Vplyv suplementácie riasami na koncentráciu glutatiónu a aktivitu glutatiónových enzýmov v myšej pečeni a obličkách
Mar 17, 2022
Abstrakt: Riasy sú potenciálnym a prirodzeným zdrojom polynenasýtených mastných kyselín s dlhým reťazcom, ako je kyselina eikozapentaénová (EPA) a kyselina dokosahexaénová (DHA). Rozsievka Pinnularia Borealis akumuluje vysoké hladiny EPA a možno ju považovať za zdroj pre komerčnú výrobu doplnkov stravy. V tejto štúdii sme položili otázku, či suplementácia stravy s P. Borealis môže zvýšiť antioxidačnú obranu a zlepšiť rizikové faktory kardiovaskulárnych ochorení. Myši (Mus musculus) sme kŕmili lyofilizovanými roztokmi rozsievok rôznych koncentrácií (1 percento, 3 percentá a 5 percent) počas 7 dní. Potom sme merali obsah glutatiónu a aktivitu enzýmov glutatiónového redoxného systému, koncentrácie celkového cholesterolu a triacylglycerolov a koncentráciu malondialdehydu vpečeňaobličky. Zistili sme, že koncentrácie cholesterolu a triacylglycerolov vpečeňa obličky boli najnižšie u myší, ktoré boli kŕmené najvyššou koncentráciou Pinnularia Borealis, čo naznačuje ochranné vlastnosti rias. Navyše najnižšia koncentrácia Pinnularia Borealis postačovala na zlepšenie antioxidačnej kapacity. Naše výsledky naznačujú, že P. Borealis možno použiť ako zdroj doplnkov stravy bohatých na EPA, ale množstvo dodávané do organizmu by malo byť obmedzené.
Kľúčové slová:riasy; EPA; suplementácia; glutatión; glutatiónové enzýmy; oxidačný stres; obličky; pečeň
CISTANCHE ZLEPŠÍ FUNKCIU OBLIČIEK/RENÁL
Úvod
Voľné radikály a ROS predstavujú pre organizmy významné výzvy, pretože môžu poškodiť nukleové kyseliny, proteíny a lipidy. Organizmy si teda vyvinuli účinný antioxidačný obranný systém, ktorý zahŕňa endogénne enzymatické a neenzymatické antioxidanty. Avšak antioxidanty ako vitamín C, vitamín E, karotenoidy a fenoly možno získať aj zo stravy. Okrem toho polynenasýtené mastné kyseliny (PUFA), ktoré rýchlo oxidujú in vitro, môžu znižovať oxidačné poškodenie in vivo [1]. Strava bohatá na PUFA znižuje riziko kardiovaskulárnych ochorení a niektorých typov rakoviny. Môže tiež znižovať koncentráciu cholesterolu v plazme, a tým znižovať riziko kardiovaskulárnych a Alzheimerových chorôb [1,2] a zohráva priaznivú úlohu pri psychiatrických poruchách, zraku, astme a reumatoidnej artritíde [3]. Ľudské telo si dokáže syntetizovať mnoho typov mastných kyselín, ale esenciálne mastné kyseliny, ako je kyselina -linolénová (omega-3, ω-3) a kyselina linolová (ω-6), musia byť získané zo stravy. Dva deriváty kyseliny -linolénovej, kyselina eikozapentaénová (ω-3, EPA) a kyselina dokosahexaénová (ω{{10}}, DHA), sú dôležitými štrukturálnymi zložkami bunkovej membrány [4] . EPA a DHA zlepšujú rizikové faktory srdcových chorôb, ako je mŕtvica, arytmia a vysoký krvný tlak [3], a zohrávajú priaznivú úlohu pri psychiatrických poruchách, zraku, astme a reumatoidnej artritíde [4]. EPA aj DHA sa bežne získavajú z každodennej stravy, najmä z rybieho tuku. Pri extrakcii z rýb sa však vyskytujú problémy, ako je zápach a nestabilita produktov extrakcie [4]. Preto sú potrebné alternatívne zdroje. Rozsievky predstavujú jednu hlavnú skupinu fotosyntetických rias [5–11] a sú známe vysokými hladinami esenciálnych ω-3 mastných kyselín, EPA, DHA a karotenoidov [12,13]. V 20}11 Lang a kol. publikovali profily mastných kyselín viac ako 2 000 mikrorias, čo umožňuje podrobné štúdium profilov VLC-PUFA v rozsievkach [14]. Sú bohaté na polynenasýtené mastné kyseliny so stredne dlhým a veľmi dlhým reťazcom (VLC-PUFA). Prevládajúcimi mastnými kyselinami sú kyselina myristová (14:0), kyselina palmitová (16:0), kyselina palmitolejová (16:1) a kyselina eikosapentaénová (20:5), zatiaľ čo mastné kyseliny C18 sú zvyčajne prítomné v stopových množstvách. 15]. Rozsievky sú ekologicky rozšírené, vyskytujú sa v morských, sladkovodných a suchozemských biotopoch na celom svete a významne prispievajú k primárnej produkcii a ku globálnemu kolobehu uhlíka a živín [16]. Pinnularia Borealis je bežný suchozemský kozmopolitný druh vyskytujúci sa vo vzdušných biotopoch (skaly, steny, pôda, mach) a nasledujúcich a stojatých vodách [17]. V posledných rokoch sú rozsievky čoraz viac uznávané pre ich veľký potenciál v biotechnologických aplikáciách, pretože produkujú vysoko hodnotné zlúčeniny, ktoré možno použiť v medicíne a ako potravinové doplnky [18].
