In vitro hodnotenie liekových interakcií sprostredkovaných P-gp pomocou modelu ľudských obličkových buniek RPTEC/TERT1

edmund.chen@wecistanche.com

Úvod In vitro hodnotenie inhibičného potenciálu P-glykoproteínu (P-gp) je dôležitou otázkou počas procesu vývoja lieku, pretože umožňuje predpovedať klinicky relevantné liekové interakcie (DDI) [1–3]. P-gp patrí do superrodiny transportérov ATP-binding cassette (ABC) a je kódovaný génom multidrogovej rezistencie MDR1 (tiež známy ako ABCB1). Je známe, že tento membránový transportér je nadmerne exprimovaný v nádorových bunkách a spôsobuje rezistenciu na mnohé protirakovinové lieky [4]. Nachádza sa vo všetkých fyziologických bariérach, vrátane čreva, pečene aobličkyP-gp chráni pred xenobiotikami tým, že obmedzuje absorpciu týchto substrátov z tráviaceho traktu a uľahčuje ich únik do žlče a moču. P-gp teda hrá významnú úlohu vo farmakokinetike rôznych terapeutických tried [5–7]. Je známe, že množstvo liekov, ako sú protirakovinové látky, antimykotiká a kardiovaskulárne lieky, sú substrátmi a/alebo inhibítormi P-gp, a mnohé z nich sa podieľajú na klinicky relevantných interakciách [8–10]. Preto americký Úrad pre kontrolu potravín a liečiv (FDA) nariaďuje, aby sa inhibičný potenciál P-gp vyhodnotil počas skorých štádií vývoja lieku. In vitro testy uskutočňované na tento účel sú bežne založené na štúdiách transportu liečiva s použitím bunkových línií exprimujúcich P-gp. Presnejšie, usmernenia FDA odporúčajú stanovenie hodnôt polovičnej maximálnej inhibičnej koncentrácie (IC50) in vitro na posúdenie rizika klinických DDI vyplývajúcich z inhibície P-gp. Na tento účel sa uskutočnilo mnoho experimentálnych testov a väčšina z nich sa zamerala na liekové interakcie súvisiace s črevnou absorpciou pomocou modelov Caco{12}} alebo MDCK-MDR1 [11–13]

CISTANCHE ZLEPŠÍ OCHORENIE OBLIČIEK/OBLIVÍN

Od robličkovéeliminácia je tiež bežnou eliminačnou cestou pre rôzne triedy liečiv, kľúčovú úlohu v týchto interakciách môže zohrávať aj aktívna tubulárna sekrécia prostredníctvom ABC transportérov [14]. Avšak údaje in vitro oobličkovéDDI sprostredkované P-gp sú obmedzené. Je to čiastočne spôsobené nedostatočným vývojom a charakterizáciou in vitro modelov na predpovedanieobličkovétransport drog. Zdá sa, že medzi rôznymi ľudskými bunkovými líniami je model RPTEC/TERT1 sľubný pre hodnotenieobličkovéliekové interakcie. Táto bunková línia pochádza od zdravého ľudského darcu a bola vytvorená z imortalizovaných buniek proximálneho tubulu. Navyše expresia a funkčnosť P-gp boli demonštrované pomocou tohto modelu, čím sa potvrdila jeho schopnosť predpovedaťobličkovévýrony drog [15, 16]. V tomto kontexte bola táto štúdia navrhnutá tak, aby skúmala P-gp inhibičný potenciál pomocou modelu RPTEC/TERT1. Najprv sa uskutočnil skríningový test akumulácie rodamínu 123 (R123), aby sa získal profil inhibície pre každé testované liečivo. Na základe tohto skríningu sa potom vybrali štyri lieky na posúdenie ich účinkov závislých od koncentrácie na intracelulárnu akumuláciu dvoch substrátových liekov P-gp: apixabanu a rivaroxabanu

Kľúčové slová:renálna bunka, renálny model, renálne liečivo, renálna eliminácia, obličky.

Materiály a metódy

ČinidláApixaban, [2H71 3C ] - api xa ban , ri va r oxa ban ,[13C6]-rivaroxaban, nilotinib, krizotinib, erlotinib, axitinib, idelalisib, warfarín a dabigatran etexilát boli zakúpené od Alkirchsachim, Francúzsko). Verapamil, ketokonazol, simvastatín, amiodarón, rodamín 123, Hankov vyvážený soľný roztok (HBSS) a roztok HEPES boli zakúpené od spoločnosti Sigma-Aldrich (Saint-Quentin-Fallavier, Francúzsko).

