrofágy
Aktivácia makrofágov je jednou z kritických imunitných reakcií proti infekcii a rozvoju nádoru (Mantovani et al., 2002, 2008). Aby sme ďalej odhalili pohľad na mechanizmy, ktorýmiCistancheextraktliečba znížená črevná hyperplázia a mikrobiálny obsah, účinok oCistancheextraktna produkciu NO a fagocytózu makrofágov sa skúmali bunky RAW264.7. Ako je znázornené na obr. 5A, expresia proteínu NOS II bola v kultúrach po inkubácii sCistancheextrakt. Tieto výsledky ešte podporilo zvýšenie produkcie NO v rStimulovaný extraktom cistanchekultúr (obr. 5B), doložené 3,88 plus -0,13 mM dusitanov v 50 mg/mlCistancheextraktstimulované bunkové kultúry RAW264.7 v porovnaní s 0.11 plus -0.12 mM dusitanov v nestimulovaných kontrolných kultúrach (jednosmerná ANOVA, s.<>
Fagocytóza je bunkový proces pohlcovania pevných častíc, ako sú baktérie. Ako je znázornené na obr. 5C a D, pridanieCistancheextraktystimulovaná fagocytóza makrofágov, čo naznačuje viac fagocytárnych buniek (9,8 plus -0,1 percenta) zistených vCistanche-extrakt-stimulované makrofágové kultúry v porovnaní s (5,2 plus -0,4 percenta) v kultúrach stimulovaných vehikulom (extrakt vs. vehikulum: p=0.0007, t-test, n=3) po 2 hodinách inkubácie. Tieto údaje tomu nasvedčujúCistancheextraktmôže priamo aktivovať makrofágy up-reguláciou lokálnej produkcie NO a stimuláciou fagocytózy makrofágov v čreve myší.
DISKUSIA
Táto štúdia po prvýkrát demonštruje, že perorálne podávanieCistancheextraktvýznamne znižuje frekvenciu hyperplázie a infekcie H. hepaticus v čreve myší so sklonom k rakovine hrubého čreva. Priaznivý účinokCistancheextraktliečba je spojená so zvýšením počtu a cytotoxicity slezinných NK buniek a makrofágov. Pridanie in vitroCistancheextraktstimuluje produkciu NO a fagocytózu v makrofágoch. Rag2 s deficitom TGF-b1-/-u myší sa preukázalo, že sa u nich vyvinula rakovina hrubého čreva (hyperplázia, adenóm alebo adenokarcinóm) vo veku od 3 do 6 mesiacov a preukázalo sa, žezápalovéložiská sú vždy spojené s týmito tumorogénnymi léziami (Engle et al., 1999). Ďalšie štúdie ukázali, že u týchto myší je potrebný rozvoj rakoviny hrubého čreva na prítomnosť infekcie patogénnou mikrobiálnou flórou, pretože rakovina hrubého čreva je úplne eliminovaná umiestnením myší v podmienkach bez mikróbov (Engle et al., 2002) a H. hepaticus infekcia tiež indukuje kolitídu a karcinóm hrubého čreva v Rag2-/-myši (Erdman a kol., 2003). Podobne u ľudí je mikrobiálny stav a imunita hostiteľa kľúčovými faktormi pre progresiu IBD (Fiocchi, 1998) a bolo hlásené, že karcinóm žalúdka je spojený s chronickou infekciou alebo zápalom vyvolaným H. pylori (Parsonnet et al., 1991; El-Omar a Malfertheiner, 2001). Zistenia z týchto štúdií naznačujú, že gastrointestinálna infekcia môže hrať kľúčovú úlohu vo vývoji rakoviny hrubého čreva. Zacielenie na gastrointestinálnu infekciu sa teda môže stať terapeutickou stratégiou na prevenciu alebo liečbu rakoviny hrubého čreva, ako aj IBD. Naša štúdia po prvýkrát demonštruje, že perorálne podávanieCistancheextraktznižuje frekvenciuzápalovéhyperpláziav čreve a počet H. hepaticus vo výkaloch u myší s deficitom TGF-b1. Priaznivý účinokCistanche extraktmôže byť spôsobené jeho aktiváciou makrofágov, čo sa prejavuje zvýšením produkcie NO a fagocytózy po liečbeCistancheextrakt(obr. 5), čo môže obmedzovať črevnú patogénnu mikroflóru vrátane helikobaktera (Mantovani et al., 2002, 2008). V dôsledku toho sa léziazápalovéhyperpláziabola znížená.