V tejto štúdii sme položili otázku, či doplnok stravy s rozsievkou Pinnularia Borealis môže zvýšiť antioxidačnú obranu u myší Mus musculus. Analyzovali sme glutatiónový antioxidačný systém, ktorý hrá kľúčovú úlohu pri udržiavaní oxidačnej homeostázy, ako aj koncentráciu malondialdehydu, produktu peroxidácie lipidov, ako markera oxidačného stresu. Glutatiónový antioxidačný systém pozostáva z redukovaných a oxidovaných foriem glutatiónu (GSH, resp. GSSH), glutatiónperoxidáz a glutatiónreduktázy. Zvýšený pomer GSSG (glutatióndisulfid) ku GSH svedčí o väčšom oxidačnom strese [1]. Glutatión sa syntetizuje v cytoplazme buniek apečeňje najaktívnejším orgánom [1]. Redukovaný glutatión (L-gama-glutamyl-L-cysteinyl glycín, GSH) je najhojnejší nízkomolekulárny tiol v bunkách cicavcov so silnými antioxidačnými vlastnosťami [19–21]. GSH regeneruje aj ďalšie oxidované antioxidanty, ako je vitamín C a vitamín E. Zúčastňuje sa tiež na oprave štruktúry molekúl proteínov, lipidov a nukleových kyselín poškodených oxidáciou [22]. Glutatiónperoxidázy (GPx) so svojou vysokou afinitou k peroxidu vodíka využívajú redukovanú formu glutatiónu na redukciu peroxidu vodíka na vodu a jeho elimináciu z tela [1]. Redoxný cyklus GSH uzatvára glutatiónreduktáza, ktorá katalyzuje redukciu oxidovanej formy glutatiónu na jeho redukovanú formu [1]. Tento proces je dôležitý pre udržanie správneho bunkového pomeru glutatiónu v jeho redukovanej a oxidovanej forme [23].
CISTANCHE ZLEPŠÍ ZLYHAVOVANIE OBLIČIEK/RENÁL
Nakoniec, glutatión S-transferáza (GST) katalyzuje konjugáciu GSH na širokú škálu endogénnych a exogénnych elektrofilných zlúčenín [24–26]. GST konjugácia je prvým krokom v dráhe kyseliny merkapturovej, ktorá vedie k eliminácii toxických zlúčenín. GST hrá významnú úlohu pri detoxikácii rôznych škodlivých xenobiotík, exogénnych aj endogénnych, a tiež v karcinogénnych biotransformačných procesoch [27]. U cicavcov je GST prítomná vo všetkých orgánoch a tkanivách, ale najvyšší obsah enzýmu sa nachádza vpečeň[21]. Ďalším cieľom našej štúdie bolo otestovať predpoveď, že krátkodobá suplementácia stravy Pinnularia Borealis môže zlepšiť rizikové faktory kardiovaskulárnych ochorení. Na tento účel sme merali koncentrácie triacylglycerolov a celkového cholesterolu vpečeňaobličkylaboratórnych myší.
Materiály a metódy
Táto štúdia bola vykonaná na Univerzite Jana Kochanowského v Kielciach v Poľsku. Všetky experimentálne postupy boli schválené Miestnym výborom pre etiku vo výskume na zvieratách vo Varšave, Poľsko (rozhodnutie číslo 37/2019). Experiment zahŕňal dve fázy štúdie: (1) prípravu Pinnularia Borealis na použitie ako potravinový doplnok a (2) výskum in vivo na 6-týždenných švajčiarskych myšiach.