Bunková kultúra  Bunky RPTEC/TERT1 sa získali z American Type Culture Collection (ATCC, Molsheim, Francúzsko) a kultivovali sa v hormonálne chránenom médiu bez séra pozostávajúcom z Dulbeccovho modifikovaného Eagleho média F12 (ATCC) doplneného súpravou rastových faktorov (ATCC) a 1% zmes antibiotika/antimykotík (penicilín-streptomycín, amfotericín B) pri 37 stupňoch a 5% CO 2. Vo všetkých experimentoch boli bunky nasadené na 96-jamkové platne s hustotou 50,000 buniek na jamku a boli použité na rast po 14 dňoch kultivácie. Médium sa obnovovalo každé 2 dni a bunky sa použili od pasáže 27 do pasáže 34. Bunky Caco{14}} boli tiež zakúpené od ATCC. Bunky sa udržiavali v kultivačnom médiu pozostávajúcom z Eagle's Minimal Essential Medium (Sigma-Aldrich, Missouri, USA) doplneného 10 percentami FBS, 1 percentami neesenciálnych aminokyselín a 1 percentom zmesi antibiotika/antimykotík (penicilín-streptomycín, amfotericín B ) pri 37 stupňoch a 5 percentách CO2. Bunky Caco{21}} sa vysiali na 96-jamkové platne v hustote 5 × 10 3 buniek na jamku a použili sa na rast po 14 dňoch kultivácie. Ľudské proximálne tubulárne epitelové bunky (HPTEC) boli získané od BIOPREDIC (Rennes, Francúzsko) a kultivované v DMEM/F12 doplnenom hydrokortizónom, EGF, inzulínom, transferínom a seleničitanom sodným. Bunky boli nasadené na 96-jamkové kultivačné platne potiahnuté kolagénom v hustote 6600 buniek na jamku a boli použité na rast po 11 dňoch kultivácie.

Skríningový test akumulácie rodamínu 123  P-gp inhibičný potenciál bol stanovený meraním intracelulárnej akumulácie rodamínu 123 v RPTEC/TERT1 bunkách v prítomnosti a neprítomnosti rôznych tried liečiv. Spomedzi 14 testovaných liečiv sa ako inhibítory P-gp použili cyklosporín A (10 uM), ketokonazol (50 uM), verapamil (100 uM) a amiodarón (50 uM). Apixaban, rivaroxaban a dabigatranetexilát – tri priame perorálne antikoagulanciá (DOAC) – sa použili ako substráty P-gp (10 uM). Warfarín (50 uM) sa použil ako neinhibítor a päť protirakovinových liečiv vrátane nilotinibu, krizotinibu, erlotinibu a idelalisibu sa použilo bez znalosti ich inhibičných profilov v koncentrácii 10 uM. Niekoľko podmienok bolo reprodukovaných s bunkami Caco{14}}, ktoré sú schválené FDA na štúdie transportu liečiv. Týmto spôsobom sa stanovila intracelulárna retencia rodamínu 123 v Caco-2 bunkách v prítomnosti a neprítomnosti verapamilu (100 uM), cyklosporínu A (10 uM), nilotinibu (10 uM) a DOAC (10 uM ). V stručnosti, po 14 dňoch kultivácie v 96-jamkových doštičkách boli bunky predinkubované počas 10 minút pri 37 stupňoch s každým liečivom rozpusteným v HBSS s 10 mM HEPES (v/v). Potom sa bunky inkubovali s 10 uM rodamínu 123 počas 45 minút pri 37 stupňoch. Nakoniec sa po troch premytiach v studenom roztoku HBSS/HEPES bunky lyzovali pri teplote miestnosti počas 45 minút v roztoku dodecylsulfátu sodného (SDS) obsahujúcom 1 % boritanu sodného. Množstvo intracelulárneho rodamínu 123 sa kvantifikovalo pomocou nanospektrofluorometra Infnite M (Life Sciences, TECAN, Švajčiarsko), pričom vlnové dĺžky boli nastavené na 485/535 nm. Údaje boli vyjadrené ako percentá akumulácie rodamínu 123 v kontrolných bunkách, ktoré neboli vystavené žiadnym potenciálnym inhibítorom P-gp, a boli ľubovoľne nastavené na 100 percentnú akumuláciu.

