Ako chrániť renálne tubulárne bunky postihnuté apoptózou vyvolanou gentamicínom?

Ochranné účinky Zhibai Dihuang Wan na renálne tubulárne bunky ovplyvnené apoptózou indukovanou gentamicínom

Ďalšie informácie:{0}}

Kľúčové slová: Akútna obličkychoroba, Apoptóza, Gentamicín,Renálna tubulárna bunka, oblička.

Abstraktné

Etnofarmakologický význam: Zhibai Dihuang Wan (ZDW) je starodávna tradičná čínska medicína zložená z ôsmich rastlinných zložiek a používa sa na liečbu chronickýchobličkyzápaly a cukrovka už tisíce rokov. Napriek tomu vplyv ZDW na akútobličkyzranenie je stále neznáme. Zamýšľali sme identifikovať vplyv ZDW na rast buniek agentamicín- indukované apoptotické poškodenie vrenálne tubulárne bunky.

Materiály a metódy: ZDW sme extrahovali umelou črevnou tekutinou a liečeného potkanarenálne tubulárne bunky(NRK-52E) s rôznymi koncentráciami extrakcie ZDW. Bunková proliferácia agentamicín-indukovanýapoptózaNRK-52E buniek bolo hodnotených pomocou monitorovania proliferácie v reálnom čase a farbenia anexínom V, v danom poradí. Western blotting sa použil na vyhodnotenie hladín expresie Bcl-2 a kaspázy-3. Účinok ZDW nagentamicín-indukovanýobličkyPoškodenie bolo tiež monitorované u myší pomocou terminálnej deoxynukleotidyltransferázou sprostredkovaného biotinylovaného testu značenia UTP nick end label (TUNEL) a merania sérového kreatinínu a dusíka močoviny v krvi.

Výsledky: Zistili sme, že 30 μg/ml ZDW podporovalo bunkovú proliferáciu potkanovrenálne tubulárne bunky. ZDW tiež vyjadril na dávke závislý ochranný účinok protigentamicín-indukovanýapoptózav bunkách. Predbežná úprava 3 μg/ml alebo 30 μg/ml ZDW maximálne zvýšila Bcl-2 a znížila štiepenú kaspázu-3 vgentamicín-ošetrené NRK-52E bunky. Spomedzi rastlinných zložiek ZDW iba Phellodendron amurense Rupr., kôra (Cortex Phellodendri) a Anemarrhena asphodeloides Bunge, podzemok inhibovali obegentamicín-indukované zníženie Bcl-2 a zvýšenie štiepenej kaspázy-3. Phellodendron amurense Rupr., kôra a Anemarrhena asphodeloides Bunge, podzemok tiež inhibovanýgentamicín-indukovanýapoptózav určitých koncentráciách; tieto dve zložky však boli menej účinné ako ZDW. V modeli myši zgentamicín- indukovanej nefropatii, liečba ZDW významne znížila apoptotické bunky v obličkovej kôre a zlepšila funkciu obličiek.

Závery: Naše výsledky naznačujú, že ZDW pri adekvátnych dávkach tlmígentamicín- indukované apoptotické poškodenie vrenálne tubulárne bunkya tiež chrániobličkyodgentamicín-spôsobené poranenie u myší.

1. Úvod

Bylinné lieky sa používajú na liečbu rôznych chorôb po mnoho storočí, najmä v čínskej spoločnosti. V poslednej dobe sa potenciálne vedľajšie účinky bylín naobličkyboli hlásené (Isnard Bagnis a kol., 2004). V roku 1991 nefrológovia v Belgicku informovali o mnohých mladých ženách, ktoré konzumovali výťažky z čínskych bylín obsahujúcich Aristolochia fang chi v diétnych režimoch, ktoré vykazovali rôzne stupne zlyhania obličiek (Vanherweghem et al., 1993). Ukázalo sa, že vystavenie neúmyselne pridanej rastline Aristolochia obsahujúcej kyselinu aristolochovú (AA) je hlavnou príčinou poškodenia obličiek, atypie urotelových buniek a karcinómu (De Broe, 2012). Keďže tradičná čínska medicína sa všeobecne praktizuje na Taiwane a v pevninskej Číne, v týchto oblastiach prevláda AA nefropatia a predstavuje potenciálny problém verejného zdravia (Grollman, 2013). Väčšina nefrológov na Taiwane odporúča pacientom vyhnúť sa tradičnej bylinnej medicíne. Napriek tomu sa niektoré tradičné bylinné lieky ukázali ako sľubné pri liečbeobličkyochorenie v predklinických štúdiách alebo klinických skúškach (Wojcikowski et al., 2006; Wang et al., 2012; Zhang et al., 2012). Hoci je nevyhnutné vyhnúť sa používaniu rastlín Aristolochia v rastlinných liekoch, bylinné lieky sú stále potenciálnymi kandidátmi na liečbu niektorýchobličkychoroby.