2.1. Príprava Pinnularia Borealis Náplasti rias boli zoškrabané z borovicových vetvičiek zozbieraných z jaskyne Głowoniowa Nyza˙ (Tatry, Poľsko) a boli umiestnené do sterilných plastových vrecúšok a prevezené do laboratória, kde boli riasy kultivované na sklenených Petriho platniach obsahujúcich čerstvý agar vyrobený z 1. percent Bold's Bazal Medium [28]. Kultúry sa udržiavali pri teplote 20 ◦C v cykle 12-h svetlo/12-h tma pri 300{{5{ {60}}}} µEmm2 s²1 l× (40 W studené žiarivky FL). Približne po dvoch až troch mesiacoch od prvého objavenia sa rias bola vykonaná mikroskopická štúdia. Materiál bol pozorovaný v živom stave a identifikovaný pomocou svetelného mikroskopu Nikon Eclipse E 600 (Nikon, Tokio, Japonsko) a fotografie boli urobené digitálnym fotoaparátom Coolpix 4500 (Nikon, Tokio, Japonsko). Bunky boli fixované v 3 percentách glutaraldehydu v 0,1 M fosfátovom pufri pri pH 7,1, postosmikované v 1 percente oxidu osmičelého a potom boli infiltrované v Spurrovom médiu [29]; mikrofotografie boli urobené transmisným elektrónovým mikroskopom TESLA BS 500 (TEM). Pinnularia Borealis bola identifikovaná podľa [30] a pomocou inverzného mikroskopu Nikon Eclipse Ti a odfotografovaná konfokálnym zariadením Nikon A1 (Nikon, Tokio, Japonsko). Laserové hlavy a detekčný systém 405,488,561 nm boli detektor PMT-DU4 v rozsahu 400–820 nm, inverzná šošovka Plan Apo VC 100XOil, ortuťové osvetlenie Nikon C-HgFiE a digitálny fotoaparát DS0Fi1C-U3. Získaním údajov v Nikon NIS-Elements boli získané digitálne obrázky, ktoré boli spracované v programe Adobe Photoshop CS5 (Adobe, San Jose, CA, USA). Profil metylesterov mastných kyselín (FAME) v sušených Pinnularia Borealis sa analyzoval plynovou chromatografiou-hmotnostnou spektrometriou (GC-MS) s použitím prístroja Clarus 600T od PerkinElmer (Waltham, MA, USA) na základe metódy Guzmana a kol. [31]. Obsah lyofilizovaného P. Borealis v ωn-3 PUFA bol nasledovný: ωn-3 PUFA (v percentách celkových mastných kyselín), celkovo=28 percent a EPA {{45 }} percent . Celkovo bolo identifikovaných a zmeraných 14 mastných kyselín: kyselina myristová (C14:0), kyselina palmitová (C16:0), kyselina palmitolejová (C16:1 n-7), kyselina hexadekadiénová (C16:2 n{{{ 56}}), kyselina hexadekatriénová (C16:3), kyselina stearová (C18:0), kyselina olejová (C18:1 n-9), kyselina linolová (C18:2 n-6), - kyselina linolénová (C18:3 n-3), arachidónová (C20:4 n-6), kyselina eikozapentaénová (C20:5 n-3), kyselina eruková (C22:1 n{{ 79}}) a kyselina dokosahexaénová (C22:6 n-3).
2.2. Subjekty testované na zvieratách a spracovanie tkanív
2.2.1. Skupiny zvierat a liečby
Celkovo 40 samce švajčiarskych myší vo veku 6 týždňov s počiatočnou telesnou hmotnosťou 20,5 g ± 0,5 g boli zakúpené od Inštitútu genetiky a živočíšnej biotechnológie Poľská akadémia vied (Jastrz ˛ebiec, Poľsko). Zvieratá boli chované v štandardných laboratórnych podmienkach pri konštantnej teplote 20–22 ◦C a relatívnej vlhkosti 55 percent ± 10 percent počas 12-h svetelného cyklu (12L-12D ). Všetci jedinci boli umiestnení do štandardných polykarbonátových klietok (252 × 167 × 140 mm) pokrytých nerezovými viečkami so zabudovaným podávacím zásobníkom. Jedlo (Poľná stanica Łomna-Las, Poľsko) a voda mali k dispozícii delírium. Do jednej klietky bolo umiestnených päť jedincov. Všetky myši dostali štandardnú potravu obsahujúcu (na základe hmotnosti) 20,5 percent bielkovín, 10 percent tukov (0,28 g PUFA), 62 percent sacharidov, 6,5 percent minerálov (vápnik 1,9 percenta, fosfor 1,6 percenta, horčík 1,2 percenta, sodík 0,9 percenta a draslík 0,9 percenta) a 1 percento vitamínov (retinol 25.000 IU, cholekalciferol 1.000 IU, tiamín 300 mg, riboflavín 20 mg, pyridoxín 15 mg, kobalamín 40 mg, kyselina askorbová 58 mg, chinóny 5 mg, tokoferoly 125 mg, kyselina listová 3 mg, biotín 100 µg, kyselina nikotínová 60 mg, kyselina pantoténová 35 mg a cholínchlorid 1000 mg). Myši mali počas štúdie voľný prístup k potrave a vode. Po jednom týždni aklimatizácie na laboratórne podmienky boli myši rozdelené náhodne do 4 skupín (10 myší na skupinu). Nasledujúcich 7 dní boli myši kŕmené rôznymi diétami:
(1) kontrolná skupina dostávala štandardnú stravu; (2) druhá skupina bola kŕmená štandardnou stravou doplnenou 1 percentným roztokom lyofilizovaného P. Borealis (0,16 mg EPA); (3) tretia skupina bola kŕmená štandardnou stravou doplnenou 3 percentným roztokom lyofilizovaného P. Borealis (0,48 mg EPA); a (4) štvrtá skupina bola kŕmená štandardnou stravou doplnenou 5 percentným roztokom lyofilizovaného P. borealis (0,8 mg EPA). Lyofilizované vodné roztoky P. borealis sa podávali orálne raz denne v objeme 50 ul. Myši mali počas štúdie voľný prístup k potrave a vode. Dvakrát sa sledoval prírastok hmotnosti zvierat (počas experimentu) a dvakrát sa meral aj ich príjem potravy. Roztoky lyofilizovaných rozsievok boli vybavené bežnou jednokanálovou mikropipetou p200 (Gilson Pipetteman, Thermo Fischer Scientific, Reinach, Švajčiarsko) a špička pipety bola priložená k ústam, kým myš nezačala piť.