DOAC intracelulárny akumulačný test a stanovenie IC50 Z predchádzajúceho skríningového testu rodamínu 123 boli vybrané štyri lieky na skúmanie ich účinkov závislých od koncentrácie na intracelulárnu akumuláciu apixabanu a rivaroxabanu (10 µM) v bunkách RPTEC/TERT1. Ketokonazol, krizotinib a nilotinib boli vybrané ako inhibítory P-gp a warfarín bol vybraný ako neinhibítor. Cyklosporín A (10 uM) bol použitý ako širokospektrálny inhibítor transportérov. Štúdie interakcií medzi DOAC a nilotinibom na stanovenie hodnôt IC50 boli reprodukované v Caco-2 bunkách s cieľom porovnať tieto dva bunkové modely. Všetky zlúčeniny sa zriedili buď samotné alebo s pridruženým inhibítorom v transportnom pufri HBSS doplnenom 1 percentom HEPES (obj./obj.) a 1 percentom DMSO (obj./obj.). Pred inkubáciou boli všetky roztoky predhriate na 37 stupňov a pH bolo upravené na 7,4. V prípade protirakovinových liečiv krizotinib a nilotinib sa koncentrácie vzhľadom na ich slabú rozpustnosť a cytotoxický potenciál pohybovali v rozmedzí od 0,1 do 25 uM. Pre ketokonazol a warfarín sa koncentrácie pohybovali od 0,1 do 100 uM. Stručne, po 14 dňoch kultivácie sa všetky liečivá rozpustené v HBSS s 1 percentom HEPES (obj./obj.) predinkubovali 10 minút pri 37 stupňoch. Potom boli bunky inkubované s 10 uM apixabanu alebo rivaroxabanu počas 60 minút pri 37 stupňoch. Nakoniec sa po troch premytiach v studenom roztoku HBSS/HEPES bunky lyzovali pri teplote miestnosti počas 45 minút v 0,2 percentnom roztoku Tritonu X-100. Množstvo intracelulárneho DOAC sa potom kvantifikovalo kvapalinovou chromatografiou – hmotnostnou spektrometriou (LC-MS). Údaje boli vyjadrené ako percentuálne zvýšenie akumulácie DOAC a intracelulárna akumulácia DOAC bola v kontrolných bunkách ľubovoľne nastavená na 100 percent. Hodnoty IC50 pre inhibíciu aktivity P-gp, ktoré zodpovedajú hodnotám polovičnej maximálnej účinnej koncentrácie (EC50) pre zvýšenie akumulácie DOAC, boli stanovené z neváženého nelineárneho regresného modelovania zvýšenej akumulácie pomocou funkcie 'nls()' v R. softvér, podľa nasledujúcej rovnice (Rov. 1):

Kvapalinová chromatografia – hmotnostná spektrometrická analýzaKvantifikácia apixabanu (m/z 460.19793) a rivaroxabanu (m/z 436.07285) sa uskutočnila pomocou Ultimate U300{{18 }} systém kvapalinovej chromatografie (Dionex, Sunnyvale, CA, USA) spojený s hmotnostným spektrometrom Q-Exactive Plus (ThermoFisher, Brémy, Nemecko). LC separácie sa dosiahli použitím Hypersil Gold C18 (3 µm, 50 × 2,1 mm) analytickej kolóny (ThermoFisher Scientifc, Waltham, MA, USA) a prietokom 0,6 ml/min. . Mobilná fáza A bola voda s 0,1 % kyseliny mravčej (FA) a mobilná fáza B bol acetonitril s 0,1 % FA. Pre rivaroxaban bol gradient: 0–0,3 min, 10 percent B; 0,3–1 min, lineárne od 10 percent do 70 percent B; 1–1,5 min, 70 percent B; 1,51 min, návrat do štartovacích podmienok do 3 min. Pre apixaban bol gradient: 0–0,3 min, 10 percent B; 0,3–0,7 min, lineárne od 10 do 90 percent B; 0,7–1,5, 90 percent B; 1,51 min, návrat do štartovacích podmienok do 3 min. Detekcia sa uskutočňovala v režime elektrosprejového pozitívneho monitorovania paralelnej reakcie (PRM) s rozlíšením 35,000 (pri m/z 200). Interné štandardy (IS) boli [13C,2H7]-apixaban (m/z 468,2452) pre apixaban a [13C6]-rivaroxaban (m/z 442,09297) pre rivaroxaban. Pre každý liek a jeho príslušný IS sa monitoroval cieľový ión (na kvantifikáciu) a potvrdzujúci ión. Pre rivaroxaban a jeho IS bol cieľový ión m/z 144,95125 a potvrdzujúce ióny boli m/z 231,11280 a m/z 237,13298. Pre apixaban a jeho IS bol cieľový ión m/z 199,08656 a potvrdzujúce ióny boli m/z 282,12387 a m/z 241,06062, v tomto poradí.