Kliknite na Cistanche účinky na nadobličku

Zhi bai Dihuang Wan (ZDW), polybylinný prípravok, sa používa na liečbu chronických ochoreníobličkyzápaly a cukrovka už tisíce rokov. ZDW sa vyrába z Cornus officinalis Siebold & Zucc (13,8 percent), Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., koreň, pečený (Radix Rehmanniae preparata, 27,6 percent), Dioscorea oppositifolia L. (13,8 percent), Phelloprdendron amurense (Cortex Phellodendri, 6,9 percenta), Anemarrhena asphodeloides Bunge, podzemok (6,9 percenta), Paeonia suffruticose Andrews, koreňová kôra (Moutan Cortex, 10,3 percenta), Alisma Plantago-Aquatica L., podzemok (Rhizomatis cos 10% Alis) (Schw.) Wolf (10,3 percenta) a neobsahuje Aristolochiu. Medzi týmito zložkami sú Cornusofficinalis Siebold & Zucc, Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., koreň, pečený, Phellodendron amurense Rupr., kôra a kokosové orechy Poria sa uvádzajú ako prospešné pri diabetickej nefropatii alebo chronickom poškodení obličiek na zvieracích modeloch (Yokozawa a kol., 2004; Kim a kol., 2008; Jiang a kol., 2012; Zhao a kol., 2013). ZDW bez Anemarrhena asphodeloides Bunge a Phellodendron amurense Rupr., kôra mala tiež čiastočný ochranný účinok na včasnú diabetickú nefropatiu u potkanov (He et al., 2007). Tieto zistenia naznačujú, že ZDW má potenciálne ochranné účinky proti poškodeniu obličiek. Avšak vplyv ZDW na rast buniek aapoptózazrenálne tubulárne bunkyje stále nejasné.

Gentamicínje široko používané aminoglykozidové antibiotikum na liečbu gramnegatívnych bakteriálnych infekcií, ale vyvoláva akútobličkyzranenia u približne 30 percent pacientov (Singh et al., 2012). V obličkových proximálnych tubulárnych bunkách vyvolávaapoptózaje kľúčovým cytotoxickým mechanizmomgentamicín(Servais a kol., 2006).Gentamicínvyvolávaapoptózaprostredníctvom mitochondriami sprostredkovanej signálnej dráhy, vrátane zníženia Bcl-xL a zvýšenia štiepenej kaspázy-3 a -9 (Ali, 2003; Juan et al., 2007). K dnešnému dňu neexistuje ideálny klinický liek, ktorému by sa dalo zabrániťgentamicín- vyvolané akútneobličkyzranenie. V tejto štúdii sme skúmali vplyv ZDW nagentamicín-indukovanýapoptózavrenálne tubulárne bunkyin vitro a in vivo. Naše údaje odhalili ochranný účinok ZDW nagentamicín-ošetrenýrenálne tubulárne bunkya ďalej preukázali príspevky jeho zložiek k ochrannému účinku ZDW.

