ČASŤ Ⅱ: SARS-CoV-2 Infekcia u modelu sýrskeho škrečka spôsobuje zápal, ako aj dysreguláciu interferónu typu I v respiračných aj nerespiračných tkanivách vrátane srdca a obličiek
Mar 18, 2022
pre viac informácií:{0}}
Magen Ellen Francis, Una Goncin a kol.
KLIKNITE SEM PRE PARTNERSTVO Ⅰ
Abstraktné
COVID-19(koronavírusové ochorenie 2019) spôsobenéSARS-CoV-2(závažný akútny respiračný syndróm koronavírus 2) infekcia je ochorenie postihujúce viaceré orgánové systémy. Model, ktorý zachytáva všetky klinické príznakyCOVID-19, ako aj dlhotrvajúce ochorenie. Skúmali sme reakcie hostiteľa spojené s infekciou v niekoľkých hlavných orgánových systémoch vrátane dýchacieho traktu, srdca aobličkypoSARS-CoV-2infekcia u sýrskych škrečkov. Zistili sme významné zvýšenie zápalových cytokínov (IL-6, IL-1beta a TNF) a interferónov typu II, zatiaľ čo interferóny typu I boli inhibované. Vyšetrenie mimopľúcneho tkaniva poukázalo na zápal vobličkypečeň a srdce, ktorým tiež chýbala zvýšená regulácia interferónu typu I. Histologicky malo srdce známky myokarditídy a mikrotrombovobličkymal tubulárny zápal. Tieto výsledky poskytujú pohľad na multiorgánové ochorenie, ktoré zažívajú ľudia sCOVID-19a možno predĺžené ochorenie u ľudí s postakútnymi následkamiSARS-CoV-2(PASC). Infekcia koronavírusom 2) môže postihnúť niekoľko orgánových systémov vrátane dýchacích ciest, močových ciest, neurologického systému a kardiovaskulárneho systému. Na správne štúdium tohto ochorenia a vyhodnotenie terapeutík, model, ktorý zachytáva všetky klinické symptómyCOVID-19sa vyžaduje. Je známe, že poškodenie, ku ktorému dochádza po vírusovej infekcii, je často spôsobené vlastnými imunitnými odpoveďami hostiteľa. Preto sme tu skúmali, ako sú imunitné hostiteľské reakcie regulované v niekoľkých hlavných orgánových systémoch vrátane dýchacieho traktu, srdca aobličkypoSARS-CoV-2infekcia u sýrskych škrečkov. Zistili sme významné zvýšenie zápalových cytokínov (IL-6, IL-1beta a TNF), ako aj antivírusových cytokínov, nazývaných interferóny typu I. Je zaujímavé, že interferóny typu I antivírusovej odpovede boli inhibované v dýchacom trakte. Vyšetrenie mimopľúcneho tkaniva poukázalo na zápal vobličkypečeň a srdce, ktorým tiež chýbala zvýšená regulácia interferónu typu I. Histologicky malo srdce známky myokarditídy a mikrotrombovobličkymal tubulárny zápal. Tieto výsledky poskytujú pohľad na multiorgánové ochorenie, ktoré zažívajú ľudia sCOVID-19a možno predĺžené ochorenie u ľudí s postakútnymi následkamiSARS-CoV-2(PASC).
Click to Cistanche používa na funkciu obličiek
Infekcia SARS-CoV-2 má za následok významný zápal alebo imunitnú reguláciu v srdci, lymfatických uzlinách a slezine, ako aj eozinofilné znaky v hrubom čreve
Imunitné markery zápalu, adaptívnej imunity a antivírusové reakcie sa hodnotili aj v tkanivách bez dýchania spolu s histopatológiou tkanív. Vyšetrili sme mediastinálnu lymfatickú uzlinu, srdce,obličkyslezinu, pečeň a hrubé črevo na reguláciu imunitných cieľov kategorizovaných ako je uvedené vyššie podľa IFN typu I, typu II/všeobecná odozva IFN a vrodených/adaptívnych mediátorov (obr. 6), ako aj pre imunopatológiu (obr. 7 a S4). Ak počiatočné hodnotenie histopatológie naznačovalo zapojenie špecifických imunitných mechanizmov (obr. S4), vykonalo sa skenovanie s vysokým rozlíšením, aby sa získala väčšia hĺbka informácií (obr. 7). Mediastinálne lymfatické uzliny nebolo možné obnoviť na 15. deň. Zodpovedajúce významy pre génovú expresiu možno nájsť v tabuľke S2. Reakcie IFN typu I a typu II vo všetkých mimopľúcnych orgánoch okrem pečene mali podobné profily regulácie ako v pľúcach a nosových mušľách (obr. 6). Génová regulácia bola charakterizovaná zníženými odpoveďami typu I a zvýšením reakcií typu II. STAT2 bol významne znížený v mediastinálnej lymfatickej uzline,obličky, slezina a hrubé črevo. Srdce malo významný a trvalý pokles IRF1, zatiaľ čo hrubé črevo malo pokles IFN-beta (obr. 6). Naopak, výrazné zvýšenie IFN-gama bolo pozorované v mediastinálnej lymfatickej uzline aobličkyav menšom rozsahu v srdci a slezine. CXCL10, chemoatraktant T buniek, sa zvýšil na vysoké hladiny v slezine, pečeni a mediastinálnej lymfatickej uzline, kde bola regulácia v lymfatickej uzline dvojfázová (obr. 6). Regulácia vrodených/adaptívnych mediátorových génov v slezine a