CISTANCHE ZLEPŠÍ BOLESŤ OBLIČIEK/OBLIVÍN
2.2.2. Zbierka vzoriek tkaniva
Po jednom týždni potravinového doplnku sa myšiam sťali hlavy apečeňa boli vypreparované obličky. Thepečeňbola perfundovaná ochladeným fyziologickým roztokom (4 ◦C), aby sa odstránila všetka zvyšná krv. Tkanivové fragmenty (100 mg/1 ml tlmivého roztoku) sa homogenizovali s TH 220-PCRH-Omni TH homogenizátorom v 0,1 M fosfátovom tlmivom roztoku s pH 7,4 obsahujúcom 10 mM EDTA. Homogenáty sa 15 minút centrifugovali pri 12.{12}} rpm v laboratórnej centrifúge s chladením MPW-351 R. Po centrifugácii sa supernatanty ihneď zmrazili v tekutom dusíku a uskladnili pri t 40 ◦C na ďalšiu analýzu .
2.2.3. analytické metódy,V tkanivových supernatantoch sa spektrofotometricky merala koncentrácia redukovaného glutatiónu, aktivita glutatiónperoxidázy, glutatiónreduktázy, glutatióntransferázy, cholesterolu, triacylglycerolov, bielkovín a malondialdehydu [32].
2.3. Redukovaný glutatión (GSH)Koncentrácia GSH sa stanovila pomocou Glutatiónovej Assist Kit (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Nemecko, kat. č. CS0260), podľa postupu výrobcu. Vzorky sa najskôr deproteinovali 5 % roztokom kyseliny 5-sulfosalicylovej a centrifugovali, aby sa odstránil vyzrážaný proteín. Meranie GSH využíva kinetický test, v ktorom katalytické množstvá GSH spôsobujú nepretržitú redukciu 5,5 ditiobis (2-nitrobenzoovej kyseliny) (DTNB) na 5-tio-2nitrobenzoovú kyselinu (TNB) , ktorý má žltú farbu. Intenzita farby sa merala spektrofotometricky pri 412 nm.
2.4. Glutatión peroxidáza (GPx)Aktivita glutatiónperoxidázy sa merala pomocou súpravy Glutatiónperoxidáza Cellular Activity Assay Kit (Sigma–Aldrich, Darmstadt, Nemecko, kat. č. CPG1). Metóda je založená na oxidácii glutatiónu (z GSH na formu GSSG) katalyzovanej GPx, ktorá je spojená s recykláciou GSSG späť na GSH s využitím glutatiónreduktázy a NADPH. Pokles absorbancie NADPH meranej pri 340 nm počas oxidácie NADPH na NADP plus je indikátorom aktivity GPx.
2.5. Glutatión transferáza (GST)Glutatión transferáza sa merala pomocou súpravy na stanovenie glutatión S-transferázy (GST) (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Nemecko, kat. č. CS0410). Princíp testu je založený na skutočnosti, že GST katalyzuje konjugáciu L-glutatiónu na 1-chlór-2,4- dinitrobenzén (CDNB) cez tiolovú skupinu glutatiónu. Konjugát GS-DNB absorbuje pri 340 nm. Rýchlosť zvýšenia absorpcie je priamo úmerná aktivite GST vo vzorke.
2.6. Glutatión reduktáza (GR)Aktivita glutatiónreduktázy sa merala pomocou súpravy na stanovenie glutatiónreduktázy (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Nemecko, kat. č. GRSA). Aktivita sa merala zvýšením absorbancie spôsobenej redukciou DTNB [5,5" ditiobis(2-nitrobenzoová kyselina)] pri 412 nm.
2.7. Obsah cholesteroluObsah cholesterolu bol stanovený pomocou Biochemtest testu metódou podľa [33]. Estery cholesterolu boli hydrolyzované cholesterolesterázou (CE) na voľný cholesterol a mastné kyseliny. Absorpcia testovanej vzorky bola meraná pri 505 nm.
2.8. Obsah triacylglycerolovObsah triacylglycerolov bol stanovený pomocou Alpha Diagnostic testu [34]. Princíp testu je založený na skutočnosti, že triacylglyceroly sú hydrolyzované lipázou na voľné mastné kyseliny a glycerol, potom fosforylované ATP. Intenzita farby sa merala pri 520 nm.
CISTANCHE ZLEPŠÍ DIALÝZU OBLIČIEK/RENÁL
2.9. Koncentrácia malondialdehydu (MDA).Koncentrácia MDA sa merala spektrofotometricky s použitím testu s kyselinou tiobarbiturovou (TBA). Na vykonanie testu sa {{0}}.5 ml vzorky pridalo do reakčnej zmesi (1,{5}} ml) tvorenej rovnakými dielmi 15-percentnej kyseliny trischlóroctovej (TCA) v 0,25 N HCL a 0,375 percentná kyselina tiobarbiturová (TBA) v 0,25 N HCL a zahrievaná na 95 ◦C počas 30 minút. Po ochladení a odstredení sa spektrofotometricky pri 532 nm zmerala intenzita ružovej farby aduktu TBA-malóndialdehyd [35].