2. Materiály a metódy

2.1. Činidlá a príprava ZDW

Dulbeccovo modifikované Eaglovo médium (DMEM), fetálne teľacie sérum a činidlá pre tkanivové kultúry boli získané od Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD, USA). Všetky ostatné chemikálie reagenčnej kvality boli získané od Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, USA). Prášky ZDW (číslo šarže 051941) a jeho prísady (Cornus officinalis Siebold & Zucc, šarža č. C810Y; Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., koreň, pečený, šarža č. C730N; Dioscorea oppositifolia L., č. šarže C624N; Phellodendron amurense Rupr., kôra, č. šarže C722Y; Anemarrhena asphodeloides Bunge, podzemok, č. šarže C805N; Paeonia, koreň barokosa, Andrews sufruticosa šarža č. C813Y, Alisma Plantago-Aquatica L., podzemok, č. šarže C819N, Poria cocos (Schw.) Wolf, šarža č. C827N) boli zakúpené od SunTen Pharmaceutical Co. (Taipei, Taiwan). Podľa pokynov výrobcu 29 g 8-bylinnej zmesi (4 g Cornus officinalis Siebold & Zucc, 8 g Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., koreň, pečený, 4 g Dioscorea oppositifolia L., 2 g Phellodendron amurense Rupr., kôra, 2 g Anemarrhena asphodeloides Bunge, podzemok, 3 g Paeonia suffruticose Andrews, koreňová kôra, 3 g Alisma Plantago-Aquatica L., podzemok a 3 g Poria cocos (Schw.) 290 ml sa uvarili v destilovanej vody počas 4 hodín pri 100 1C, prefiltrovaný, lyofilizovaný, čím sa získalo 7,5 g suchých extraktov, a potom zmiešaný s 2,2 g kukuričného škrobu a 5,3 g práškovej celulózy za vzniku 15 g ZDW. Všetky bylinky overil profesor herbológie z Brion Research Institute of Taiwan, ROC. Vzorky poukazov boli uložené v Herbári Národného výskumného inštitútu čínskej medicíny, Taiwan, ROC (čísla poukazov: Cornus officinalis Siebold & Zucc - NHP{{32} }, Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., koreň, pečený -NHP-00411, Dioscorea oppositifolia L. – NHP-00600, Phellodendron amurense Rupr., kôra – NHP-00369, Anemarrhena asphodeloides Bunge, podzemok – NHP-00196, Paeonia suffruticose Andrews, koreňová kôra – NHP-00169, Alisma Plantago-Aquatica L., podzemok – NHP-00424, Poria cocos (Schw.) Wolf – NHP -00309). Rastlinné lieky (0,1 g) sa trávili s 1 ml umelej črevnej tekutiny (1 percento pankreatínu, 50 mM dihydrogenfosforečnanu draselného, ​​pH 7,5) pri 37 1C počas 2 hodín, prefiltrovali sa cez 0.{58}} μ m filtre a potom aplikované v bunkových experimentoch. Okrem toho sa samotná umelá črevná tekutina tiež inkubovala pri 37 1C počas 2 hodín, prefiltrovala sa cez 0,{62}} μm filtre a potom sa aplikovala v kontrolných skupinách.

2.2. Analýza odtlačkov prstov pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC)

Kvalita ZDW sa merala pomocou HPLC. Stručne povedané, {{0}},1 g prášku ZDW sa rozpustilo v démonickej vode pri izbovej teplote počas 2 hodín, prefiltrovalo sa cez {{10}}.22- μm filtre a potom aplikované v HPLC analýze. Sto μl roztoku sa nanieslo na 250 4,6 mm C18-kolónu (Grace. Columbia, USA) pomocou systému Waters HPLC vybaveného 60{{18 }} ovládač a detektor 996 fotodiódového poľa (Waters, St. Massachusetts, USA). Vzorka sa potom eluovala 0–95 percentným lineárnym gradientom metanolu v démonickej vode, pH 7,0, počas 60 minút pri prietoku 0,8 ml/min. Eluenty sa detegovali a kvantifikovali pri 254 nm od 0 min do 60 min pri teplote miestnosti. Analýza bola vykonaná 10-krát a výsledky sú konzistentné.

2.3. Bunková kultúra

Zakúpili sme potkanie renálne proximálne tubulárne bunky (NRK-52E) od Bioresource Collection and Research Center (Hsinchu, Taiwan). Bunky sa kultivovali v DMEM doplnenom antibiotickým/antifungálnym roztokom a 10 percentným fetálnym hovädzím sérom. Pestovali sa, kým sa monovrstva nestala súvislou. Kultivované bunky sa potom kultivovali v médiu bez séra cez noc pred experimentom. Extrakty ZDW umelou črevnou tekutinou sa pridali k vyhladovaným bunkám v uvedenej koncentrácii a inkubovaná umelá črevná tekutina sa aplikovala ako kontrolná liečba. Po 24 hodinách inkubácie sa vzorky buniek zozbierali a aplikovaliapoptózaanalýza a analýza Western blotting.

2.4. Monitorovanie bunkovej proliferácie v reálnom čase

Na monitorovanie bunkovej proliferácie sme použili systém „xCELLigence“ od Roche Applied Sciences (Indianapolis, IN, USA). NRK-52E bunky sa naočkovali v duplikáte na E-platne v hustote 10 000 buniek/jamku. E-platne sa potom preniesli do prístroja xCELLi-glance RTCA DP na automatizované monitorovanie v reálnom čase vo zvlhčenom inkubátore obsahujúcom 5 percent CO2 pri 37 1C. Po 24 hodinách sa bunky na E-platniach nechali cez noc hladovať. Na test proliferácie sa k bunkám pridali extrakty ZDW na 30 minút a potom sa pridali 3 mmol/lgentamicínbol pridaný do buniek. Bunkový index, ľubovoľná jednotka odrážajúca impedanciu bunkového senzora, sa meral každých 15 minút. Výpočet sklonu sa uskutočnil pomocou softvéru RTCA verzie 1.2 (Roche Applied Sciences). Boli uskutočnené tri nezávislé experimenty.