Výsledky

Skríningový test akumulácie rodamínu 123Skríningový test akumulácie rodamínu 123 sa uskutočnil v bunkách RPTEC/TERT1 so 14 liečivami s rôznymi inhibičnými profilmi (obr. 1). Ako sa očakávalo, intracelulárna akumulácia rodamínu 123 v prítomnosti cyklosporínu A, širokospektrálneho inhibítora, patrila medzi najvyššie, so zvýšením akumulácie o 75 percent v porovnaní s kontrolnými bunkami. Prítomnosť verapamilu, špecifického inhibítora P-gp, viedla k zvýšeniu akumulácie rodamínu 123 o 57 percent, čo dokazuje účasť P-gp. Rovnakým spôsobom, ketokonazol, opísaný ako silný inhibítor P-gp, viedol k väčšiemu zvýšeniu (66 percent) intracelulárnej akumulácie rodamínu 123 v porovnaní s verapamilom, čím sa potvrdil jeho inhibičný profil. Naopak, pridanie amiodarónu, charakterizovaného ako mierny inhibítor P-gp, spôsobilo zvýšenie akumulácie o 59 percent, čo je podobné ako pri verapamile. Pre protirakovinové látky nilotinib, axitinib, krizotinib, erlotinib a idelalisib boli pozorované rôzne profily inhibície. Pridanie nilotinibu spôsobilo silné zvýšenie akumulácie rodamínu 123 (71 percent), čo naznačuje významný inhibičný potenciál, po ktorom nasledoval axitinib, ktorý spôsobil zvýšenie retencie o 57 percent. Na druhej strane, krizotinib a erlotinib vykazovali mierny až nízky inhibičný potenciál, so zvýšením akumulácie rodamínu 123 o 23 percent a 16 percent, v uvedenom poradí. Idelalisib neovplyvnil akumuláciu rodamínu 123; to isté platilo o warfaríne, ktorý bol

vybraný ako neinhibítor. Spomedzi troch DOAC apixaban a rivaroxaban spôsobili mierne zvýšenie retencie rodamínu 123: 33 percent a 12 percent, v uvedenom poradí. Je zaujímavé, že dabigatranetexilát, prekurzor dabigatranu a známy substrát P-gp, spôsobil zvýšenie retencie rodamínu 123 asi o 50 percent, hoci nie je opísaný ako potenciálny inhibítor P-gp. Nakoniec pridanie simvastatínu spôsobilo len mierne zvýšenie akumulácie fluorescenčného substrátu (32 percent). Na základe tohto skríningu sa vybrali štyri liečivá na posúdenie ich účinkov závislých od koncentrácie na intracelulárnu akumuláciu apixabanu a rivaroxabanu v rámci modelu RPTEC/TERT1. Ketokonazol bol vybraný ako podmienka pozitívnej kontroly pre inhibíciu P-gp a warfarín bol vybraný ako neinhibítor P-gp pre podmienku negatívnej kontroly. Nilotinib a krizotinib boli vybrané ako silné a stredne silné inhibítory P-gp. Niekoľko podmienok bolo reprodukovaných pomocou referenčného modelu Caco{15}}. Intracelulárna akumulácia R123 v bunkách bola stanovená po kombinácii (alebo nie) s apixabanom a rivaroxabanom (10 uM), nilotinibom (10 uM) a s cyklosporínom A (10 uM) a verapamilom (100 uM) pre kontrolné podmienky inhibície (Obr. 2A). Ako sa očakávalo, verapamil a cyklosporín A spôsobili vysoké zvýšenie retencie R123 o 297 percent a 275 percent. Rovnakým spôsobom nilotinib spôsobil vysoký nárast intracelulárnej akumulácie R123 (229 percent), čím sa potvrdil jeho inhibičný potenciál. Kombinácia R123 s DOAC viedla k menšiemu zvýšeniu akumulácie R123 (40–44 percent) v porovnaní s inými liekmi. Okrem toho intracelulárna akumulácia rodamínu 123 v neprítomnosti a prítomnosti cyklosporínu A vobličkovéV tejto štúdii sa skúmali aj primárne ľudské bunky, aby sa skontrolovala spoľahlivosť výsledkov získaných s bunkami RPTEC/TERT1 (obr. 2B). Tieto analýzy ukázali, že prítomnosť cyklosporínu A zvýšila retenciu R123 o 71 percent. Táto hodnota bola blízka hodnote získanej za rovnakých podmienok s bunkami RPTEC/TERT1 (nárast o 75 percent s cyklosporínom A). Preto bola aktivita P-glykoproteínu podobná v modeli RPTEC/TERT1 a primárnych ľudských bunkách.