2.10. Obsah bielkovínObsah bielkovín bol stanovený pomocou metódy podľa [36]. Lowryho proteínový test je založený na reakciách iónov medi s peptidovými väzbami (s Folin-Ciocalteuovým činidlom, tj zmesou kyseliny fosfowolfrámovej a kyseliny fosfomolybdénovej) v alkalických podmienkach (Biuret test) s oxidáciou aromatických proteínových zvyškov ( hlavne tryptofán a tyrozín). Cysteín je tiež reaktívny na činidlo. Koncentrácia farebného komplexu bola meraná spektrofotometricky pri vlnovej dĺžke λ=750 nm.
2.11. Štatistická analýzaVšetky výsledky sú prezentované ako priemer so štandardnými odchýlkami (SD). Biochemické parametre sa porovnávali pomocou analýzy rozptylu ANOVA, po ktorej nasledoval Tukeyho post hoc test. Zmeny v telesnej hmotnosti a spotrebe potravy sa porovnávali pomocou dvojvzorkového párového t-testu. Tieto analýzy boli vykonané pomocou softvéru Statistica 9.0 [37]. Údaje sú prezentované aj v percentách za predpokladu, že kontrolné hodnoty sú 100 percent . Štatistická významnosť bola stanovená na p < 0,05="" a="" p="">< 0,01.="" okrem="" toho="" sa="" vykonali="" analýzy="" priamej="" ordinácie="" cca="" pomocou="" permutačných="" testov="" monte="" carlo,="" aby="" sa="" určilo,="" ktoré="" z="" nameraných="" biochemických="" parametrov="" významne="" odlišujú="" súbory="" štúdií.="" tieto="" analýzy="" sa="" robili="" pomocou="" softvéru="" canoco="" 5.0="" [38],="" oddelene="">pečene a obličiek.
3. Výsledky
Koncentrácia alebo aktivita všetkých častí glutatiónového antioxidačného systému závisela od suplementácie stravy, a to ako vpečene a obličiek. Pred experimentom myši vážili 20,5 g ± 0,5 g. Po jednom týždni suplementácie rôznymi roztokmi rozsievok sa myši nelíšili v telesnej hmotnosti [t== 1,75, p=0,088]. Spotreba potravy sa medzi skupinami tiež nelíšila a myši zjedli v priemere 2,5 ± 0,4 g potravy denne. Avšak po jednom týždni suplementácie sa obsah cholesterolu a triacylglycerolov vpečeňa obličky sa znížili v porovnaní s kontrolnou diétou a aktivita glutatiónreduktázy a koncentrácia malondialdehydu sa významne zvýšili, nezávisle od koncentrácie roztoku rozsievky, v obochpečeňa obličky.
V pečeni aktivita GPx kontinuálne klesala so zvýšením obsahu Pinnularia Borealis (F (3, 36)=3,80, p=0,018) (obrázok 1A). Najväčší pokles (78,18 percenta) bol zaznamenaný vpečeňmyší kŕmených 5 % roztokom (obrázok 1A, tabuľka 1). V obličkách bol vzor takmer opačný (F (3, 36)=13,08, p=6,2 × 10 6) (obrázok 1A) a najvyššia aktivita GPx bola zaznamenaná u zvierat, ktoré dostávali 3 percentný roztok rozsievok (obrázok 1A, tabuľka 1). Zmeny v koncentrácii glutatiónu po suplementácii stravy nepreukázali jednotný vzor ani vpečeň(F (3, 36)=5.44, p=0.003) (obrázok 1B) alebo v obličkách (F (3, 36)=23.12, p {{ 11}},6 x 10°C8) (obrázok 1B). Po 7 dňoch doplnku stravy 5-percentným roztokom sa koncentrácia GSH vpečeňznížil na ~82 percent kontrolných hodnôt, ale tento rozdiel nebol významný (obrázok 1B, tabuľka 1). Významný rozdiel v obsahu GSH bol zaznamenaný len medzi myšami kŕmenými 3 % a 5 % roztokom rozsievok. V obličkách bol najvyšší obsah GSH zaznamenaný u zvierat kŕmených 3 % roztokom rozsievok (obrázok 1B, tabuľka 1).
Aktivita glutatiónreduktázy sa významne zvýšila, nezávisle od koncentrácie roztoku rozsievky, a to v obochpečeň(F (3, 36)=29,34, p=8,9 × 10 10) (obrázok 1C) aobličky(F (3, 36)=9,85, p=7.0 × 10 5 ) (obrázok 1C) a vo všeobecnosti bola oveľa vyššia vpečeňnež vobličky(p < 0.05).="" aktivita="" gr="" po="" doplnení="" 5="" percentným="" roztokom="" dosiahla="" až="" 290="" percent="" kontrolnej="" hodnoty="">pečeň(Obrázok 1C) a až 180 percent kontrolnej hodnoty vobličky(Obrázok 2, Tabuľka 1).