2.5. Detekcia apoptózy

Na detekciu sa použilo dvojité farbenie fluoresceín izotiokyanát (FITC)-anexín V/propídiumjodid (PI).apoptózavyvolanégentamicínliečbe. Ošetrené bunky NRK{0}}E boli zozbierané a dvakrát premyté ľadovo studeným fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom (PBS). Špecifická väzba FITC-anexínu V a zafarbená PI sa uskutočnila s použitím anexínu Vapoptózadetekčná súprava (BD Biosciences-Pharmingen, San Diego, CA, USA), podľa pokynov výrobcu. Bunky sa potom analyzovali pomocou prietokovej cytometrie.

2.6. Western blot analýza

Dvadsať mikrogramov proteínového lyzátu NRK{0}}E sa nanieslo na každú dráhu blotovacieho prúžku a analyzovalo sa Western blotom. Protilátky pre Bcl-2 a kaspázu-3 boli zakúpené od spoločnosti Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA) a pre test zriedené v pomere 1:1000. Glyceraldehyd 3-fosfátdehydrogenáza (GAPDH) bola detegovaná ako kontrola nanášania. Relatívne hladiny proteínových pásov boli kvantifikované pomocou softvéru Quantiscan (Biosoft, Cambridge, Spojené kráľovstvo).

2.7. Zvieratá a liečba

Samce myší BALB/c vo veku 8 týždňov a s hmotnosťou 20 až 25 g boli získané od BioLasco Taiwan (Taipei, Taiwan). Všetky pokusy na zvieratách boli schválené Výborom pre experimentálnu starostlivosť o zvieratá a použitie na lekárskej univerzite v Taipei. Zvieratá boli umiestnené v centrálnom zariadení, podrobené 12-hodinovému cyklu svetlo-tma a bolo im poskytnuté bežné krmivo pre potkany a voda z vodovodu. Experimentálna skupina myší (n=6) pregentamicínliečení boli podrobení intraperitoneálnej (IP) injekcii sgentamicín(20 mg/kg/deň) počas 10 dní. Prášok ZDW (1 alebo 2 g/kg) bol rozpustený vo fyziologickom roztoku a predtým orálne podanýgentamicíninjekciu zakaždým. Myšiam v kontrolnej skupine (n=6) sa orálne a intraperitoneálne podával fyziologický roztok. Všetky myši boli anestetizované použitím pentobarbitalu 30–50 mg/kg telesnej hmotnosti intraperitoneálne (Sigma, St. Louis, MO) 1 deň po ich poslednej injekcii. Zvieratá sa potom usmrtili ešte pod účinkom anestézie a zo srdca sa odobrali vzorky krvi na meranie sérového kreatinínu a dusíka močoviny v krvi. Theobličkysa odobrali laparotómiou a tkanivo obličkovej kôry sa rýchlo zmrazilo v tekutom dusíku a uskladnilo sa v -80C.

2.8. Test in situ terminálneho deoxynukleotidyltransferázou sprostredkovaného biotinylovaného UTP nick end značenia (TUNEL)

Zmrazené tkanivové rezy (4 μm) zobličkyboli spracované s ApopTag Fluorescein in situapoptózadetekčná súprava (CHEMICON International, Inc., CA, USA) podľa pokynov výrobcu. v skratke,obličkytkanivové sklíčka boli vopred ošetrené proteinázou K a H₂O₂a inkubované s reakčnou zmesou obsahujúcou terminálnu deoxynukleotidyltransferázu (TdT) a dUTP konjugovaný s digoxigenínom počas 1 hodiny pri 37 1C, pripevnené pomocou upevňovacieho roztoku obsahujúceho PI a nakoniec pozorované fluorescenčnou mikroskopiou.

2.9. Štatistické analýzy

Údaje sú prezentované ako priemer 7 štandardných odchýlok (SD). Štatistické analýzy sa uskutočnili pomocou Studentovho t-testu, kde P 0.05 sa považovalo za štatisticky významné.

3. Výsledky

3.1. Vplyv ZDW na bunkovú proliferáciu

Na kontrolu kvality ZDW sme použili HPLC na vytvorenie chromatogramu odtlačkov prstov, ako je znázornené na obr. 1. Najprv sme skúmali vplyv extraktov ZDW na proliferáciu buniek NRK-52E. Na napodobnenie gastrointestinálneho prostredia sa ZDW trávil a extrahoval pomocou umelej črevnej tekutiny a potom sa použil v bunkových experimentoch.