lymfatických uzlinách bola pozorovaná u všetkých skúmaných imunitných cieľov s výnimkou TGF-beta, IL-5R a CCR3, ktoré neboli účinne regulované. Konkrétne významná regulácia CD3, CD4, CD8A, IL-2, IL-21, IL-10, IL-4, IL-5, IL{{13 }} a IL-12 bola zaznamenaná v týchto sekundárnych imunitných orgánoch. Regulácia vrodených/adaptívnych imunitných mediátorov bola obzvlášť zaujímavá v srdci, kde sa IL-2, IL-10, IL-4 a IL{18}} zvýšili 100-krát nad základnú hodnotu . Najvyššia upregulácia zápalových cytokínov bola zistená v srdci, po ktorom nasledovali obličky, pečeň a mediastinálne lymfatické uzliny. V srdci sa IL-12 významne zvýšil skoro a spolu s TNF zostal zvýšený na 15. deň pi. IL-6 a IL{23}}beta boli tiež prechodne indukované v srdcovom tkanive v dňoch 5 a 8 (obr. 6). Histologickou analýzou boli pozorované významné zmeny v srdci (obr. S4). Zobrazovanie s vysokým rozlíšením našlo dôkaz mikrotrombov (obr. 7A, biele šípky), ako aj myokarditídu (obr. 7B, biele šípky) v srdci. CD14, IL-1beta a TNF boli upregulované skoro v obličkách, ale znížili sa o deň 8 na 12 pi (obr. 6), čo sa zhodovalo s infiltráciou zápalových buniek do obličiek a možno s akútnym poškodením obličiek alebo tubulárnym poškodením (indikované bielymi šípkami, obr. 7C). Expresia IL-6 sa udržala v pečeni, kde bol IL-1beta tiež zvýšený v neskorých časových bodoch. Mediastinálna lymfatická uzlina mala bifázický nárast IL-12 s prechodným zvýšením IL-6 a TNF na násobok hladín 12, 8 a 11, v uvedenom poradí. Hrubé črevo malo významnú reguláciu IL-5, IL{45}}R a CCR3 s infiltráciou eozinofilov (obr. 7D), ale minimálnu reguláciu akýchkoľvek iných vrodených/adaptívnych mediátorov. Na doplnenie analýzy mimopľúcnych orgánov sme analyzovali chémiu krvi zvierat v priebehu času, aby sme vyhodnotili dysfunkciu orgánov (obr. S5). Ako znak funkcie pečene sme analyzovali glukózu, albumín, alkalickú fosfatázu, alanín transferázu, dusík močoviny v krvi, celkový bilirubín a celkový proteín [27]. Na hodnotenie obličiek sa analyzoval vápnik, draslík, albumín, amyláza, dusík močoviny v krvi a celkový proteín [27]. Gastrointestinálne zdravie bolo hodnotené pomocou sodíka, draslíka a alkalickej fosfatázy[27]. Srdcová funkcia bola meraná pomocou sodíkovej, draselnej a alanín transferázy [27]. Zvýšená regulácia globulínu bola hodnotená ako znak antigénnej stimulácie[27]. Zo 14 skúmaných molekúl boli iba amyláza a glukóza významne zvýšené u infikovaných zvierat v porovnaní s kontrolami, pričom vrchol dosiahli 1700 U/l a 280 mg/dl, v danom poradí, v deň 8 pi. Okrem toho zmeny koncentrácie draslíka ([K plus ]) boli najpozoruhodnejšie a zdalo sa, že väčšinou súviseli s časom počas štúdie, pretože väčšina jedincov mala zvýšenie [K plus] s najväčšou zmenou pozorovanou na 15. deň. v albumíne bola tiež pozoruhodná, ale mierna u mnohých zvierat. Celková koncentrácia proteínu sa u väčšiny subjektov mierne zvýšila, ale zmena je relatívne mierna a pravdepodobne klinicky nevýznamná. Ostatné pečeňové markery dosiahli vrchol neskôr v priebehu, vrátane glukózy (280 mg/dl) na 8. deň, alkalickej fosfatázy (ALP) na 12. deň (3 U/l) a dusíka močoviny v krvi (BUN) (22 mg/dl) na 15. deň. Alanín transferáza (ALT), hoci vrcholila na 2. deň, bola vysoká na 12. deň tesne pod 100 U/l, čo naznačuje možné poškodenie pečene. Obličkové markery tiež dosiahli vrchol neskôr, na 8. deň pre amylázu (1700 U/l) a na 15. deň pre draslík a BUN (12 a 22 mg/dl, v danom poradí). BUN mal až na niekoľko výnimiek možné časovo závislé zvýšenie koncentrácie. Vápnik, naopak, vrcholil na 2. deň pri 2,6 mg/dl, ale spadol do referenčných rozsahov. Markery gastrointestinálneho a srdcového zdravia, ako je sodík, vykazovali minimálnu reguláciu, zatiaľ čo [K plus ] sa zvyšovalo relatívne lineárne počas infekčného časového priebehu, s vrcholom na 15. deň (12 mg/dl). ALP (gastrointestinálny marker) bol vysoký na 5. a 8. deň pri 3 u/l a ALT (kardiálny marker) bol zvýšený u infikovaných škrečkov v porovnaní s neinfikovanými škrečkami na 2., 8. a 12. deň pri 75–100 U/l, ale rozdiely neboli významné. Nakoniec, globulín vyvrcholil v deň 2 pri 0,6 g/dl a klesal relatívne lineárne v priebehu času. Súhrnne povedané, analýza krvi naznačuje určitú dysreguláciu v mimopľúcnych orgánoch, ako aj antigénnu stimuláciu v reakcii naSARS-CoV-2.