Činnosť GST vobličkykontinuálne stúpal so zvyšujúcim sa obsahom Pinnularia Borealis v potravine (F (3, 36)=15,59, p=1,2 × 10 6) (obrázok 1D). Najvyššia aktivita bola zaznamenaná po doplnení 5 percentným roztokom, keď dosiahla 158 percent kontrolnej hodnoty (obrázok 1D). Činnosť GST vpečeňbola výrazne vyššia ako v robličky(p < 0.05).="" hoci="" činnosť="" gst="">pečeňbola závislá od stravy (F (3, 36)=11,62, p=1,8 × 10 5) (obrázok 1D), nevykazovala taký pravidelný vzor ako v aobličky(Obrázok 1D). Koncentrácia malondialdehydu sa tiež neustále zvyšovala so zvyšujúcim sa obsahom Pinnularia Borealis v potravinách, a to ako vpečeň(F (3, 36)=4.26, p=0.011) (obrázok 1E) a vobličky(F (3, 36)=6,74, p=0,001) (obrázok 1E). V oboch prípadoch bola najvyššia koncentrácia MDA zaznamenaná po kŕmení 5 percentným roztokom rozsievok (obrázok 1E). Premenné významné pre rozmanitosť súboru údajov spolu tvorili 55,9 percenta celkovej variability vpečeňa 53,9 percenta vobličky(Obrázky 2 a 3). V obličkách bol v kontrolných vzorkách zistený štatisticky významný vzťah medzi vysokým cholesterolom a triglyceridmi. Významný bol aj nárast hladiny GSH s 3-percentným doplnením rozsievok. Podobne zvýšenie GR významne súviselo s pridaním 5 percent rozsievok (obrázok 3). V pečeni koreloval nárast koncentrácie MDA s 5 percentnou prímesou rozsievok. Vzťah bol štatisticky významný. Štatisticky významné bolo aj zvýšenie hladín GSH a GR pri nízkych koncentráciách rozsievok v krmive (obrázok 2).
Obsah triacylglycerolov a cholesterolu vpečeňaobličkyboli podobné (obrázok 1F,G). Doplnky stravy s rozsievkami významne ovplyvnili koncentráciu triacylglycerolov, a to v obochpečeň(F (3, 36)=16.22, p=7,8 × 10 7 ) a vobličky(F (3, 36)=7.89, p=0.0004). V porovnaní s kontrolnými skupinami, po 3-percentnom a 5-percentnom roztoku rozsievkypečeňtriacylglyceroly sa znížili na 75,25 percenta a 65,84 percenta, resp.obličkyna 92 (ns) a 73,16 percent, v uvedenom poradí. Podobne, obohatenie stravy o rozsievky znížilo obsah cholesterolu, a to ako vpečeň(F (3, 36)=2.57, p=0.07) a voblička (F (3, 36)=14,90, p =1,8 × 106). Najväčší pokles obsahu cholesterolu bol zaznamenaný v orgánoch myší kŕmených 5-percentným roztokom rozsievok.
4. Diskusia
V tejto štúdii sme položili otázku, či doplnok stravy s Pinnularia Borealis môže zvýšiť antioxidačnú obranu a zlepšiť rizikové faktory kardiovaskulárnych ochorení. Zistili sme, že koncentrácie cholesterolu a triacylglycerolov vpečeňaobličkyboli najnižšie u myší, ktoré boli kŕmené najvyššou koncentráciou P. Borealis, čo naznačuje ochranné vlastnosti rias. Navyše najnižšia koncentrácia P. Borealis postačovala na zlepšenie antioxidačnej kapacity myší. Riasy sú potenciálnym a prirodzeným zdrojom polynenasýtených mastných kyselín s dlhým reťazcom (PUFA), ako je kyselina eikozapentaénová (EPA) a kyselina dokosahexaénová (DHA). Vo všeobecnosti sa obsah lipidov vo fototrofných riasach pohybuje od 10 percent do 60 percent suchej hmotnosti a obsahujú 10 percent – 20 percent ω-3 PUFA [4]. Profily mastných kyselín v riasach sú geneticky dané, ale obsah mastných kyselín závisí aj od intenzity svetla a slanosti vody [39]. Ryckebosch a kol. [40] uviedli, že veľké množstvá EPA alebo DHA sa hromadia v morských riasach: Bacillariophyceae, Chlorophyceae, Chrysophyceae, Cryptophyceae a Florideophyceae. Peltomaa a kol. [39] navrhli, že sladkovodné riasy môžu byť bohatšie na ω-3 PUFA ako morské a brakické, a špicatá sladkovodná rozsievka Nitzschia sp. ako najsľubnejší kmeň rozsievky pre komerčnú produkciu EPA. Nitzschia laevis obsahuje celkovo 75,9 % EPA a 37,4 % EPA sa akumuluje vo forme triacylglycerolu, 22,6 % vo forme monoacylglyceridov a 15,9 % vo forme fosfatidylcholínu [41]. V P. Borealis použitom v tejto štúdii ω-3 PUFA predstavovali 28 percent celkových mastných kyselín a EPA 32 percent všetkých ω-3 PUFA. Ľudská EPA sa získava zo stravy, najmä z rybieho tuku. Je to esenciálna mastná kyselina s dôležitou nutričnou hodnotou a má schopnosť zmierniť riziko mnohých chorôb. Na pokrytie rastúcej potreby PUFA sú teda potrebné alternatívne zdroje rybieho oleja. Rozsievka P. Borealis akumuluje vysoké hladiny (32 percent) EPA, a preto ju možno považovať za doplnok stravy.