Pri monitorovaní bunkovej proliferácie v reálnom čase proliferačné krivky aj sklony ukázali, že bunky ošetrené 30 μg/ml ZDW mali vyššiu rýchlosť proliferácie v porovnaní s kontrolnými bunkami ošetrenými umelou črevnou tekutinou (obr. 2A a B). Na rozdiel od toho 300 μg/ml ZDW významne znížilo rýchlosti proliferácie. Dávkovanie 30 μg/ml ZDW obsahuje 4 μg/ml Cornus officinalis Siebold & Zucc, 8 μg/ml Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., koreň, pečený, 4 μg/ml Dioscorea oppositifolia L., 2 μ g/ml Phellodendron amurense Rupr., kôra, 2 μ g/ml Anemarrhena asphodeloides Bunge, podzemok, 3 μ g/ml Paeonia suffruticose Andrews, koreňová kôra, 3 μ g/ml Alisma Plantago-Aquatica L., podzemok a 4 μ g/ml Poria cocos (Schw.) Wolf. Tieto dávky zložiek však namiesto toho znížili proliferáciu NRK-52E buniek (obr. 2C).Gentamicínvýznamne inhiboval rast buniek a dokonca znížil index počtu buniek, ktorý sa čiastočne obnovil po ošetrení 3 alebo 30 ug/ml ZDW, ako je znázornené na obr. 2A. Vysoké dávky ZDW (300 μg/ml) ďalej zvýšili inhibičný účinokgentamicínna bunkovú proliferatívnu kapacitu. Naše výsledky naznačujú, že nízka dávka ZDW (3–30 g/ml) podporuje proliferáciu buniek NRK-52E, a to aj v prítomnostigentamicínliečbe.

3.2. Vplyv ZDW na apoptózu

Ďalej sme hodnotili vplyv extraktov ZDW nagentamicín-indukovanýapoptózav NRK{0}}E bunkách farbením anexínom V/PI a prietokovou cytometriou. Ako je znázornené na obr. 3, extrakty ZDW od 0,3 do 300 μg/ml neindukovali významnéapoptózav bunkách NRK-52E. Vystavenie 3 mmol/lgentamicínvýrazne zvýšené apoptotické bunky. Predúprava buniek pomocou ZDW sa výrazne znížilagentamicín-indukovanýapoptózav závislosti od dávky a inhibičný účinok vrcholil pri 30 μg/ml a klesal pri 300 μg/ml ZDW (obr. 3).

ZDW extrahuje chránené bunky NRK-52E zgentamicín-indukovanýapoptóza. Na potvrdenie tohto výsledku sme tiež monitorovali vplyv ZDW na apoptotickú signálnu dráhu indukovanúgentamicín. V normálnych NRK{0}}E bunkách koncentrácie ZDW od 0,3 do 300 μg/ml významne neovplyvnili expresiu Bcl-2 a štiepenie kaspázy-3 (obr. 4).Gentamicínliečba významne znížila expresiu Bcl{0}} a vyvolala štiepenie kaspázy-3 v NRK-52E bunkách. Predbežné ošetrenie buniek pomocou ZDW zlepšilo expresiu Bcl-2 ingentamicín-ošetrené bunky a výrazne zníženégentamicín-indukované kaspázové-3 štiepenie (obr. 4).

3.3. Vplyv zložiek ZDW na apoptózu

Výsledky ukázali, že najúčinnejšia koncentrácia ZDW bola blízka 30 μg/ml. Teoreticky 30 μg/ml ZDW obsahuje 4 μg/ml Cornus officinalis Siebold & Zucc, 8 μg/ml Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., koreň, pečený, 4 μg/ml Dioscorea oppositifolia L., 2 μ g/ml Phellodendron amurense Rupr., kôra, 2 μ g/ml Anemarrhena asphodeloides Bunge, rizóm, 3 μ g/ml Paeonia suffruticose Andrews, koreňová kôra, 3 μ g/ml Alisma Plantago-Aquatica L., podzemok a 3 μ g/ml Cocos Poria. Extrakty týchto zložiek v uvedených koncentráciách však neovplyvnili proliferáciu buniek NRK{11}}E, ako sa ukázalo pri monitorovaní bunkovej proliferácie v reálnom čase (údaje nie sú uvedené). Ďalej sme samostatne monitorovali zložky ZDW z hľadiska ich účinkov na expresiu štiepenia Bcl-2 a kaspázy{14}}gentamicín-ošetrené NRK-52E bunky. Obr. 5 ukazuje, že Cornus officinalis Sieb. et Zucc, Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., koreň, pečený, Dioscorea opak, Paeonia suffruticose Andrews, koreňová kôra, Alisma Plantago-Aquatica L., podzemok a Poria cocos neovplyvnili expresiu Bcl-2 a kaspázovým{5}} štiepenímgentamicín-ošetrené bunky. Len 0,2 μg/ml Phellodendron amurense Rupr., kôra a Anemarrhena asphodeloides Bunge, rizóm pri 4 a 60 μg/ml inhibovali obegentamicín-indukované zníženie Bcl-2 a zároveň zvýšenie štiepenia kaspázou{2}} (obr. 5).