Test intracelulárnej akumulácie DOAC: Stanovenie pomeru IC50 a I1/IC50 Uskutočnili sa štúdie vnútrobunkovej akumulácie na vyhodnotenie transportu apixabanu a rivaroxabanu sprostredkovaného P-gp pri konštantnej koncentrácii 10 µM v bunkách RPTEC/TERT1 in vitro a v prítomnosti zvyšujúcich sa koncentrácií nilotinibu, krizotinibu, ketokonazolu a warfarín (obr. 2, 3). Hodnotilo sa modelovanie zvýšenej retencie apixabanu a rivaroxabanu, aby sa určili hodnoty IC50. Kombinácia DOAC s nilotinibom viedla k najnižším hodnotám IC50: 0,85 uM pre rivaroxaban a 1,37 uM pre apixaban (obr. 4, 5). Kombinácia s krizotinibom poskytla hodnoty IC50 10,1 uM pre rivaroxaban a 12,2 uM pre apixaban. Prekvapivo, kombinovanie DOAC s ketokonazolom neprinieslo najnižšie hodnoty IC50 (16,5 uM a 16,9 uM pre rivaroxaban a apixaban, v danom poradí). Nakoniec podľa očakávania kombinácia s warfarínom, ktorá bola

vybrané ako neinhibítor, neovplyvnili intracelulárne retencie dvoch DOAC. Preto sa skúmala vnútrobunková akumulácia apixabanu aj rivaroxabanu v bunkách Caco{1}} v prítomnosti zvyšujúcich sa koncentrácií nilotinibu na porovnanie s bunkovými modelmi. Je zaujímavé, že ako bolo pozorované pri modeli RPTEC/TERT1, hodnota IC50 pre rivaroxaban (4,16 uM) bola nižšia ako hodnota získaná pre apixaban (9,35 uM). Je tiež zaujímavé poznamenať, že hodnoty IC50 pozorované v bunkách Caco-2 boli vyššie ako hodnoty získané v bunkách RPTEC/TERT1 pre rovnaký inhibítor. Klinický význam DDI možno predpovedať z údajov in vitro. Podľa smerníc FDA boli pomery [I1]/IC50 vypočítané pre každú kombináciu liekov. Tento pomer umožňuje porovnávať koncentrácie in vivo s koncentráciami, o ktorých je známe, že vytvárajú relevantný účinok in vitro. Pre apixaban v bunkách RPTEC/TERT1 boli pomery 3,1, 0,06 a 17,4 s nilotinibom, krizotinibom a ketokonazolom (tabuľka 1). V bunkách Caco{21}} bol pomer [I1]/IC50 0,46 pre interakciu medzi apixabanom a nilotinibom (tabuľka 1). Pre rivaroxaban boli pomery mierne vyššie ako pomery získané pre apixaban v bunkách RPTEC/TERT1: 5,1, 0,08 a 17,7 pre nilotinib, krizotinib a ketokonazol (tabuľka 2). Rovnakým spôsobom pomer [I1]/IC50 pozorovaný pre interakciu medzi rivaroxabanom a nilotinibom v bunkách Caco-2 bol 1,03, čo bolo vyššie ako pomer získaný pre apixaban (tabuľka 2).