Zistili sme, že suplementácia stravy lyofilizovanými roztokmi rozsievky P. Borealis v rôznych koncentráciách vyvolala na dávke závislý pokles koncentrácií cholesterolu a triacylglycerolu. Vzhľadom na veľké rozdiely v obsahu cholesterolu v kontrolnej skupine tento účinok nedosiahol úroveň významnosti v kontrolnej skupinenaživor (p=0,07), ale bol evidentný konzistentný trend. Voblička,koncentrácia cholesterolu u myší suplementovaných najvyšším 5 percentným roztokom rozsievky sa znížila o ~30 percent. Konzistentne bol obsah triacylglycerolov výrazne znížený, a to ako vpečeňaobličky. Domnievame sa, že pokles obsahu cholesterolu a triacylglycerolov bol výsledkom suplementácie stravy PUFA, ktoré sú známe svojim ochranným účinkom [1]. P. Borealis je xerofytická rozsievka, ktorá obsahuje nielen vysokú koncentráciu EPA, ale aj niekoľko bioaktívnych zlúčenín, ako sú pigmenty, vlákna a fytosteroly, ktoré sú všetky zdraviu prospešné [5,8]. Podobné výsledky získali Sano et al. [42], ktorí pozorovali významné antilipidemické a antiaterosklerotické účinky suplementácie stravy riasou Chlorella vulgaris u králikov kŕmených potravou s vysokým obsahom cholesterolu počas 10 týždňov. Fallah a spol. [43] preukázali, že príjem chlorelly môže tiež znížiť hladinu cholesterolu u pacientov s hypercholesterolémiou. Tieto potenciálne zdravotné prínosy sa pripisujú špecifickým zložkám Chlorelly, ako sú minerály, vláknina, bielkoviny a ω-3 PUFA. Cherng a kol. [44] tiež ukázali, že Chlorella pyrenoidosa má schopnosť zabrániť dyslipidémii u modelov potkanov a škrečkov kŕmených vysokotučnou stravou obsahujúcou 20 percent hydrogenovaného kokosového oleja (bohatého na nasýtené mastné kyseliny). Niekoľko štúdií ukázalo, že u zvierat kŕmených diétou s vysokým obsahom tukov je väčšia pravdepodobnosť vzniku dyslipidémie a hyperglykémie [45], inzulínovej rezistencie [46], steatózy pečene [47], agregácie krvných doštičiek [48] a oxidačného stresu [49]. Správna strava bohatá na PUFA teda môže zlepšiť rizikové faktory týchto chorôb.
CISTANCHE ZLEPŠÍ INFEKCIU OBLIČIEK/OBLIVÍN
Lee a spol. [50] ukázali, že u mužských kórejských fajčiarov suplementácia Chlorella Vulgaris zachovala plazmatický antioxidačný stav živín a zlepšila aktivity antioxidačných enzýmov v erytrocytoch. Reaktívne formy kyslíka a voľné radikály môžu byť škodlivé pre lipidy, proteíny a DNA a môžu spúšťať množstvo ľudských ochorení, ako sú neurodegeneratívne a kardiovaskulárne ochorenia [51]. V tejto štúdii sme predpovedali, že suplementácia stravy s P. Borealis by zmiernila oxidačný stres, pretože PUFA môžu znížiť oxidačné poškodenie in vivo [1]. Avšak koncentrácia malondialdehydu (MDA), markera oxidačného stresu, bola najvyššia, a to ako vpečeňaobličkyu myší suplementovaných 5 percentným roztokom rozsievky (obrázky 2 a 3). Malondialdehyd je vo veľkej miere výsledkom peroxidácie PUFA a hoci je menej nebezpečný, ako sa pôvodne predpokladalo, stále je toxický, imunogénny a mutagénny [1]. MDA však môže pochádzať nielen z peroxidácie lipidov, ale aj z potravy. Je teda pravdepodobné, že vysoký obsah MDA nesúvisí s oxidačným stresom, ale s vysokým obsahom EPA v doplnku stravy. Aktivita glutatiónperoxidázy (GPx) sa po doplnení stravy skutočne nezmenila alebo dokonca neklesla (obrázok 2). Enzýmy GPx katalyzujú redukciu peroxidu vodíka, čím chránia organizmus pred oxidačným poškodením. Ak by sa teda zvýšil oxidačný stres, aktivita GPx by sa zvýšila. Nepochopiteľne sa zvýšila aktivita GPx vobličkymyší kŕmených 3-percentným roztokom rozsievky a bolo paralelne so zvýšením obsahu GSH (obrázok 3). S najväčšou pravdepodobnosťou to je dôvod, prečo koncentrácia GSH vysvetlila 23,7 percenta rozptyluobličky(Obrázok 3). Tieto výsledky by mohli naznačovať zvýšenie oxidačného stresu v tejto skupine. Avšak aktivita glutatiónreduktázy (GR) vpečeňaobličky zvýšenépo doplnení stravy, nezávisle od roztoku rozsievky (obrázok 2). V pečeni vysvetľovala aktivita GR 39,7 percenta rozptylu (obrázok 2). Tento