Obr. 6. Infekcia SARS-Cov{2}} u škrečkov vedie k zvýšeniu počtu zápalových génov a génov súvisiacich s imunitným mediátorom vo vybraných extrapulmonálnych orgánoch, čo môže naznačovať myokarditídu, adaptívnu imunitnú evolúciu a infiltráciu eozinofilov do hrubého čreva.qRT-PCR bola vykonaná na RNA extrahovanej z mediastinálnej (M) lymfatických uzlín, srdca, obličiek, sleziny, pečene a hrubého čreva zSARS-CoV-2naočkované škrečky. Vo vzorkách sa hodnotila odpoveď súvisiaca s interferónom typu I (IFN-beta, STAT2, IRF1, IRF3, TLR3), súvisiaca s odpoveďou na interferón typu II (IFN-gama, IRF2, STAT1, CXCL10) a vrodená/ adaptívny mediátor (CD3, CD4, CD8, CD19, IL-2, TGF-beta, IL-21, IL-10, IL-4, IL-5, IL-5R, IL-13, IL-12, CD14, CCR3, PKR, CCL20, CCL22, IL-1beta, IL-6, TNF) gény využitie PCR primerov špecifických pre škrečie sekvencie (tabuľka 1). Zmena násobku bola vypočítaná prostredníctvom ACt oproti základnej línii (deň 0) s BACT ako housekeeping génom. N je 3 pre všetky časové body.
Diskusia
PôvodneSARS-CoV-2Predpokladalo sa, že infekcia spôsobuje hlavne respiračné ochorenie, ale teraz je jasné, žeCOVID-19je ochorenie mnohých tvárí postihujúce viaceré orgánové systémy[25,26]. Aby sme lepšie pochopili pôvod choroby a nespočetné množstvo klinických symptómov, ktoré sa vyskytli u ľudí, skúmali sme imunopatológiu naprieč dýchacím traktom, ako aj nerespiračnými orgánmi počasSARS-CoV-2infekcia u sýrskych škrečkov. Infekcia s 105 TCID50SARS-CoV-2vyústilo do mierneho až stredného klinického ochorenia. Infekčný vírus bol obsiahnutý hlavne v dýchacom trakte, hoci vírusová RNA bola prítomná vo všetkých hodnotených tkanivách. Profilovanie odpovede hostiteľa v dýchacom trakte identifikovalo inhibíciu odpovede IFN typu I so súčasným zvýšením IFN typu II, zápalových cytokínov, vrodených a adaptívnych cytokínov. Vyšetrenie mimopľúcnych orgánov tiež zistilo podobný profil pre signalizáciu IFN typu I a II; bola však identifikovaná aj tkanivovo špecifická imunitná regulácia. Konkrétne bola identifikovaná významná expresia vrodených a adaptívnych mediátorov v srdci a slezine. Od antivírusovej liečby počasSARS-CoV-2infekcia je účinná len počas krátkeho obdobia[28], závažnáCOVID-19sa považuje za dôsledok dysregulovanej imunitnej odpovede[29]. Pochopenie imunitnej patogenézy je nevyhnutné na identifikáciu terapeutických cieľov a liečbu akútnych nerespiračných symptómov spojených sCOVID-19vrátane búšenia srdca alebo migrény a dlhšie trvajúcich stavov vo fáze zotavovania, ako sú postakútne následkySARS-CoV-2infekcia (PASC), označovaná aj ako long-COVID[30].
Obr. 7. Vybrané mimopľúcne orgány majú odlišnú patológiu po infekcii SARS-CoV-2 s dôkazmi mikrotrombov a myokarditídy v srdci, tubulárnym poškodením v obličkách a infiltráciou eozinofilov v hrubom čreve.Srdce, obličky a hrubé črevo boli odobraté z každého zvieraťa pri pitve a fixované v 10 percentnom formalíne pred zaliatím parafínovým blokom. Tkanivá boli zafarbené H&E. Srdcové tkanivá vykazovali mikrotromby (biele šípky) počas niekoľkých dní (A), ako aj myokarditídu na 8. deň (biela šípka) (B). Oblička mala akútne poranenie/tubulárne poškodenie (biele šípky) (C). Hrubé črevo malo infiltráciu eozinofilmi (biele šípky) (D). Zafarbené tkanivá sa vizualizovali a zobrazili pomocou skenera sklíčok Aperio ScanScope XT. Zobrazené obrázky reprezentujú 3 zvieratá na skupinu a časový bod.
Primárne miesto infekcie ovplyvňujúce prenos preSARS-CoV-2u ľudí je dýchací trakt. Pôvodným zameraním nášho výskumu bol preto dýchací trakt vrátane súvisiacich imunitných reakcií a imunopatológie. Tu sme demonštrovali infekciu horných aj dolných dýchacích ciest a súvisiace ochorenie po infekcii SARS-CoV-2 u sýrskych škrečkov. Vírusová infekcia v pľúcach viedla k závažnej patológii charakterizovanej infiltráciou zápalových buniek, čo malo za následok bronchopneumóniu na 5. deň pi a krvácanie na 8. deň. Tieto zistenia boli v súlade s infekciou SARS-CoV-2 v predchádzajúcich štúdiách so sýrskymi škrečkami[19, 20,31,32] a väčšie zvieracie modely vrátane