Podobne ako výsledky Western blottingu, farbenie anexínom V/PI odhalilo, že Phellodendron amurense Rupr., kôra pri 0,2 μg/ml a Anemarrhena asphodeloides Bunge, rizóma pri 4 a 60 μg/ml významne inhibovaligentamicín-indukovanýapoptóza(obr. 6). Ostatné rastlinné zložky nevykazovali antiapoptotický účinokgentamicín-ošetrené NRK-52E bunky, ako sa ukázalo prietokovou cytometriou (údaje nie sú uvedené). ZDW obsahuje 6,9 ​​percenta Anemarrhena asphodeloides Bunge, rizóm. Dávka 60 μg/ml Anemarrhena asphodeloides Bunge, rhizoma bola oveľa vyššia ako množstvo obsiahnuté v 300 μg/ml ZDW, čo bola najvyššia dávka použitá v tejto štúdii. Dávka Phellodendron amurense Rupr., kôra 0,2 μg/ml bola podobná množstvu Phellodendron amurense Rupr., kôra obsiahnutá v 3 μg/ml ZDW. Anemarrhena asphodeloides Bunge, rhizoma dávka 4 μg/ml bola blízka množstvu Anemarrhena asphodeloides Bunge, rhizoma obsiahnutá v 30 μg/ml ZDW. Koncentrácie ZDW 3 aj 30 μg/ml mali významné antiapoptotické účinky (obr. 2), ktoré môžu čiastočne vyplývať z Phellodendron amurense Rupr., kôra, a Anemarrhena asphodeloides Bunge, rhizoma.

3.4. Ochranný účinok ZDW na obličky

Ochranný účinok ZDW nagentamicín-indukovanýapoptózabol ďalej dokázaný na myšom zvieracom modeli. Myši boli liečené sgentamicín(20 mg/kg/deň) alebo fyziologický roztok ako kontroly; experimentálne skupiny boli navyše liečené ZDW (1 alebo 2 g/kg/deň). Na konci liečebného obdobia (9 dní) saobličkysa odobrali laparotómiou a narezali na in situ TUNEL testy. Ako je znázornené na obr. 7, jadrá vobličkyrezy boli odhalené ako svetlé škvrny zafarbené PI. Rozptýlené a svetlé jadrá zafarbené pomocou TUNEL bolo možné detegovať v celej obličkovej kôregentamicín-ošetrené zvieratá, napriek tomu boli zriedkavo zistené v kontrolných vzorkách. Liečba ZDW zníženágentamicín-indukované apoptotické jadrá spôsobom závislým od dávky. Väčšina jadier označených TUNEL bola pozorovaná v epiteli proximálneho tubulu. ZDW inhiboval in vivogentamicín-indukovaná bunkaapoptózau potkanarenálne tubulárne bunky. Renálna funkcia experimentálnych myší bola tiež monitorovaná meraním koncentrácie dusíka močoviny v krvi a sérového kreatinínu.

Obr. 8 ukazuje, že koncentrácie dusíka močoviny v krvi a sérového kreatinínu boli zvýšené v krvigentamicín-ošetrené skupiny a liečba ZDW ich významne inhibovalagentamicín-indukované zvýšenie. Tieto výsledky naznačujú, že ZDW exprimuje renálny ochranný účinok in vivo.

4. Diskusia

V tejto štúdii sme sa zamerali na účinok ZDW nagentamicín-indukovanýapoptózau potkanov proximálnerenálne tubulárne bunky. Hlavné zistenia ukázali, že ZDW (3 a 30 μg/ml) zoslabilgentamicín- indukované apoptotické poškodenie v NRK-52E bunkách (obr. 3). Predbežná úprava ZDW bola tiež inhibovanágentamicín-indukované apoptotické signály, vrátane zníženia Bcl-2 a zvýšenia štiepenia kaspázou{2}} (obr. 4). V modeli myšigentamicíntoxicita, liečba ZDW významne znížila apoptotické bunky v obličkovej kôre a zlepšila funkciu obličiek (obr. 7 a 8). Naše výsledky naznačujú, že ZDW chránirenálne tubulárne bunkyodgentamicín-indukovanýapoptóza. Okrem toho sme tiež zistili, že 30 μg/ml ZDW podporovalo proliferáciu buniek NRK{1}}E (obr. 2), čo by mohlo prispieť k obnove renálnych tubulov zakútnaobličkychoroba. Vysoká dávka ZDW (300 μg/ml) však znížila bunkovú proliferáciu a znížil sa aj jej antiapoptotický účinok (obr. 2 a 3). Tieto výsledky ukazujú, že ZDW vo vysokých dávkach je cytotoxickýrenálne tubulárne bunky. Preto navrhujeme, aby podávanie ZDW v primeraných dávkach bolo prospešné pre pacientov sgentamicín-indukovanýobličkyzranenie.