V extraktoch C. deserticola boli identifikované rôzne bioaktívne zlúčeniny vrátane fenyletanoidových glykozidov a polysacharidov (Jiang a Tu, 2009). Fenyletanoidové glykozidy sú cytoprotektívne, čo naznačuje skutočnosť, že tieto zlúčeniny zabraňujú bunkovej smrti v kultivovaných hepatocytoch a neurónoch cerebelárnych granúl (Xiong et al., 1998; Pu et al., 2003). Zatiaľ čo polysacharidy stimulujú mitogénom indukovanú proliferáciu T- a B-lymfocytov (Wu a Tu, 2005; Wu a kol., 2005; Dong a kol., 2007). Bolo dobre zdokumentované, že rastlinné polysacharidy modulujú imunitnú odpoveď (Jiang et al., 2010).Cistancheextraktobsahuje 2–3 percentá fenyletanoidov a 65–70 percent polysacharidov, čo naznačuje, že imunomodulačný účinokCistancheextraktliečba môže byť spôsobená imunoregulačnou aktivitou polysacharidov, väčšiny bioaktívnych látok v extrakte Cistanche. Avšak jeho cieľové imunitné bunky (napr. makrofágy alebo NK bunky alebo oboje) a molekulárne dráhy vyžadujú ďalšie skúmanie. Nedávna štúdia navyše ukazuje, že podávanie rastlinného fenyletanoidného acetonidu, jedného z bioaktívnych fenyletanoidov v extrakte C. deserticola (Xiong a kol., 1996; Jiang a Tu, 2009), má priaznivý vplyv na zníženie dextránu kolitída vyvolaná síranom sodným u myší (Hausmann et al., 2007), čo dokazuje, že fenyletanoidy (2–3 percentá) vCistancheextraktmôže aspoň čiastočne prispieť k jeho účinnosti pri znižovanízápalovéhyperplázia, čo si vyžaduje aj vyhodnotenie v budúcnosti.
Záverom možno povedať, že kolorektálny karcinóm je celosvetovo jedným z najrozšírenejších druhov rakoviny a vo väčšine prípadov sa mu dá predísť. Použitie netoxických bylinných extraktov môže ponúknuť účinnú stratégiu na prevenciu rozvoja rakoviny hrubého čreva a konečníka a môže sa tiež použiť ako chemo-adjuvans, čo môže prospieť zvýšeniu chemoterapeutickej protirakovinovej účinnosti a/alebo zníženiu chemoterapeutickej účinnosti. vedľajšie účinky. Údaje prezentované v tejto štúdii jasne ukazujú, že ošetrenie vodným extraktom C. deserticola znižuje hyperpláziu a infekciu H. hepaticus v čreve myší náchylných na rakovinu hrubého čreva. Helicobacter infekcia alebo črevozápalhyperpláziaje rizikovým faktorom pre rozvoj kolorektálneho karcinómu. Naša súčasná štúdia naznačuje, že použitie tejto byliny môže mať potenciál na prevenciu a liečbu kolorektálneho karcinómu, najmä u tých jedincov, ktorí majú IBD.
Poďakovanie
YM bol podporený postgraduálnym študentským štipendiom od China Scholarship Council.
Konflikt záujmov
Autori nemajú konflikt záujmov.