makakov rhesus[33], ako aj ťažkú pneumóniu identifikovanú u niektorých ľudíCOVID-19pacientov[34-36]. Konzistentnosť údajov podporuje použitie škrečka na modelovanieSARS-CoV-2infekcie dýchacích ciest u ľudí a súvisiacej imunopatológie. Tiež sme zaznamenali, že niektoré škrečky zaznamenali väčší úbytok hmotnosti, ktorý koreloval s vyššou vírusovou záťažou. Rozdielna hmotnosť mohla byť spôsobená prirodzeným inštinktom škrečkov skrývať potravu vo svojich lícach, neefektívnym očkovaním alebo tým, že existujú inherentné vlastnosti hostiteľa, ktoré môžu viesť k rozdielnemu úbytku hmotnosti a vírusovej replikácii v tomto zvieracom chove. Pretože všetky zvieratá boli skontrolované na skladovanie potravy v ich ústach a všetky zvieratá boli pozitívne naSARS-CoV-2vírus, nemáme pocit, že tento výsledok je odrazom chýb váženia alebo zlého očkovania. Je potrebné viac práce, aby sa zistilo, či existujú genetické rozdiely medzi sýrskymi škrečkami z Charles River. Pochopenie čistoty zvierat poskytne dôležité informácie pre použitie týchto zvierat v terapeutických štúdiách SARS-CoV-2 a ak je možné využiť tieto poznatky na vývoj závažnejšieho škrečkaSARS-CoV-2Model. V našej štúdii sme tiež identifikovali upreguláciu kľúčových zápalových génov, ako sú IL{0}} a TNF v pľúcach a nosových mušľách, čo potvrdzuje predchádzajúce imunitné modelovanie u škrečkov [32,37]. Tieto zistenia sú dôležité, pretože sa ukázalo, že tieto zápalové markery sú prediktormi závažného ochorenia prostredníctvom hodnotenia krvi u ľudí[38-42]. Hlbšia analýza reakcie hostiteľa na SARS-CoV-2 v dýchacích tkanivách škrečkov bola vykonaná pomocou analýzy sekvenovania transkriptómov[43,44]. Hoagland a kolegovia hodnotili pľúca oSARS-CoV-2infikovaných škrečkov na reguláciu imunitných génov hostiteľa a zistili výraznú upreguláciu IL-6, TNF a IL-1beta[43] v súlade s našimi výsledkami PCR. V inej štúdii analýza jednobunkového sekvenovania odhalila výraznú reakciu T buniek vrátane upregulácie IFN-gama a IL-2[44], dvoch markerov, o ktorých sme tiež zaznamenali, že sú vysoko exprimované v pľúcach. Okrem toho naše analýzy pľúc odhalili upreguláciu T bunkových markerov CD3, CD4 a CD8A. Dôležité je, že analýza qRT-PCR, o ktorej sme informovali v našej súčasnej štúdii, je v súlade s týmito ďalšími štúdiami, čím sa potvrdzuje použitie qRT-PCR ako metódy na rýchle posúdenie účinnosti vakcín a terapeutík, ktoré sa hodnotia u škrečkov SARS-CoV{{ 13}} model. Naše profily qRT-PCR poskytujú cielené biomarkery, ktoré možno ľahko použiť. Naša štúdia a interpretácia boli obmedzené iba prítomnosťou analýzy patogenézy. Budúce štúdie by mali využiť náš panel imunitných cieľov na použitie vo vakcínach a terapeutických štúdiách.
Antivírusová odpoveď je nevyhnutná pre počiatočnú kontrolu vírusu aktívnou deštrukciou vírusovej replikácie a imunitnou stimuláciou, aby sa obmedzilo šírenie do iných buniek. Po identifikácii prítomnosti vírusu alebo vírusových antigénov je indukcia interferónov kľúčová pre nastolenie antimikrobiálneho stavu v bunkách, kde je rovnováha medzi interferónmi a inými vrodenými cytokínmi rozhodujúca pre účinné pôsobenie (45). Nedávno bola inhibícia interferónov typu I (IFN-alfa a IFN-beta) spojená so závažným ochorenímCOVID-19čo naznačuje, že vírus je schopný blokovať antivírusovú imunitu, čo vedie k zvýšenej patogenéze [14,46,47]. V našej štúdii sme zistili, že škrečky infikovanéSARS-CoV-2majú prototypickú odpoveď IFN typu II. Na rozdiel od toho, odpoveď typu IIFN je downregulovaná, čo dokazuje pokles expresie génu IFN-beta a zvýšenie expresie génu IRF2, antagonistu typu I. Početné štúdie preukázali zhoršenú odpoveď IFN typu I po infekcii SARS-CoV-2 in vitro[14,{5}}]. Dysregulácia IFN, ktorú tu uvádzame, ešte nebola analyzovaná v respiračnom tkanive ľudí s ťažkou formouCOVID-19, ale systémové imunitné analýzy krvi ukázali podobné výsledky [14,46,47,52]. Hoci mechanizmy inhibujúce reakcie interferónu typu I neboli úplne objasnené, do tejto dysregulácie sa podieľajú vírusové a hostiteľské faktory (53,54).