Rastlinné lieky používané v bunkových experimentoch boli strávené a extrahované pomocou umelej črevnej tekutiny obsahujúcej pankreatín. Pankreatín sa skladá z amylázy, lipázy a proteázy. V zásade možno biologicky dostupné molekuly v rastlinných liekoch získať pomocou laboratórnej extrakcie, ktorá napodobňuje gastrointestinálne prostredie v takých detailoch, ako sú prítomné chemikálie a enzýmy, teplota, doba expozície a pH. V našom systémerenálne tubulárne bunkymali šancu interagovať s biologicky dostupnými molekulami v rastlinných liekoch, ale nie so surovinami. Účinné biologicky dostupné molekuly ZDW v našom systéme sú stále neznáme. Detekcia absorpcie ZDW vrenálne tubulárne bunkyje zatiaľ ťažké, pretože neexistuje žiadny vhodný cieľ na monitorovanie. Umelé črevné extrakty ZDW však mali v bunkových experimentoch účinok závislý od dávky. Tieto experimenty naznačujú, že umelé črevné extrakty ZDW obsahujú účinné biologicky dostupné molekuly pôsobiace na renálne tubulárne bunky. Na druhej strane perorálny ZDW tiež v závislosti od dávky vyjadril renálny ochranný účinokgentamicín-ošetrené myši (obr. 7 a 8). Tieto údaje naznačujú, že účinné molekuly umelých črevných extraktov ZDW môžu tiež existovať vobličkymyší liečených ZDW. Naše výsledky ukazujú farmakologickú konzistentnosť medzi bunkovými štúdiami s umelými črevnými extraktmi z rastlinných liekov a štúdiami na zvieratách s perorálnymi rastlinnými liekmi. Aplikácia umelých črevných tekutín v bunkových štúdiách je dostupná nedávno. V Caco-2 bunkách sa použili umelé črevné tekutiny na skúmanie charakteristík bunkovej absorpcie L-valyl-ara-C (Cheon et al., 2006). Orálna biologická dostupnosť pôdnych kontaminantov bola meraná in vitro s použitím umelých črevných tekutín (Ellickson a kol., 2001). Biodostupnosť arzénu v rôznych druhoch ryže bola študovaná aj pomocou in vitro systému gastrointestinálnych tekutín (He et al., 2012). Umelá gastrointestinálna extrakcia priniesla výsledky v primeranej zhode s klinickými meraniami biologickej dostupnosti arzénu meranými analýzou moču u dospelých ľudí po požití tradičnej čínskej medicíny obsahujúcej arzén (Koch et al., 2007). Okrem toho sa pankreatín v umelej črevnej tekutine sám trávi a stráca svoju enzymatickú aktivitu počas inkubácie 37 1C. Koncentrácia pankreatínu v bunkových experimentoch bola tiež veľmi nízka (0.3 30 ppm). Vplyv pankreatínu na bunkovú proliferáciu aapoptózaje veľmi obmedzená. Navrhujeme, aby umelá extrakcia črevnej tekutiny bola jednou z ideálnych extrakčných metód pre tradičné bylinné lieky v experimentoch s bunkovou kultúrou.