Diskusia

Početné štúdie uskutočnené v posledných desaťročiach uvádzajú významnú úlohu P-gp vo farmakokinetike liečiv [17–19]. Vzhľadom na rastúci regulačný záujem o liekové interakcie sprostredkované P-gp sú in vitro testy na skúmanie inhibičného potenciálu liekov dôležitým aspektom vývoja liekov a klinickej praxe. Na tento účel sa vykonalo mnoho testov in vitro a väčšina súvisiacich údajov o predpokladanej intestinálnej absorpcii bola získaná z bunkových línií Caco-2 a MDCK-MDR1 [20–22]. K dispozícii je však málo údajov o aktívnej tubulárnej sekrécii liečiv, ktorá tiež zohráva kľúčovú úlohu pri dispozícií liečiva a závisí od prítomnosti ABC transportérov. Toto pozorovanie je jasne spojené s nedostatkom charakterizácieobličkovébunkové línie na predpovedanie liečivaobličkovéeflux. Tento cieľ si vyžaduje in vitroobličkovémodel, ktorý presne napodobňuje fyziologickú bariéru. Ľudská bunková línia RPTEC/TERT1, ktorá exprimuje niekoľko transportérov ABC (najmä P-gp), sa zdá byť dobrou alternatívou, ako sa ukázalo v predchádzajúcej štúdii [16]. V tejto súvislosti táto práca skúmala aplikáciu modelu RPTEC/TERT1 na posúdenie inhibičného potenciálu P-gp. Podľa našich najlepších vedomostí je táto práca prvou, ktorá poskytuje údaje zo štúdií inhibície P-gp s použitím človekaobličkovébunky.

In vitro testy na stanovenie inhibičného potenciálu P-gp sú bežne založené na použití špecifického referenčného substrátu P-gp, ako je digoxín alebo rodamín 123 [23–25]. Vzhľadom na jednoduchosť použitia sú fluorescenčné sondy výhodné pre vysokovýkonné testy. Okrem toho sa rodamín 123 široko aplikoval na detekciu aktivity P-gp v širokej škále štúdií [26–28]. Týmto spôsobom sa v tejto štúdii uskutočnili testy akumulácie rodamínu 123 v bunkách RPTEC/TERT1, aby sa identifikovali profily inhibície 14 liečiv. Spomedzi týchto liekov boli ako silné inhibítory P-gp vybrané cyklosporín A, ketokonazol a verapamil. Tieto inhibítory boli extenzívne charakterizované pre ich významný inhibičný potenciál P-gp, ktorý vedie k modulácii transportu digoxínu aj rodamínu 123 [27, 29, 30]. Ako sa očakávalo, tieto lieky spôsobili najvyššie retencie rodamínu 123 v bunkách RPTEC/TERT1. Na rozdiel od toho nebolo pozorované žiadne zvýšenie retencie R123 pri warfaríne, ktorý bol použitý ako negatívna kontrola, čo potvrdzuje spoľahlivosť modelu RPTEC/TERT1. Je zaujímavé, že spomedzi všetkých testovaných liekov DOAC – vrátane dabigatranetexilátu, apixabanu a rivaroxabanu – spôsobili zreteľné zvýšenie retencie R123, aj keď predtým neboli charakterizované ako inhibítory, iba substráty P-gp [31, 32]. Toto pozorovanie môže byť spôsobené existenciou takzvanej "kompetitívnej" inhibície, kde liečivá môžu interagovať s rovnakými väzbovými miestami na P-gp. Najviac dobre charakterizované miesta pre P-gp sú H miesto (pre väzbu Hoechst 33342) a R miesto (pre väzbu rodamínu 123). V týchto interakciách by však mohlo hrať úlohu viacero ďalších neznámych miest viažucich liečivo, čo by mohlo vysvetliť rôzne účinky DOAC na akumuláciu R123 [33, 34]. Inhibícia P-gp pozorovaná pre daný liek je preto závislá od substrátu použitého počas štúdií in vitro [28, 35]. Preto by sa malo zvážiť použitie rôznych substrátov P-gp, ktoré interagujú s rôznymi miestami viažucimi liečivo, aby sa presne opísali predpokladané inhibičné účinky liečiv na P-gp. Je tiež zaujímavé poznamenať, že niekoľko podmienok zo skríningu rodamínu 123 sa uskutočnilo aj v bunkách Caco{44}}, aby sa porovnali bunky RPTEC/TERT1 s referenčným modelom v štúdiách transportu liečiv. Ako sa očakávalo, cyklosporín A, verapamil a nilotinib spôsobili najvyššie zvýšenie retencie rodamínu. Rovnaké profily inhibície boli pozorované u buniek Caco-2 aj RPTEC/TERT1. Avšak zvýšenia retencie rodamínu 123 generované interakciami v modeli Caco{49}} boli väčšie ako tie, ktoré sa pozorovali v bunkách RPTEC/TERT1, čo naznačuje potenciálny rozdiel v expresii P-glykoproteínu medzi modelmi. Preto v súčasnosti V štúdii sa použila druhá metóda na posúdenie a potvrdenie potenciálnej inhibície P-gp liekmi.