Dysregulácia interferónovej odozvy je stratégia, ktorú používajú vírusy, aby sa vyhli imunite hostiteľa. Predchádzajúce skúmania reakcie hostiteľa na SARS-CoV (koronavírus ťažkého akútneho respiračného syndrómu 1) a infekciu MERS-CoV (koronavírus respiračného syndrómu na Blízkom východe) naznačujú, že túto stratégiu využíva viacero koronavírusov[55-59]. Štúdia z roku 2020 od Xia et al. zistili, že táto dysregulácia využívaná vysoko patogénnymi koronavírusmi sa rozširuje naSARS-CoV-2demonštrovaním, že všetky tri tieto beta-koronavírusy downregulujú dráhu interferónu typu I. Konkrétne NSP1, NSP6 a NSP13[50] interferujú s transláciou IFN-beta, buď blokovaním ribozómu hostiteľa v prípade NSP1[60], alebo zacielením na upstream proteíny potrebné na indukciu IFN-beta v prípade NSP13[61]. InéSARS-CoV-2vírusové proteíny sa tiež podieľajú na downregulácii interferónu [62]. ORF3b a ORF9b sa špecificky zameriavajú na mitochondriálny komplex antivírusových signálnych proteínov, aby inhibovali signalizáciu IFN typu I [63,64]. Faktory hostiteľa ovplyvňujúceSARS-CoV-2výsledky infekcie zahŕňajú vek a pohlavie; okrem toho sa na dysregulácii interferónu podieľajú aj komorbidity (65). Preskúmala sa štúdia z roku 2020 od Trouillet-Assenta a kolCOVID-19výsledky pacientov v kohorte zahŕňajúcej jedincov systémovo exprimujúcich IFN typu I a jedincov, ktorí mali významne nižšie hladiny IFN-alfa aj beta. Zistili, že pacienti bez expresie interferónu typu I boli starší a pravdepodobne išlo o mužov v porovnaní s tými, ktorí exprimovali IFN typu I[66]. V podobnej štúdii boli zistené významne vyššie systémové hladiny IFN-alfa2 u žien v porovnaní s hladinami u mužov|67]. V našej nedávnej štúdii sme zistili, že staršie dospelé samce fretky mali oneskorenú odpoveď na interferón typu I v porovnaní s dospelými samicami, pričom samcom chýbala indukcia základných antivírusových génov vrátane OASL, MIX1 a IDG15, čo sa zhodovalo so zvýšenou vírusovou záťažou[68]. V našej súčasnej štúdii s použitím modelu škrečka boli všetky naše zvieratá samce, čo naznačuje, že na úplné pochopenie nami pozorovanej dysregulácie interferónu typu I je potrebné vyšetrovanie pohlavných predsudkov. V súčasnosti nie je známe, prečo alebo ako hostiteľské faktory ovplyvňujú odpovede interferónuSARS-CoV-2. Štúdia Bastarda a spol. identifikovala prítomnosť autoprotilátok proti interferónom typu I u mužov s ťažkýmCOVID-19[69]. To ponúka možné vysvetlenie imunitných mechanizmov zapojených do znížených reakcií interferónu typu I u podskupiny ľudských pacientov. Mechanizmus znížených interferónových reakcií v našej súčasnej štúdii, kde všetky škrečky boli dospelé samce, čaká na ďalšie skúmanie. Okrem toho, imunitný profil, ktorý sme identifikovali spolu s patológiou dýchacieho traktu, naznačuje, že škrečky sú ideálnym modelom na skúmanie týchto mechanizmov a testovanie terapeutík, ako sú interferóny typu I[48,49,70] alebo interferón lambda [Z1, Z2], obe preukázali účinnosť pri liečbeCOVID-19pacientov [Z3-75], ale je potrebný ďalší výskum.
COVID-19je ochorenie, ktoré zahŕňa patogenézu respiračných aj nerespiračných orgánov [25,26, avšak málo sa vie o reakcii hostiteľa mimo dýchacieho traktu. V našej štúdii sme identifikovali vRNA v niekoľkých tkanivách mimo dýchacieho traktu vrátane mediastinálnej lymfatickej uzliny, srdca, obličiek, pečene, sleziny a hrubého čreva. Prítomnosť vírusovej RNA môže byť indikátorom replikácie živého vírusu a infekcie tkaniva, ale môže byť prítomná aj bez živého vírusu. Nezistili sme významný živý vírus mimo dýchacieho traktu, čo by naznačovalo minimálnu, ak sa vyskytuje akákoľvek infekcia mimopľúcnych orgánov. Prítomnosť vírusovej RNA však môže byť významná pre klinické ochorenie a súvisiace mechanizmy. Prítomnosť vírusovej RNA môže byť výsledkom vírusu v krvi, ktorý je transportovaný systémovo, alebo vírusového antigénu, ktorý bol transportovaný bunkami prezentujúcimi antigén do imunologicky dôležitých tkanív, ako je slezina a mediastinálna lymfatická uzlina. Prítomnosť vírusovej RNA môže hrať úlohu v imunitných odpovediach a súvisiacej patogenéze v týchto tkanivách. Preto sme pokračovali v skúmaní imunitných reakcií hostiteľa v tkanivách, ktoré boli pozitívne na vírusovú RNA. Hoci sme zistili zvýšenú reguláciu zápalových génov a génov interferónu typu II vo všetkých mimopľúcnych tkanivách, najvýraznejšou odpoveďou bolo zvýšenie imunomodulačných cytokínov v srdci. V srdci naša analýza identifikovala nárast cytokínov vrátane IL-10, IL-2, IL-4, IL-5, IL-5R, IL{ {12}}, CD14 a CCR3, kde niektoré transkripty cytokínovej mRNA boli 100-násobne zvýšené. Hoci vybrané cytokíny tu môžu byť produkované rôznymi podskupinami T buniek, neprítomnosť TGF-beta naznačuje, že prítomnosť T-regulačných buniek je menej pravdepodobná. Okrem toho neprítomnosť IL-13 znižuje pravdepodobnosť odpovede TH2. Okrem T-lymfocytov možno zvýšenie génovej expresie IL-10, TNF a IL-6 pripísať monocytom alebo makrofágom[76]. Toto je ďalej podporené nárastom CD14[76]. Expresia IL-5, IL-5R, IL-4 a CCR3 tiež naznačuje