Cistancheextraktmôže znížiťZápalovéhyperplázia
Od: „ZníženieZápalovéHyperpláziav čreve u myší náchylných na rakovinu hrubého čreva pomocou vodného extraktuCistanchedeserticola od Yamin Jia, 1,2 a kol
---Autorské práva © 2011 John Wiley & Sons, Ltd. Phytother. Res. 26: 812–819 (2012) DOI: 10.1002/ptr.3637
LITERATÚRA
Burgdorf SK, Nielsen HJ, Rosenberg J. 2009. Imunoterapia pri kolorektálnom karcinóme. Scand J Gastroenterol 44: 261-268.
Cai RL, Yang MH, Shi Y, Chen J, Li YC, Qi Y. 2010. Protiúnavová aktivita extraktu bohatého na fenyletanoidy zCistanchedeserticola. Phytother Res 24: 313-315.
Chao A, Thun MJ, Connell CJ a kol. 2005. Konzumácia mäsa a riziko kolorektálneho karcinómu. JAMA 293: 172–182.
Cunningham D, Atkin W, Lenz HJ a kol. 2010. Kolorektálny karcinóm. Lancet 375: 1030–1047.
Dong Q, Yao J, Fang JN, Ding K. 2007. Štrukturálna charakterizácia a imunologická aktivita dvoch polysacharidov extrahovateľných studenou vodou zCistanchedeserticola YC. Ma. Carbohydr Res 342: 1343-1349.
Du C, Guan Q, Diao H, Yin Z, Jevnikar AM. 2006. Oxid dusnatý indukuje apoptózu v renálnych tubulárnych epiteliálnych bunkách prostredníctvom aktivácie kaspázy-8. Am J Physiol Renal Physiol 290: F1044-1054.
Dubois M, Gilles KAJK, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. 1956. Kolorimetrické metódy na stanovenie cukrov príbuzných látok. Anal Chem 28: 350-356.
Eaden JA, Abrams KR, Mayberry JF. 2001. Riziko kolorektálneho karcinómu pri ulceróznej kolitíde: metaanalýza. Črevo 48: 526-535.
El-Omar EM, Malfertheiner P. 2001. Helicobacter pylori a rakovina žalúdka. Curr Opin Gastroenterol 17 (Suppl 1): S24-S27.
Engle SJ, Hoying JB, Boivin GP, Ormsby I, Gartside PS, Doetschman T. 1999. Transformujúci rastový faktor beta1 potláča nemetastatickú rakovinu hrubého čreva v ranom štádiu tumorigenézy. Cancer Res 59: 3379-3386.
Engle SJ, Ormsby I, Pawlowski S, a kol. 2002. Eliminácia rakoviny hrubého čreva u myší s deficitom bezmikróbneho transformujúceho rastového faktora beta 1-. Cancer Res 62: 6362-6366.
Erdman SE, Poutahidis T, Tomczak M, a kol. 2003. CD4 plus CD25 plus regulačné T lymfocyty inhibujú mikrobiálne indukovanú rakovinu hrubého čreva u Rag2-deficientných myší. Am J Pathol 162: 691-702.
Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers C, Parkin DM. 2010. Odhady celosvetovej záťaže rakovinou v roku 2008: GLOBOCAN 2008. Int J Cancer 127: 2893–2917.
Fiocchi C. 1998.Zápalovéochorenie čriev: etiológia a patogenéza. Gastroenterology 115: 182–205.
Hausmann M, Obermeier F, Paper DH a kol. 2007. In vivo liečba bylinným fenyletanoidným akteozidom zlepšuje črevný zápal pri kolitíde vyvolanej dextránsulfátom sodným. Clin Exp Immunol 148: 373-381.
Jiang MH, Zhu L, Jiang JG. 2010. Imunoregulačné účinky polysacharidov z čínskej bylinnej medicíny. Expert Opin Ther Targets 14: 1367–1402.
Jiang Y, Tu PF. 2009. Analýza chemických zložiek vCistanchedruhov. J Chromatogr A 1216: 1970–1979.