CISTANCHE ZLEPŠÍ DIALÝZU OBLIČIEK/RENÁL

Na základe testu akumulácie rodamínu 123 sa vybrali štyri liečivá na stanovenie ich účinkov závislých od koncentrácie na intracelulárnu akumuláciu apixabanu a rivaroxabanu. Ukázalo sa, že P-gp hrá hlavnú úlohu v efuxe apixabanu a rivaroxabanu [32, 36]. Hodnoty IC50 nilotinibu, krizotinibu a ketokonazolu boli preto hodnotené, pričom DOAC boli vybrané ako „obeťové“ lieky. Podľa našich najlepších vedomostí je táto štúdia prvou, ktorá vykonala štúdie intracelulárnej akumulácie s DOAC u ľudíobličkovébunky. Hodnoty IC50 získané pre nilotinib a krizotinib boli v súlade s ich inhibičnými profilmi získanými z testu akumulácie rodamínu 123. Nilotinib, ktorý spôsobil silné zvýšenie retencie R123, vykazoval najnižšiu hodnotu IC50 pre dva DOAC, čo potvrdzuje jeho vysoký inhibičný potenciál. Tento výsledok je tiež v súlade s predchádzajúcou štúdiou, ktorá ukázala na koncentrácii závislé zvýšenie intracelulárnej akumulácie [3H]-paklitaxelu v MDR1-transfekovaných bunkách, čo naznačuje, že má profil inhibítora [37]. Pokiaľ ide o krizotinib, test R123 ukázal mierny inhibičný potenciál s menším zvýšením retencie R123 ako pri nilotinibe. Toto pozorovanie podporuje predchádzajúca štúdia, v ktorej krizotinib zvýšil intracelulárnu akumuláciu R123 a doxorubicínu v MDR1-transfekovaných bunkách [38]. Tento výsledok je tiež v súlade s hodnotami IC50 stanovenými s DOAC, ktoré boli vyššie ako zodpovedajúce hodnoty pre nilotinib, čo potvrdzuje jeho mierny inhibičný profil. Je však zaujímavé poznamenať, že koncentrácia 10 uM buď nilotinibu alebo krizotinibu nespôsobila rovnaké zvýšenie retencie rodamínu 123 a DOAC. Pri skríningu rodamínu nilotinib zvýšil retenciu substrátu o približne 71 percent, zatiaľ čo v prípade DOAC to bolo približne o 40 percent. Na rozdiel od toho, krizotinib spôsobil malé zvýšenie retencie rodamínu (23 percent), ale väčšie zvýšenie retencie DOAC (asi 50 percent) pri rovnakej koncentrácii. Ako bolo uvedené vyššie, toto pozorovanie by sa dalo vysvetliť rozdielmi vo väzbových miestach na P-gp. Je známe, že mnohé lieky interagujú a súperia s väzbovým miestom H skôr ako s väzbovým miestom R (na ktoré sa viaže rodamín 123) a naopak [39]. Je zaujímavé, že ketokonazol, o ktorom je známe, že je silným inhibítorom P-gp, spôsobil o niečo menšie zvýšenie retencie rodamínu 123 ako nilotinib (66 percent oproti 71 percentám). Napriek tomu bola podobná hodnota pozorovaná u buniek Caco{28}}, kde prítomnosť ketokonazolu spôsobila zvýšenie akumulácie R123 o 60 % [40]. Intracelulárna akumulácia DOAC na stanovenie hodnôt IC50 tiež vykazovala vyššie hodnoty v porovnaní s nilotinibom a krizotinibom. Je zaujímavé, že väčšina hodnôt IC50 zistených v modeloch LLC-PK1 alebo Caco{36}} používajúcich digoxín ako substrát P-gp bola medzi 3 a 4 µM pre ketokonazol [41, 42]. Tieto hodnoty sú celkom odlišné od hodnôt zistených v tejto štúdii (16,5 uM a 16,9 uM s apixabanom a rivaroxabanom, v danom poradí). Toto pozorovanie potvrdzuje, že výber substrátu a použitého modelu sú rozhodujúcimi vplyvmi pri určovaní inhibičného potenciálu P-gp. Okrem toho nedávna štúdia uvádza, že hladiny expresie transportérov ABC v in vitro bunkových modeloch majú vplyv na testy transportu liečiv, a teda na hodnotenie DDI týkajúce sa P-gp [43]. Určenie hodnôt IC50 pre verapamil s použitím rivaroxabanu ako substrátu P-gp skutočne odhalilo heterogenitu medzi modelmi buniek MDCKMDR1 a Caco-2 s hodnotami IC50 6,94 µM a 21,2 µM [43]. Okrem toho sa v tejto štúdii skúmal aj účinok nilotinibu závislý od koncentrácie na intracelulárnu akumuláciu apixabanu a rivaroxabanu v bunkách Caco{61}}. Je zaujímavé, že hodnoty IC50 pre nilotinib boli výrazne vyššie v bunkách Caco{63}} ako v bunkách RPTEC/TERT1. Toto pozorovanie možno vysvetliť rozdielom v expresii P-gp medzi týmito modelmi. Okrem toho je známe, že distribúcia P-gp závisí od uvažovaného tkaniva. Fallon a kol. preukázali, že hladina P-gp bola vyššia vobličkynež v pečeňovom tkanive u ľudí [45]. Na druhej strane sa zdá, že hladina expresie P-gp je vyššia v čreve ako v čreveobličkytkaniva [46]. Použitie ľudských buniek, ako je model RPTEC/TERT1, ktoré nadmerne neexprimujú transportéry, by preto mohlo poskytnúť ďalšie údaje. Tieto údaje by sa mohli použiť a pripočítať vo fyziologicky založenom farmakokinetickom modelovaní (PBPK) integráciou niekoľkých parametrov, ako je množstvo P-gp v tkanive alebo in vitro modeli alebo hodnoty IC50.