prítomnosť eozinofilov[77]. Veľký počet klinických štúdií v súčasnosti odhalil srdcové postihnutieCOVID-19[78-84]. V skutočnosti sa odhaduje, že približne 30 percent ľudí, ktorí sa zotavili zCOVID-19majú nejaký typ srdcového poškodenia85]. Nemecká štúdia 100COVID-19pacienti zistili, že zápal myokardu bol bežný aj mesiace po zotavení zSARS-CoV-2infekcia[84]. V rámci testovanej kohorty malo 78 percent pacientov symptómy súvisiace so srdcom bez ohľadu na ich stupeňCOVID-19závažnosť[84]. Monocyty patria medzi typy buniek, o ktorých je známe, že infiltrujú srdce pri zápale myokardu a produkujú IL-10, IL-1beta, IL-6 a TNF [86], ako aj IL-12[87,88], z ktorých všetky boli upregulované v srdci poSARS-CoV-2očkovanie v našej súčasnej štúdii. Okrem toho ďalšia podskupina srdcových problémov súvisiacich sCOVID-19sa pripisuje eozinofilom, čo vedie k eozinofilnej myokarditíde (89). O iných vírusoch je známe, že po infekcii spôsobujú eozinofilnú myokarditídu[90-93]. Táto patológia je zvyčajne výsledkom toho, že vírus infikuje tkanivá srdca, napríklad infekciou vírusom Coxsackie B3[94]. Eozinofilná myokarditída bola diagnostikovaná vCOVID-19pacientov, po pitve srdcové tkanivo vykazovalo infiltráciu zápalových buniek vrátane lymfocytov, makrofágov a predovšetkým eozinofilov (89). V tomto prípade bol zistený nárast eozinofilov a celkový zápal v srdci napriek nedostatku živého vírusu v srdci v čase smrti (95). V našej štúdii sme našli dôkaz o eozinofilnej myokarditíde v histopatológii a tiež o cytokínovom podpise nájdenom v srdci. V našej štúdii je možné, že eozinofily vedú k zápalom sprostredkovanej kardiomyopatii prostredníctvom upregulácie IL-4, ktorá bola zvýšená z hľadiska génovej expresie v srdciach škrečkov 8. deň po inokulácii SARS-CoV-2. Zvýšenie draslíka a mierne zvýšenie alanín transferázy v plazme infikovaných škrečkov tiež mohlo podporiť srdcovú dysreguláciu. Vzhľadom na to nie sú mechanizmy regulujúce poškodenie srdca súvisiace s COVID-19 stále známe. Vzhľadom na prevalenciu srdcového postihnutia vCOVID-19pacientov, je potrebný ďalší výskum na pochopenie mechanizmov ochorenia. Tu sme poskytli dôkaz, že škrečky môžu byť užitočné na pochopenie definujúcich mechanizmov poškodenia srdca počasSARS-CoV-2infekciu a vyhodnotenie terapeutík pre túto patológiu.
Imunologicky naše analýzy v slezine a mediastinálnych lymfatických uzlinách naznačujú vyvolanie adaptívnej imunity. Mediastinálna lymfatická uzlina identifikovala pozoruhodnú dvojfázovú reguláciu v génoch súvisiacich s T bunkami, s upreguláciou v génovej expresii CD3, CD4, IL-2, IL-21, I-10, IL{ {6}}, IL-5 a IL-13 v dňoch 2 a 15. Tento profil naznačuje skorú prezentáciu antigénu v drenážnej lymfatickej uzline krátko po infekcii pľúc dendritickými bunkami, ktorá by bola podporovaná dňom 2 upregulácia produkcie IL-12 v lymfatických uzlinách [96,97]. Migrácia dendritických buniek vedúca k aktivácii T buniek nakoniec vyvrcholí v IL{15}} stimulujúcom rast a proliferáciu T buniek[98]. Hladiny globulínu v krvi 2. deň po infekcii u infikovaných škrečkov tiež podporujú skorú antigénnu stimuláciu. Zvýšená regulácia IL-4, IL-5 a IL-13 naznačuje skreslenú odpoveď TH2[99]. Skoré štúdie ukázali, že asymptomatické alebo mierneCOVID-19prípady s vychýlením imunity smerom k systémovému TH2 charakterizovanému zvýšením IL-4 a IL-10[100].IL-10, regulačný cytokín, bol tiež upregulovaný na 2. deň našej štúdie. Naše údaje naznačujú, že aktivované T bunky sa získavajú do tkanív so živou vírusovou infekciou, ako sú nosné mušle, kde sme pozorovali zvýšenie génov súvisiacich s T bunkami v deň 5 po inokulácii. Sekundárna upregulácia génov v lymfatických uzlinách na 15. deň tiež naznačuje expanziu podskupín T buniek. V neprítomnosti infekčných vírusov v tomto čase by to mohlo byť zvýšenie podskupín T buniek, ktoré priamo prispievajú k rozvoju pamäťovej odpovede. Keďže centrálne pamäťové T bunky tiež produkujú IL{10}}[101], naše údaje ukazujúce zvýšený IL{12}} na 15. deň po inokulácii môžu naznačovať pamäť T buniek. IL-21 bol najviac upregulovaný gén súvisiaci s T bunkami na 15. deň. IL{18}} je primárne produkovaný T-folikulárnymi pomocnými bunkami, podskupinou, ktorá napomáha germinálnym centrálnym B bunkám[102], najmä zošikmenie B buniek smerom k dozrievaniu afinity a rozvoju pamäte. B bunkový marker CD19 bol tiež zvýšený v lymfatických uzlinách, pričom vrchol génovej expresie nastal 15. deň. Štúdia z roku 2021 od Lakshmanappa et al.SARS-CoV-2infekcia u makakov rhesus, odhaľujúca silnú T bunkovú odpoveď v mediastinálnej lymfatickej uzline so špecifickým zvýšením CD4, ako aj markerov T folikulárnych pomocných buniek CD28 a CXCR5 [103]. Je možné, že zvýšená expresia génu T buniek pozorovaná v našej štúdii tiež naznačuje reakciu zárodočného centra. Zvýšená systémová odpoveď T buniek bola tiež pozorovaná u pacientov so SARS-CoV-2, ktorí sa zotavujú a rozvíjajú dlhodobú pamäť [97,104]. Hlbšia analýza so zvýšenými markermi reakcií zárodočných centier na hodnotenie lymfatických uzlín by bola prospešná pre štúdie vakcín.