Z rastlinných zložiek ZDW sú inhibované iba Phellodendron amurense Rupr., kôra a Anemarrhena asphodeloides Bunge, podzemokgentamicín-indukovanýapoptózapri konkrétnych koncentráciách (obr. 5 a 6). Phellodendron amurense Rupr., kôra a Anemarrhena asphodeloides Bunge, podzemok by mal hrať úlohu v ochrannom účinku ZDW v bunkách NRK-52E. Phellodendron amurense Rupr., kôra obsahuje množstvo alkaloidov ako berberín, palmatín a jatrorrhizín. Phellodendron amurense Rupr., kôra je známa protizápalová látka (Mori a kol., 1995; Uchiyama a kol., 1989) a znižuje oxidačný stres vobličkydiabetických potkanov (Kim et al., 2008). Anemarrhena asphodeloides Bunge je široko používaný v čínskej tradičnej medicíne. Oddenky Anemarrhena asphodeloides Bunge majú antidiabetické, protidoštičkové agregačné a diuretické účinky (Takahashi et al., 1985). Timosaponíny izolované z odnoží Anemarrhena asphodeloides Bunge potláčajú agregáciu krvných doštičiek a tvorbu superoxidu indukovanú AA v ľudských neutrofiloch (Zhang et al., 1999a, 1999b). Anemarrhena asphodeloides Bunge tiež hrá kľúčovú ochrannú úlohu pri ischémiou indukovanom poranení mozgu (Oh et al., 2007). Na rozdiel od ZDW, Phellodendron amurense Rupr., kôry a Anemarrhena asphodeloides Bunge, podzemok vykazoval antiapoptotické účinky v obmedzenom koncentračnom rozsahu (obr. 3 a 6). Okrem toho 30 ug/ml ZDW podporovalo bunkovú proliferáciu, ale všetky zložky v 30 ug/ml ZDW namiesto toho redukovali bunkovú proliferáciu (obr. 2C). Tento výsledok naznačuje, že účinok ZDW podporujúci proliferáciu nemusí vyplývať z jeho jednotlivých zložiek. Ochranný účinok ZDW by mohol vyplývať, aspoň čiastočne, zo synergických účinkov spôsobených zložkami alebo z vytvárania modifikovaných molekúl vytvorených vo farmaceutických procesoch zmiešavania ZDW. Tradične veľa čínskych lekárov verí, že polybylinná receptúra ​​je zvyčajne účinnejšia ako jeden bylinný liek, čo potvrdzujú aj naše výsledky.

V tejto štúdii,gentamicínkoncentrácia použitá v experimentoch s bunkovou kultúrou bola podobná skôr publikovaným štúdiám (Juan et al., 2007).Gentamicínkoncentrácie 1–3 mmol/l účinne indukovanéapoptózavrenálne tubulárne bunkya tento koncentračný rozsah je blízky in vivoobličkyhladiny zistené počasgentamicínantimikrobiálne liečby u myší a potkanov (El Mouedden a kol., 2000a, 2000b; Sandoval a Molitoris, 2004; Servais a kol., 2005). Inými slovami,gentamicínkoncentrácie použité v tejto in vitro štúdii boli podobné koncentráciám zisteným u myšíobličkyin vivo počasgentamicínliečbe. V našom experimente s myšougentamicínsa podával v dávke 20 mg/kg intraperitoneálne raz denne agentamicín-indukovanýapoptózabol pozorovaný u myšiobličky(obr. 7). Táto dávka je navrhnutá ako rovnaké udržiavacie dávky pre dospelého pacienta s odhadovaným klírensom kreatinínu 90 ml/min (El Mouedden et al., 2000a). Okrem toho ochranná dávka ZDW bola v tejto štúdii 1 až 2 g/kg/deň. Myš je 7- až 8-krát menej metabolicky efektívna ako človek. Vzhľadom na rozdiel medzi rýchlosťami metabolizmu myší a ľudí je dávka ZDW v štúdiách na zvieratách blízka tradičnej aplikácii ZDW u ľudí. Tieto zistenia poskytujú základ pre budúce výskumy u ľudí.

Apoptotická signalizácia závislá od kaspázy hrá kľúčovú úlohugentamicín-indukovanýapoptóza. V mitochondriálnej dráhe je kaspáza-3 popravná kaspáza, ktorú možno štiepiť na aktívnu kaspázou-9, ktorá je aktivovaná z prokaspázy-9 cytosolickým cytochrómom c (Padanilam, 2003; Jiang a Wang , 2004). Mitochondriálne uvoľňovanie cytochrómu c je regulované proteínmi rodiny Bcl{5}}, ktoré sa viažu na vonkajšiu membránu mitochondrií a blokujú odtok cytochrómu c (Yang et al., 1997). V našej štúdii

gentamicínzvýšilo štiepenie kaspázy{0}} a znížilo expresiu Bcl{1}} v bunkách NRK-52E. Tieto apoptotické javy sprostredkované mitochondriami boli zvrátené liečbou ZDW. Na základe zistení tejto štúdie sme navrhli, že ZDW chránirenálne tubulárne bunkyodgentamicín-indukované apoptotické poškodenie prostredníctvom inhibície mitochondriálnej dráhy.

5. Závery

Stručne povedané, ZDW v primeraných dávkach podporoval bunkovú proliferáciu a inhibovalgentamicín-indukovanýapoptózau potkanarenálne tubulárne bunky. ZDW tiež znižujegentamicín-indukovaná renálna toxicita in vivo. ZDW by mohol mať terapeutický potenciál pre pacientov sgentamicín-indukovanýobličkyzranenie.

Poďakovanie

Túto štúdiu sponzoroval Bureau of Health Promotion, Department of Health, ROC (DOH98-HP-1106).