enzým rekonvertoval oxidovaný glutatión na jeho redukovanú formu, aby si udržal správny oxidačno-redukčný potenciál a chránil -SH skupiny proteínov pred oxidáciou [22]. ~2–25-násobné zvýšenie aktivity GR vo všetkých skupinách naznačuje, že aj pri najnižšom roztoku Pinnularia Borealis sa antioxidačné mechanizmy zlepšili. Koncentrácia redukovaného glutatiónu (GSH) bola znížená iba u myší suplementovaných 5% roztokom rozsievky. Môže naznačovať, že nižšie koncentrácie sú prospešnejšie. GSH je silný antioxidant, ktorý je tiež kofaktorom glutatiónperoxidáz a glutatióntransferáz [1]. Glutatión transferázy sú skupinou enzýmov, ktoré iniciujú detoxikáciu endogénnych a exogénnych bunkových škodlivých zlúčenín vrátane reaktívnych foriem kyslíka. Najvyššia aktivita glutatión transferázy (GST) u myší suplementovaných 5-percentným roztokom rozsievky môže tiež vysvetliť najnižší obsah GSH u týchto zvierat. Dospeli sme teda k záveru, že suplementácia stravy s P. Borealis je prospešná pre redoxný systém GSH, ak sa aplikuje v roztoku až do 3 percent. Vyššie koncentrácie môžu mať škodlivé účinky, ktoré sa nedajú kompenzovať znížením obsahu cholesterolu alebo triacylglycerolov. Diétne PUFA však môžu byť začlenené do bunkových lipidov v rôznom rozsahu a ako také môžu mať rôzne účinky v závislosti od bunkových štruktúr alebo tkaniva [52]. To by mohlo čiastočne vysvetliť rozdiely v parametroch antioxidačného systému medziobličkya pečeň. Navyše mastné kyseliny získané zo stravy môžu byť desaturované alebo predĺžené, predovšetkým v endoplazmatickom retikule [53]. Nemerali sme obsah EPA vpečeňaoblička,takže nevieme presne povedať, aký bol obsah EPA v tkanivách, ale sme presvedčení, že výsledky neboli náhodné, pretože najnižšia koncentrácia P. Borealis postačovala na zlepšenie antioxidačnej kapacity
Okrem toho pribúda dôkazov, že rôzne PUFA používané ako doplnky stravy nie sú rovnaké, pretože PUFA majú nielen pro-, ale aj antioxidačné vlastnosti, a teda môžu modulovať endogénnu antioxidačnú obranu [52]. Účinky PUFA nesúvisia len s dĺžkou uhlíkového reťazca alebo s počtom a polohou dvojitých väzieb. Spomedzi piatich rôznych študovaných PUFA (arachidonová (20:4 ω-6), linolová (18:2 ω-6), -linolénová (18:3 ω-3), eikozapentaenová (20: 5 ω-3) a dokosahexaenová (22:6 ω-3)) len DHA zvýšila antioxidačnú obranu v kultúre bunkovej línie ľudského hepatómu, zatiaľ čo kyselina arachidónová vyvolala oxidačné poškodenie [51,54]. V iných štúdiách in vitro autori [55] ukázali, že exogénne EPA a DHA majú najsilnejšie antioxidačné vlastnosti a sú oveľa účinnejšie pri zachytávaní ROS ako ω-6 PUFA
Podľa našich najlepších vedomostí ide o prvú štúdiu o P. Borealis ako doplnku stravy. Riasy dokážu syntetizovať mnohé zlúčeniny so silnými zdravotnými benefitmi [56]. Koyande a kol. [45] ukázali, že aktívne zlúčeniny v riasach majú antikarcinogénne, antioxidačné a antihypertenzívne vlastnosti. Jedným z prirodzených spôsobov, ako eliminovať riziká neurodegeneratívnych a kardiovaskulárnych ochorení, môže byť strava bohatá na ω-3 PUFA [38]. Niektoré riasy sú klasifikované ako zdroj potravy v kategórii GRAS [57] a rozsievka P. Borealis bola uznaná ako bohatý zdroj polynenasýtených mastných kyselín, ako je EPA [58]. V súčasnosti sa ľudská EPA získava zo stravy, najmä z rybieho tuku. Je to esenciálna mastná kyselina s dôležitou nutričnou hodnotou a schopnosťou zmierniť riziko mnohých chorôb. Na pokrytie rastúcej potreby PUFA sú teda potrebné alternatívne zdroje rybieho oleja. Rozsievka P. Borealis akumuluje vysoké hladiny (32 percent) EPA, a preto ju možno považovať za doplnok stravy.
5. Závery
Výsledky našej štúdie naznačujú, že Pinnularia Borealis sa môže používať ako doplnok stravy poskytujúci zdravotné výhody. Ak je podávaný v správnom množstve, môže zvýšiť antioxidačnú obranu a zlepšiť rizikové faktory kardiovaskulárnych ochorení. Riasy sú dobrou alternatívou rybieho oleja, čím odstraňujú problémy so zápachom a nestabilitou produktov extrakcie.