Zvýšená aktivita lymfatických uzlín môže tiež naznačovať patogenézu. Lymfatická uzlina bola jediným nerespiračným orgánom, kde bol zistený živý vírus. Živá vírusová infekcia lymfatických uzlín, ako aj sleziny, bola pozorovaná u ľudí, ktorí podľahliSARS-CoV-2[105]. V štúdii Kaneko et al. vzorky ľudských lymfatických uzlín a sleziny od zosnulýchCOVID-19pacientom chýbali BCL6 plus B bunky, ako aj celé germinálne centrá vo všeobecnosti. Autori predpokladali, že to bola príčina slabej humorálnej odpovedeSARS-CoV-2[106]. Keďže sme identifikovali silnú reakciu neutralizujúcich protilátok, ktorá bola detegovaná 8. deň po infekcii, čo sa zhodovalo so znížením vylučovania vírusu, je pravdepodobnejšie, že živý vírus nájdený v lymfatických uzlinách našej štúdie naznačoval funkčné reakcie B buniek a reakcie zárodočného centra.
Slezina tiež vykazovala výrazné imunitné reakcie charakterizované zvýšením génovej expresie lineárne od 8. do 15. dňa. Táto neskorá upregulácia koreluje s typickým zapojením sleziny s imunitnou odpoveďou na patogény, ku ktorej dochádza po aktivácii v lokálnych drenážnych uzlinách [107]. Slezina, lymfoidný orgán, tiež aktivuje T a B bunky ako odpoveď na vírusový antigén. Vysoká génová expresia CD3, CD4, IL-2 a I-21 naznačuje T-folikulárne bunky ako ako aj aktivitu B buniek závislú od zárodočného centra, ako sme videli v lymfatických uzlinách [108]. Okrem toho môže byť odpoveď v slezine dôsledkom virémie, kde sa plazmocytoidné dendritické bunky (pDC) podieľajú na rozpoznávaní vírusového antigénu prostredníctvom TLR7 a TLR9 pre aktiváciu CD8 plus T buniek a prirodzených zabíjačov T (NKT). Oba tieto typy buniek fungujú pri odstraňovaní vírusom infikovaných buniek po aktivácii IFN-beta a IL v slezine-12 [109], ktoré boli v našom modeli zvýšené spolu s CD8.IL-12 , IL-10 a CD14 boli upregulované v slezine infikovaných škrečkov, čo potenciálne poukazuje na fagocytárnu aktivitu makrofágov [110, 111]. Vrodené lymfoidné bunky (ILC) v slezine tiež podporujú opravu tkaniva v reakcii na poranenie a produkujú IL-5 a IL-13[112]. Celkovo táto neskoršia reakcia v slezine poukazuje na recyklačnú funkciu sleziny, ako aj na potenciálnu aktiváciu lymfocytov pre reakcie dlhodobej pamäte.
Hrubé črevo vykazovalo minimálnu reguláciu hodnotených cytokínov, s významnou výnimkou I-5, IL-5R a CCR3. Expresia všetkých troch týchto génov sa významne zvýšila v dňoch 2 až 15 s maximálnym násobkom zmeny 74 pre IL-5 v porovnaní s východiskovou hodnotou v deň 8. IL-5 je prevažne vylučovaný typom 2 T -pomocné bunky a eozinofily[113]. Vzhľadom na nižšie hladiny génovej expresie iných génov súvisiacich s Th2, ako sú IL-4 a IL-13, a zvýšenie známych eozinofilných markerov IL-5R a CCR3, ide pravdepodobne o IL{ {18}} je produkovaný predovšetkým eozinofilmi, čo možno vidieť v našej histologickej analýze hrubého čreva. Eozinofily hrajú priamu úlohu v antivírusovej obrane, ako dokazujú RNázy v ich granulách a sú spojené s klírensom iných respiračných vírusov (114, 115). Veľké množstvo eozinofilov sa nachádza aj v gastrointestinálnom trakte (116). V našej štúdii hrubé črevo infikovaných škrečkov nevykazovalo živé vírusy. Hrubé črevo však bolo pozitívne naSARS-CoV-2vírusovej RNA na 2. a 5. deň po inokulácii, čo je nález v súlade so Sia et al., ktorí tiež pozorovali vRNA v hrubom čreve v neprítomnosti zápalovej odpovede [20]. Až 20 percentCOVID-19pacienti uvádzajú gastrointestinálne symptómy, ako je hnačka[39,117]s vírusmi vylučovanými stolicou[118]. To by sa dalo vysvetliť poklesom eozinofilov, ktorý bol hlásený v závažných prípadochCOVID-19[119-121]. Zvýšenie expresie génu IL-5 eozinofilmi by mohlo prispieť k antivírusovému stavu hrubého čreva, a tým zabrániť infekcii. Na potvrdenie presného typu bunky, ktorý vedie k tejto zvýšenej IL-5 odpovedi, je potrebné ďalšie skúmanie.