Lin LW, Hsieh MT, Tsai FH, Wang WH, Wu ČR. 2002. Antinociceptívne a anti-zápalovéčinnosť spôsobenáCistanchedeserticola u hlodavcov. J Ethnopharmacol 83: 177–182.
Lukáš M. 2010.Zápalovéochorenie čriev ako rizikový faktor pre kolorektálny karcinóm. Dig Dis 28: 619–624.
Mantovani A, Allavena P, Sica A, Balkwill F. 2008. Zápal súvisiaci s rakovinou. Príroda 454: 436–444.
Mantovani A, Sozzani S, Locati M, Allavena P, Sica A. 2002. Polarizácia makrofágov: makrofágy spojené s nádorom ako paradigma pre polarizované mononukleárne fagocyty M2. Trends Immunol 23: 549-555.
Neri S, Mariani E, Meneghetti A, Cattini L, Facchini A. 2001. Test cytotoxicity kalceín-acetoxymetyl: štandardizácia metódy umožňujúcej ďalšie analýzy získaných efektorových buniek a supernatantov. Clin Diagn Lab Immunol 8: 1131–1135.
Ouyang J, Wang XD, Zhao B, Wang YC. 2005. Zlepšená produkcia fenyletanoidných glykozidov oCistanchedeserticola bunky kultivované v bioreaktore s vnútornou slučkou airlift s preosievacou stúpačkou. Enzyme Microb Technol 36: 982-988.
Park Y, Hunter DJ, Spiegelman D a kol. 2005. Príjem vlákniny a riziko kolorektálneho karcinómu: súhrnná analýza prospektívnych kohortových štúdií. JAMA 294: 2849–2857.
Parsonnet J, Friedman GD, Vandersteen DP a kol. 1991. Infekcia Helicobacter pylori a riziko karcinómu žalúdka. N Engl J Med 325: 1127-1131.
Pu X, Song Z, Li Y, Tu P, Li H. 2003. Akteozid zCistanchesalsa inhibuje apoptózu 1-metyl-4-fenylpyridíniovým iónom v neurónoch cerebelárnych granúl. Planta Med 69: 65–66.
Shames B, Fox JG, Dewhirst F, Yan L, Shen Z, Taylor NS. 1995. Identifikácia rozšírenej infekcie Helicobacter hepaticus vo výkaloch v komerčných kolóniách myší kultiváciou a testom PCR. J Clin Microbiol 33: 2968-2972.
Strate LL, Syngal S. 2005. Hereditárne syndrómy kolorektálneho karcinómu. Cancer Causes Control 16: 201–213.
Von Roon AC, Reese G, Teare J, Constantinides V, Darzi AW, Tekkis PP. 2007. Riziko rakoviny u pacientov s Crohnovou chorobou. Dis Colon Rectum 50: 839–855.
Wu TF, Hsu CY, Huang HS, Chou SP, Wu H. 2007. Proteomická analýza účinkov pycnogenolu v makrofágu RAW 264.7 odhaľuje indukciu expresie katepsínu D a zosilnenie fagocytózy. J Agric Food Chem 55: 9784-9791.
Wu XM, Gao XM, Tsim KW, Tu PF. 2005. Arabinogalaktán izolovaný zo stoniekCistanchedeserticola vyvoláva proliferáciu kultivovaných lymfocytov. Int. J. Biol. Macromol. 37: 278-282.
Wu XM, Tu PF. 2005. Isolation and characterization of alpha-(1-->6)-glukány zCistanchedeserticola. J Asian Nat Prod Res 7: 823-828.
Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Tani T, Namba T, Kadota S. 1998. Hepatoprotektívna aktivita fenyletanoidov zCistanchedeserticola. Planta Med 64: 120–125.
Xiong Q, Kadota S, Tani T, Namba T. 1996. Antioxidačné účinky fenyletanoidov z r.Cistanchedeserticola. Biol Pharm Bull 19: 1580–1585.