Hoci hodnoty IC50 zistené pre ketokonazol v modeli RPTEC/TERT1 boli vyššie ako hodnoty pozorované v literatúre, pomer [I1]/IC50 – validovaný ako prediktor potenciálnych klinicky relevantných DDI pre perorálne podávané lieky – ukázal vysoké hodnoty, ktoré boli nad hranicou 0,1 stanovenou FDA. Tento výsledok je v súlade s klinickou štúdiou, ktorá preukázala dvojnásobné zvýšenie expozície apixabanu pri súbežnom podávaní ketokonazolu [44]. Všetky tieto výsledky spolu ukazujú, že model RPTEC / TERT1 je sľubným nástrojom na hodnotenie inhibičného potenciálu P-gp.

CISTANCHE ZLEPŠÍ BOLESŤ OBLIČIEK/OBLIVÍN

Záver

Naša štúdia preukázala, že aplikácia modelu RPTEC/TERT1 je vhodná na hodnotenie P-gp inhibičného potenciálu rôznych tried liekov. Akumulačné testy rodamínu 123 umožnili vykonať počiatočný skríning liečiva. Avšak inhibičné potenciály P-gp liekov, ktoré neinteragujú s miestom R P-gp, sa musia tiež skúmať pomocou ďalších substrátov na potvrdenie predpovedí. Hodnoty IC50 stanovené z intracelulárnej akumulácie apixabanu a rivaroxabanu sú v súlade s inhibičnými profilmi pozorovanými pri rodamíne 123. Okrem toho použitie ketokonazolu a warfarínu ako silného inhibítora a neinhibítora P-gp potvrdilo spoľahlivosť modelu RPTEC/TER1, keď sa používa na získanie in vitro údajov o inhibičnom potenciáli liekov voči P-gp. Nakoniec porovnanie výsledkov získaných pomocou modelu RPTEC/TERT1 s výsledkami získanými pomocou buniek Caco{12}} zdôraznilo dôležitosť vykonania štúdií in vitro na rôznych bunkových modeloch na potvrdenie inhibičného profilu pre daný liek.