V našej štúdii sme tiež skúmali chémiu krviSARS-CoV-2infikovaných sýrskych škrečkov. Stanovili sme referenčný rozsah pomocou neinfikovaných škrečkov z nášho živočíšneho zdroja, ako aj porovnali hodnoty s publikovanými referenčnými rozsahmi pre škrečky, konkrétne sýrske škrečky[122]. Niektoré predanalytické faktory, ktoré môžu ovplyvniť biochemické vlastnosti krvi našich zvierat pred infekciou, ktoré je potrebné zvážiť pri analýze, zahŕňajú úroveň stresu, ktorému môžu zvieratá podliehať, ako aj izofluránové anestetikum používané pri odbere krvi, ktoré môže zmeniť biochemické zloženie krvi. Ukázalo sa, že hladiny glukózy, ALT, ALP a anorganického fosforu boli významne vyššie u potkanov pod izofluránom a inými anestetikami, ktoré tu nie sú uvedené[123]. V našej štúdii škrečkov infikovaných SARS-CoV-2 jeden z najpozoruhodnejšie zmeny po infekcii zahŕňali koncentrácie draslíka, ktoré sa časom zvyšovali. Draslík, ktorý je zásadou, pôsobí ako tlmivý roztok na výmenu za vodík (H') (kyselina), keď je pacient v kyslom stave. Keďže acidóza krvi môže byť spôsobená zmenami v respiračných funkciách, nie je prekvapujúce, že škrečky, ktoré vykazovali známky zápalu pľúc/respiračnej tiesne (čo naznačuje zvýšenie oxidu uhličitého (CO2), sa zadržiavajú (alebo vylučujú menej) a menej kyslíka ( O2) užívaný v dôsledku zníženej alveolárnej funkcie) by sa dostal do kyslého stavu, čo by viedlo k zvýšeniu draslíka v krvi. Pokiaľ ide o nižšie hladiny albumínu v porovnaní s naším referenčným rozsahom, očakávalo by sa, že albumín sa zvýši v reakcii na expresiu zápalových cytokínov. Je možné, že nižšie hladiny albumínu boli spôsobené použitím izofluránu, čo už bolo preukázané[122-124]. Čo sa týka glukózy v priebehu času, väčšina infikovaných zvierat mala zvýšenú koncentráciu glukózy, čo naznačuje stres vyvolaný kortizolom, vzrušenie vyvolané epinefrínom alebo dysreguláciu v produkcii inzulínu alebo interakcii sekrécia/receptor. Stručne povedané, najzaujímavejším zistením tejto analýzy bol návrh znížených hladín kyslíka spojených so zvýšenými hladinami draslíka. Tieto výsledky naznačujú, že monitorovanie draslíka sa môže použiť na identifikáciu pneumónie počas časti životaCOVID-19štúdie na zvieratách. V budúcnosti možno túto prácu použiť aj na vytvorenie referenčných hodnôt pre model infekcie SARS-CoV-2 sýrskeho škrečka a použiť ju na skríning terapeutík počas života.
Naša štúdia ponúka dôležité poznatkySARS-CoV-2infekcia aCOVID-19regulácia chorôb. Predklinické modely sú základným kameňom biomedicínskeho výskumu, ktorý ponúka schopnosť experimentálne izolovať mechanizmy chorôb a tiež vyhodnotiť potenciálne lekárske protiopatrenia vrátane imunomodulačných liekov, antivirotík a vakcín. AkoSARS-CoV-2sa prvýkrát objavili, mali sme obmedzené pochopenie mechanizmov patogenézy, žiadne identifikované terapeutiká alebo profylaktika a žiadny predklinický model, ktorý by sa dal využiť na objavovanie lekárskych protiopatrení. Od čias objavenia sa vírusu sa urobili obrovské skoky najmä vo vývoji predklinických modelov, ale naše chápanieCOVID-19a jeho mnohé prejavy sú stále obmedzené. Naša štúdia potvrdila vírusový tropizmus a respiračnú patológiu predtým identifikovanú v našej štúdiiSARS-COV-2škrečkov, ale bol tiež schopný rozšíriť naše chápanie imunitnej regulácie a patogenézy v rámci dýchacieho traktu a mimo neho.
Referencie
Zhuang Pinghui JW. Wuhanská pneumónia: ako sa rozvinulo pátranie po zdroji záhadnej choroby South China Morning Post 2020. Dostupné z: https://www.scmp.com/news/china/society/article/ 3046233/Wuhan-pneumonia-how-search -zdroj-záhada-choroba-odhalená.
Cucinotta D, Vanelli M. Vyhlasuje WHOCOVID-19pandémia. Acta Biomed. 2020; 91 (1): 157-60. Epub 20. 3. 2020. https://doi.org/10.23750/abm.v91i1.9397 PMID: 32191675.
Petrosillo N, Viceconte G, Ergonul O, Ippolito G, Petersen E.COVID-19, SARS a MERS: spolu úzko súvisia? Clin Microbiol Infect. 2020; 26 (6): 729-34. Epub 2020/04/03. https://doi.org/10.1016/j. cmi.2020.03.026 PMID: 32234451; PubMed Central PMCID: PMC7176926.
Medicína JHU. Coronavirus Resource Center 2021. Dostupné z: https://coronavirus.jhu.edu/.
Marshall M. Trvalá bieda koronavírusových diaľkových prepravcov. Príroda. 2020; 585(7825):339–41. Epub 2020/09/16. https://doi.org/10.1038/d41586-020-02598-6 PMID: 32929257.
Gupta A, Madhavan MV, Sehgal K, Nair N, Mahajan S, Sehrawat TS a kol. Mimopľúcne prejavyCOVID-19. Nat Med. 2020; 26 (7): 1017-32. Epub 2020/07/12. https://doi.org/10.1038/s41591- 020-0968-3 PMID: 32651579.
Nikolich-Zugich J, Knox KS, Rios CT, Natt B, Bhattacharya D, Fain MJ.SARS-CoV-2aCOVID-19u starších dospelých: čo môžeme očakávať v súvislosti s patogenézou, imunitnými odpoveďami a výsledkami. Geroscience. 2020; 42 (2): 505-14. Epub z 11. apríla 2020. https://doi.org/10.1007/s{10}} PMID: 32274617; PubMed Central PMCID: PMC7145538.
SZO. Informácie pre poskytovateľov pediatrickej zdravotnej starostlivosti 2021. Dostupné z: https://www.cdc.gov/ coronavirus/2019-ncov/hcp/pediatric-hcp.html.
Fu Y, Cheng Y, Wu Y. PorozumenieSARS-CoV-2-Sprostredkované zápalové reakcie: Od mechanizmov k potenciálnym terapeutickým nástrojom. Virol Sin. 2020; 35 (3): 266-71. Epub 2020/03/04. https://doi.org/ 10.1007/s12250-020-00207-4 PMID: 32125642; PubMed Central PMCID: PMC7090474.
Poznámka:vyššie uvedené nie je úplný referenčný zoznam
